Способ диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию зрительных белков аррестина и рековерина в моче Российский патент 2023 года по МПК G01N33/68 G01N33/493 G01N33/574 G01N33/573 H01F1/42 

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и клинической биохимии. Изобретение может быть использовано для ранней диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию зрительных белков аррестина и рековерина в образцах мочи пациентов с применением иммунохимических методов детекции.

1. Как и при других видах онкологических заболеваний, своевременное выявление болезни и местное хирургическое лечение почечно-клеточной карциномы (ПКК) может привести к полному выздоровлению больных. Однако, в настоящее время не существует методов ранней диагностики ПКК. Основными причинами являются сильная гетерогенность опухоли и высокая инвазивность процедуры биопсии (Т.С. Ngo, C.G. Wood, J.A. Karam, Biomarkers of renal cell carcinoma, Urologic oncology, 32 (2014) 243-251, doi: 10.1016/j.urolonc.2013.07.011). В настоящее время в качестве диагностических, прогностических и предиктивных биомаркеров ПКК предложены различные белково-тканевые и генетические маркеры (Halabi S, Yang Q, Carmack A, et al. Tissue based biomarkers in non-clear cell RCC: Correlative analysis from the ASPEN clinical trial. Kidney Cancer J. 2021;19(3):64-72, doi: 10.52733/kcj19n3-a1; Li F, Aljahdali IAM, Zhang R, et al. Kidney cancer biomarkers and targets for therapeutics: survivin (BIRC5), XIAP, MCL-1, HIFlalpha, HIF2alpha, NRF2, MDM2, MDM4, p53, KRAS and АКТ in renal cell carcinoma. J. Exp Clin Cancer Res. 2021;40(1):254, doi: 10.1186/s 13046-021-02026-1; Gulati S, Vogelzang NJ. Biomarkers in renal cell carcinoma: Are we there yet? Asian J Urol. 2021;8(4):362-75, doi: 10.1016/j.ajur.2021.05.013.), которые, однако, не нашли пока применения в клинической практике. Одним из подходов для улучшения диагностики может быть поиск новых неинвазивных биомаркеров, представленных в жидкой биопсии, и более чувствительных методов их детекции. Наиболее перспективными кажутся белковые мочевые маркеры, поскольку моча обычно содержит намного меньше общего белка по сравнению с кровью и легко получить образцы для анализа, что важно при проведении крупномасштабного скрининга. Кроме того, учитывая, что моча находится в непосредственном контакте с опухолью при урологических онкозаболеваниях, можно ожидать повышенной эффективности таких биомаркеров. На сегодняшний день мочевые биомаркеры ПКК подробно описаны в книге Дакубо (Dakubo, G.D. (2019) Cancer Biomarkers in Body Fluids (Biomarkers in Proximal Fluids). ISBN: 978-3-030-24723-2, doi: 10.1007/978-3-030-24725-6) и в недавно опубликованных обзорах, например, Флиткрофта и др. (Flitcroft, J.G., Verheyen, J., Vemulkar, Т., Welbourne, E.N., Rossi, S.H., Welsh, S.J., et al. (2022) Early detection of kidney cancer using urinary proteins: a truly non-invasive strategy, BJU Int., 129(3), 290-303, doi: 10.1111/bju. 15601). Из многочисленных мочевых биомаркеров аквапорин-1 с перилипином-2 (PLIN2), карбоангидраза IX (CAIX), белок, ингибирующий Raf-киназу (RKIP), белок ядерного матрикса-22, белок 14-3-3 β/α и липокалин, ассоциированный с нейтрофильной желатиназой, считаются наиболее перспективными в диагностике рака почки. В настоящее время также представляет интерес характеристика методов детекции мочевых биомаркеров. В большинстве случаев используются наборы ИФА. Однако для повышения чувствительности применяли Вестерн-блоттинг, например, для обнаружения PLIN2 (Morrissey, J.J., Mellnick, V.M., Luo, J., et al. (2015) Evaluation of urine aquaporin-1 and perilipin-2 concentrations as biomarkers to screen for renal cell carcinoma: a prospective cohort study, JAMA Oncol, 1(2), 204-12, doi: 10.1001/jamaoncol.2015.0213). В дальнейшей работе Моррисей с соавт. показали, что PLIN2 в моче может быть надежно обнаружен с помощью биоплазмонного анализа на бумаге (Hu, R., Gupta, R., Wang, Z., Wang, С, Sun, H., Singamaneni, S., et al. (2019) Bioplasmonic paper-based assay for perilipin-2 non-invasively detects renal cancer, Kidney Int., 96(6), 1417-1421, doi: 10.1016/j.kint.2019.08.020). Для идентификации РКИП применяли масс-спектрометрию (Papale, М., Vocino, G., Lucarelli, G., Rutigliano, M., Gigante, M., Rocchetti, M.T., et al. (2017) Urinary RKIP/p-RKIP is a potential diagnostic and prognostic marker of clear cell renal cell carcinoma, Oncotarget, 8(25), 40412-40424, doi: 10.18632/oncotarget. 16341). В дополнение к упомянутым маркерам, в моче открыты белки, которые были идентифицированы как биомаркеры ПКК, с использованием других методов, например, жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (Di Meo, A., Batruch, I., Brown, M.D., Yang, С., Finelli, A., Jewett, М.А., et al. (2020) Searching for prognostic biomarkers for small renal masses in the urinary proteome, Int J Cancer, 146(8):2315-2325, doi: 10.1002/ijc.32650).

Однако, несмотря на некоторые достижения, ни один из этих подходов до сих пор не апробирован для применения в клинике. Таким образом, в настоящее время не существует биомаркера, подходящего для ранней (скрининговой) диагностики ПКК.

Наиболее близким к предлагаемому в настоящей заявке способу является детекция белков Tu М2-РК, VEGF, TATI, СА9 (М.О. Golovastova, D.O. Korolev, L.V. Tsoy, V.A. Varshavsky, W.H. Xu, A.Z. Vinarov, E.Y. Zernii, P.P. Philippov, A.A. Zamyatnin, Jr., Biomarkers of Renal Tumors: the Current State and Clinical Perspectives, Current urology reports, 18 (2017) 3. doi: 10.1007/s11934-017-0655-1). Известно, что существуют белки, которые экспрессируются в норме в иммунопривилегированных тканях, таких как центральная нервная система и сетчатка глаза, и которые могут аберрантно экспрессироваться в опухолевых клетках вследствие злокачественной трансформации. Одна из групп включает так называемые раково-сетчаточные антигены (PCA). Показано, что клетки меланомы могут экспрессировать такие РСА как родопсин, трансдуцин, cGMP-фосфодиэстеразу 6, родопсин киназу, рековерин и аррестин 1 (A.V. Bazhin, D. Schadendorf, N. Willner, С.De Smet, A. Heinzelmann, N.K. Tikhomirova, V. Umansky, P.P. Philippov, S.B. Eichmuller, Photoreceptor proteins as cancer-retina antigens, International journal of cancer, 120 (2007) 1268-1276, doi: 10.1002/ijc.22458). Таким образом, по аналогии с меланома-ассоциированной ретинопатией, экспрессия РСА в клетках опухоли при ПКК может привести к выделению антигенов в мочу.

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что помимо повсеместно встречаемых аррестинов, в тканях опухоли почки с высокой частотой встречается также экспрессия зрительного белка рековерина (Golovastova, М.О., Tsoy, L.V., Bocharnikova, A.V., Korolev, D.O., Gancharova, O.S., Alekseeva, E.A., Kuznetsova, E.B., et al. (2016) The cancer-retina antigen recoverin as a potential biomarker for renal tumours, Tumour Biol, 37(7), 9899-9907, doi: 10.1007/s13277-016-4885-5).

Таким образом, было предложено использовать феномен аберрантной экспрессии двух РСА аррестина 1 и рековерина для ранней диагностики ПКК.

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является разработка малоинвазивного способа ранней диагностики ПКК.

Техническим результатом заявляемого изобретения является возможность определения наличия белков аррестина 1 и рековерина в моче пациентов с предполагаемой патологией иммунохимическими методами детекции.

Поставленная задача решается способом определения наличия в моче пациентов белков аррестина 1 и рековерина, способных аберрантно экспрессироваться в клетках опухоли почки пациентов с ПКК, с помощью ультрачувствительного метода проведения иммуноанализа на микрочипах с использованием суперпарамагнитных частиц для детекции сигнала. К таким методам могут быть также отнесены иммуноблотинг, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ и т.п.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 приведена схема ультрачувствительного анализа с детекцией магнитными частицами, где 1 - магнитные частицы, покрытые антителами, 2 - проточная ячейка, 3 - аналит, 4 - микрочип, 5 - магнит.

На фиг. 2 приведены репрезентативные примеры результатов иммуноанализа образцов мочи, полученных от пациентов с ПКК. Расположение зон показано на фиг. 1 (Б). Слева: образец мочи пациента, у которого выявляются оба антигена – аррестин и рековерин; по центру: образец мочи больного, у которого детектируется только один из антигенов – рековерин; справа: образец мочи больного, у которого детектируется только аррестин.

На фиг. 3 приведен пример результатов иммуноанализа отрицательного контроля: мочи, полученной от здорового человека. В образце определяется только положительный контроль, который служит внутренним контролем образца.

Осуществление изобретения

В рамках проведенных в Институте молекулярной медицины ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) исследований было показано, что РСА аррестин 1 и рековерин довольно часто могут аберрантно экспрессироваться в клетках опухоли почки пациентов с ПКК. Однако ранее данные белки никогда не определялись в образцах мочи больных пациентов из-за недостаточной чувствительности обычных методов иммуноанализа (ИФА, Вестерн-блот и др.).

Настоящее изобретение поясняется конкретным примером выполнения, который наглядно демонстрируют возможность достижения требуемого технического результата, но при этом не ограничивает заявленный объем притязаний.

Наличие аррестина 1 и рековерина в моче определялось с помощью высокочувствительного иммуноанализа на микрочипах с иммобилизованными первичными антителами к данным белкам, использующего на стадии выявления антигенов сканирование поверхности двумя типами магнитных частиц, покрытых отдельно вторичными антителами к аррестину 1 и рековерину, при приложении магнитного поля. Такой «активный» способ детекции позволяет преодолеть диффузионный барьер и значительно повысить чувствительность и уменьшить время анализа. Предварительно на мембране из регенерированной целлюлозы (диализной мембране) методом электрораспыления изготавливаются микрочипы с моноклональными антителами к аррестину 1 и рековерину, а также положительный и отрицательный контроли. Ранее показано, что микрочипы, хранящиеся в 50% -ном глицерине при -20°С, сохраняют работоспособность, по крайней мере, в течение месяца. Заявляемый способ ранней диагностики ПКК может быть осуществлен следующим образом. У пациента с утра производят забор образца мочи, который используется для анализа без дополнительной пробоподготовки. Возможно замораживание и хранение образцов при -80°С. Иммуноанализ проводится в специальной проточной ячейке с закрепленным микрочипом, помещенной под обычный медицинский микроскоп с темнопольным осветителем (фиг.1). Накануне анализа, в образец мочи объемом 1 мл помещается кусочек микрочипа и оставляется на ночь при 4°С при интенсивном перемешивании. За это время происходит связывание обоих антигенов в активных зонах микрочипа, содержащих первичные специфические антитела. Через 12-14 ч микрочип промывают от образца дистиллированной водой и помещают в проточную ячейку, под которой располагают магнит. Через ячейку пропускают 5×10^-4% (по массе) суспензию смеси магнитных частиц со вторичными поликлональными антителами к аррестину 1 и рековерину, в стандартном фосфатном буфере с добавкой 1% бычьего сывороточного альбумина. Магнитное поле прижимает частицы к микрочипу и вынуждает их сканировать поверхность, облегчая процесс связывания антигенов со вторичными антителами.

Как правило, эта процедура занимает около 1 минуты. Поскольку одна связь антиген-антитело способна удерживать магнитную частицу, отдельные молекулы аналита на поверхности микрочипа могут быть помечены и обнаружены при сканировании. Изображения микрочипов получают с помощью USB-камеры. Сигнал (количество связанных магнитных частиц) в активной зоне микрочипа и фоновый сигнал определяют вручную или с помощью программного обеспечения, подсчитывающего яркие пятна заданного размера на темном фоне. Далее, по результатам детекции делают вывод о наличии или отсутствии аррестина 1 и рековерина в моче пациента: образец классифицируют как положительный, если хотя бы в одной из зон, соответствующих аррестину 1 и рековерину, количество связавшихся магнитных частиц превышает фон (количество частиц вне активной зоны) не менее, чем на 2 стандартных отклонения фонового сигнала. В противном случае образец сыворотки классифицируют как отрицательный и делают вывод об отсутствии данных антигенов в моче пациента.

Пример 1

В исследуемый образец мочи объемом 1 мл помещали кусочек микрочипа (0,5×1 см) с иммобилизованными моноклональными антителами к аррестину 1 и рековерину и оставляли на ночь при перемешивании (20 об/мин) при 4°С. Утром чип промывали дистиллированной водой и фиксировали в проточной ячейке (фиг. 1), под которую подносили магнит. Затем помощью шприцевого дозатора SK500I (Китай) через ячейку со скоростью 5-6 мкл/мин пропускали равную смесь суперпарамагнитных частиц, модифицированных вторичными антителами к аррестину 1 и рековерину в общей концентрации 5×10^-4% (по массе) в стандартном фосфатном буфере с добавкой 0,1% Твин 20 и 1% бычьего сывороточного альбумина в течение 2 минут. Темнопольное изображение микрочипа регистрировали цифровой камерой, на котором фиксировалось появление светящихся зон с антителами к аррестину 1 или рековерину со связавшимися магнитными частицами. Количество связанных магнитных частиц в каждой зоне определяли с помощью программного обеспечения собственной разработки, подсчитывающего яркие пятна определенного размера на темном фоне. Эксперимент провели с 89 образцами мочи, полученными от различных больных с подтвержденным диагнозом ПКК. Если сигнал (число магнитных частиц на 1 мм² в активной зоне микрочипа) превосходил фон (число магнитных частиц на 1 мм² вне активной зоны микрочипа) + 2 стандартных отклонения фона, результат анализа данного образца признавался положительным. Репрезентативные примеры изображений микрочипов со связанными магнитными частицами приведены на фиг. 2. Положительными по аррестину были 89% образцов, по рековерину - 66%, по аррестину или рековерину - 96%. Таким образом, диагностическая чувствительность метода составила 96%.

Пример 2

Эксперимент провели согласно Примеру 1 с 50 контрольными образцами мочи, полученными от людей, не страдающих урологическими онкозаболеваниями. Положительными по аррестину были 6% образцов, по рековерину - 4%, по аррестину или рековерину - 8%. Таким образом, диагностическая специфичность метода составила 92%.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и клинической биохимии, и может быть использовано для диагностики почечно-клеточной карциномы путем определения наличия в моче одного из зрительных белков - аррестина 1 или рековерина. Аррестин 1 и рековерин можно определять иммунохимическими методами детекции, в качестве которых используют анализ на микрочипах, который можно проводить с использованием суперпарамагнитных частиц для детекции сигнала. Способ обеспечивает возможность малоинвазивной ранней диагностики почечно-клеточной карциномы за счет определения наличия белков аррестина 1 и рековерина в моче пациентов с предполагаемой патологией иммунохимическими методами детекции. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Способ диагностики почечно-клеточной карциномы путем определения наличия в моче одного из зрительных белков - аррестина 1 или рековерина.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что аррестин 1 и рековерин определяют иммунохимическими методами детекции, в качестве которых используют анализ на микрочипах.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что иммунохимический анализ на микрочипах проводят с использованием суперпарамагнитных частиц для детекции сигнала.