Во всем мире наблюдается устойчивая тенденция роста числа онкологических заболеваний. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения в течение последующих 20 лет число онкологических заболеваний вырастет на 60% [https://www.who.int/news-room/detail/04-02-2020-who-outlines-steps-to-save-7-million-lives-fromcancer?fbclid=IwAR0jKASIm8zBQYcVAlzhriBUtT2oG4WgMOOuz3fMQXcjmbL9p6eTQv1aoas]. Наибольшее увеличение числа новых случаев ожидается в странах с низким и средним уровнем дохода. В России, например, этот показатель, по данным на 2019 год, ежегодно увеличивается 1,5% [https://rosstat.gov.ru/folder/13721]. Всего в 2018 году в Российской Федерации было выявлено более 624 тысяч новых случаев злокачественных новообразований, около 3,7 млн пациентов состоят на лечении. По данным Росстата рак стал причиной инвалидности 222 тысяч граждан РФ в 2019 г. На лечение онкологических больных тратится значительная доля бюджета государства. Всего в 2020 году на оказание помощи пациентам с онкологией по ОМС предусмотрено 271,3 млрд рублей, включая 115 млрд рублей по проекту «Борьба с онкологическими заболеваниями». По данным отчета Федерального фонда ОМС всего за пять месяцев 2020 г на оказание помощи онкобольным потрачено 110,4 млрд рублей (97,6% от плана), что составило прирост в 163% по сравнению с 2019 г. По оценкам экспертов к 2030 году этот показатель останется также на высоком уровне и составит 7,5 млрд. долларов США (0,14% от ВВП), при этом четверти этих потерь можно было бы избежать при своевременной диагностике заболеваний [Национальная онкологическая программа 2030, nop2030.ru].
В РФ статистика по смертности от злокачественных образований (ЗНО) в 2020 г. показала снижение данного показателя на 1% по сравнению с 2019 г., на сегодняшний день она находится на втором месте после сердечно-сосудистых с явной тенденцией к опережению последних. Одной из причин высоких показателей смертности является выявление заболевания на поздних стадиях. В настоящее время в России выявление заболевания на поздних стадиях происходит у 40-45% пациентов. В случаях диагностики рака быстрота обнаружения новообразования имеет принципиальное значение, существенно повышая шансы пациента на благополучный исход болезни и снижая затраты государства на дорогостоящее лечение онкобольных. Так, для одной из самых распространенных в РФ и мире форм рака, рак молочной железы (РМЖ), прогноз пятилетней выживаемости при выявлении на первой стадии составляет 96%, а при выявлении на четвёртой стадии только 21% пациентов доживает до одного года [https://www.oncoforum.ru/o-rake/prognozy-vyzhivaemosti/vyzhivaemost-pri-rake.html].
У Большинства пациентов, погибших от рака, заболевание было диагностировано на поздних стадиях, когда оно уже было диссеминировано [1. Siegel RL, Miller KD, Jemal A, Cancer statistics, 2020. CA Cancer J. Clin. 70, 7-30 (2020); 2. Howlader N et al., Eds., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2014, National Cancer Institute, Bethesda, MD: (2017); 3. Ahlquist DA, Universal cancer screening: Revolutionary, rational, and realizable. NPJ Precis Oncol 2, 23 (2018)]. Тем не менее, появление метастазирования происходит в какой-то момент развития заболевания, что дает возможность его обнаружить и лечить на более ранней стадии [4. Goldblum JR, Lamps LW, McKenney J, Myers JL, Surgical Pathology. Elsevier, 2018); 5. Singhi AD, Koay EJ, Chari ST, Maitra A, Early Detection of Pancreatic Cancer: Opportunities and Challenges. Gastroenterology 156, 2024-2040 (2019)]. В дополнение к потенциалу хирургического вмешательства, лучевой и адъювантной терапии для лечения локализованного заболевания, традиционные, а также новые терапевтические средства, включая иммунотерапию, более эффективны при низкой опухолевой нагрузке [6. André T, Adjuvant Fluorouracil, Leucovorin, and Oxaliplatin in Stage II to III Colon Cancer: Updated 10-Year Survival and Outcomes According to BRAF Mutation and Mismatch Repair Status of the MOSAIC Study. J. Clin. Oncol. 33, 4176-4187 (2015); 7. Huang AC, T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature 545, 60-65 (2017); 8. Park JH, Long-Term Follow-up of CD19 CAR Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia. N. Engl. J. Med. 378, 449-459 (2018)]. Более того, крупные исследования показали, что случаи смерти на поздних стадиях заболевания, в частности, от колоректального рака, значительно реже встречаются при обнаружении рака с помощью любой формы скрининга, чем при обнаружении симптомов [9. Brenner H, Survival of patients with symptom- and screening-detected colorectal cancer. Oncotarget 7, 44695-44704 (2016)]. Цель более раннего выявления состоит в том, чтобы определить наличие рака на стадии, когда лечение с большей вероятностью будет успешным, тем самым предлагая лучшие шансы на долгосрочную выживаемость.
Было показано, что такие методы скрининга, как колоноскопия, маммография, низкодозная компьютерная томография и микроскопия мазков по Папаниколау снижают смертность от рака толстой кишки, РМЖ, легких и шейки матки (РШМ) соответственно [10. Feasibility of blood testing combined with PET-CT to screen for cancer and guide intervention, Science. 2020 Jul 3; 369 (6499)]. Однако по стандартам оказания медицинской помощи такой скрининг не рекомендован для лиц со средним риском любых других типов рака. Таким образом, существует необходимость проведения минимально инвазивных, скрининговых тестов с широким спектром охвата онкопатологий для снижения заболеваемости и смертности от этих заболеваний.
В соответствии с национальным проектом «Здравоохранение» в РФ к 2024 году планируется вывести выявление рака на ранних стадиях с 56 до 63-70%; снизить показатели смертности от новообразований на 8,4%, в том числе от злокачественных до 185 случаев на 100 тыс. населения [«О национальных целях и стратегических задачах развития РФ на период до 2024 года». Указ Президента РФ от 7 мая 2018 года № 204]. Тем не менее, доля ЗНО, выявленных на ранней стадии, в 2020 году составила 56,1 %, что ниже показателя 2019 года на 2,3% и ниже планового значения федерального проекта «Борьба с онкологическими заболеваниями» в 56,4%.
Для таких форм рака, как РМЖ, РШМ, колоректальный, рак полости рта [https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/272264/9789244511947-rus.pdf?ua=1], было доказано, что ранняя диагностика, как правило, дает максимальную пользу и раннее начало лечения улучшает исходы. В связи с этим российская «Национальная программа по борьбе с онкологическими заболеваниями» фокусируется в первую очередь на снижении показателей смертности и запущенности при злокачественных новообразованиях у трудоспособного населения по шести локализациям: молочная железа, шейка матки, предстательная железа, ободочная и прямая кишка, кожа, рот и глотка [Национальная онкологическая программа 2030, nop2030.ru].
Организация и проведение скрининговых исследований населения - сложное многовариантное мероприятие, требующее заметных усилий от организаторов здравоохранения, медицинских работников, а также от пациентов. По данным ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения РФ, среди причин запущенности злокачественных новообразований выделяют в качестве одной из основных - несвоевременное обращение к врачу (более 50% больных обращаются через 6 месяцев и более после появления первых симптомов, 22% - спустя 1 год) [http://science-education.ru/ru/article/view?id=26640]. Что объясняется страхом перед болезненными процедурами обследования (биопсия, ФГДС, колоноскопия и др.), высокой стоимостью исследований. Другая причина - большой интервал от первого обращения до выявления заболевания (скрытое течение заболевания (43,8%), неполное обследование больных (3,5%), ошибки в диагностике (1,7%), длительность обследования (0,5%)). Суммируя это, можно говорить о целесообразности внедрения малоинвазивных, недорогих, простых в исполнении и интерпретации способов скрининга.
Среди неинвазивных общедоступных методов ранней диагностики ведущее место занимает выявление онкомаркеров. Принятая схема назначения исследований ОМ: в качестве дополнительного метода в комбинации с другими типами исследований; при ведении онкологических больных для мониторинга терапии и контроля течения заболевания, для идентификации остатков опухоли, множественных опухолей и метастазов; для раннего обнаружения опухоли и метастазов (скрининг в группах риска - ПСА и АФП); для прогнозирования течения заболевания. Так же можно говорить о профилактическом характере исследования на ОМ. Анализ уровней ОМ может помочь врачу-клиницисту в постановке диагноза, определении причины проблемы при размытой клинической картине у пациента и в корректировке схем лечения. Повышенные уровни маркеров могут обнаруживаться у больных с доброкачественными опухолями, с вирусными заболеваниями, при аутоиммунных расстройствах, при воспалительных заболеваниях, на фоне лекарственного лечения по сопутствующей патологии, то есть при тех изменениях в состоянии организма, которые так же требуют от пациента внимания и дальнейшего принятия мер. Показаниями к проведению скрининга для здоровых людей являются: пережитые сильные нервные перенапряжения; проживание в неблагоприятных экологических условиях; нарушенный режим питания; при других обстоятельствах, которые могут стать причиной заболевания онкологией. Изменения иммунологической реактивности сопутствуют фактически всем заболеваниям, они усугубляются при действии большинства неблагоприятных внешних факторов и накапливаются с возрастом. Одними из признаков неэффективной адаптации к неблагоприятным факторам является повышение содержания в крови гликопротеинов муцинового типа (ОМ) и реагинов. [E.V. Sergeeva, THE CONTENT OF ONCOFETAL ANTIGENS IN THE BLOOD OF THE INHABITANTS OF THE NORTHERN TERRITORIES, The General Pathology, DOI: 10.22138/2500-0918-2018-15-2-211-217]. тем Пациентам, у которых есть генетическая предрасположенность, доброкачественные новообразования, папилломы и родинки, скрининг целесообразно проводить 1 - 2 раза в год. Остальным людям проходить обследование допустимо раза в два года.
В настоящее время установлено, что опухоли значительно отличаются от исходных нормальных тканей по своей антигенной структуре, которая в той или иной степени характеризуется тремя признаками: утратой некоторых антигенов, свойственных нормальной исходной ткани; появлением специфических опухолевых антигенов; сохранением некоторых антигенов исходной ткани. Опухолевые маркеры - это белки, продуцируемые опухолевой клеткой, присутствие и изменение концентрации которых в периферической крови или других биологических жидкостях организма коррелирует с наличием и ростом опухоли. ОМ используются как для диагностики, так и на этапах уточнения диагноза, оценки эффективности лечения и прогноза течения заболевания. В 50% случаев корректно определенный профиль изменения концентраций ОМ позволяет выявить опухолевый процесс на 1-6 месяцев раньше, чем с использованием других методов, в том числе инвазивных. Некоторые виды злокачественных новообразований могут быть выявлены еще до появления клинических признаков, тем самым повышая эффективность его лечения [Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностического использования//Проблемы].
К «идеальным» ОМ предъявляют ряд требований. Высокая специфичность: способность дифференцировать пациентов с данным типом опухоли и здоровых. Понятие специфичности применимо так же по отношению к определенной ткани или органу (возможная локализация опухоли). Многие онкомаркеры могут вырабатываться в разных тканях, не давая точной информации о локализации возможного опухолевого процесса. «Идеальный» маркер должен быть специфичным для органа/типа ткани. Высокая чувствительность: способность выявлять всех пациентов с типом опухоли, с которым ассоциирован маркер; маркер должен быть положительным при заболевании, даже когда клинические или рентгенологические тесты ещё отрицательны. Надежность и воспроизводимость исследования. Прогностическая значимость. Должна прослеживаться корреляция уровня маркера с массой опухоли (количеством опухолевых клеток). При рецидиве опухолевого процесса повышение концентрации маркера должно обнаруживаться раньше появления его клинических признаков.
Использование ОМ в диагностике имеет ряд ограничений. Некоторые виды рака, обнаруженные на ранней стадии, могут никогда не прогрессировать до клинически значимых состояний, так же как повышенный уровень онкомаркера не всегда свидетельствует о наличии онкопатологии, то и другое может привести к гипердиагностике [Srivastava S, Koay EJ, Borowsky AD, De Marzo AM, Ghosh S, Wagner PD, Kramer BS, Cancer overdiagnosis: A biological challenge and clinical dilemma. Nat. Rev. Cancer 19, 349-358 (2019)]. Так же известны случаи онкологических заболеваний, при которых не происходит повышение уровня ОМ. Таким образом, скрининговое исследование выступает в качестве первой линии массовой диагностики населения с целью увеличения частоты выявления онкопатологии, которое затем при необходимости будет уточняться более специфическими методами обследования.
В настоящее время широкое применение в диагностической практике нашли около 50 видов маркеров. Существенной особенностью большинства из них является их невысокая специфичность. Некоторый уровень маркеров может присутствовать в норме (продуцироваться в разных органах/тканях) или быть реактивным (например, при воспалительном процессе). В этой связи разработка мультиплексных тест-систем, включающих наиболее изученные, диагностически значимые и дополняющие друг друга онкомаркеры, представляется особенно актуальной. Наиболее полную картину о состоянии здоровья пациента при скрининговом лабораторном обследовании даст оценка уровня комплекса маркеров разных классов в составе одной панели: онкофетальных антигенов (ХГЧ), раково-эмбриональных антигенов (РЭА), АФП, антигенов, ассоциированных с мембранами опухолевых клеток CA 19-9, CA 125, CA 72-4, CA 15-3, ПСА, SCC, метаболических маркеров Cyfra-21-1, NSE, секреторных белков HE-4. Данные маркеры в той или иной степени соответствуют перечисленным выше требованиям, широко используются для выявления пяти самых встречаемых в России видов злокачественных заболеваний, перечисленных в Национальной онкологической программе как приоритетные с точки зрения диагностики.
Мукогликопротеин CA 125 - основной опухолевый маркер карцином яичника с чувствительностью 87%, отвечает требованию по зависимости концентрации от стадии и гистологического типа опухоли [CA125 and HE4: Measurement Tools for Ovarian Cancer//Gynecol Obstet Invest 2016;81:430-435], информативен в качестве дополнительного маркера при диагностике карцином другой локализации (бронхов, ЖКТ, молочной железы, эндометрия, перикарда).
Повышение уровня HE-4, эпидидимального секреторного белка, может указывать на развитие некоторых злокачественных опухолей (мезотелиомы, рака легкого, почек, молочной железы, эндометрия, злокачественных образований желудочно-кишечного тракта). Наибольшее значение HE-4 имеет в диагностике, оценке прогноза и контроле лечения опухолей яичника и эндометрия, а также для диагностики рецидива рака яичника. Известно, что уровень маркера достоверно повышается за несколько месяцев до возникновения клинических признаков рецидива. Маркеры СА-125 и HE-4, совместно входят в один из самых широко апробированных алгоритмов для определения уровня риска рака яичников ROMA, рассчитываемый в зависимости от менопаузального статуса женщины (первичная дифференциальная диагностика доброкачественных и злокачественных новообразований яичника). По комбинации CA-125 и HE-4 возможно выявление рака яичника с чувствительностью 92,3-100 % и специфичностью 74,5-76,0 %.
РЭА (Раковый эмбриональный антиген) в норме в малых количествах вырабатывается в тканях некоторых внутренних органов. Данный маркер не является абсолютно тканепецифичным. Повышение его уровня может указывать на онкопролиферативные заболевания разных отделов ЖКТ, молочной железы, легких, простаты, яичников, метастазах рака различного происхождения в печень и кости (реже). Тест на РЭА используется для контроля онкозаболеваний ЖКТ, для оценки результатов оперативного лечения, мониторингом рецидивов на ранних сроках.
CA 125 в сочетании с РЭА и CA 19-9 (опухоль-ассоциированный гликопротеин) предложен в качестве способа дифференциальной диагностики заболеваний женской репродуктивной сферы. Метод основан на анализе «треугольников онкогенности», построенных в системе декартовых координат [Значение анализа онкомаркеров в диагностике опухолей гениталий // Дисс. канд. мед. наук Андреева Е.Н. 1992, М].
CA 19-9 - высокомолекулярный гликопротеин, в небольших количествах вырабатывающийся в эпителиальных клетках органов пищеварительного тракта, является информативным маркером злокачественных новообразований ЖКТ. Обладая чувствительностью в 82%, он является тестом выбора при диагностике карциномы поджелудочной железы. Другой опухоль-ассоциированный гликопротеин CA 72-4 представляет собой высокомолекулярный гликопротеин типа муцина, вырабатывается эпителиальными клетками желудочно-кишечного тракта плода, после рождения его концентрация в крови очень низкая или полностью отсутствует. СА 72-4 также с успехом применяется в диагностике новообразований ЖКТ, но имеет преимущество по сравнению с CA 19-9: он обладает высокой специфичностью (более 95%) и редко выявляется при воспалительных и доброкачественных заболеваниях. Также, в сочетании с CA 125 этот индикатор используется при диагностике рака яичников [Современные представления о серологических опухолеассоциированных маркерах и их месте в онкологии // Успехи молекулярной онкологии - 1-2014]. Высокая концентрация маркера указывает на наличие метастаз. В связи с этим оба маркера могут удачно дополнять друг друга в программе скрининга онкозаболеваний ЖКТ.
Одним из наиболее точных и специфичных лабораторных онкомаркеров является ПСА (простат-специфический антиген). При критическом уровне 10 нг/мл его специфичность по отношению к доброкачественным заболеваниям предстательной железы составляет 90%. Он широко используется в диагностике заболеваний простаты у мужчин. В настоящее время благодаря ранней диагностике, выполняемой в ходе скрининговых мероприятий, от 70 до 80% случаев рака предстательной железы (РПЖ) выявляется на ранней стадии заболевания, что позволяет проводить более эффективное хирургическое или радиационное лечение [Evidence-based medical perspectives: the evolving role of PSA for early detection, monitoring of treatment response, and as a surrogate end point of efficacy for interventions in men with different clinical risk states for the prevention and progression of prostate cancer. Am J Ther, 11: 501, 2004].
CA 242 - высокомолекулярный белок, является раковым антигеном, который вырабатывается эпителиальными клетками протока поджелудочной железы и толстой кишки. У здоровых людей и у пациентов с доброкачественными новообразованиями он не выявляется или присутствует в незначительных количествах, его уровень увеличивается с развитием злокачественных опухолей в желудочно-кишечном тракте. CA 242 используются для выявления рака на ранних стадиях, мониторинга во время терапии и своевременного выявления рецидивов (уровень маркера начинает повышаться за 6 месяцев до выявления рецидива). Уникальной его характеристикой является то, что, в отличие от CA 19-9, уровень маркера в сыворотке не зависит от экспрессии Lewis антигенов, и на его концентрацию в значительно меньшей степени влияет холестаз. В зависимости от изучаемой популяции, чувствительность СА242 для диагностики РПЖ варьирует от 41 до 75% при специфичности 85-95%. При уровне cut-off 20 Ед/мл CA242 обладает более высокой специфичностью (>90%), но несколько меньшей чувствительностью (~70%). При равной специфичности (90%) чувствительность определений СА242 для дифференциальной диагностики РПЖ и ХП выше, чем у СА19-9.
Антиген CA 15-3, применяемый в диагностике рака молочной железы, примечателен с точки зрения зависимости от стадии: его повышенный уровень обнаруживают у 85% пациенток с распространенным опухолевым процессом и только у 20 с I-II стадией РМЖ. При диагностике РМЖ он признан маркером выбора.
CYFRA 21-1 - растворимые фрагменты цитокератина-19, структурного белка эпителиальных тканей. Концентрация Cyfra 21-1 является адекватным показателем степени деградации тканей и клеточного некроза, информативен при плоскоклеточном раке легких, шейки матки. Этот показатель используется для дифференциальной диагностики между доброкачественными и злокачественными новообразованиями легких, мелкоклеточным и немелкоклеточным рака легких.
NSE (Нейрон-специфическая енолаза) является ферментом, присутствует во всех клетках организма и представлен тремя изоформами с тканевой специфичностью. Альфа-альфа и гамма-гамма изоформы фермента являются маркерами нейроэндокринных опухолей, в том числе мелкоклеточного рака легких.
Онкофетальные антигены - это антигены, которые обычно экспрессируются только во внутриутробном периоде, но могут обнаруживаться на неопластических клетках (карциноэмбриональный антиген, альфа-фетопротеин) Повышение уровня ХГЧ у мужчин и небеременных женщин может говорить о наличие опухолей, продуцирующих хорионический гонадотропин. РЭА, АФП, ХГЧ не обладают специфичностью по локализации опухоли, но являются универсальными маркерами злокачественного процесса и используются в качестве дополнительных в диагностике практически всех видов рака кроме меланом и рака лимфоидной системы.
SCC - гликопротеин с высоким молекулярным весом, продуцируется клетками плоского эпителия. Является серологическим маркером плоскоклеточных карцином различных локализаций: шейки матки, вульвы, легких, головы и шеи, пищевода. Особенно важен уровень этого маркера в диагностике плоскоклеточного рака шейки матки, при котором уровень SCC-антигена до начала лечения может быть использован как независимый прогностический фактор на ранних стадиях заболевания. SCC показателен и для пациентов с раком легкого, результаты позволяют с высокой вероятностью (до 92%) обнаружить рецидивы за несколько месяцев до появления симптомов. Уровень маркера повышается при незлокачественных заболеваниях легких и кожи, при печеночной и почечной недостаточности. Уровень SCC увеличивается в 60% случаев РШМ (в начальной стадии заболевания чувствительность составляет только 10%, а в последней стадии - 75-80%).
S-100 - группа внутриклеточных белков, в норме присутствующих в ряде тканей и отвечающих за протекание таких процессов, как рост, размножение, сокращение и дифференциация клеток, синтез РНК, фосфорилирование белковых молекул, формирование иммунной реакции, задействованы в регуляции клеточного цикла. Отдельные виды белка S-100 являются тканеспецифическими (S-100 бета-бета: головной мозг, шванновские и глиальные клетки, меланоциты; S-100 альфа-бета - глиальные клетки и меланоциты; S-100 альфа-альфа - сердечная и скелетная мышечная ткань). Различные виды белка S-100 являются маркерами онкологических патологий, в том числе является маркером злокачественной меланомы (повышение ОМ наблюдается у 74% пациентов). Повышение уровня S-100 в сыворотке коррелирует со стадией заболевания, количеством пораженных органов, наличием метастазов в печени и костях, ответом на химио- или иммунотерапию и, соответственно, с более коротким периодом общей выживаемости. Определение уровня S-100 позволяет следить за эффективностью лечения и выявлять рецидивы на ранней стадии.
Перечень ОМ, определяемых в тест-системах российского производства, представлен наиболее изученными и диагностически значимыми, но не является достаточным для развернутой диагностики. В связи с этим, наряду с российскими, широкое применение получили тест-системы зарубежного производства. Стоимость исследования на 1 показатель с использованием тест-систем российского производства колеблется в среднем 500-1500 руб. Стоимость исследования на 1 показатель на тест системах зарубежных производителей доходит до 5000 р. В связи с высокой стоимостью лабораторной диагностики на онкомаркеры, профилактические мероприятия остаются малодоступными для пациентов. Анализ содержания девяти наиболее часто назначаемых онкомаркеров (CA 125, CA 19-9, CA 15-3, CA 72-4, Cyfra 21-1, ПСА, РЭА, NSE, HE4) в пяти наиболее крупных лабораторных сетях Санкт-Петербурга составляет в среднем 10.000 руб. [данные по коммерческой стоимости анализов предоставлены сайтами лабораторий helix.ru, invitro.ru, citylab.ru, labstori.ru, gemotest]. Данная стоимость обусловлена необходимостью выполнения полного цикла иммуноферментного анализа для каждого маркера, затратами реагента и времени персонала лаборатории. При использовании мультиплексного подхода, позволяющего произвести многопараметрический анализ содержания маркеров, достигается значительная экономия ресурсов, что положительным образом отражается на себестоимости комплексного исследования и конечной цене для потребителя.
На сегодняшний день на российском рынке лидирующую роль в клинической лабораторной диагностике занимают тест-системы, в основе которых лежит метод иммуноферментного анализа в различных модификациях. Большинство из них направлено на выявление только одного аналита. Иммуноферментные методы предполагают качественное и количественное выявление антител к антигенам (в данном случае к ОМ), являются хорошо отработанными, широко распространенными и доступными во многих лабораториях. Так, например, на российском рынке предлагаются тест-системы, основанные на методах твердофазного «сэндвич» ИФА, ИХЛА. Общая методика проведения этих видов анализа выглядит следующим образом. Для выявления аналита в сыворотке используются антитела, иммобилизованные на твердой фазе (полистироловой сфере, дне полистироловой пробирки, поверхности лунок планшета) и специфически связывающиеся с антигеном в образце. Второй тип антител конъюгирован с ферментом, флуоресцентной меткой или люминофором. Оба антитела связывают антигены в образце и при наличии аналита в сыворотке образуют иммунные комплексы антитело-антиген-антитело с меткой. Оценка наличия и количества иммунных комплексов производится при помощи спектрофотометра по оптической плотности образца.
Наиболее широкое применение получили тест-системы следующих российских производителей: Вектор-Бест (ХГЧ-ИФА-БЕСТ, РЭА-ИФА-БЕСТ, АФП-ИФА-БЕСТ, ПСА общий-ИФА-БЕСТ, ПСА свободный-ИФА-БЕСТ, СА-125-ИФА-БЕСТ, ТБГ-ИФА-БЕСТ, СА 19-9-ИФА-БЕСТ, СА 15-3-ИФА-БЕСТ, СА 72-4-ИФА-БЕСТ, NSE-ИФА-БЕСТ, HE4-ИФА-БЕСТ); Алкор Био (ОнкоИФА-РЭА, ОнкоИФА-СА 19-9, ОнкоИФА-СА 15-3, ОнкоИФА-СА 125, ОнкоИФА-общий ПСА, ОнкоИФА-свободный ПСА); Хема-Медика (ХГЧ ИФА, Общий ПСА ИФА, СА125 ИФА, CA199 ИФА, CA199 ИФА, CA15-3 ИФА (MUC1), Свободный ПСА ИФА). Наряду с тест-системами российского производства, используются тест-системы зарубежных поставщиков. Наиболее широкое применение получили тест-системы FujireBio Diagnostics - CanAg, Швеция (Опухолевый маркер Cyfra 21-1 (цитокератин 19) , Белок S-100 общий (αβ+ββ), Антиген плоскоклеточной карциномы (SCC), Нейрон-специфическая енолаза (НСЕ), Опухолевый маркер СА 242); IBL (Маркер рака мочевого пузыря UBC II); Bender MedSystems (Маркер меланомы sCD44std); ORGenTec Diagnostika (Бета-2-микроглобулин); BCM Diagnostics (Метаболический онкомаркер Tu M2-пируваткиназа, Маркер рака поджелудочной железы PHHF); Bio Vendor (Свободные каппа и лямбда цепи); CalproLab (кальпротектин) и другие.
Крупные российские лаборатории отдают предпочтения методикам, выполняемым на анализаторах. Используется электрохемилюминесцентный иммуноанализ, иммунохемилюминесцентный анализ. В основе иммунохемилюминесцентного (ИХЛА) метода лежит иммунная реакция антигена с антителом. В данном случае так же происходит определение только одного аналита за реакцию. Преимуществами метода считаются: высокая точность метода; скорость выполнения анализа (порядка 30 минут); использование не ферментативных компонентов реагентов гарантирует стабильность агентов. Безусловным лидером на российском рынке анализаторов является Cobas, Roche Diagnostics, Швейцария.
Поскольку большинство иммуноферментных методов предполагает выявление только одного маркера в одном клиническом образце, в настоящее время большие надежды в области ранней диагностики онкологии связывают с использованием мультиплексных систем. Такие системы разработаны ведущими иностранными производителями аналитического оборудования и могут использоваться для диагностики различных видов рака [Development of a Multiplexed Tumor-Associated Autoantibody-Based Blood Test for the Detection of Non-Small Cell Lung Cancer- DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-3192 Published July 2010; Multiplexed Immunobead-Based Cytokine Profiling for Early Detection of Ovarian Cancer - DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-04-0404 Published April 2005]. Данные системы позволяют получать данные, которые коррелируют с результатами, полученными при измерении каждого индивидуального маркера в соответствующей иммуноферментной системе, при этом значительно повышается производительность, снижаются времязатраты и требуемое количество анализируемого субстрата. В настоящее время выпускаются ИФА тест-системы планарного и суспензионного типа.
Технология Luminex xMap относится к суспензионному типу или «жидкому биочипу» и предполагает использование микросфер (гранул из полистирола диаметром 5,6 мкм) в качестве твердой фазы для иммобилизации моноклональных антител. Образец (сыворотку крови) вносят в ячейку 96-луночного планшета, в которой происходит сэндвич иммуно-анализ с использованием микросфер в качестве твердой фазы. Внутри каждой микросферы содержится смесь флуоресцентных красителей в определенных соотношениях, формирующих индивидуальный узнаваемый флуоресцентный код. На микросферах ковалентно иммобилизуют антитела, которые специфически связывают аналит-онкомаркер. Затем к реакционной смеси добавляют биотинилированные вторичные антитела, также специфически взаимодействующие с компонентой аналита. После этого добавляют конъюгат стрептавидина с фикоэритрином, что позволяет регистрировать сигнал флуоресценции фикоэритрина на тех микросферах, на которых произошло образование имунного комплекса антитело-онкомаркер-биотинилированное антитело. Детекция сигнала осуществляется на специальном лазерном проточном анализаторе. Платформа Luminex в настоящее время теоретически позволяют проводить количественное определение до 100 различных аналитов за один анализ [Vignali D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays // J. Immunol. Methods. - 2000. - Vol. 243, N 1-2. - P. 243-255], по числу возможных вариантов кодирования типов микросфер для их идентификации анализатором. Примером продукта на основе технологии суспензионного биочипа является технология «WideScreen Human Cancer Panel 1» (Novagen, США) - диагностическая тест-система суспензионного типа, предполагает использование микросфер и анализирует одновременно 6 типов опухолевых маркеров (АФП, СА 125, СА 15-3, СА 19-9, РЭА, пролактин). Антитела, специфически связывающие искомые компоненты аналита, иммобилизованы на микросферах, содержащих смесь флуоресцентных красителей в определенных соотношениях. Микросферы смешиваются с биологическим образцом и инкубируются. В процессе инкубации опухолевые маркеры связываются с антителами на поверхности микросфер. Образовавшиеся комплексы антитело-антиген выявляют добавлением к реакционной смеси биотинилированных детектирующих антитела и конъюгата стрептавидина с фикоэритрином. Регистрирацию специфического сигнала на лазерном проточном анализаторе флуоресцентных сигналов «BioPlex System».
Существуют модификации метода, например, иммунофлуоресцентный метод мультиплексного определения на магнитных сферах [SIBERIAN JOURNAL OF ONCOLOGY. 2021; 20(2): 61-67, MULTIPLEX DETECTION OF TUMOR MARKERS FOR DIFFERENT STAGES OF COLORECTAL CANCER]. С помощью панели «Human Circulation Biomarker» серии Milliplex Map (Millipor) возможно определение следующих аналитов: CA125, CA15-3, CA19-9, CEA, CYFRA21-1, sFAS/TNFRSF6, sFasL, HE4, остеопонтин, VEGF-A.
В планарной модификации многопараметрической тест-системы вместо микросфер применяются биочипы. Биочипы - это массивы индивидуальных микроэлементов, зон, нанесенных на твердую подложку и содержащих различные зонды - ДНК, РНК, олигонуклеотиды, сахара, полипептиды, белки, клетки и ткани, и т.д. Биочипы позволяют проводить одновременный параллельный анализ образца по многим аналитам, что значительно увеличивает эффективность анализа, позволяет миниатюризировать проведение исследований и значительно снижает требуемое количество исследуемого материала.
Биочипы для выявления опухолевых маркеров представляют собой матрицу или массив зон на планарной подложке, в которых иммобилизованы моноклональные антитела, специфичные к опухолевым маркерам. Идентификация наличия антигенов в биологическом образце выполняется по методике сэндвич-варианта ИФА с флуоресцентной или хемилюминесцентной детекцией. На микрочип наносится раствор биологического образца, а образующиеся комплексы антитело-антиген выявляются при помощи детектирующих антител, меченых энзиматической, флуоресцентной или хемилюминесцентной меткой. Считывание результата для варианта с флуоресцентной меткой производится с помощью оптического анализатора, снабженного комплексом источника возбуждения флуоресценции, светофильтрами и регистратором флуоресценции на узкой длине волны. Для хемилюминесцентной идентификации используются оптические детекторы со светочувствительными CMOS матрицами.
Известны работы с использованием технологии Proseek® [A multiplex platform for the identifcation of ovarian cancer biomarkers Boylan et al. Clin Proteom (2017) 14:34 DOI 10.1186/s12014-017-9169-6]. В основе которой используется мультиплексный подход для идентификации белковых биомаркеров для выявления рака яичников на ранней стадии. Технология Proseek позволяет одновременно измерять экспрессию 92 белков в сыворотке крови. Анализ проводится на 96-луночном планшете и использованием антител меченных специальными репортерными олигонуклеотидами. Идентификация образования специфических иммунных комплексов осуществляется методом количественной ПЦР в реальном времени. Эта комбинация обнаружения антител с последующей количественной оценкой ПЦР позволяет проводить специфический и чувствительный анализ 9216 белков в одной 96-луночной плате (измеряется 96 белков/лунок; 92 белка-биомаркера и 4 внутренних контроля). Считается, что данная технология сочетает в себе чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфичностью методов обнаружения на основе антител, позволяя выявлять мультиплексные биомаркеры и проводить количественную оценку с высокой пропускной способностью с точностью анализа, аналогичной другим методам мультиплексного обнаружения.
Компанией Tripath Imaging, Inc. (США) предложен способ скрининга для выявления пациентов группы риска с повышенной предрасположенностью к раку яичников, основанный на детекции повышенной экспрессии ряда биомаркеров (например, НЕ4, СА125, гликоделин, ММР7, Muc1, PAII, CTHRC1, ингибин A, PLAUR, пролактин, KLKIO, KLK6, SLPI5 и α1-антитрипсин). При этом используются принцип специфического связывания антиген-антитело (метод иммуноанализа на микропланшетах) - для выявления самих белков в сыворотке крови, или ДНК/РНК-гибридизационная техника (микрочипы фирмы Affymetrix) - для выявления нуклеотидных последовательностей, кодирующих экспрессируемые белки. Предлагается двустадийная схема: сначала выявляются пациентки с заведомо положительным содержанием аналитов (отсечение по показателю уровня среза), а затем проводится количественный анализ и статистическая обработка данных (Methods for identifying patients with an increased likelihood of having ovarian cancer and compositions therefore. Патентная заявка WO/2007/090076). Zhang X. с сотр. показали, что в формате микрочипа возможно одновременное иммуноаналитическое определение нескольких онкомаркеров (АФП, Р-ХГЧ и РЭА) и общего IgG человека в плазме с ICP-MS-масс-спектрометрической детекцией с применением лазерной техники с использованием антител, меченных солями редкоземельных металлов (Sm3+, Eu3+) и коллоидным золотом. Song S.-P. и сотр. (Song S.-P., Li В., Hu J., Li M.-Q. I Simultaneous multianalysis for tumor markers by antibody fragments microarray system // Analytica Chimica Acta. 2004. 510: 147-152) разработали микрочип для одновременного определения шести маркеров онкологических заболеваний. На силиалированные слайды, содержащие альдегидные группы, были нанесены шесть Fab-фрагментов антител против маркеров АФП, РЭА, Р-ХГЧ, СА125, СА19-9 и СА15-3. Использован «сэндвич» -иммуноанализ с применением авидин-биотиновой системы для усиления флуоресцентного сигнала. Sun и др. (Sun Z, Fu X, Zhang L, Yang X, Liu F, Hu G. I A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. // Anticancer Res. 2004 Mar-Apr; 24(2C):1159-65) разработали микрочип для одновременного иммунологического определения 12 онкомаркеров (С12-биочип). Чип предназначен для скринингового обследования онкологических больных и групп популяций с высоким риском злокачественных заболеваний. На нитроцеллюлозной мембране были иммобилизованы двенадцать мноклональных антител против маркеров СА125, СА15-3, СА19-9, СА242, РЭА, АФП, ПСАобщ, ПСАсвоб, ХГЧ, β-ХГЧ, НСЕ и ферритина. Вышеперечисленные тест-системы используют «двумерные» чипы, где антитела иммобилизованы на поверхности твердофазного носителя.
В патенте РФ №2363955 (Биологический микрочип для множественного параллельного иммунологического анализа соединений и способы иммуноанализа, в которых он используется, ИМБ РАН им. В.А. Энгельгардта, РФ) описано создание и применение гидрогелевого микрочипа для различных типов множественного параллельного иммуноанализа (прямого, конкурентного, сэндвич-анализа). На основании описанного в патенте РФ №2363955 решения была создана отечественная система «ОМ-биочип» (ООО «Биочип»), основана на технологии планарных гидрогелевых чипов и также позволяет определить содержание 6 типов онкомаркеров (АФП, РЭА, ПСА общий и ПСА свободный, ХГЧ, NSE). Антитела к опухолевым маркерам сорбированы на матрицу из гелевых элементов. Далее в лунки планшета с гелевыми элементами наносится раствор сыворотки со смесью вторичных антител, меченных флуоресцентной меткой. Считывание сигнала производится с помощью портативного лазерного анализатора биочипов «Чипдетектор-1» (ИБН РАН, Россия).
Это изобретение и реализованный на его основе продукт является ближайшим аналогом предлагаемого авторами способа идентификации онкомаркеров и принят за прототип изобретения.
К недостаткам описанного выше изделия можно отнести флуоресценцию как способ визуализации иммунных комплексов в связи с нестабильностью и относительной дороговизной соединений, используемых в качестве флуоресцентной метки. Необходимость полимеризации гелевых элементов в токе азота при УФ облучении усложняет производство биочипов, поскольку создает необходимость подготовки химически активной смеси антител и полимеризующихся компонентов гелевого матрикса, последнее требует дополнительных производственных операций, усложнения технологического процесса и дополнительных материальных затрат. Инкорпорирование антител в полимерный гелевый матрикс может приводить к стерическим и кинетическим ограничениям при взаимодействии антитела и аналита. Измерительная система результатов анализа ближайшего аналога подразумевает наличие детекции флуоресцентного сигнала и влечет за собой наличие сложной оптической системы фильтрации света результирующей флуоресценции от источника возбуждающего излучения, что усложняет и удорожает систему ридера-анализатора для конечного потребителя. К недостаткам ближайшего аналога можно так же отнести длительную процедуру инкубации биочипа с образцом (более 20 часов), что в 10-20 раз дольше стандартного времени инкубации для большинства массовых скрининговых серологических тестов. Еще одним недостатком является использование контактной пиновой технологии нанесения диагностических антител на биочип, а именно такая технология не предоставляет возможности точного контроля объема нанесенного образца и является дорогостоящей и крайне низкопроизводительной, что неприемлемо для массового производства. Кроме того, ближайший аналог использует для размещения биочипа планарный стекляный слайд (подложку), что создает сложности использования изделия, а именно, отсутствие возможности автоматизировать анализ на привычном для отрасли оборудовании для иммуноферментного анализа, открытых роботизированных системах, позволяющих проводить много анализов в автоматическом режиме.
Вместе с тем, как уже было упомянуто выше, выполнение анализов на наличие маркеров, связанных с онкологическими заболеваниями, должен стать доступным и производительным массовым тестом. Поэтому насущным требованием времени является сокращение времени на проведение анализов и снижение их сложности, стоимости, а также стоимости необходимого оборудования, повышение возможности автоматизации и интеграции в существующие современные роботизированные платформы анализаторов и манипуляторов.
Изобретение решает задачу создания такого способа проведения комплексной серологической диагностики и выявления в биологических образцах сыворотки или плазмы человека маркеров, ассоциированных с онкологическими заболеваниями, который позволял бы многократно сократить время и трудозатраты на проведение комплексной серологическое диагностики онкологических заболеваний, был бы простым в исполнении, требовал минимальное количество дополнительного специального оборудования и был привычным для конечных пользователей по своему формату и форм-фактору.
Поставленная задача решается следующим образом. Предлагается способ комплексной идентификации белковых аналитов, ассоциированных с онкологическими заболеваниями человека (далее онкомаркеров) в биологическом образце. Анализ проводится на стандартных 96-луночных микропланшетах, в которых лунки сгруппированы в 12 рядов по 8 лунок объемом от 0,2 до 0,4 мл. На дно каждой лунки планшета производится сорбция иммуноглобулинов (антител), способных специфически связывать онкомаркеры из образца крови пациента. Антитела иммобилизуют методом бесконтактной прецизионной биопечати с использованием пьезо-дозаторов. Иммуноглобулины сорбируются раздельно по типу выявляемых антигенов в виде реакционных зон (спотов), каждая из которых будет способна связывать только один специфичный онкомаркер. Методика постановки включает в себя следующие этапы: этап 1, в рамках которого происходит внесение образца крови пациента в лунку планшета с иммуносорбеном с последующей инкубацией; этап 2, в рамках которого рабочую поверхность иммуносорбента вводят в контакт с исследуемым образом сыворотки или плазмы крови и инкубируют. В случае если в крови пациента присутствуют маркер/маркеры на данном этапе анализа будет происходить специфическое связывание антиген-антитело; этап 3, в рамках которого осуществляется обработка рабочей поверхности иммуносорбента раствором смеси конъюгатов антител, специфичных к исследуемым онкологическим биомаркерам, содержащих соответствующие биологические метки. В ходе данного этапа происходит образование иммунных комплексов антитело (на реакционной зоне чипа) - онкомаркер (из биологического образца) - иммуноглобулин, конъюгированный с биологической меткой; этап 4, в рамках которого осуществляется детекция образовавшихся имунных комплексов. Иммунные комплексы, благодаря присутствию в их составе биологической метки, выявляют путем денситометрического или люминесцентного измерения пероксидазной активности. Данное определение проводится в каждой отдельной реакционной зоне (споте) иммуносорбента.
Варианты комбинаций иммуноглобулинов на иммуносорбенте не ограничены, однако в комплекс обязательно должны входить компоненты, обеспечивающие выявление как минимум трех онкомаркеров из ряда AFP, PSA, HE4, CA125, CA72-4, CA19-9, CA 15-3, S100, CEA, NSE, Cyfra 21-1, HCG-, SCC. Введение в композицию иммуносорбента или конъюгатов иммуноглобулинов, дополняющих спектр определяемых онкомаркеров, а также изменения в процедуре анализа не изменяют суть настоящего изобретения.
Предлагаемое изобретение используется для скрининга содержания онкомаркеров в сыворотке крови. Новизна изобретения заключается в сочетании многопараметрического принципа выявления аналитов с усовершенствованной системой нанесения антител на иммуносорбент, форм-фактора иммуносрбента, совместимого со стандартным оборудованием процессинга производства и выполнения анализа, а также системой детекции иммунных комплексов антиген-антитело на основе преципитирующего тетраметилбензидина или изолюминола в качестве субстрата. Состав панели онкомаркеров разработан с учетом наиболее востребованных в клинической практике маркеров, используемых для диагностики самых встречаемых на территории РФ видов онкологии. Одновременное выявление содержания нескольких аналитов позволяет существенно сократить время на выполнение анализа, сократить необходимое количество образца, снизить загрузку оборудования и персонала лаборатории, стоимость проведения анализа.
Применение бесконтактного высокоточного оборудования для печати биочипов способствует повышению производительности и совместимости технологии с имеющимся у потребителя стандартным оборудованием для анализа и его автоматизации за счет использования стандартного форм-фактора 96-луночного микропланшета для ИФА. При производстве иммуносорбента и нанесении массива реакционных зон производится автоматический контроль качества объема капли и точности позиционирования спота, осуществляемых с помощью установленных на борту оборудования фото/видео камер. По сравнению с производством традиционных планшет ИФА или тестов ИХЛА при нанесении реакционных зон расход антител сокращается не менее чем на 3 порядка при сохранении аналитической чувствительности тест-системы. Сорбция антител на поверхность лунок планшета происходит непосредственно на поверхности иммуносорбента пассивно или ковалентно, без применения гидрогелей или полимеризации в составе сложных матриксов, что сокращает время и не требует дополнительных расходных материалов. Печать осуществляется в стандартный 96-луночный ИФА-планшет, совместимый со стандартными анализаторами открытого типа и другим оборудованием для проведения ИФА, повсеместно установленного в действующих клинико-диагностических лабораториях.
Комплексная система детектирования образующихся иммунных комплексов в рабочих зона иммуносорбента с использованием биотинилированной биологической и полимеризованной пероксидазы, конъюгированной с реакомбинантным стрептавидином позволяет амплифицировать сигнал, увеличивая аналитическую чувствительности системы. Использование денситометрического способа регистрации сигнала с применением красителя на основе тетраметилбензидина позволяет упроситить и удешевить систему субстрат-хромоген за счет применения одного готового к использованию раствора субстрата-хромогена. Тетраметилбензидин является одним из самых эффективных субстратов для выявления активности пероксидаз с высоким показателем чувствительности по сравнению с другими субстратами, например ортофенилдиамином или диаминобензидином, кроме того, тетраметилбензидин является дешевым и простым в применении реагентом по сравнению с флуоресцентными метками. В случае денситометрической регистрации сигнала применение тетраметилбензидина обеспечивает простоту анализа и не требует сложной системы светофильтров и электронных компонентов у измерительного оборудования, как в случае с флуоресцеными метками. Для остановки реакции преципитации окрашенного продукта окисления тетраметилбензидиндиимина не требуется дополнительные реагенты, результат окрашивания спотов устойчив к выцветанию, что позволяет визуализировать его в удобное время или архивировать иммуносорбенты для повторных измерений в случае необходимости. В случае хемилюминесцентной регистрации сигнала система позволяет обеспечить высокое соотношение сигнал/шум в системе детекции по сравнению с флуоресценцией за счет отсутствия необходимости в источнике возбуждающего излучения и системы светофильтров. Хемилюминесцентый метод определения активности пероксидазы в реакционных зонах иммуносорбента позволяет расширить динамический диапазон обнаружения онкомаркеров для количественного типа анализа. Хемилюминесцентная система детекции на основе люминола и денситометрическая система детекции на основе тетраметилбензидина предполагает идентичную архитектуру анализа и его компонентов, одни и те же метки на основе пероксидазы, что обеспечивает возможность совместимости технологии с денситометрическими или хемилюминесцентными анализаторами. При обработке результатов анализа используется средняя величина интенсивности оптической плотности или люминесценции по каждому пикселю формирующегося на светочувствительной матрице изображения, анализируется форма, положение, размер каждого спота, соответствующим каждому онкомаркеру, что повышает надежность анализа.
Способ осуществляют следующим образом.
Для идентификации онкомаркеров на рабочую поверхность иммуносорбента, в каждую из 96 рабочих лунок, иммобилизуют иммуноглобулины (антитела), способные специфично связываться с соответствующим белковым аналитом-онкомаркером из ряда AFP, PSA, HE4, CA125, CA72-4, CA19-9, CA 15-3, S100, CEA, NSE, Cyfra 21-1, HCG, SCC при этом, термин специфичность означает, что каждое антитело способно связывать только соответствующий ему онкомаркер. Целесообразно использовать моноклональные иммуноглобулины (МКАТ), полученные методами гибридобных технологий и/или технологии рекомбинантных антител различной видовой принадлежности, например мышиные или человеческие МКАТ.
Для иммобилизации иммуноглобулинов предпочтительно использование очищенных моноклональных антител, полученных по гибридомной или рекомбинантной технологии различной видоспецифичности и классов иммуноглобулинов.
Каждый иммуноглобулин, способный специфично связываться с соответствующим онкомаркером иммобилизуется в изолированных реакционных зонах иммуносорбента, формируя так называемые споты внутри лунок планшета. Массив спотов на иммуносорбенте принято называть термином иммуночип или биочип или микрочип.
Иммобилизация антител на реакционные зоны осуществляется путем введения в контакт иммуносорбента с растворами, содержащими антитела, способом бесконтактной прецизионной биопечати, в количестве от 200 до 500 пиколитров на каждую зону (спот), предпочтительно 350 пиколитров на зону.
Целесообразно осуществлять контроль дозы сорбционного раствора, содержащего иммуноглобулин, с аппаратным контролем дозы с коэффициентом вариации дозы не более 1%, предпочтительно не более 0,25%. Иммобилизация иммуноглобулинов осуществляется путем сорбции иммуноглобулинов из раствора на поверхность полимерного иммуносорбента пассивно, т.е. через ионно-гидрофобные взаимодействия иммуноглобулина и поверхности иммуносорбента или через образование ковалентных связей между функциональными группами иммуноглобулинов и поверхности твердой фазы, такими как амино-, карбокси-, сульфгидрил- и/или альдегдными группами. Так же для ковалентной иммобилизации могут быть применены дополнительные гомо- и бифункциональные кросслинкеры, которые опосредуют химическую связь иммуноглобулина и поверхности иммуносорбента. Для иммобилизации иммуноглобулинов при их бесконтактном нанесении на иммуносорбент целесообразно использовать их раствор с концентрацией от 0,5 до 50 микрограмм в миллилитре.
Для иммобилизации иммуноглобулинов в качестве иммуносорбента целесообразно использовать полистирол, обработанный ионизирующим излучением для увеличения сорбционной емкости поверхности.
Для исключения преждевременного высыхания раствора при иммобилизации иммуноглобулинов целесообразно добавлять в раствор, содержащий иммуноглобулины, от 5% до 20% глицерина или аналогичные по свойствам гигроскопичные многоатомные спирты и их комбинации с моно- ди- и полисахаридами.
Целесообразно осуществлять иммобилизацию каждого иммуноглобулина по меньшей мере в 3 спотах, таким образом, что на иммуносорбенте имеется не менее 3 спотов, способных специфически связывать единственный соответствующий аналит онкомаркер.
Расположение между центрами соседних спотов на иммуносорбенте целесообразно выбирать из диапазона от 100 микрон до 300 микрон.
Для иммобилизации иммунглобулинов на иммуносорбент целесообразно инкубировать иммуносорбент от 20 до 60 минут после завершения бесконтактного нанесения на иммуносорбент раствора, содержащего иммуноглобулины.
Иммобилизацию иммуноглобулинов целесообразно вести в условиях контролируемой влажности в диапазоне от 70% до 90% при температуре от 16 до 30 градусов Цельсия.
Для автоматизации дальнейшего процессинга иммуносорбента и его применения по назначению в анализе, целесообразно выбрать в качестве форм-фактора иммуносорбента стандартный 96 луночный формат прозрачных полистирольных планшет для иммуноферментного анализа в которых реакционные лунки сгруппированы в 12 рядов по 8 лунок объемом от 0,2 до 0,4 мл.
Для идентификации участка иммуносорбента с нанесенными реакционными зонами, определения ориентации спотов и их взаиморасположения на иммуносорбенте, целесообразно создать координатную сетку нанесения массива спотов, привязав ее к узловым маркерам, которые располагаются ассиметрично и позволяют однозначно определить положение и привязку спотов к ячейкам сетки. Для создания узловых маркеров сетки допустимо аналогичным образом иммобилизовать биотинилированные неспецифические белки так, чтобы на завершающей стадии анализа было возможно однозначно определить предписанные положения ячеек спотов относительно координатной сетки массива спотов.
Контроль положения спотов после печати целесообразно осуществлять путем фотофиксации каждой лунки планшета и анализа отклонения фактического положения каждого спота от ожидаемого расчетного положения.
Целесообразно блокировать свободные от нанесенных иммуноглобулинов участки иммуносорбента путем промывки иммуносорбента растворами, содержащими неионные детергенты в концнтрации от 0,05% до 5% и растворами неспецифических белков в концентрации от 0,1% до 5%. В качестве неспецифических белков для блокировки иммуносорбента могут быть использованы по крайней мере белки из ряда: казеин, желатин, альбумин в различных сочетаниях формах происхождения.
Для стабилизации иммуносорбента после нанесения иммуноглобулинов, в раствор для блокировки, помимо неспецифических белков, целесообразно добавлять моно- ди- или полисахариды, по меньшей мере из ряда маннит, глюкоза, фруктоза, сахароза, полисахароза, сорбит, трегаллоза или декстран.
Для стабилизации иммуносорбента после нанесения иммуноглобулинов, в раствор для блокировки целесообразно добавлять инертные полимеры, способные улучшать стабильность иммуносорбента за счет образования защитной пленки, например поливинипироллидон и/или модифицированную целлюлозу и/или кополимеров малеиновых ангдиридов или аналогичные по способности стабилизировать иммуносорбент полимерные добавки с целью пролонгации его хранения.
Для инкубации с иммуносорбентом, сыворотку или плазму крови целесообразно разбавлять водным буферным раствором с коэффициентом разбавления от 1 до 100.
Для разбавления исследуемого образца и/или раствора конъюгатов иммуноглобулинов целесообразно использовать водные буферные растворы, содержащие неспецифические белки из ряда казеин, сывороточный альбумин, неспецифические мышиные иммуноглобулины, сыворотку крови животного происхождения в количествах от 0,1 до 20%. Целесообразно разделить процедуру анализа на этапы от 2 до 4 стадий инкубации с промежуточными промывками твёрдой фазы от не связавшихся компонентов исследуемого образца и конъюгатов. Исследуемый образец плазмы или сыворотки целесообразно инкубировать в контакте с рабочими зонами иммуносорбента от 30 до 120 минут. После инкубации иммуносорбента с исследуемым образцом, его вводят в контакт со смесью конъюгатов и инкубируют от 10 до 30 минут. При инкубации исследуемых образцов и/или растворы конъюгатов, иммуносорбент целесообразно активно перемешивать с использованием стандартных лабораторных термошейкеров с частотой в диапазоне от 5 до 20 герц и термостатировать в диапазоне температур 18-44°C.
Для выявления связавшихся с поверхностью иммуносорбента в соответствующих спотах иммунных комплексов, преимущественно используют смеси конъюгатов моноклональных иммуноглобулинов (МКАТ) с меткой биотина и/или с ферментативной меткой ферментом пероксидазой хрена, при этом названные иммуноглобулины так же способны специфически связывать белковые аналиты онкомаркеры из ряда: AFP, PSA, HE4, CA125, CA72-4, CA19-9, CA 15-3, S100, CEA, NSE, Cyfra 21-1, HCG-, SCC.
Во время инкубации иммуносорбента, образца и конъюгатов, в реакционных зонах (спотах) иммуноглобулины образуют иммунные комплексы типа «антитело - онкомаркер - биотинилированное антитело - конъюгат стрептавидина с пероксидазой» и/или «антитело - онкомаркер - конъюгат антитела с пероксидазой».
После инкубации иммуносорбента с исследуемым образцом плазмы или сыворотки крови человека и после инкубации иммуносорбента со смесью конъюгатов иммуносорбент промывают от не связавшихся с рабочими зонами иммуносорбента компонентов с использованием лабораторного автоматического промывателя планшет, предпочтительно осуществляют промывку от 300 до 800 мкл водного буферного раствора, содержащего неионные детергенты, наполняя и аспирируя каждую лунку планшета, процесс повторяют от 3 до 7 раз.
Оценку концентрации любого из названных онкомаркеров в исследуемом образце проводят по наличию и интенсивности ферментативной активности биологической метки, связанной с твердой фазой иммуносорбента в зонах с нанесенными иммуноглобулинами в составе иммунных комплексов по окончанию всех инкубации и финальной отмывки твердой фазы иммуносорбента.
Для выявления связавшихся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунных комплексов, содержащих в своем составе метку биотина, используют конъюгат белка авидина или стрептавидина или их модификаций с ферментом пероксидаза хрена, в частности, для амплификации специфического сигнала предпочтительно применять конъюгат полимеризованной пероксидазы с рекомбинантным стрептавидином, в котором на каждое взаимодействие биотин-стрептавидин приходится мультиплицированное количество коньюгированного фермента пероксидазы.
Связавшиеся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунные комплексы, содержащие пероксидазу, выявляют по изменению оптической плотности или люминесценции в реакционных зонах иммуносорбента (спотах) с иммобилизованными иммуноглобулинами на поверхности иммуносорбента.
Для измерения оптической плотности или люминесценции, на завершающем этапе анализа, в лунки иммуносорбента вносят раствор субстрата для пероксидазы, а именно перекись водорода, при этом пероксидаза активно разрушает перекись водорода, продукты этой реакции приводят к вторичным химическим реакциям вблизи зоны активности пероксидазы, а именно к изменению цвета специального красителя, либо к появлению хемилюминесценции, вызванной окислением хемилюминесцентного субстрата.
Для измерения оптической плотности зон (спотов) иммуносорбента применяют раствор хромогена на основе водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, способный в присутствии фермента пероксидазы, перекиси водорода и полианионных полимеров, формировать окрашенный преципитат в зонах иммуносорбента с образовавшимися иммунными комплексами иммуноглобулин-онкомаркер-конъюгат иммуноглобулина. Окрашенный преципитат представляет собой образующийся в процессе реакции окисления комплекс переноса заряда катион-радикала 3,3',5,5'-тетраметилбензидиндиимина, имеющий синий цвет с максимумом поглощения на длине волны 650 нм, с отрицательно заряженным полианионным полимером. Реакция осуществляется при рН среды предпочтительно от 4 до 6. Измерение интенсивности окрашивания реакционных зон (спотов) иммуносорбента производится автоматическим планшетным анализатором, путем измерения интенсивности поглощения света в оптическом диапазоне при прохождении через или при отражении от зон с нанесенными иммуноглобулинами. Если хромоген приобрел цвет в результате активности пероксидазной биологической метки в составе иммунных комплексов, то свет при прохождении через лунку или при отражении от дна лунки - поглощается хромогеном в зоне спота, а если хромоген не изменился в результате реакции и остался бесцветным, то луч не поглощается в зоне спотов. Планшетный денситометр сравнивает интенсивность поглощения или отражения света в зонах спота по сравнению с окружающим споты пространством иммуносорбента. Относительная интенсивность поглощения света в реакционных зонах (спотах) может быть проинтерпретирована для оценки концентрации онкомаркеров в исследуемом образце.
Для измерения люминесцентной активности зон иммуносорбента применяются субстратные смеси, содержащие люминол или его производные и перекись водорода, при этом разрушение перекиси водорода в результате ферментативной активности пероксидазы в зоне спота иммуносорбента приводит к окислению люминола, сопровождающегося образованием возбужденного состояния и испусканием кванта света в оптическом диапазоне на длине волны 428 нм. Измерение интенсивности хемилюминесценции производится приборами - люминометрами, способными регистрировать интенсивность слабого излучения света в лунках планшета. В основе работы люминометра лежит фотоэлектронные умножители на основе, например, полупроводниковых фотодиодов или CCD-матриц. Прибор измеряет интенсивность излучения идущего из лунок планшета в результате реакций в реакционных зонах (спотах), катализируемых ферментом на поверхности иммуносорбента, и сравнивает данные с излучением окружающего споты пространства иммуносорбента, а так же делает поправку на темновой счет фотонов ССD матрицы. Относительная интенсивность излучения в реакционных зонах (спотах) может быть проинтерпретирована для оценки концентрации онкомаркеров в исследуемом образце.
Кроме анализа оптической плотности и хемилюминесценции целесообразно установить граничные значения на форму контуров, размер и взаимоположение спотов таким образом, чтобы не попадающие под критерии споты были отклонены и не учитывались в анализе. Допустимы следующие граничные условия: 1) эксцентриситет окружности контуров спотов не более 0,3; 2) диапазон диаметра контура окружности от 70 до 300 микрон; 3) размещение не менее 80% площади каждого спота внутри предписанной ячейки относительно координационной сетки массива спотов; 4) расстояние между центрами любых соседних спотов не менее 100 микрон;
Все споты, которые не удовлетворяют критериям целесообразно отстранить от анализа. Если в каждой серии спотов из трех повторов одного и того же МКАТ наблюдается отклонение от заданных параметров более чем по 1 споту, то такой трипликат целесообразно полностью отклонить от анализа и интерпретации результатов.
Относительная интенсивность оптической плотности твердой фазы в зоне спота или интенсивность люминесценции в зоне спота по сравнению с окружающего споты пространства иммуносорбента напрямую связана с концентрацией специфических аналитов-онкомаркеров в исследуемом образце. Результат исследования может быть интерпретирован как качественный или количественный в зависимости от метода калибровки системы.
Для качественного варианта обработки результатов исследования целесообразно путем статистической обработки данных многочисленных измерений калиброванных по концентрации онкомаркеров в других референтных методах (например, в планшетном моноплексном ИФА или иммуно-хемилюминесцентном анализе (ИХЛА)) образцах сыворотки или плазмы крови определить критический уровень интенсивности оптической плотности или люминесценции, при котором чувствительность определения превышения пороговой концентрации онкомаркера, соответствующей паталогическому уровню содержания онкомаркера у человека, составит как минимум 80% с доверительным интервалом 90%. Верхние пределы нормы для концентрации онкомаркеров у условно здоровых пациентов известны из общедоступных источников. Положительным результатом в описываемом анализе, будет являться превышение верхнего предела нормы концентрации онкомаркера, принятой для условно здорового человека, а отрицательным результатом будет являться отсутствие превышения концентрации онкомаркера согласно установленным нормам концентрации онкомаркера для условно здорового человека. Диагностической чувствительностью тестирования в таком случае будет являться вероятность, выраженная в процентах, что проведенный анализ может правильно дискриминировать образцы с концентрацией онкомаркеров, превышающих принятую для условно здорового пациента норму, от образцов, содержащих онкомаркер с концентрацией в пределах условной нормы. Целесообразно усьановить диагностическую чувствительность не менее 80%, с доверительной вероятностью 90%.
Диагностическая специфичность описываемого анализа с качественной интерпретацией результата исследования определяется на статистически значимой выборке образцов, полученных от заведомо здоровых доноров, как вероятность, выраженная в процентах, что проведенный анализ может правильно дискриминировать образцы с концентрацией онкомаркеров не превышающих принятую для условно здорового пациента норму, выраженная в процентах, с доверительной вероятностью не менее 90%. Целесообразно выбрать диагностическую специфичность анализа не менее 90%, с доверительной вероятностью 90%.
При количественной интерпретации результата анализа биологического материала, используются калибраторы с различными заранее установленными в других референтных методах концентрациями онкомаркеров для построения калибровочной кривой, отражающей зависимость интенсивности оптической плотности или люминесценции от концентрации онкомаркера в биологическом образце. Количественная интерпретация результатов анализа выражается в абсолютных значениях концентрации каждого онкомаркера, в пределах динамического диапазона калибровочной кривой для каждого онкомаркера индивидуально.
Далее осуществление изобретения поясняется на примере со ссылками на фигуры, на которых приведено следующее.
Фиг. 1 - Распределение спотов в лунке микропланшета после бесконтактного нанесения МКАТ на поверхность дна лунок иммунособента (справа); Схематическое изображение координатной сетки ожидаемого расположения реакционных зон с сорбированными МКАТ (слева): 1 - CA19-9, 2 - PCA, 3 - Cyfra21-1, 4 - AFP, 5 - CA125, 6 - HE4, 7-HCG, 8 - S100, 9 - CEA, 10 - CA15-3, 11 - CA72-4, 12 - NSE, 13 - маркер узлов координационной сетки.
Фиг. 2 - Распределение образцов в лунки микропланшета: лунка А1 - отрицательный контрольный образец; лунка В1 - положительный калибратор; лунка С1 - исследуемый образец.
Фиг. 3 - Фотографические изображения дна лунки после завершения процедуры анализа. Лунка с положительным калибратором А2 (слева); лунка с исследуемым образцом С1, содержащим повышенное содержание одновременно СА-125, S100 и CA 72-4 (справа).
Фиг. 4 - Фотографические изображения дна лунки с исследуемым образцом С1 после завершения процедуры анализа и распознавания узлов координатной сетки анализатором денситометром. Указаны распознанные положения трипликатов, соответствующие реакционным зонам с нанесенными МКАТ. Образец содержит повышенное содержание одновременно СА-125, S100 и CA 72-4.
Пример 1
Комплексная серологическая мультиплексная идентификация биологических маркеров, обнаруживаемых в сыворотке крови человека и ассоциированных с наличием одного или нескольких типов онкологических заболеваний человека, путем мультиплексного иммуноферментного иммуноанализа, позволяющего качественно выявить превышение нормальной концентрации группы аналитов-онкомаркеров в сыворотке крови, а именно AFP, CA72-4 CA15-3, CA19-9, CA-125, hCG, NSE, PSA, S100, Cyfra 21-1, CEA, HE4. Искомые аналиты представляют собой человеческие белки: человеческие углеводные антигены 19-9, 125, 72-4, 15-3; Cyfra 21-1 (фрагмент цитокератина 19); ПСА (простат-специфический антиген); AFP (человеческий альфа-фетопротеин); HE-4 (белок эпидидимиса); hCG (хорионический гонадотропин человека); СEA (раково-эмбриональный антиген); S100 (человеческий кальций-связывающий белок); NSE (нейрон-специфическая енолаза). Анализ проводится в несколько стадий.
Стадия 1. Нанесение иммуноглобулинов (антител), способных специфически связывать онкомаркеры на рабочую поверхность иммуносорбента
Моноклональные антитела класса G (далее МКАТ), способные специфически связывать онкомаркеры AFP, CA15-3, CA19-9, CA-125, HCG, NSE, PSA, S100, Cyfra 21-1, CEA, растворяют в 50 мМ карбонатном буфере, содержащим 5% растворе глицерина в деионизованной воде, pH10, при этом, каждый МКАТ растворяется отдельно в концентрации 20 мкг/мл. Полученные растворы МКАТ используют для бесконтактного нанесения в лунки стандартного 96-луночного полистирольного планшета. Для этого, раствор каждого МКАТ последовательно закачивается в количестве 5 мкл в стеклянный капилляр устройства дозатора, сопряженный с управляемым пьезоэлементом, ополаскивается в деионизованной воде, и дозируется в лунки планшета с расстояния 500 микрон от поверхности дна в виде индивидуальных капель объемом 360(20) пиколитров на дно лунок иммуносорбента в заранее обозначенные позиции, удаленные друг от друга на 250 (20) микрон по осям. Генерация капель происходит за счет ударной волны внутри капилляра, генерируемой работой управляемого пьезоэлемента смонтированного снаружи капилляра. Контроль дозы капли осуществляется в начале и в конце цикла печати посредством видеорегистрации пролетающих индивидуальных капель в фокусе видеокамеры устройства регистратора. В результате нанесения растворов МКАТ на дне каждой лунки планшета формируется массив спотов в виде матрицы, сгруппированной в 12 рядов по три спота в каждом, в которой по горизонтали отложены триплеты спотов с МКАТ к одному и тому же аналиту. Размер зоны спота нанесения МКАТ - 100 (10) мкм, общий размер зоны печати в лунке планшета - 3х3 мм. Для идентификации ориентации спотов и их взаиморасположения относительно узлов координатной сетки массива реакционных зон, аналогичным образом наносится раствор биотинилированного казеина в концентрации 1 мкг/мл в 50 мМ карбонатном буфере в деионизованной воде, содержащим 5% глицерин. Контроль положения спотов после печати осуществляется путем фотофиксации каждой лунки планшета и анализа отклонения фактического положения каждого спота от ожидаемого расчетного положения. Фактическое положение центра каждого спота не должно отклоняться от расчетного более чем на 25 микрон. Фактическое расположения спотов, содержащих растворы МКАТ и биотинилированного казеина, на поверхности лунок иммуносорбента представлена в процессе иммобилизации МКАТ на Фиг.1. Планшеты после нанесения спотов инкубируют при температуре 23C (2C) и относительной влажности 80% в течение 30 минут. По завершению инкубации планшеты промывают 3 раза по 400 мкл раствором 0,1% неионного детергента TritonX100 и 0,1% казеина в деионизованной воде и 3 раза по 400 мкл раствором 0,9% NaCl. После завершения промывки лунки планшета смачиваются раствором, содержащим 0,1% поливинилпирролидона, 1% казеина, 30% сахарозы и сушатся при тмпературе +30°С в течение 120 минут. Планшет после сушки упаковывается в фольгированный полимерный пакет с влагопоглотителем на основе силикагеля и вакуумируется.
Стадия 2. Подготовка рабочих растворов
Готовят раствор для разведения исследуемого образца сыворотки или плазмы, для этого в деионизованной воде растворяют гидроксиметиламинометан-трис до 50 мМ, NaCl до 150 мМ, казеинат натрия до 0,5%, неионный детергент TritonX100 до 0,5%, этилендиаминтетраацетат до 5 мМ, консервант Proclin300 до 0,1%, краситель Е-124 до 0,05%, доводят рН до 7,5 концентрированной соляной кислотой.
Готовят раствор для разведения биотинилированного конъюгата, для этого в деионизованной воде растворяют гидроксиметиламинометан-трис до 50 мМ, NaCl до 150 мМ, казеинат натрия до 0,1%, бычий сывороточный альбумин до 0,1%, неионный детергент TritonX100 до 0,1%, неспецифическая мышиная асцитная жидкость до 1%, консервант Proclin300 до 0,1%, краситель Е-102 до 0,025%, доводят рН до 7,5 концентрированной соляной кислотой.
Готовят раствор стабилизатора для лиофилизации концентрата конъюгатов. Для этого в деионизованной воде растворяют гидроксиметиламинометан-трис до 10 мМ, NaCl до 50 мМ, полисахарозу до 5%, казеинат натрия до 0,1%, бычий сывороточный альбумин до 0,1%, доводят рН до 7,4 соляной кислотой.
Готовят раствор концентрата биотинилированного конъюгата, для этого в раствор стабилизатора для лиофилизации вносятся биотинилированные МКАТ, специфичные к аналитам-онкомаркерам AFP, PSA, HE4, CA125, CA72-4, CA19-9, CA 15-3, S100, CEA, NSE, Cyfra 21-1, HCG в концентрации от 25 до 1000 нанограмм в миллилитре каждый. Точная концентрация для каждого конъюгата МКАТ с биотином определяется заранее таким образом, чтобы выполнялось условие валидности анализа с использованем положительного и калибратора, и отрицательного контрольного образца. Раствор перемешивается и лиофилизируется.
Готовят рабочий раствор биотинилированных конъюгатов, для этого, во флакон с лиофилизированным концентратом биотинилированных конъюгатов вносят раствор для разведения биотинилированных конъюгатов в объеме, равным 5-кратному объему концентрата конъюгата до лиофилизаци. Флакон оставляют для гидратации лиофилизата в течение 15 минут, после чего перемешивают содержимое и приводят к комнатной температуре.
Готовят раствор разведения конъюгата стрептавидина с полимеризованной пероксидазой (СПХ), для этого в деионизованной воде растворяют гидроксиметиламинометан-трис до 50 мМ, NaCl до 150 мМ, казеинат натрия до 0,1%, неионный детергент TritonX100 до 0,1%, консервант Proclin300 до 0,1%, краситель бромтимоловый синий до 0,025%, доводят рН до 7,5 концентрированной соляной кислотой.
Готовят раствор концентрата конъюгата СПХ, для этого в раствор стабилизатора для лиофилизации вносят коньюгат полимеризованной пероксидазы со стрептавидином до концентрации 15 мкг/мл. Раствор перемешивается и лиофилизируется.
Готовят рабочий раствор конъюгата СПХ, для этого, во флакон с лиофилизированным СПХ вносят раствор для разведения СПХ в объеме, равном 2-кратному объему дозы концентрата конъюгата во флакон до лиофилизаци. Флакон оставляют для гидратации лиофилизата в течение 15 минут, после чего перемешивают содержимое и приводят к комнатной температуре.
Готовят промывочный раствор, для чего в деионизованной воде растворяют навески однозамещенного и двузамещенного фосфата натрия до 10 мМ, pH 7,4, навеску NaCl до 150 мМ, добавляют детергент Tween20 до 0,05%.
Готовят раствор отрицательного контрольного образца, для этого смешивают заранее отобранные образцы сывороток человека, полученные от здоровых доноров, в которых концентрация аналитов-онкомаркеров не превышает 10% от предельно допустимой для здорового человека. Нормировку концентраций онкомаркеров в сыворотке для приготовления отрицательного контрольного образца осуществляют в референтных коммерческих тест-системах иммуноферментного и иммунохимического анализа. Раствор отрицательного контрольного образца лиофилизируют. Перед использованием раствор восстанавливают добавлением деионизованной воды до первоначального объема.
Готовят раствор положительного калибратора, для этого в сыворотке, отобранной для отрицательного образца растворяют аналиты-онкомаркеры AFP, PSA, HE4, CA125, CA72-4, CA19-9, CA 15-3, S100, CEA, NSE, Cyfra 21-1, HCG до концентрации в диапазоне от 1-кратного до 4-кратного превышения максимально допустимого значения для условно здорового человека, указанных в таблице №1.
Таблица №1
Концентрации аналитов-онкомаркеров в растворе положительного калибратора. Предельно допустимые концентрации онкомаркеров для условно здорового человека
Раствор положительного калибратора лиофилизируют. Перед использованием раствор восстанавливают добавлением деионизованной воды до первоначального объема. Для каждого онкомаркера в составе калибратора вводится понятие внутренней, т.е. установленной разработчиком теста, условной единицы концентрации (У.Е./мл), при этом 100 У.Е./мл эквивалентно предельно допустимой концентрации каждого онкомаркера в сыворотке или плазме условно здорового человека. Калибровка концентраций и привязка к условным единицам для каждого маркера осуществляется на основании данных валидации концентрации онкомаркера в калибраторе в референс-методике, а именно в зарегистрированных как медицинские изделия ин-витро диагностики иммуноферментных тестах или иммунохимических тестах. Данные по концентрациям онкомаркеров, выраженных в независимых и в условных единицах, приведены в таблице №1.
Стадия 3. Введение рабочей поверхности иммуносорбента в контакт с исследуемым образцом сыворотки или плазмы крови.
В лунку планшета иммуносорбента А1, В1, С1 пипетируют по 50 мкл раствора для разведения исследуемого образца планшета иммуносорбента. В лунку А1 пипетируют по 20 мкл отрицательного контрольного образца. В лунку В1 пипетируют 20 мкл положительного калибратора. В лунку С1 планшета иммуносорбента пипетируют по 20 микролитров исследуемого образца сыворотки крови человека. Схематическое изображение планшета и использованных лунок показано на Фиг. 2. Планшет иммуносорбента помещают в термостатируемый при +37°С ротационный шейкер и инкубируют при перемешивании при частоте вращения 600 оборотов в минуту в течение 60 минут. По завершению инкубации планшет помещается в автоматический промыватель, где непрореагировавшие компоненты реакционной смеси удаляются путем полного наполнения лунок промывочным раствором и последующей аспирацией, наполнение и аспирация повторяется 5 раз с 30 секундным замачиванием на каждом цикле.
Стадия 4. Обработка рабочей поверхности иммуносорбента раствором смеси биотиниллированных конъюгатов
В каждую лунку планшета пипетируют по 50 микролитров рабочего раствора биотинилированных конъюгатов. Планшет иммуносорбента помещают в термостатируемый при +37°С ротационный шейкер и инкубируют при перемешивании при частоте вращения 600 оборотов в минуту в течение 10 минут. По завершению инкубации планшет помещается в автоматический промыватель, где путем полного наполнения лунок промывочным раствором и последующей аспирацией удаляются непрореагировавшие компоненты реакционной смеси, наполнение и аспирация повторяется 5 раз с 30 секундным замачиванием на каждом цикле.
Стадия 5. Обработка рабочей поверхности иммуносорбента раствором пероксидазного конъюгата
В каждую лунку планшета пипетируют по 50 микролитров рабочего раствора конъюгата СПХ. Планшет иммуносорбента помещают в термостатируемый при +37°С ротационный шейкер и инкубируют при перемешивании при частоте вращения 600 оборотов в минуту в течение 5 минут. По завершению инкубации планшет помещается в автоматический промыватель, где путем полного наполнения лунок промывочным раствором и последующей аспирацией удаляются непрореагировавшие компоненты реакционной смеси, наполнение и аспирация повторяется 5 раз с 30 секундным замачиванием на каждом цикле.
Стадия 6. Проявление пероксидазной активности в реакционных зонах иммуносорбента
В каждую лунку планшета пипетируют по 30 микролитров раствора преципитирующего хромогена на основе тетраметилбензидина (производства ООО «Передовые Диагностические Платформы», Россия). Планшет иммуносорбента помещают защищенной от прямых солнечных лучей место при температуре от 18 до 27°С и инкубируют в течение 10 минут. По завершении инкубации планшет помещается в автоматический промыватель, где жидкое содержимое лунок аспирируется полностью.
Стадия 7. Денситометрическое измерение пероксидазной активности в реакционных зонах иммуносорбента
Планшет помещается в автоматический анализатор-денситометр. Оценивают относительную интенсивность окрашивания реакционных зон (спотов) путем измерения интенсивности поглощения света в оптическом диапазоне при его прохождении через дно лунок иммуносорбента. Анализатор получает и обрабатывает изображение дна лунок в оптическом диапазоне. Изображение дна лунки формируется оптической системой анализатора на CCD-матрице с разрешением 5 микрометров на пиксель в виде черно-белого изображения разрядностью 8 бит. Получение и обработка изображений последовательно лунка за лункой. На первом этапе обработки изображения осуществляется поиск и ориентация фрагмента иммуносорбента с массивом реакционных зон по заранее известной сигнатуре расположения узловых маркеров координатной сетки спотов, согласно схеме их нанесения на Фиг. 1.
На втором этапе обработки изображения осуществляют поиск оптически плотных областей в ожидаемых положениях, соответствующих координатам нанесения МКАТ в реакционные зоны иммуносорбента, а также измерение их параметров. Интенсивность поглощения света в реакционных зонах (спотах) выражается в относительных единицах интенсивности, установленных для каждого денситометра заводом изготовителем. Данные интенсивности оптической плотности измеряются по каждому пикселю и усредняется по каждому пикселю внутри границ спота и за границами какого-либо из спотов отдельно. Из медианной величины относительных единиц интенсивности по совокупности пикселей внутри спота вычитается усреднённая величина единиц интенсивности по совокупности пикселей иммуносорбента за пределами какого-либо из спотов, получаемая величина в относительных единицах является показателем оптической плотности по каждому споту и далее интерпретируется при анализе результатов. Анализ осуществляется лунка за лункой с последовательной генерацией численных значений интенсивности по каждому из трипликатов (повторов трех реакционных зон с идентичными МКАТ) зон нанесения иммуноглобулинов иммуносорбента, при этом данные по каждому из спотов в серии трипликата усредняются.
Для анализа спотов задаются дополнительные границы допустимых отклонений:
- эксцентриситет окружности контуров спотов не более 0,2;
- размер диаметра окружности контура спота от 70 до 120 микрон;
- размещение не менее 90% площади каждого спота внутри предписанной ячейки относительно координационной сетки массива спотов.
- расстояние между центрами любых соседних спотов не менее 200 микрон;
- интенсивность окрашивания узловых спотов разметки сетки не менее 100 относительных единиц.
Все споты, которые не удовлетворяют критериям отстраняются от анализа. Если в каждой серии спотов из трех повторов (трипликате) одного и того же МКАТ наблюдается отклонение от заданных параметров более чем по 1 споту, то такой трипликат полностью отстраняется от анализа и интерпретации результатов. Результаты фотофиксации лунок А1, В1, С1 иммуносорбента приведены на Фиг. 3. Пример результата распознавания реакционных зон на этапе анализа изображения приведены на Фиг. 4.
Стадия 8. Представление и анализ результатов
На первом этапе обрабатываются данные оптической плотности спотов в лунках с отрицательным контрольным образцом и положительным калибратором А1 и В1 соответственно. Значения интенсивности оптической плотности по каждому трипликату, соответствующему своему онкомаркеру, должны удовлетворять установленным индивидуально критериям валидности, перечисленным в таблице №2 и №3.
Таблица №2
Данные проверки валидности интенсивности оптической плотности отрицательного контрольного образца
(интенсивность оптической плотности)
Таблица №3
Данные проверки валидности интенсивности оптической плотности положительного калибратора
Если установленные критерии валидности анализа выполнены, осуществляется калибровка системы и анализ исследуемых образцов. Создается система координат с отложенными по оси абсцисс данными концентрации аналита-онкомаркера, а по оси абсцисс откладываются медианные значения интенсивности оптической плотности по каждому трипликату. Осуществляется калибровка данных измерений относительно положительного калибратора. Калибровка осуществляется по двум точкам, одна из которых зафиксирована в центре координат, а другая соответствует данным измерения положительного калибратора по каждому аналиту-онкомаркеру отдельно. Выбирается линейная апроксимация зависимости интенсивности оптической плотности и концентрации аналита. Таким образом формируется линейная калибровочная зависимость интенсивности оптической плотности от концентрации аналита-онкомаркера в образце калибратора и в исследуемом образце, при этом для каждого аналита-онкомаркера строится своя калибровочная зависимость.
Результаты анализа представлены в виде таблицы №4 в соответствии со схемой̆ внесения исследуемых образцов, данные приведены в виде медианных значений относительных единиц интенсивности оптической плотности трипликатов с соответствующими МКАТ, а также соответствующим им на основании калибровки значений концентрации аналитов-онкомаркеров, выраженных в условных единицах (У.Е./мл). В связи с ограниченным диапазоном линейной апроксимации зависимости интенсивности оптической плотности от концентрации, значения концентрации ниже 70 или выше 1000 условных единиц в миллилитре не может быть оценено точно, и отображается соответственно в виде значений <70 У.Е./мл и >1000 У.Е./мл.
Таблица №4
Медианные данные относительной интенсивности оптической плотности (ИОП) отрицательного контрольного образца, исследуемого образца и положительного калибратора по каждому трипликату с округлением до целого значения, а также данные калиброванной концентрации аналитов-онкомаркеров в условных единицах на миллилитр (У.Е./мл)
(отрицательный контрольный образец)
(положительный калибратор)
(исследуемый образец)
Результат анализа исследуемого образца по каждому отдельному онкомаркеру считается положительным, если образец содержит онкомаркер в концентрации, превышающей максимально допустимую для условно здорового человека. Исходя из взятого за основу определения условных единиц концентрации положительного калибратора, все исследуемые образцы, имеющие значения концентрации выше 100 условных единиц в миллилитре могут интерпретироваться как положительные, поскольку содержат аналиты-онкомаркеры в концентрации, превышающей максимально допустимое значение для условно здорового человека (см. таблицу №1).
Результат анализа исследуемого образца по каждому отдельному онкомаркеру считается отрицательным, если образец не содержит онкомаркер в концентрации, превышающей максимально допустимую для условно здорового человека. Исследуемый образец расценивают как отрицательный по каждому аналиту-онкомаркеру, если значение концентрации по каждому онкомаркеру не превышает 70 условных единиц в миллилитре.
Исследуемый образец расценивают как неопределенный или сомнительный по каждому онкомаркеру, т.е. требующий дополнительного исследования более точными методами, если значение концентрации по любому из аналитов находится в интервале от 70 до 100 условных единиц в миллилитре включительно.
Итоговая интерпретация результатов анализа по каждому онкомаркеру образцов в диапазоне лунок A1-C1 приведена в таблице №5.
Таблица №5
Итоговая качественная интерпретация и представление результатов анализа. По каждому онкомаркеру: (POS) - положительный результат, (NEG) - отрицательный результата
(отрицательный контрольный образец)
(положительный калибратор)
(исследуемый образец)
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ количественного определения антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека | 2018 |
|
RU2702900C1 |
| Способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и М в крови человека на биологическом микрочипе | 2015 |
|
RU2625018C2 |
| ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА В ФОРМАТЕ ИММУНОЧИПА И СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА | 2009 |
|
RU2397178C1 |
| СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА ПУТЕМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА | 2012 |
|
RU2488832C1 |
| СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIIа ЧЕЛОВЕКА | 2010 |
|
RU2429008C1 |
| Способ проведения биологического микроанализа | 2019 |
|
RU2710262C1 |
| СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ КЛАССА G К АНТИГЕНАМ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ TORCH-ИНФЕКЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОЧИПА | 2014 |
|
RU2545792C2 |
| НАБОР ДЛЯ СКРИНИНГОВОГО АНАЛИЗА ОНКОМАРКЕРА В СЫВОРОТКЕ И ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ | 1995 |
|
RU2119167C1 |
| НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА C ЧЕЛОВЕКА (ВАРИАНТЫ) | 1993 |
|
RU2084527C1 |
| Способ определения биологических макромолекул на основе ЯМР-релаксометрии | 2020 |
|
RU2743426C1 |
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к комплексному иммуноферментному анализу в микропланшетном формате. Массив иммобилизованных моноклональных антител, специфически связывающих онкологические маркеры из ряда AFP, CA15-3, CA19-9, CA72-4, CA-125, hCG, NSE, HE4, PSA, S100, Cyfra 21-1, CEA, SCC, иммобилизованных в индивидуальные реакционные зоны иммуносорбента, вводят в контакт с образцом сыворотки или плазмы человека. Указанные реакционные зоны наносят непосредственно на дно плоскодонной полистирольной реакционной ячейки объемом от 100 до 1000 микролитров, диаметр каждой зоны составляет от 50 до 250 микрон, при этом центры зон удалены друг от друга на 200 - 1000 микрон по радиусу. Осуществляют инкубацию образца и указанного массива реакционных зон, после чего промывают поверхность иммуносорбента и вводят раствор смеси биотинилированных конъюгатов моноклональных антител, инкубируют, иммуносорбент промывают и вводят раствор конъюгата стрептавидина с пероксидазой, инкубируют 5 - 20 минут при температуре от 20 до 42°С стационарно или при перемешивании с частотой от 5 до 30 Гц. Иммуносорбент промывают и вводят раствор преципитирующего хромогена на основе тетраметилбензидина, инкубируют, жидкое содержимое полностью аспирируют. Выявление связавшихся с иммуносорбентом онкомаркеров осуществляют в результате измерения интенсивности генерации оптического сигнала в зонах иммуносорбента с нанесенными моноклональными антителами в результате образования специфических иммунных комплексов в результате иммуноферментной реакции с участием пероксидазы в составе конъюгата иммунного комплекса, приводящей к преципитации хромогена 3,3’,5,5’-тетраметилбензидиндиимина и формированию окрашенного участка иммуносорбента. Изобретение позволяет проводить многопараметрическую идентификацию и оценку концентрации аналитов-биомаркеров, ассоциированных с онкологическими состояниями организма человека, позволяет многократно сократить время и трудозатраты на оценку содержания онкомаркеров в крови. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 1 пр.
1. Способ идентификации биологических маркеров, обнаруживаемых в сыворотке или плазме крови человека в связи с возможным наличием онкологических заболеваний, осуществляемый путем мультиплексного иммуноферментного сэндвич-иммуноанализа, включающий в себя массив иммобилизованных моноклональных антител, специфически связывающих онкологические маркеры из ряда AFP, CA15-3, CA19-9, CA72-4, CA-125, hCG, NSE, HE4, PSA, S100, Cyfra 21-1, CEA, SCC, иммобилизованных в индивидуальные реакционные зоны иммуносорбента, вводимые в контакт с образцом сыворотки или плазмы человека, отличающийся тем, что указанные реакционные зоны наносятся непосредственно на дно плоскодонной полистирольной реакционной ячейки объемом от 100 до 1000 микролитров, диаметр каждой зоны составляет от 50 до 250 микрон, при этом центры зон удалены друг от друга на 200 - 1000 микрон по радиусу, осуществляют инкубацию образца и указанного массива реакционных зон в течение 20 - 60 минут при температуре от 20 до 42°С, при перемешивании при с частотой от 5 до 30 Гц, после чего промывают поверхность иммуносорбента и вводят раствор смеси биотинилированных конъюгатов моноклональных антител, инкубируют 5 - 30 минут при температуре от 20 до 42°С стационарно или при перемешивании с частотой от 5 до 30 Гц, иммуносорбент промывают и вводят раствор конъюгата стрептавидина с пероксидазой, инкубируют 5 - 20 минут при температуре от 20 до 42°С стационарно или при перемешивании с частотой от 5 до 30 Гц, иммуносорбент промывают и вводят раствор преципитирующего хромогена на основе тетраметилбензидина, инкубируют стационарно при температуре от 20 до 44°С, жидкое содержимое полностью аспирируют, а выявление связавшихся с иммуносорбентом онкомаркеров осуществляют в результате измерения интенсивности генерации оптического сигнала в зонах иммуносорбента с нанесенными моноклональными антителами в результате образования специфических иммунных комплексов в результате иммуноферментной реакции с участием пероксидазы в составе конъюгата иммунного комплекса, приводящей к преципитации хромогена 3,3’,5,5’-тетраметилбензидиндиимина и формированию окрашенного участка иммуносорбента.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сыворотка или плазма крови человека вводится в контакт с массивом иммобилизованных моноклональных антител иммуносорбента с фактором разведения от 1 до 20.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве иммуносорбента используется плоскодонная реакционная ячейка, выполненная из полистирола модифицированного ионизирующим излучением, устанавливаемая в рамку-держатель реакционного модуля совместно с контейнерами для реагентов для проведения этапов анализа, при этом указанные зоны с нанесенными моноклональными антителами находятся на дне реакционной ячейки.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве иммуносорбента используется плоскодонный 96-луночный полимерный планшет для иммуноанализа, выполненный из полистирола, модифицированного ионизирующим излучением, в котором реакционные ячейки представлены лунками планшета и могут быть неизвлекаемыми, или извлекаемыми из рамки планшета, или сгруппированными в 12 извлекаемых модулей-стрипов по 8 реакционных ячеек в каждом, при этом указанные зоны с нанесенными моноклональными антителами находятся на дне лунок планшета или модулей стрипов.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитела в реакционных зонах иммуносорбента иммобилизованы непосредственно на поверхности иммуносорбента пассивно за счет ионно-гидрофобных взаимодействий и/или путем образования ковалентных химических связей между моноклональными антителами и химически активными группами непосредственно на поверхности иммуносорбента.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выявления образующихся в зонах иммуносорбента иммунных комплексов антитело-биологический маркер-конъюгат и амплификации сигнала используются конъюгат стрептавидина и/или авидина и/или их функциональных аналогов с полимеризованной пероксидазой.
| БИОЛОГИЧЕСКИЙ МИКРОЧИП ДЛЯ МНОЖЕСТВЕННОГО ПАРАЛЛЕЛЬНОГО ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СОЕДИНЕНИЙ И СПОСОБЫ ИММУНОАНАЛИЗА, В КОТОРЫХ ОН ИСПОЛЬЗУЕТСЯ | 2004 |
|
RU2363955C2 |
| ZHENGHONG SUN, et al., Protein Chip System for Parallel Analysis of Multi-tumor Markers and its Application in Cancer Detection, ANTICANCER RESEARCH 24: 1159-1166 (2004) | |||
| KRISTIN L., et al., A multiplex platform for the identification of ovarian cancer biomarkers, Boylan et al., Clin Proteom, (2017) 14:34, DOI | |||
