Способ одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2 Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6888 

Способ одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6 В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2

Изобретение относится к области молекулярной биологии, лабораторной диагностики, вирусологии и эпидемиологии, касается способа одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6 В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2 в образцах клинического материала методом однораундовой мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией результатов амплификации для перспективного развития методологии молекулярно-биологических исследований в клинической практике и эпидемиологическом надзоре за герпесвирусными инфекциями.

Характеристика генетических особенностей циркулирующих вирусов лежит в основе изучения патогенеза, целевой разработки методов лабораторной диагностики, средств специфической профилактики и лечения, а также совершенствования системы эпидемиологического надзора за инфекциями.

Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) и вирусы герпеса человека 6А и 6В (ВГЧ6А и ВГЧ6В) убиквитарны, инфицируют представителей всех социальных групп, начиная с раннего детского возраста. Они характеризуются выраженной лимфотропностью, способностью к хромосомной интеграции генома, модуляции иммунного ответа организма хозяина, онкогенным потенциалом.

ВЭБ общеизвестен как самый частый возбудитель инфекционного мононуклеоза (ИМ) (76,6% случаев) [Демина О.И., Тихомиров Д.С., Чеботарева Т.А., Мазанкова Л.Н., Туполева Т.А. Клиническая значимость вирусологических методов верификации этиологии инфекционного мононуклеоза//Детские инфекции - 2020 - Т. 19, №2 - С.29-37.], ВГЧ6 В является этиологическим агентом внезапной экзантемы, реже ИМ, в то время как специфическая форма ВГЧ6А инфекции еще не определена [Попкова М.И., Уткин О.В., Брызгалова Д.А. Сравнительная характеристика бета-герпес-вирусов человека 6А и 6В. Современный взгляд на проблему// Журнал инфектологии. - 2021. - Т. 13, №3- С.5-18.]. Спектр ВЭБ- и ВГЧбА/В-ассоциированных заболеваний у детей и взрослых постоянно расширяется и уточняется.

ВЭБ характеризуется генетической гетерогенностью. Первой и общепринятой классификацией генетического разнообразия ВЭБ является деление на два основных типа - ВЭБ-1 и ВЭБ-2 по уровню различий в длине открытой рамки считывания домена U2 и белка EBNA-2 между штаммами В95-8 (тип 1) и AG876 (тип 2) [Dambaugh Т., Hennessy К., Chamnankit L., Kieff Е. U2 region of Epstein-Barr virus DNA may encode Epstein-Barr nuclear antigen 2//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984, vol. 81, P. 7632-7636.]. Известно, что в гене EBNA-2 степень идентичности между двумя типами вируса по нуклео-тидным и аминокислотным последовательностям составляет 70 и 54% соответственно [Knipe D.M., Howley P.M. Fields virology. 6th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2013.]. При этом ВЭБ-2 характеризуется меньшей степенью разнообразия по сравнению с ВЭБ-1. Внутри каждого типа наибольшая дивергенция отмечается для генов EBNA-1 и LMP-1 [Kaymaz Y., Oduor СЛ., Aydemir О., Luftig М.А., Otieno J.A., Ong'echa J.M., et al. Epstein-Barr virus genomes reveal pulation structure and type 1 association with endemic Burkitt lymphoma//J. Virol - 2020; 94(17).]. Основное фенотипическое различие между двумя типами вируса заключается в том, что ВЭБ-1 трансформирует В-лимфоциты человека более эффективно, чем ВЭБ-2 [Rickinson А.В., Young L.S., Rowe М. Influence of the Epstein-Barr virus nuclear antigen EBNA 2 on the growth phenotype of virus-transformed В cells//J.Virol- 1987. 61(5): 1310-7.]. В экспериментах in vitro установлено, что разные штаммы одного типа (ВЭБ-1) обладают выраженными отличиями в трансформирующем потенциале и клеточном тропизме, что может предопределять развитие разных типов опухолей [Tsai М.Н., Lin X., Shumilov А., Bernhardt К., Feederle R., Poirey R., et al. The biological properties of different Epstein-Barr virus strains explain their association with various types of can-cers//Oncotarget - 2017. 8(6).- 10238-54.]. А недавние сообщения о том, что ВЭБ-2 инфицирует Т-клетки как в культуре, так и in vivo (например, у кенийских детей), определяют необходимость дальнейшего развития представлений о биологическом значении основных типов ВЭБ, в том числе с позиций оценки геномных вариаций вируса [Correia S., Palser A., Elgueta Karstegl С, Middeldorp J.M., Ramayanti О., Cohen J.I., et al. Natural variation of Epstein-Barr virus genes, proteins, and primary MicroRNA//J.Virol- 2017. 91(15): e00375-17.]. Оба типа ВЭБ встречаются повсеместно, при этом их распределение имеет географические особенности. ВЭБ-1 является основным типом, распространенным во всем мире, преобладает в популяции жителей Европы, Америки, Китая и Южной Азии. Темпы изучения ВЭБ-2 отстают, поскольку инфицированные этим типом вируса люди встречаются реже, в основном в регионе Африки к югу от Сахары и в Папуа - Новой Гвинее [Smatti М.К., Al-Sadeq D.W., Ali N.H., Pintus G., AbouSaleh H., Nasrallah G.K. Epstein-Barr virus epidemiology, serology, and genetic variability of LMP-1 oncogene among healthy population: an update// Front. Oncol. 2018; 8: 211.]. Небольшой процент представителей европеоидной расы также инфицированы ВЭБ-2 [Correia S., Palser A., Elgueta Karstegl С, Middeldorp J.M., RamayantiO., Cohen J.I., et al. Natural variation of Epstein-Barr virus genes, proteins, and primary MicroRNA// J. Virol- 2017. 91(15): e00375-17.]. В России только начинают появляться первые публикации по изучению распространенности основных типов ВЭБ [Смирнова К.В., Сенюта Н.Б., Лубенская А.К., Душенькина Т.Е., Гурцевич В.Э. Древние варианты вируса Эпштей- на-Барр (Herpesviridae, Lymphocryptovirus, HHV-4): гипотезы и факты// Вопросы вирусологии. -2020. - Т.65, №2. - С.77-86.; Попкова М.И., Уткин О.В., Соболева Е.А., Сахарнов Н.А., Брызгалова Д.А., Сенатская А.О. и соавт.Методические основы дифференциальной детекции ВЭБ1/ВЭБ2 и ВГЧ6А/ВГЧ6 В//Инфекция и иммунитет.- 2021. - Т.11, №6 - С.1057-1066.]. Различия отмечаются не только в географическом распространении типов вируса, но также и среди отдельных социальных групп. Так, в когорте гомосексуальных мужчин в западных странах по сравнению с общей популяцией наблюдается более высокая частота инфицирования ВЭБ-2, в частности, в группах ВИЧ-инфицированных индивидов. Считается, что пациенты с иммунодефицитными состояниями более восприимчивы к инфицированию обоими типами ВЭБ [Traore L., Nikiema О., Ouattara А.К., Compaore T.R., Soubeiga S.T., Diarra В., et al. EBV and HHV-6 circulating subtypes in people living with HIV in Burkina Faso, impact on CD4 T cell count and HIV viral load//Mediterr. J. Hematol. Infect. Dis-2017. 9(1): e2017049.]. Патогенетическая роль каждого из них до конца не изучена, доказательств связи генотипов с развитием различных заболеваний недостаточно.

Согласно новой международной классификации, принятой в 2012 г., вирусы ВГЧ6А и ВГЧ6 В являются самостоятельными таксономическими единицами [Adams M.J., Carstens Е.В. Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses//Arch. Virol-2012.157(7).: 1411-22.]. Оба герпесвируса относят к роду Roseolovirus. Их генетический материал представлен двуцепочечной ДНК. ВГЧ6А и ВГЧ6 В различаются особенностями культивирования, последовательностям нуклеотидов и клинико-эпидемиологическими показателями. В зависимости от сравниваемого гена последовательность ДНК двух вариантов вируса совпадает на 75-95% [Isegawa Y., Mukai Т., Nakano К., et al. Comparison of the complete DNA sequences of human herpesvirus 6 variants A and B//J Virol. -1999. 73 (10): 8053-63.; Dominguez G., Dambaugh T.R., Stamey F.R., Dewhurst S., Inoue N., Pellett P.E. Human herpesvirus 6B genome sequence: coding content and comparison with human herpesvirus 6A//J. Virol. -1999.73 (10): 8040-52.; Achour A., Malet I., Le Gal F., et al. Variability of gB and gH genes of human herpesvirus-6 among clinical specimens//.!. Med. Virol. - 2008.80 (7): 1211-21.]. ВГЧ6А описан как более нейровирулентный по сравнению с ВГЧ6 В и часто выявляется у пациентов с демиелинизирующими заболеваниями такими, как рассеянный склероз [Nitsche A., Muller C.W., Radonic A., et al. Human herpesvirus 6A DNA is detected frequently in plasma but rarely in peripheral blood leukocytes of patients after bone marrow transplantation//.!. Infect. Dis.-2001.183(1): 130-3.; Cone R.W., Huang M.L., Hackman R.C., Corey L. Coinfection with human herpesvirus 6 variants A and В in lung tissue//J. Clin. Microbiol. -1996. 34 (4): 877-81.; Hall C.B., Caserta M.T., Schnabel K.C., et al. Persistence of human herpesvirus 6 according to site and variant: possible greater neurotropism of variant A//Clin. Infect. Dis.- 1998. 26(1): 132-7.; Alvarez-Lafuente R., De Las Heras V., Bartolome M., Picazo J.J., Arroyo R. Relapsing-remitting multiple sclerosis and human herpesvirus 6 active infection//Arch. Neurol.- 2004. 61 (10): 1523-7.; Crawford J.R., Kadom N., Santi M.R., Mariani В., Lavenstein B.L. Human herpesvirus 6 rhombencephalitis in immunocompetent children//J. Child. Neurol.- 2007. 22 (11): 1260.]. ВГЧ6 В при первичном заражении вызывает распространенную детскую болезнь - розеолу, известную как внезапная экзантема (exanthema subitum) или «шестая болезнь» [Yamanishi К., Okuno Т., Shiraki К. et al. Identification of human herpesvirus-6 as a causal agent for exanthem subitum//Lancet.- 1988.1 (8594): 1065.].

Известны серологические способы определения маркеров ВЭБ и ВГЧ6 как иммунофлюоресцентный метод, иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг, иммунопреципитация. Доступные в настоящий момент серологические тест-системы не позволяют дифференцировать ВЭБ и ВГЧ6А и ВГЧ6В.

Известны способы дифференциации ВГЧ6А и ВГЧ6 В методом ПЦР с последующей электрофоретической детекцией продуктов амплификации фрагмента гена U89/90 ВГЧ6, различающихся по молекулярной массе у ВГЧ6А и ВГЧ6В за счет присутствия инсерций размерами 228 пар нуклеотидов (п.н.) и 108 п. н. соответственно [JP 2003135100 А,2003-05-13.] и методом ПЦР в режиме реального времени с использованием специфических праймеров HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3' для амплификации участка гена U67; зондов, меченных флуорофорами (F1 и F2), и соответствующими им гасителями (Q1 и Q2) - HHV6AZ F1-GC AATAGATTTGGAAACGCGGCAT-Q1 и HHV6BZ F2-GCAATAGATTCGGAAATGCGGCAT-Q2, для выявления ВГЧ6А и ВГЧ6В соответственно [патент РФ №2627607 от 09.08.2017.]. Известные способы не обеспечивают одновременной детекции основных генотипов ВЭБ, а также вирусов ВГЧ6А и ВГЧ6В.

Известен способ диагностики герпесвирусной инфекции, включающий детекцию вирусной ДНК в исследуемом материале путем проведения двухраундовой ПЦР с использованием в первом раунде двух внешних праймеров и матрицы в виде участка вирусной ДНК с получением амплификата, а во втором раунде - двух внутренних праймеров и матрицы в виде полученного в первом раунде амплификата с последующим определением образовавшихся во втором раунде продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в агарозном геле [С.А. Клинчева и др. Использование метода nested-полимеразой цепной реакции для быстрого выявления цитомегаловируса в лейкоцитах периферической крови пациентов после трансплантации костного мозга // Вопр. вирусологии. - 1996, Т. 41. №4. С.147-149.]. Однако известным способом определяется только один тип герпесвируса - цитомегаловирус (ЦМВ). Для определения других типов герпесвирусов необходимо проведение ПЦР с использованием других, дополнительных праймеров, что делает определение длительным, дорогостоящим и трудоемким.

Известен также способ диагностики герпесвирусной инфекции путем проведения двухэтапной ПЦР с использованием на первом этапе двух внешних праймеров I и II, а на втором - двух внутренних праймера I и III. Два этапа ПЦР включают три стадии: первая стадия в один цикл включает денатурацию и отжиг, вторая стадия - в 30 циклов включает элонгацию, денатурацию и отжиг, а третья стадия в один цикл включает элонгацию. Продукты амплификации дифференцируют путем рестрикционного анализа, например, электрофорезом в горизонтальном агарозном геле [патент РФ №2192473С1, 10.11-2002.]. Способ позволяет одновременно определять ДНК ВПГ 1, ВПГ 2, ЦМВ и ВЭБ.

В настоящее время в России дифференциация вариантов (генотипирование) ВГЧ6А, ВГЧ6 В и ВЭБ-1 и ВЭБ-2 в диагностических целях не проводится. Работы зарубежных и отечественных авторов, изучающих распространенность ВЭБ-1, ВЭБ-2, ВГЧ6А, ВГЧ6В, а также их ассоциацию с различными заболеваниями, базируются на использовании серии индивидуальных «вложенных» ПЦР-тестов [Mendes, Т.М. Epstein-Barr virus nuclear antigen-2 detection and typing in immunocompromised children correlated with lymphoproliferative disorder biopsy findings// Braz. J. Infect Dis. -2008. - Vol.12, №3. - P. 186-191.4.; Sushruth, R. Quantitative detection and differentiation of human herpesvirus 6 subtypes in bone marrow transplant patients by using a single real-time polymerase chain reaction assay//Biology of Blood and Marrow Transplantation. - 2005. - Vol.11, №7. - P. 530-541.]. Это делает процесс детекции вирусов и их генотипирование многооперационным, трудоемким и малодоступным для использования в рутинной клинической практике.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2 методом однораундовой мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией результатов амплификации.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в одновременном определении ВГЧ6А, ВГЧ6В, а также основных генотипов ВЭБ (ВЭБ-1 и ВЭБ-2) в одной пробе, сокращении времени и упрощении процедуры исследования. Способ осуществляется следующим образом.

ПЦР проводят в один раунд по единому протоколу амплификации с соблюдением следующих режимов: инициация 95°С - 1 мин 30 сек, 45 циклов: 95°С - 30 сек, 60,5°С - 40 сек, 72°С - 1 мин 30 сек, финальная элонгация 72°С - 8 мин.

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами, где Фиг. 1 представляет электрофореграмму результатов однораундного варианта мультиплексной ПЦР для раздельной детекции ВЭБ-1, ВЭБ-2, ВГЧ6А и ВГЧ6В, где М - маркер молекулярных масс; 1,2,3 - образцы с мультиплексным вариантом ПЦР: ВЭБ-1 (497 п. н.), ВГЧ6В (431 п. н.), ВГЧ6А (206 п. н.), ВЭБ-2 (162 п. н.), K+1 - положительный контроль ВЭБ-1 (497.п.н.), K+2 - положительный контроль ВЭБ-2 (162 п. н.), K+3 - положительный контроль ВГЧ6 В (431 п. н.), ВГЧ6А (206 п. н.), K-1 - отрицательный контроль ВЭБ-1, К-2 - отрицательный контроль ВЭБ-2, К-3 - отрицательный контроль ВГЧ6В, ВГЧ6А;

Фиг. 2 представляет результаты электрофоретической детекции в агарозном геле, где в первом клиническом образце идентифицировали ВЭБ-1 (497 п. н.) и ВГЧ6 В (431 п. н.), во втором образце - ВЭБ-1 (497 п. н.) и ВГЧ6А (206 п. н.), в третьем образце - ВГЧ6 В (431 п. н.) и ВЭБ-2 (162 п. н.) - обозначены цифрами 1, 2 и 3, соответственно, М - маркер молекулярных масс, К- отрицательный контроль, K+mix - положительный контроль на ВЭБ-1, ВЭБ-2, ВГЧ6А, ВГЧ6 В.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Осуществление способа

Подготовительный этап.

Экстракция ДНК ВЭБ из образцов биологического материала.

Ход анализа

Раздельную детекцию ВЭБ-1, ВЭБ-2, ВГЧ6А, ВГЧ6В методом мультиплексной ПЦР проводили в один раунд. При этом использовали специфические пары праймеров EBV1F 5'-TCTTGATAGGGATCCGCTAGGATA-3', EBV1R 5'-ACCGTGGTTCTGGACTATCTGGATC-3' амплифицирующие фрагмент ВЭБ-1 размером 497 п.н., EBV2F 5 '-CATGGTAGCCTTAGGACATA-3', EBV2R 5' - AG ACTTAGTTGATGCCCT AG-3' амплифицирующие фрагмент ВЭБ-2 размером 162 п.н., HHV-6F 5'-CTCATAAGGTGCTGAGTGATCAGTT-3', HHV-6R 5 '-ССТС AGTGACAGATCTGGGC-3', амплифицирующие фрагменты ВГЧ6А размером 206 п. н. и ВГЧ6 В размером 431 п. н., соответственно. Состав реакционной смеси общим объемом 25 мкл на реакцию включал: праймеры (5 пМ в реакцию), 5-кратный Taq Red буфер 12,5 мМ Mg²⁺, 5 е.a. HS Taq ДНК-полимеразы, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов до конечной концентрации 0,1 мМ; деионизированную воду I типа. В качестве матрицы использовали выделенную ДНК в объеме 5 мкл на реакцию. Применяли оптимизированный единый лабораторный протокол амплификации. Условия амплификации: инициация 95°С - 1 мин 30 сек, 45 циклов: 95°С - 30 сек, 60,5°С - 40 сек, 72°С - 1 мин 30 сек, финальная элонгация 72°С - 8 мин. Продукты ПЦР амплификации визуализировали с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле, содержащем бромид этидия. Результаты детектировали на трансиллюминаторе с использованием прилагающегося к нему программного обеспечения.

Оценка результатов.

По результатам электрофореза в агарозном геле продуктов амплификации специфические фрагменты размером 497 п. н. соответствуют ВЭБ-1, 431 п. н. - ВГЧ6 В, 206 п. н. - ВГЧ6А, 162 п. н. - ВЭБ-2. В качестве стандарта для определения длины двуцепочечных молекул ДНК применяли маркер длин ДНК и положительные контроли данных фрагментов, специфичность которых была подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Полученные данные выражали в качественном формате - обнаружено или не обнаружено.

Пример 2. Применение мультиплексного варианта ПЦР для идентификации ВЭБ-1, ВЭБ-2, ВГЧ6А, ВГЧ6 В.

Три пробы положительные на ДНК ВЭБ, ВГЧ6А, ВГЧ6 В (по результатам предварительно проведенной ПЦР в реальном времени) исследовали с помощью мультиплексного варианта ПЦР по заявляемому способу. По результатам электрофоретической детекции в агарозном геле в первом образце идентифицировались ВЭБ-1 (497 п. н.) и ВГЧ6 В (431 п. н.), во втором образце - ВЭБ-1 (497 п. н.) и ВГЧ6А (206 п. н.), в третьем образце -ВГЧ6 В (431 п. н.) и ВЭБ-2 (162 п. н.).

Заявляемый вариант мультиплексной ПЦР, ориентированный на детекцию ВЭБ-1 и ВЭБ-2, ВГЧ6А, ВГЧ6 В, отличается проведением амплификации в один раунд по единому протоколу ПЦР, что обеспечивает мультиплексность, сокращение времени анализа (один раунд) и количества используемых реагентов. Исследования могут проводиться в одной пробирке.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="детекция ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ, ВЭБ-1,

ВЭБ-2.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2023-04-05">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023103931</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-02-20</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии

и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

(ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной

Роспотребнадзора)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Blokhina Scientific Research Institute of

Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ одновременной детекции

лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ и его основных генотипов

ВЭБ-1 и ВЭБ-2</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human gammaherpesvirus

4</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcttgatagggatccgctaggata</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human gammaherpesvirus

4</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accgtggttctggactatctggatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human gammaherpesvirus

4</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catggtagccttaggacata</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human gammaherpesvirus

4</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agacttagttgatgccctag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human betaherpesvirus

6A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcataaggtgctgagtgatcagtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q21">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human betaherpesvirus

6B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctcagtgacagatctgggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2 в образцах клинического материала методом однораундовой мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией. ПЦР проводят в один раунд по единому протоколу амплификации: инициация 95°С - 1 мин 30 с, 45 циклов: 95°С - 30 с, 60,5°С - 40 с, 72°С - 1 мин 30 с, финальная элонгация 72°С - 8 мин, при этом используют пары специфических праймеров: амплифицирующие фрагмент ВЭБ-1 размером 497 п.н., амплифицирующие фрагмент ВЭБ-2 размером 162 п.н., амплифицирующие фрагменты ВГЧ6А размером 206 п.н. и ВГЧ6В размером 431 п.н. соответственно. Технический результат заключается одновременном определении ВГЧ6А, ВГЧ6В, а также основных генотипов ВЭБ (ВЭБ-1 и ВЭБ-2) в одной пробе, сокращении времени и упрощении процедуры исследования. 2 ил., 2 пр.

Способ одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2 методом мультиплексной ПЦР с электрофоретической визуализацией продуктов амплификации в агарозном геле, отличающийся тем, что ПЦР проводят в один раунд по единому протоколу амплификации: инициация 95°С - 1 мин 30 с, 45 циклов: 95°С - 30 с, 60,5°С - 40 с, 72°С - 1 мин 30 с, финальная элонгация 72°С - 8 мин, при этом используют пары специфических праймеров:

EBV1F 5'-TCTTGATAGGGATCCGCTAGGATA-3',

EBV1R 5'-ACCGTGGTTCTGGACTATCTGGATC-3',

амплифицирующие фрагмент ВЭБ-1 размером 497 п.н.,

EBV2F 5'-CATGGTAGCCTTAGGACATA-3',

EBV2R 5'-AGACTTAGTTGATGCCCTAG-3',

амплифицирующие фрагмент ВЭБ-2 размером 162 п.н.,

HHV-6F 5'-CTCATAAGGTGCTGAGTGATCAGTT-3',

HHV-6R 5'-CCTCAGTGACAGATCTGGGC-3',

амплифицирующие фрагменты ВГЧ6А размером 206 п.н. и ВГЧ6В размером 431 п.н. соответственно.