Жидкий симбиотик и способ его получения Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Группа изобретений относится к области медицинской и пищевой биотехнологии и может быть использована для приготовления пробиотиков в форме лечебно-профилактических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания с использованием в качестве стартерных культур живых пробиотических штаммов микроорганизмов.

Предметом патентования является пробиотик «БиКоэЛь», по составу являющийся симбиотиком, по функциональному воздействию - психобиотиком.

Симбиотики-мультипробиотики, - препараты или продукты, содержащие несколько симбиотических штаммов пробиотических микроорганизмов одного или нескольких видов.

Пробиотические микроорганизмы - живые непатогенные, нетоксигенные микроорганизмы, поступающие в кишечник человека с пищей, благотворно воздействующие на организм человека и нормализующие состав и биологическую активность микробиоты пищеварительного тракта.

Чаще всего в качестве пробиотических микроорганизмов рассматриваются бактерии родов Bifidobacterium, Lactobacillus. К пробиотическим микроорганизмам предъявляется обширный перечень требований [Методические указания по контролю биологических и микробиологических факторов. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков: методические указания №4.2.2602-10. - М.: Роспотребнадзор. - 2011. - 80 с.; Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов: методические указания №2.3.2.2789-10 М.: Роспотребнадзор. 2010. 103 с.], соответствуют которым лишь отдельные штаммы, а не все представители данных видов.

Бифидобактерии выполняют и регулируют многочисленные функции организма. В процессе жизнедеятельности они образуют органические кислоты, что способствует установлению нормальных значений рН кишечника, препятствует размножению патогенной, гнилостной и газообразующей микрофлоры, принимают участие в процессах энзиматического переваривания пищи, усиливая гидролиз протеинов, сбраживают углеводы, омыляют жиры, растворяют клетчатку, стимулируют перистальтику кишечника, способствуют нормальной эвакуации содержимого кишечника. Кроме того, они выполняют витаминообразующую функцию, синтезируют витамины группы В, витамин К, фолиевую и никотиновую кислоты, способствуют синтезу незаменимых аминокислот, лучшему усвоению солей кальция, витамина D, который, в свою очередь, обладает антианемическим, антирахитическим и антиаллергическим действием [Бондаренко В.М. Молекулярно-клеточные механизмы терапевтического действия пробиотических препаратов // Фарматека. - 2010. - №2. - С. 26-32.; Бухарин О.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека / Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - 212 с.]. Важной функцией бифидобактерий является их участие в формировании иммунологической толерантности организма. Бифидобактерий стимулируют лимфоидную ткань, синтез иммуноглобулинов, повышают активность лизоцима и способствуют уменьшению проницаемости тканевых барьеров для токсичных продуктов патогенных и условно патогенных микроорганизмов [Янковский Д.С. Микробная экология человека: современные возможности ее поддержания и восстановления. - К.: Эксперт ЛТД, 2005. - 362 с.; Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 3. Пробиотики и функциональное питание. - М.: Издательство «ГРАНТЪ», 2001. - 288 с.].

Лактобактерии - в процессе сбраживания углеводов образуют короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) - молочная, уксусная, масляная, пропионовая, в присутствии которых тормозится развитие условно-патогенных штаммов, обладающих в большинстве своем протеолитическим типом метаболизма [Зорина, В.В. Влияние бактерий рода Lactobacillus на миграционную активность макрофагов // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - №6. - С. 40-44]. Ингибирование протеолитических штаммов сопровождается угнетением гнилостных процессов и подавлением образования аммиака, ароматических аминов, сульфидов, эндогенных канцерогенов. Благодаря выработке жирных кислот происходит регуляция рН внутрикишечного содержимого [Суржик А.В. Влияние пробиотической культуры Lactobacillus rhamnosus GG на иммунный ответ организма // Вопросы современной педиатрии. - 2009. - №2. - С. 54-58.; Андреева И.В. Потенциальные возможности применения пробиотиков в клинической практике // Клинич. микробиол. антимикроб, химиотерапия. - 2006 - Т. 8, №8. - С. 151-172.; Kavitha, С. Antibiosis of bacteriocins with domestic Lactobacilli isolated from prepared curd // Emir. J. Food Agric. - 2010. - Vol. 22, №5. - P. 398-400]. Показано, что выраженное угнетение роста, размножения и процесса адгезии патогенных и условно-патогенных микроорганизмов зависит от присутствия всего спектра кислот, вырабатываемых нормофлорой желудочно-кишечного тракта. Синергизм такого сочетания обеспечивает ингибирование не только бактерий, но и некоторых видов дрожжей, при этом практически не затрагивается кислотоустойчивая нормальная микрофлора. Антимикробный эффект молочной и уксусной кислот хорошо изучен. Они обеспечивают поддержание показателя рН внутрикишечного содержимого на уровне 4,0-5,8, благодаря чему сдерживается рост и размножение условно-патогенных и гнилостных микроорганизмов в кишечнике [Ермоленко Е.И. Антимикробное действие лактобацилл // Медицина - XXI век. - 2007. - №5. - С. 41-49.; J. Nissen-Meyer [et al.] A novel lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complemetary action of two peptides III. Bacteriol. - 1992 - Vol. 174, №17 - P. 5686 - 5692], а также проникая через мембрану, выделяют ион гидроокиси в нейтральную цитоплазму, что приводит к подавлению жизненных функций клетки. Так, уксусная кислота при рН выше 4,5 проявляет более выраженный ингибирующий эффект, чем молочная кислота, и, наоборот, при рН ниже 4,0 более сильная антимикробная активность наблюдается у молочной кислоты [В.М. Бондаренко [и др.] Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клинич. гастроэнтерология. - 2004. - №3. - С. 83-87.; С.В. Сидоренко Молекулярные основы резистентности к антибиотикам // Успехи биол. химии. - 2004. - Т. 44. - С. 263-306]. Особое место среди антибактериальных метаболитов лактобактерий занимает перекись водорода, она угнетает рост целого ряда микроорганизмов - кишечной палочки, стафилококков, псевдомонад, гонококков и др. Штаммы Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei и Lactobacillus acidophilus, составляющие нормальную микрофлору кишечника и влагалища человека, активно продуцируют лизоцим [Поспелова В.В. Биологическая характеристика некоторых производственных и свежевыделенных штаммов лактобацилл // Мед. аспекты микр. экологии. - 1992. - Вып. 6. - С. 54-57.; Шендеров Б.А. Медицинская и микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Т. 3: Пробиотики и функциональное питание / Москва: ГРАНТЪ, 2001. - 286 с.].

Наиболее значимыми для реализации антагонистической активности лактобактерий считаются бактериоцины и бактериоциноподобные вещества [Л.П. Блинкова [и др.] Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества как биологически активные средства // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания: фундаментальные и клинические аспекты: материалы 9 Междунар. Славяно-Балт. науч. форума «Санкт-Петербург ГАСТРО-2007», Санкт-Петербург, 16-19 мая 2007. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 22.; J. R. Tagg, A.S. Dajani, L.W. Wannamaker Bacteriocins of gram-positive bacteria // Bacteriol. Rev. - 1976. - Vol. 40, №. 3. - P. 722-756].

Бактерии семейств Lactobacillaceae и Bifidobacteriaceae синтезируют бактериоцины - антибиотические вещества пептидной природы, убивающие родственные виды или штаммы, тормозящие их рост, или имеющие более широкий спектр антибактериального действия [Похиленко, В.Д. Бактериоцины: их биологическая роль и тенденции применения // Электронный научный журнал «Исследовано в России» - С. 164-198.]. Например, лактобациллы L. plantarum и L. fermentum продуцируют бактериоцины и бактериоциноподобные вещества: лантибиотики (класс I) - термостабильные пептиды с молекулярной массой менее 5 кДа, состоящие из необычных, посттрансляционно-модифицированных аминокислот (дегидроаланин, лантионин, α-метиллантионин); не-лантибиотики (класс II) - термостабильные пептиды с молекулярной массой менее 10 кДа, которые не содержат лантионин и сохраняют свою активность при широком диапазоне рН (3-9); высокомолекулярные (более 30 кДа) термолабильные пептиды (класс III); катионные, амфифильные, мембрано-проницаемые антимикробные пептиды размером от 2 до 6 кДа (липо- и гликопротеины) класс IV. Так, L. plantarum 8 RA-3 способен продуцировать лантибиотик плантарицин. Некоторые штаммы B. bifidum и B. longum синтезируют бактериоциноподобные вещества и бактериоцины различных классов.

Метаболиты, продуцируемые бифидо- и лактобактериями, оказывают стимулирующее действие на индигенную микрофлору макроорганизма, проявляют противомикробное действие по отношению к представителям патогенной и условно-патогенной микрофлоры, а также иммунотропное действие. Кроме того, в составе экзометаболитов лакто- и бифидобактерий имеются стимуляторы и ингибиторы роста бактериальных культур, а также вещества, влияющие на выживаемость и антагонистическую активность микробных клеток.

Пробиотические штаммы используются для приготовления различных лекарственных средств, продуктов питания, в т.ч. БАД к пище, кисломолочных продуктов и биопродуктов как в виде монокомпонентных пробиотиков, так и в составе многокомпонентных консорциумов бактерий, относящихся к разным видам и даже родам микроорганизмов.

Психобиотики - это пробиотические бактерии, которые оказывают благотворное воздействие на психическое здоровье человека.

Психобиотики - живые микроорганизмы, которые при приеме в адекватных количествах улучшают здоровье пациентов с психиатрическими проблемами.

Согласно последним научным данным, симбиотическая микробиота пищеварительного тракта человека активно участвует в регуляции развития и функционирования головного мозга в результате взаимодействия низкомолекулярных соединений микробного происхождения с нервными клетками. Так, известно, что бактерии способны и распознавать, и синтезировать нейромедиаторы и нейроэндокринные гормоны. Взаимодействие микробиоты кишечника с энтеральной нервной системой и мозгом млекопитающих подтверждено во многих работах [Stilling R.M., Bordenstein S.R., Dinan T.G., Cryan J.F. Friends with social benefits: host-microbe interactions as a driver of brain evolution and development? // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. - 2014. - DOI: 10.3389/fcimb.2014.00147; Олескин A.B., Шендеров Б.А., Роговский B.C. Социальность микроорганизмов и взаимоотношения в системе микробиота - хозяин: роль нейромедиаторов. Монография. - Москва: Издательство Московского университета, 2020. - 286 с. - ISBN 978-5-19-011-450-8]. Выдвинута достаточно серьезная гипотеза о том, что без микробиоты человек не смог бы достичь современного уровня познавательных способностей [Montiel-Castro A.J., Gonzalez-Cervantes R.M., Bravo-Ruiseco G., Pacheco-Lopez G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality // Frontiers in Integrative Neuroscience. - 2013. October. - DOI: 10.3389/fnint.2013.00070]. Ряд исследователей рассматривают микробиоту как фактор риска для лиц, генетически предрасположенных к РАС; считается, что изменения в микробиоте кишечника повышают риск развития РАС, влияя на иммунную систему и обмен веществ [De Angelis М., Francavilla R., Piccolo M., De Giacomo A., Gobbetti M. Autism spectrum disorders and intestinal microbiota. Gut Microbes. - 2015. - Vol. 6? N.3 - P. 207-213. https://doi.org/10.1080/19490976.2015.1035855; Благонравова A.C., Жиляева T.B., Квашнина Д.В. Нарушения кишечной микробиоты при расстройствах аутистического спектра: новые горизонты в поиске патогенетических подходов к терапии. Часть 1. Особенности кишечной микробиоты при расстройствах аутистического спектра // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2021 - т. 98, №1 - С. 65-72 DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-62]. Гипотеза о роли микробиоты кишечника в патогенезе аутизма поддерживается исследованиями, в которых показано, что манифестация аутизма часто сопровождается жалобами на гастроинтестинальные симптомы, которым предшествует использование антибиотиков: многие дети с расстройством аутического спектра (РАС) часто проходят антибиотикотерапию в течение первых 3 лет жизни, что, предположительно, дестабилизирует их микробиоту и открывает возможности для конкурентных потенциальных патогенов вносить вклад в тяжесть РАС [Niehus R., Lord С.Early medical history of children with autism spectrum disorders. J. Dev. Behav. Pediatr. 2006; 27(2): SI 20-7. https://doi.org/10.1097/00004703-200604002-00010; Willing B.P., Russell S.L., Finlay B.B. Shifting the balance: antibiotic effects on host-microbiota mutualism. Nat. Rev. Microbiol. 2011; 9(4): 233-43. https://doi.org/10.1038/nrmicro2536]. To есть можно констатировать, что риск возникновения нейродегенеративных заболеваний следует связывать с глубокой разбалансировкой оси микробиота-кишечник-мозг (microbiota-gut-brain axis). Такая разбалансировка во многом объясняется широким использованием в современном обществе антибиотиков и других химиотерапевтических средств, гормональных препаратов, ксенобиотиков и пр. [Шендеров Б.А., Голубев В.Л., Данилов А.Б., Прищепа А.В. Кишечная микробиота человека и нейродегенеративные заболевания // Неврология. - 2016. - №1. - С. 7-13].

Среди микроорганизмов, продуцирующих низкомолекулярные соединения, способные модифицировать поведенческие реакции человека, в различных научных исследованиях фигурируют штаммы Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum и.т.д. [Олескин А.В., Шендеров Б.А., Роговский B.C. Социальность микроорганизмов и взаимоотношения в системе микробиота - хозяин: роль нейромедиаторов. Монография. - Москва: Издательство Московского университета, 2020. - 286 с. - ISBN 978-5-19-011-450-8]. Различные штаммы лактобацилл, бифидобактерий, а также кишечной палочки способны продуцировать серотонин, тирамин, ацетилхолин, агматин, сероводород, аспартат, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), инсулин, L-диоксифенилаланин (ДОФА). Так, например, L. plantarum и L. fermentum способны продуцировать лактат (фениллактат, гидроксифениллактат), КЦЖК (уксусную, пропионовую, изомасляную, масляную (бутират), изовалериановую, валериановую, изокапроновую, капроновую кислоты), формиат, аминокислоты, этанол, перекись водорода, лизоцим, внеклеточные полисахариды и т.д. [Ситкин С.И., Ткаченко Е.И., Вахитов Т.Я. Метаболический дисбиоз кишечника и его биомаркеры // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2015. - №12(124). - С. 6-29].

В. bifidum и В. longum синтезируют лактат, КЦЖК (уксусную, пропионовую ксилоты), янтарную кислоту, перекись водорода, витамины группы В, фолат, лизоцим, триптофан [Ситкин С.И., Ткаченко Е.И., Вахитов Т.Я. Метаболический дисбиоз кишечника и его биомаркеры // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2015. - №12(124). - С. 6-29].

Представители вида E.coli способны продуцировать лактат, уксусную кислоту (КЦЖК), янтарную кислоту, этанол, бактериоцины (колицин), витамин К [Ситкин С.И., Ткаченко Е.И., Вахитов Т.Я. Метаболический дисбиоз кишечника и его биомаркеры // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2015. - №12(124). - С. 6-29].

Нейромедиаторы, синтезируемые микроорганизмами, участвуют в поддержании активного бодрствующего состояния и регуляции ритма сон -бодрствование, стимуляции гедонического поведения, исполнении произвольных движений, переключении внимания, регуляции эмоций, запоминании, обучении, когнитивной деятельности, в регуляции аппетита, болевой чувствительности, облегчении тревожности и стресса [Олескин А.В., Шендеров Б.А., Роговский B.C. Социальность микроорганизмов и взаимоотношения в системе микробиота - хозяин: роль нейромедиаторов. Монография. - Москва: Издательство Московского университета, 2020. - 286 с. - ISBN 978-5-19-011-450-8]. Так, например, известно, что бифидобактерий способны продуцировать триптофан, являющийся предшественником серотонина, дефицит которого обуславливает последовательно недостаток дофамина, мелатонина, вследствие чего развивается бессонница.

Продукция биологически активных метаболитов является штаммовой характеристикой микроорганизмов, в связи с чем многокомпонентные пробиотки имеют преимущества перед монокомпонентными. В многокомпонентных пробиотиках каждый входящий в состав штамм имеет уникальные характеристики, обуславливающие эффективность продукта в целом. Например, возможность приема пробиотика на фоне антибиотикотерапии достигается введением в состав консорциума продуцентов с хромосомной (нетрансмиссивной) устойчивостью к разным группам антимикробных препаратов таким образом, чтоб всегда имелся хотя бы один штамм, устойчивый к конкретному антибиотику. Учитывая метаболический потенциал штаммов можно сконструировать пробиотик с заданными свойствами: обладающий специфической антагонистической активностью в отношении определенной группы микроорганизмов или обладающий набором определенных метаболитов, способствующих восполнению их дефицита при конкретных патологиях. Кроме того, известно, что между молочнокислыми бактериями существуют симбиотические связи, при которых лактобактерии могут расти в ассоциативных средах, бедных ростовыми веществами, взаимно дополняя потребности друг друга. Также при совместном культивировании биосовместимых штаммов достигается цель создания консорциума, обладающего усиленным комплексом свойств, присущих отдельным штаммам. Накопление молочной кислоты одними штаммами способствует синтезу веществ - пробиотиков другими штаммами, что усиливает антимикробную активность консорциума в отношении патогенной микрофлоры.

Наиболее распространены пробиотики, выпускаемые в сухой сублимированной форме, однако также известен и целый ряд так называемых жидких пробиотиков, являющихся суспензиями по своей сути. Лиофилизированные пробиотики имеют длительные сроки годности (до нескольких лет, удобство применения и реализации). Но наибольшую сохранность метаболитов обеспечивает жидкая форма пробиотиков, тогда как при лиофилизации большая часть полезных субстанций разрушается. Бактерии в жидкой форме пробиотиков находятся в физиологически активном состоянии и способны активно колонизировать кишечник уже через 2 часа после попадания в организм, структура адгезинов не нарушена, в питательной основе сохраняются ценные бакткериальные метаболиты, в частности органические кислоты: уксусная, молочная, витамины В, С, К, которые, попадая в кишечник, изменяют в нем свойства среды, что благотворно влияет на развитие собственной микрофлоры и угнетает патогенные и условно-патогенные микроорганизмы [Бодаренко В.М., Шапошникова Л.И. Клинический эффект жидких пробиотических биокомплексов, содержащих физиологически активные клетки бифидобактерий и лактобацилл, 2007]. Однако при разработке жидких форм пробиотиков необходимо учитывать их биосовместимость - способность длительное время к совместному существованию и функционированию в едином питательном субстрате.

По сути, жидкие пробиотики являются и пробиотиками, и метабиотиками одновременно.

Метабиотики - продукты метаболизма и структурные компоненты пробиотических микроорганизмов.

Более точное определение этой группы было сформулировано профессором Б.А. Шендеровым [Шендеров Б.А. Микробная экология человека и ее роль в поддержании здоровья // Метаморфозы. 2014. №5. С. 72-80]: метабиотики являются структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, и/или сигнальных молекул с определенной (известной) химической структурой, которые способны оптимизировать специфичные для организма хозяина физиологические функции, регуляторные, метаболические и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью индигенной микробиоты организма хозяина. Метабиотики начинают действовать в макроорганизме «здесь и сейчас». Терапевтический эффект метабиотиков обусловлен сочетанием нескольких основных действий: способностью обеспечивать необходимые для нормального взаимодействия эпителия и микрофлоры условия гомеостаза в контактной зоне, а также прямым влиянием на физиологические функции и биохимические реакции макроорганизма, воздействуя на активность клеток и биопленок. При этом стимулируется собственная микрофлора организма.

Из уровня техники уже известны мультиштаммовые пробиотики, содержащие лакто- и бифидобактерий, часть из них представлена в таблице (таблица 1).

Известны пробиотики, которые содержат в своем составе представителей других видов микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры, таких как Streptococcus spp., Enterococcus spp. и др., а также неспецифические для микробиоты кишечника человека микроорганизмы (например, Bacillus cereus, Saccharomyces spp.), их называют самоэлиминирующимися антагонистами. После приема внутрь они проходят через желудочно-кишечный тракт в неизмененном виде без колонизации, но проявляют антагонизм по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре. Препараты полностью выводятся из организма в течение 2-4 дней после прекращения приема [Новиков В.Е. Фармакологическая регуляция микробиоценоза кишечника // Обзоры по клин, фармакол. и лек. терапии. - 2009 - Т. 7 - №2 - С. 51-57]. Перечень некоторых из таких пробиотиков представлен в таблице 2.

В предварительных исследованиях установлено, что для детей с РАС было характерно наиболее частое (р=0,001) выявление дисбиоза кишечника в целом и обнаружение существенных нарушений (р=0,001) в виде дисбиоза кишечника 3-4 степени. По результатам бактериологического исследования микробиоты кишечника установлено, что для детей с РАС по сравнению с условно здоровыми детьми было характерно существенное уменьшение общей бактериальной массы кишечной микробиоты (γ=0,29, р-0,006); снижение представленности основных представителей филометаболического ядра микрообиоты [Ситкин С.И., Ткаченко Е.И., Вахитов Т.Я. Филометаболическое ядро микробиоты кишечника. Альманах клинической медицины. 2015; 40: 12-34]: Lactobacillus spp (γ=0,47, р=0,001); Bifidobacterium spp. (γ=0,37, р=0,001); Bacteroides spp. (γ=0,34, р=0,002); Bacteroides thetaomicron (γ=0,33, р=0,021) Faecalibacterium (γ=0,40, р=0,001); Blautia spp. (γ=0,43, р=0,002); Eubacterium rectale (γ=0,44, р=0,001); Roseburia inulinivorans. (γ=0,41, р=0,001) и Ruminococcus spp. (γ=0,41, р=0,001). Полученные результаты анализа качественного и количественного состава кишечной микробиоты по данным полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме реального времени в полной мере согласуются с таковыми по данными анализа результатов бактериологического исследования; а так же с результатами других исследователей, обнаруживших существенное снижение микробного разнообразия в части количественной представленности отдельных представителей микробиоты при РАС [Kang DW, Ilhan ZE, Isern NG, Hoyt DW, Howsmon DP, Shaffer M, et al. Differences in fecal microbial metabolites and microbiota of children with autism spectrum disorders. Anaerobe. 2018 Feb; 49: 121-31. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.12.007.; Kang, D.W.; Park, J.G.; Ilhan, Z.E.; Wallstrom, G.; LaBaer, J.; Adams, J.В.; Krajmalnik-Brown, R. Reduced incidence of Prevotella and other fermenters in intestinal microflora of autistic children. PLoS ONE 2013, 8, e68322. doi: 10.1371/journal.pone.0068322].

Установлена функциональная несостоятельность кишечной микробиоты при РАС в отношении таких короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) как бутират и пропионат. Результаты метагеномного секвенирования показали существенно меньшую представленность бутиратпродуцентов {Coprococcus spp.), пропионат и лактат продуцентов (Fusicatenibacter spp., Sellimonas spp., Ruthenibacterium spp.) у пациентов с РАС. Были обнаружены различия в микробном метаболизме жирных кислот у детей с РАС и здоровых, а также установлено, что в качестве ключевого резидента в регуляции функциональной активности метаболизма жирных кислот может выступать Escherichia coli. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что у детей с РАС имеется необходимость коррекции нарушенного микробиоценоза толстой кишки, а в качестве продуцентов пробиотиков могут выступать микроорганизмы родов Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. и Escherichia coli. Исходя из данных функционального профилирования микроорганизмов кишечной микробиоты здоровых детей и детей с РАС, полученных авторами, у детей с РАС обнаруживается повышенное содержание молочной кислоты и глиоксиловой кислоты и пониженное содержание масляной, изомасляной, янтарной, изовалериановой и валериановых кислот, а также выявлено значительное снижение концентрации пировиноградной кислоты по сравнению со здоровыми. В связи с этим рационально включение в состав разрабатываемых форм симбиотиков микроорганизмов, продуцирующих наименьшее количество молочной и глиоксиловой кислоты (последняя кислота продуцируется всеми микроорганизмами в минимальных количествах). Повышенный уровень глиоксиловой кислоты непосредственно влияет на продукцию большого количества оксалатов и, как следствие, возникновение гипероксалурии, что часто отмечается у детей с расстройствами аутистического спектра. Метаболизм оксалатов тесно связан с продукцией пировиноградной кислоты (при гипероксалурии снижено количество фермента, превращающего глиоксилат в пируват), поэтому композиции микроорганизмов, продуцирующие высокие концентрации пировиноградной, изомасляной, изовалериановой и валериановой кислот наиболее предпочтительны для включения в состав разрабатываемого симбиотика.

Из уровня техники известны пробиотики, содержащие в составе коли-компонент - Escherichia coli (таблица 3).

Для использования пробиотиков в качестве психобиотиков преимущество следует отдавать жидкой форме, поскольку кроме самих микроорганизмов в жидкой основе пробиотиков накапливаются метаболиты, среди которых особое значение принадлежит веществам, влияющим на нервную систему макроорганизма (ГАМК, триптофан, бутираты, фолиевая кислота и т.п.), а при лиофилизации большая часть полезных субстанций разрушается. Кроме того, бактерии в жидкой форме пробиотиков активны сразу после приема, им не нужно время для восстановления своих физиологических и метаболических функций в отличие от сухих пробиотических препаратов и БАД к пище. Продукция биологически активных метаболитов является штаммовой характеристикой микроорганизмов, в связи с чем многокомпонентные пробиотики имеют преимущества перед монокомпонентными. Однако при разработке жидких форм многокомпонентных пробиотиков необходимо учитывать их биосовместимость - способность длительное время к совместному существованию и функционированию в едином питательном субстрате.

Внутривидовой антагонизм лактобацилл, бифидобактерий и кишечной палочки является штаммовой характеристикой и широко распространен. В связи с этим исследования характера взаимоотношений различных видов пробиотических микроорганизмов в условиях in vitro являются одним из важнейших вопросов при конструировании мультиштаммовых пробиотиков. Одним из необходимых условий, обеспечивающим высокое качество многокомпонентных пробиотиков и их хорошую специфическую активность и сохранность, является синергидный характер взаимоотношений (биосовместимость) входящих в них штаммов пробиотических бактерий.

В предварительных исследованиях определяли биосовместимость 9 производственных пробиотических штаммов методом совместного культивирования на плотных питательных средах [Глушанова Н.А. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: Автореф. дис. … докт. мед. наук. - Москва, 2005. - 56 с.]. В процессе создания пробиотиков «LB-комплекс ПЛЮС» «LB-комплекс Л» с использованием единого методического подхода нами была доказана биосовместимость штаммов Lactiplantibacillus plantarum 8 RA 3, Limosilactobacillus fermentum 39, Limosilactobacillus fermentum 90 TC-4, и бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379 [Точилина, А.Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus: специальность 03.00.04, 03.00.07: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Точилина Анна Георгиевна. - Нижний Новгород, 2009. - 25 с.; Белова И.В., Точилина А.Г., Соловьева И.В., Новикова Н.А., Ефимов Е.И., Иванова Т.П., Жирнов В.А. Использование цеолитов в составе иммобилизованных мультипробиотиков // Медицинский альманах. - 2014. - №2(32). - С. 74-77].

В качестве перспективных также рассматривались штаммы Lactiplantibacillus plantarum 38 и Bifidobacterium bifidum ЛВА-3. По этому же методу был изучен тип взаимоотношений E.coli М-17, Lactiplantibacillus plantarum 38, Bifidobacterium bifidum ЛВА-3 как между собой, так и с представителями консорциума Lactiplantibacillus plantarum 8 RA-3, Limosilactobacillus fermentum 39, Limosilactobacillus fermentum 90 TC-4, и бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, штаммы Lactiplantibacillus plantarum 8 RA-3 и Limosilactobacillus fermentum 39 проявляли выраженный антагонизм к штамму Lactiplantibacillus plantarum 38 (подавлял его рост), который, в свою очередь, демонстрировал выраженный антагонизм в отношении штаммов Bifidobacterium bifidum 1 и Е. coli М-17. Штамм Bifidobacterium bifidum ЛВА-3 подавлялся штаммом Lactiplantibacillus plantarum 8 RA-3 и штаммом Escherichia coli М-17. Проведенные исследования определили возможный консорциум штаммов-продуцентов для создания жидкой формы мультиштаммового пробиотика - это Lactiplantibacillus plantarum 8 RA-3, Limosilactobacillus fermentum 39, Limosilactobacillus fermentum 90 TC-4, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379, Escherichia coli M-17.

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии ВЭЖХ-МС было проведено метаболомное профилирование всех штаммов-консорциума. Результаты представлены в таблице 5.

Пробиотические композиции получают традиционными для данной области техники способами, которые выбирают в зависимости от типа и формы готового препарата.

Так, известен способ приготовления лекарственного средства «Бификол, лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь» в сухой сублимированной форме, в качестве стартерных культур которого используются B.bifidum 1, E.coli М-17 (ФС 42-3268-99, НД ЛС 002258-190618, РУ ЛС 002158), включающий раздельное культивирование штаммов бифидобактерий и кишечной палочки на разных питательных средах. Для культивирования бифидобактерий в соответствии с регламентом производства используется питательная среда КД-5 следующего состава:

- панкреатический гидролизат казеина с конечной концентрацией аминного азота 150±10_мг/%- 350 мл/л

- дрожжевой автолизат - 650 мл/л

- NaCl - 5,0 г/л

- лактоза - 10,0 г/л

- L-цистеин солянокислый - 0,1 г/л

- агар микробиологический - 0,75 г/л

Для масштабирования биомассы культивируются три генерации: I генерация - 48 часов, II генерация - 48 часов, III генерация в реакторе - 18 часов.

Для культивирования E. coli М-17 - казеиновый бульон:

- Гидролизат казеина при содержании аминного азота 220-270 мг/% - 1 л

- Пептон 0,5-0,6%

- рН 7,6-7,7

Для масштабирования биомассы культивируются три генерации: I генерация - 18 часов, II генерация - 18 часов, III генерация в реакторе - 7 часов.

По окончании культивирования третьи генерации стартерных культур смешиваются в соответствии с регламентом производства в соотношении 4 части бифидобактерий и 1 часть кишечной палочки (4:1). Далее добавляется защитная среда СЖМ. Биомасса разливается по флаконам и подвергается лиофильному высушиванию.

Недостатками данного пробиотика являются, во-первых, лиофилизированная форма, при получении которой большая часть полезных метаболитов разрушается. Кроме того, бактериям в сухой форме нужно время для восстановления своих физиологических и метаболических функций. Во-вторых - использование в рецептуре среды лактозы в количестве 10,0 г/л делает невозможным применение препарата, приготовленного по данному способу у людей с лактазной недостаточностью. В-третьих, использование только штамма В.bifidum 1, 1 штамма кишечной палочки и отсутствие лактобацилл не решает проблему создания психобиотика, поскольку этот препарат не содержит активных продуцентов ГАМК, масляной, янтарной, изовалериановой и валериановой кислот, и не дает возможности использовать данный пробиотик на фоне применения любых антибактериальных препаратов. Его возможности ограничиваются антибиотикорезистентностью двух штаммов-продуцентов.

В качестве прототипа нами рассматривается способ приготовления лечебно-профилактического препарата из живых штаммов микроорганизмов лактобацилл и бифидобактерий «LB-комплекс ПЛЮС», (патент РФ №2517734, 27.05.2014). Способ включает совместное культивирование штаммов В. bifidum 791, В. longum 379 начиная с I генерации и отдельное культивирование В.bifidum 1; совместное культивирование лактобацилл L.plantarum 8RA-3, L.fermentum 39 начиная с I генерации и отдельное культивирование L.fermentum 90-ТС-4. После 24 часового культивирования биомассу I генерации смешивают со свежей питательной средой, продолжают культивировать в течение 48 часов. По окончании культивирования полученные биомассы смешивают в соотношении 2:1:2:1. Способ предполагает использование двух гидролизатно-казеиновых сред ГКС-Л для лактобацилл и ГКС-Б для бифидобактерий, приготавливаемых на основе одного полупродукта - гидролизата казеина- с уровнем аминного азота 450-500 мг %. Среды отличаются между собой: уровнем аминного азота 160-170 мг % и 180-200 мг %, содержанием агара 0,75±0,1 г и 1,0±0,1 г, уровнем рН 7,8-8,0 и 8,5-8,6 соответственно. В качестве углеводной составляющей обеих сред используется фруктоза в количестве 10,0±0,1 г/л. Готовый препарат расфасовывают во флаконы с учетом необходимой суточной дозы. Способ позволяет за 72 часа получить готовый к употреблению препарат с высоким содержанием живых микробных клеток, воздействующий на лакто- и бифидокомпоненты микрофлоры человека.

Недостатком данного способа является отсутствие возможности изменять соотношение количества отдельных штаммов в готовом продукте в зависимости от их метаболической активности. Двухэтапный ускоренный метод культивирования не позволяет в полной мере реализоваться метаболическому потенциалу выбранных штаммов-продуцентов. Пробиотик «LB-комплекс ПЛЮС», полученный способом, рассматриваемым в качестве прототипа, не имеет в своем составе кишечной палочки, вследствие чего не содержит достаточного количества нейрометаболитов (ГАМК, масляной, янатарной, валериановой кислот и пр.), необходимых для его использования больным с когнитивными нарушениями, в том числе с расстройствами аутистического спектра (РАС).

Эти недостатки устраняются предлагаемым техническим решением.

Решаемая задача: создание жидкого многокомпонентного бифидо-, лакто- и колисодержащего симбиотика с высоким уровнем нейрометаболитов, продуцируемых семью входящими в консорциум штаммами, и способа его приготовления для коррекции кишечной микробиоты и когнитивных нарушений, в том числе при расстройствах аутистического спектра.

Техническим результатом заявляемых технических решений является создание жидкого симбиотика из семи живых штаммов бифидо-, лактобактерий и E. coli М-17, который содержит повышенный по сравнению с «LB-комплекс ПЛЮС» уровень нейрометаболитов таких, как ГАМК, бутират, пировиноградная, янтарная, изомасляная, изовалериановая и валериановая кислоты при сниженном уровне молочной и глиоксиловой кислот, что позволяет использовать его для нормализации микробиоты кишечника и коррекции когнитивных нарушений, в том числе при расстройствах аутистического спектра.

Указанный технический результат достигается жидким симбиотиком, включающим биомассу штаммов Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 39, Limosilactobacillus fermentum 90TC-4, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379, и Escherichia coli M-17 с содержанием КОЕ/мл не менее 10⁸ в следующих процентных соотношениях: Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3 - 14-16 об. %, Limosilactobacillus fermentum 39 - 14-16 об. %, L. fermentum 90-TC-4 - 15-17 об. %, Bifidobacterium bifidum 1 - 15-17 об. %, В. bifidum 791 - 16-18 об. %, B. longum 379 - 13-15 об. %, Escherichia coli M-17 - 6-8 об. % и продукты метаболизма всех штаммов-продуцентов.

Указанный технический результат достигается также тем, что способ его получения, включающий использование штаммов-продуцентов Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 90-TC-4, Limosilactobacillus fermentum 39, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791 и Bifidobacterium longum 379, их культивирование на гидролизатно-казеиновой питательной среде, содержащей в качестве питательной основы гидролизат казеина, хлористый натрий, пептон, фруктозу, агар-агар, аскорбиновую кислоту, заключается в использовании в качестве дополнительного штамма-продуцента штамма Escherichia coli M-17, раздельном культивировании трех генераций штаммов-продуцентов на гидролизатно-казеиновой питательной среде, применении после культивирования первой генерации MALDI TOF масс-спектрометрии, позволяющей подтвердить чистоту штаммов и обеспечить при использовании способа точное соответствие изготавливаемого препарата заявленному, смешивании полученных третьих генераций биомасс штаммов-продуцентов Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 90-TC-4, Limosilactobacillus fermentum 39, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379, Escherichia coli M-17 в процентных соотношениях: Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3 - 14-16 об. %, Limosilactobacillus fermentum 39 - 14-16 об. %, L. fermentum 90-TC-4 - 15-17 об. %, Bifidobacterium bifidum 1 - 15-17 об. %, B. bifidum 791 - 16-18 об. %, В. longum 379 - 13-15 об. %, Escherichia coli M-17 - 6-8 об. % и расфасовке с учетом необходимой для пациентов суточной дозы.

Способ осуществляют следующим образом:

На первом этапе готовят впрок полупродукт следующим образом: питьевую воду (ГОСТ 2874-82) нагревают до 48±1°С, засыпают казеин (казеин пищевой кислотный по ГОСТ 4960-74) в количестве 60-70 г на литр, размешивают, доводят рН до 7,8-8,2 ЕД 20% раствором NaOH, ставят в термостат на ротационную качалку для перемешивания со скоростью 20-30 оборотов в минуту при температуре 48±1°С на 24±1 час. Затем выключают качалку и оставляют для осаждения еще на 24±1 час, после выдержки в термостате сливают надосадочную жидкость через бумажный фильтр и устанавливают рН 8,2-8,5.

Из полученного полупродукта готовят две питательные среды: ГКС и ГКС-М по следующим рецептурам.

Для приготовления ГКС разводят цельный гидролизат дистиллированной водой до показателя аминного азота 220-230 мг %. В разведенный гидролизат добавляют из расчета на 1 литр 5 г хлористого натрия, 2 г пептона, 10 г фруктозы, 0,25 г аскорбиновой кислоты и 0,75 г предварительно стандартно приготовленного агар-агара. Доводят РН до 8,1-8,3 20% раствором NaOH.

Среду ГКС-М приготавливают как и ГКС, но не добавляют агар-агар. Готовые среды ГКС и ГКС-М стерилизуют по единому способу при 0,5 атм 30 минут.

В качестве штаммов-продуцентов используют Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 90-TC-4, L. fermentum 39, Bifidobacterium bifidum 1, B. Bifidum 791, B. longum 379 и дополнительно Escherichia coli M-17.

Культивирование штаммов-продуцентов лактобацилл и бифидобактерий производят следующим образом.

I генерация: в ампулы с сухими штаммами добавляют по 1 мл среды ГКС-М, далее содержимое каждой ампулы переносят в отдельный флакон с 10,5 мл ГКС-М. Затем штаммы - продуценты культивируют в течение 24±1 час при температуре 37±1°С. После культивирования проводят MALDI TOF масс-спектрометрию для подтверждения чистоты штамма и соответствия выросшего штамма заявленному в рецептуре.

II генерация: полученные биомассы I генерации, каждую отдельно, смешивают с питательной средой ГКС 10 мл I генерации вносят в 110 мл среды, и продолжают культивировать в течение 24±1 час при температуре 37±1°С. После культивирования контролируют концентрацию бактериальных клеток.

III генерация: полученные биомассы II генерации каждого штамма отдельно смешивают с питательной средой ГКС 100 мл II генерации вносят в 1000 мл ГКС, термостатировали 48±1 час при температуре 37±1°С. После культивирования контролируют концентрацию бактериальных клеток.

Проводят культивирование штаммов E.coli M17 также как и культивирование штаммов-продуцентов лактобацилл и бифидобактерий с тем отличием, что продолжительность инкубации - 18±1 час для всех генераций.

По окончании культивирования полученные биомассы всех семи штаммов-продуцентов смешивают в следующих процентных соотношениях: Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3 - 14-16 об. %, Limosilactobacillus fermentum 39 - 14-16 об. %, L. fermentum 90-TC-4 - 15-17 об. %, Bifidobacterium bifidum 1 - 15-17 об. %, В. bifidum 791 - 16-18 об. %, В. longum 379 - 13-15 об. %, Escherichia coli M-17 - 6-8 об. %.

Разливают смесь биомассы стартерных культур лактобацилл, бифидобактерий и кишечной палочки в стерильные флаконы с учетом суточной дозы пробиотика. Затем флаконы маркируют, фасуют в коробки.

Симбиотик может быть получен реакторным методом.

Полученный заявленным способом жидкий симбиотик назван «БиКоэЛь».

Нами проведено исследование полученных пробиотиков по предложенному способу (вариант 1), и способам, отличающимся от предложенного иными процентными соотношениями смешиваемых штаммов-продуцентов III генерации (вариант 2 и вариант 3) (таблица 5).

Как видно из таблицы 6, симбиотик по варианту 2 отличался нежелательно высоким уровнем молочной и глиоксиловой кислот и недостаточным уровнем ГАМК, бутирата, валериановой и янтарной кислот. По количеству живых микробных клеток на 20-е сутки хранения было отмечено снижение количества отдельных штаммов лактобацилл и бифидобактерий и угнетение роста E. coli М-17 до 10⁵ КОЕ/мл (таблица 7).

Симбиотик по варианту 3 отличался еще более высокой концентрацией молочной и глиоксиловой кислот и низким уровнем ГАМК и бутирата, и на фоне достаточного уровня лакто- и бифидобактерий угнетением E. coli - М-17 до 10⁵ КОЕ/мл (таблица 6,7).

В связи с этим, симбиотики, приготовленные по вариантам два и три не могут быть рекомендованы для применения больным с РАС, поскольку у больных с РАС обнаруживается повышенное содержание молочной и глиоксиловой кислот, повышенное содержание последней непосредственно влияет на продукцию большого количества оксалатов, в результате развивается гипероксалурия, на фоне пониженного уровня нейромедиаторов (ГАМК, бутират и др.). По количеству живых микробных клеток штаммов-продуцентов второй и третий варианты не соответствуют поставленной задаче получения мультиштаммового пробиотика с количеством каждого представителя консорциума не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Как видно из таблиц 6 и 7, препарат по варианту 1, оптимален по количеству метаболитов и живых микробных клеток, а за выходом значений из интервалов по варианту 1 мы не получаем препарат с заявленными свойствами.

Заявленный способ позволяет получить жидкий симбиотик для использования его с целью коррекции кишечной микробиоты и когнитивных нарушений, в том числе при РАС. Трехэтапное масштабирование биомассы позволяет повысить уровень выхода метаболитов, а контроль соответствия штаммов-продуцентов заявленным на первом этапе культивирования способствует высокому качеству готового препарата. Заявленный жидкий симбиотик представляет собой гипоаллергеный безлактозный многокомпонентный пробиотик (симбиотик, психобиотик) с высоким содержанием живых микробных клеток всех семи стартерных культур в единице объема с достаточной концентрацией нейрометаболитов (ГАМК, КЦЖК, триптофан, бутират, янтарная кислота и др.).

Пример получения жидкого симбиотика «БиКоэЛь» предложенным способом

На первом этапе готовили впрок полупродукт следующим образом: питьевую воду (ГОСТ 2874-82) нагревали до 48±1°С, засыпали казеин (казеин пищевой кислотный по ГОСТ 4960-74) в количестве 60-70 г на литр, размешивали, доводили рН до 7,8-8,2 ЕД 20% раствором NaOH, ставили в термостат в 5 л бутыли на ротационную качалку для перемешивания со скоростью 20-30 оборотов в минуту при температуре 48±1°С на 24±1 час. Затем выключали качалку и оставляли для осаждения еще на 24±1 час, после выдержки в термостате сливали надосадочную жидкость через бумажный фильтр и устанавливали рН 8,2-8,5. Готовый гидролизат содержал 490-520 мг % аминного азота. Хранили гидролизат впрок под хлороформом 1% к объему при температуре 4±1°С.

Из полученного полупродукта готовили две питательные среды: ГКС и ГКС-М по следующим рецептурам.

Для приготовления ГКС разводили цельный гидролизат дистиллированной водой до показателя аминного азота 220-230 мг % (в среднем из расчета на 1 л полупродукта 1,8 л воды). В разведенный гидролизат добавляли из расчета на 1 литр 5 г хлористого натрия, 2 г пептона, 10 г фруктозы, 0,25 г аскорбиновой кислоты и 0,75 г предварительно стандартно приготовленного агар-агара. Доводили РН до 8,1-8,3 20% раствором NaOH.

Среда ГКС-М отличалась отсутствием в своем составе агар-агара. Готовые среды ГКС и ГКС-М стерилизовали по единому способу при 0,5 атм 30 минут.

Использование непрерывного перемешивания в течение процесса гидролиза сокращало время проведения гидролиза по сравнению с прототипом на 24 часа и обеспечивало выход полупродукта с более высоким уровнем аминного азота 490-520 мг % по сравнению с прототипом 450-500 мг %, что позволило повысить уровень аминного азота, обеспечивающего высокий выход биомассы штамма-продуцента, до 220-230 мг % по сравнению с прототипом 160-200 мг %.

Использование данного состава сред, приготовленных по представленному способу, кроме сохранения высокого уровня выхода биомассы, также способствовало накоплению в составе продукта ценных бактериальных метаболитов, таких, как ГАМК КЦЖК, триптофан необходимых для больных с РАС (таблица 8). Аскорбиновая кислота использовалась как стимулятор роста для бифидобактерий и лактобацилл.

Пептон представлял собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, солей и микроэлементов, соответственно, являлся источником питательных веществ.

Агар увеличивал вязкость среды, что обеспечивало равномерный рост микроорганизмов по всей толще среды и равномерное потребление факторов роста и питательных веществ.

Фруктоза - углевод - энергетический субстрат и источник углерода.

Хлорид натрия поддерживал оптимальное осмотическое давление в клетке.

В качестве штаммов-продуцентов использовали Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 90-TC-4, L. fermentum 39, Bifidobacterium bifidum 1, B. Bifidum 791, B. longum 379 и дополнительно Escherichia coli M-l 7.

Культивирование штаммов-продуцентов лактобацилл и бифидобактерий производили следующим образом.

I генерация: в ампулы с сухими штаммами добавляли по 1 мл среды ГКС-М, далее содержимое каждой ампулы переносили в отдельный флакон с 10,5 мл ГКС-М. Затем штаммы - продуценты культивировали в течение 24±1 час при температуре 37±1°С. После культивирования отбирали по 1,5 мл первой генерации каждой культуры и проводили MALDI TOF масс-спектрометрию для подтверждения чистоты штамма и соответствия выросшего штамма заявленному в рецептуре. MALDI TOF масс-спектрометрия позволяла получить уникальный индивидуальный спектр каждого штамма. Ограничением метода являлась возможность изучения штамма только в жидких неагаризованных средах, поэтому для получения I генерации штаммов использовали безагаровую жидкую среду ГКС-М.

II генерация: полученные биомассы I генерации, каждую отдельно, смешивали с питательной средой ГКС 10 мл I генерации вносили в 110 мл среды, и продолжали культивировать в течение 24±1 час при температуре 37±1°С. После культивирования отбирали по 10 мл II генерации каждого штамма для контроля концентрации бактериальных клеток в 1 мл с использованием денситометра. Концентрация клеток бактерий (клеток /мл) - 10¹⁰-10¹¹.

III генерация: полученные биомассы II генерации каждого штамма отдельно смешивали с питательной средой ГКС 100 мл II генерации вносили в 1000 мл ГКС, термостатировали 48±1 час при температуре 37±1°С. По окончании культивирования отбирали по 10 мл III генерации каждого штамма для контроля концентрации бактериальных клеток в 1 мл с использованием денситометра. Концентрация клеток бактерий (клеток /мл) - 10¹⁰-10¹².

В результате получили по 1,09 л III генерации трех штаммов лактобацилл и трех штаммов бифидобактерий.

Культивирование штаммов E. coli МП проводили по описанному выше способу, сначала на среде ГКС-М, затем на среде ГКС в тех же соотношениях I, II и III генерации. Изменяли продолжительность инкубации, она составляла 18±1 час для всех генераций при температуре 37±1°С.

По окончании культивирования полученные биомассы всех семи штаммов - продуцентов смешивали в следующих процентных соотношениях: Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3 - 15 об. %, Limosilactobacillus fermentum 39 - 15 об. %, L. fermentum 90-TC-4 - 16 об. %, Bifidobacterium bifidum 1-16 об. %, B. bifidum 791 - 17 об. %, B. longum 379 - 14 об. %, Escherichia coli M-17 - 7 об. % с учетом метаболического потенциала штаммов-продуцентов.

Таким образом, получен безлактозный многокомпонентный пробиотик (симбиотик, психобиотик, метабиотик) с высоким содержанием живых микробных клеток всех семи биосовместимых штаммов-продуцентов в единице объема с повышенным по сравнению с «LB-комплекс ПЛЮС» уровнем нейрометаболитов таких, как ГАМК, бутират, пировиноградная, янтарная, изомасляная, изовалериановая и валериановая кислоты при сниженном уровне молочной и глиоксиловой кислот (таблица 8).

Разливали смесь биомассы стартерных культур лактобацилл, бифидобактерий и кишечной палочки в стерильные флаконы по 2,5, 5,0 мл с учетом суточной дозы пробиотика.

Герметично закрывали резиновой пробкой и алюминиевым колпачком. Затем флаконы маркировали, фасовали в коробки по 9 штук, (минимальный курс лечения 27 дней, то есть три коробки на курс лечения). Хранили препарат при температуре +6±2°С с сохранностью специфической активности симбиотика не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Жидкий симбиотик может использоваться перорально в 1 или 2 приема по 1 флакону в день перед едой с водой, компотом, морсом, соком и т.п. с температурой не выше 30°С. Перед употреблением флакон с препаратом тщательно встряхивают.

Показания к применению:

- в качестве пробиотической составляющей диетотерапии при любых заболеваниях, осложненных дисбактериозом кишечника, в качестве средств, нормализующих микрофлору: при длительном лечении антибиотиками, химио- и гормональными препаратами; при аллергических заболеваниях (аллергодерматозы, экземы и т.п.), при хронических заболеваниях ЖКТ, острых кишечных инфекциях бактериальной и вирусной этиологии (дизентерия, коли-энтерит, сальмонеллез, ОКИ невыясненной этиологии, рото- и энтеровирусная инфекция, а также после перенесенной новой коронавирусной инфекции и др.), пищевых токсикоинфекциях; для коррекции когнитивных нарушений, в том числе при расстройствах аутического спектра (РАС) с целью улучшения социализации, минимизации нежелательного поведения, повышения потенциала к обучению, эффективности психолого-педагогической коррекции и др.

Может применяться при лактазной недостаточности и сахарном диабете, а также на фоне антибактериальной терапии с учетом фармакокинетики и фармакодинамики антибиотика/химиопрепарата.

Доклинические исследования жидкого симбиотика «БиКоэЛь», приготовленного по способу, представленному в заявке, были проведены в центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России на животной модели «когнитивные расстройства» и на модели «дисбиоз кишечника».

Клиническая апробация симбиотика «БиКоэЛь», приготовленного по способу, представленному в заявке, была проведена в следующих государственных бюджетных учреждения здравоохранения г. Нижнего Новгорода: ГБУЗ НО «Городская детская клиническая больница №1», Институт педиатрии Университетской клиники ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России (2-ое педиатрическое отделение), Институт травматологии и ортопедии Университетской клиники ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России (2 ожоговое отделение детей).

Проведенные доклинические и клинические испытания подтвердили, что заявленный многокомпонентный пробиотик является безвредным и эффективным средством, нормализующим микрофлору кишечника и корригирующим когнитивные нарушения, в том числе расстройства аутистического спектра.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен жидкий симбиотик, содержащий не менее 10⁸ КОЕ/мл живых микробных клеток Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379, Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 39, Limosilactobacillus fermentum 90TC-4, Escherichia coli M-17 и продукты их метаболизма, включая нейрометаболиты. Предложен способ получения симбиотика из штаммов-продуцентов, культивируемых на гидролизатно-казеиновой питательной среде, содержащей гидролизат казеина, хлористый натрий, пептон, фруктозу, агар-агар, аскорбиновую кислоту. Проводят раздельное культивирование трех генераций штаммов-продуцентов. Смешивают полученные три генерации биомасс штаммов-продуцентов. Способ позволяет получить жидкий симбиотик с широким спектром физиологического действия и высоким уровнем нейрометаболитов. 2 н.п. ф-лы, 8 табл., 1 пр.

1. Жидкий симбиотик, содержащий штаммы Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 90-TC-4, Limosilactobacillus fermentum 39, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379, отличающийся тем, что дополнительно содержит штамм Escherichia coli М-17 с количеством живых микробных клеток каждого штамма-продуцента не менее 10⁸ КОЕ/мл в соотношениях: Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3 - 14-16 об. %, Limosilactobacillus fermentum 39 - 14-16 об. %, L. fermentum 90-TC-4 - 15-17 об. %, Bifidobacterium bifidum 1 - 15-17 об. %, В. bifidum 791 - 16-18 об. %, B.longum 379 - 13-15 об. %, Escherichia coli M-17 - 6-8 об. % и продукты их метаболизма, включая нейрометаболиты.

2. Способ получения жидкого симбиотика, заключающийся в том, что используют штаммы-продуценты Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 90-TC-4, Limosilactobacillus fermentum 39, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379, которые культивируют на гидролизатно-казеиновой питательной среде, содержащей в качестве питательной основы гидролизат казеина, хлористый натрий, пептон, фруктозу, агар-агар, аскорбиновую кислоту, смешивают полученные биомассы штаммов-продуцентов, расфасовывают с учетом необходимой для пациентов суточной дозы, отличающийся тем, что используют в качестве дополнительного штамма-продуцента штамм Escherichia coli М-17; раздельно культивируют биомассы штаммов-продуцентов на гидролизатно-казеиновой питательной среде, причем I генерацию штаммов-продуцентов лактобацилл и бифидобактерий получают из сухой маточной культуры ее внесением в гидролизатно-казеиновую питательную среду без агара в соотношении 1:11 с последующим культивированием при температуре 37±1°С в течение 24±1 часов, далее подтверждают чистоту штаммов и соответствие выросших штаммов заявленным в рецептуре методом MALDI TOF масс-спектрометрии, полученные биомассы I генерации, каждую отдельно, смешивают с гидролизатно-казеиновой питательной средой в соотношении 1:11 и культивируют при температуре 37±1°С в течение 24±1 часов, полученные биомассы II генерации каждого штамма отдельно смешивают с гидролизатно-казеиновой питательной средой в соотношении 1:10 и термостатируют при температуре 37±1°С в течение 48±1 часов, штаммы E.coli Ml7 культивируют аналогично штаммам-продуцентам лактобацилл и бифидобактерий в течение 18±1 часов для всех генераций; полученные генерации биомасс штаммов-продуцентов Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3, Limosilactobacillus fermentum 90-TC-4, Limosilactobacillus fermentum 39, Bifidobacterium bifidum 1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379, Escherichia coli M-17 смешивают в процентных соотношениях: Lactiplantibacillus plantarum 8RA-3 - 14-16 об. %, Limosilactobacillus fermentum 39 - 14-16 об. %, L. fermentum 90-TC-4 - 15-17 об. %, Bifidobacterium bifidum 1 - 15-17 об .%, B. bifidum 791 - 16-18 об. %, B.longum 379 - 13-15 об. %, Escherichia coli M-17 - 6-8 об. %.