Способ снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин Российский патент 2023 года по МПК G01N33/00 A61K31/4709 A61K33/38 A61P31/04 A61L2/18 A61L101/02 

Изобретение относится к областям медицины и ветеринарии и может быть использовано для разрушения биопленок.

Существование большинства видов бактерий в природе происходит не в виде свободноживущих (планктонных) клеток, а путем организации ими специфических образований - биопленок: сообществ микробных клеток, прикрепленных к поверхности или друг к другу и заключенных в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ (Donlan R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms / R.M. Donlan, J.W. Costerton // Clin microbiol rev. - 2002. - vol. 15(2). - P. 167-193.; Mulcahy L.R. Pseudomonas aeruginosa biofilms in disease / L.R. Mulcahy // Microb ecol. - 2014. - vol. 68(1). - P. 1-12.).

Особое значение имеет образование биопленок патогенными бактериями. Известно, что 80% всех инфекционных заболеваний, свыше 60% всех внутрибольничных инфекций вызываются микроорганизмами, находящимися в биопленках (Pintucci, J.P. Biofilms and infections of the upper respiratory tract / J.P. Pintucci [et al.] // Eur rev med pharmacol sci. - 2010. - vol. 14(8). - P. 683-690.; Сидоренко, С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека / С.В. Сидоренко // Инфекции в хирургии. - 2012. - №3. - С. 16-20). С наличием биопленок связывают течение длительно рецидивирующих хронических инфекционных заболеваний, трудно поддающихся стандартной терапии (Smith A., Buchinsky FJ, Post JC. Eradicating chronic ear, nose, and throat infections: a systematically conducted literature review of advances in biofilm treatment / A. Smith [et al.] // Otolaryngol head neck surg. - 2011. - vol. 144(3). - P. 338-347.; Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Журн. микробиол. - 2011. - №3. - С. 99-109).

Вследствие этого лечение и профилактика вызываемых биопленками заболеваний представляет большие трудности (Romling U., Balsalobre С.Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative treatment strategies U. Romling, C. Balsalobre // J intern med. - 2012. - vol. 272. - P. 541- 561. doi: 10.1111/joim.12004; Gupta P., Sarkar S., Das B. Biofilm, pathogenesis and prevention - a journey to break the wall: a review / P. Gupta, S. Sarkar, B. Das // Arch microbiol. - 2015. - vol. 198(1). - P. 1-15. doi 10.1007/s00203-015-l 148-6).

Нарастание резистентности бактерий к уже имеющимся препаратам и дефицит структур, которые потенциально могли бы лечь в основу новых антибиотиков, поставили на повестку дня поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами.

Известен также способ разрушения биопленок прямым воздействием излучения фемтосекундного лазера (патент Украины №104321, 27.01.2014), предполагающий длительное (10-20 минут) высокоинтенсивное облучение ультрафиолетовыми лазерными импульсами варьируемой мощности и длины волны. К недостаткам способа можно отнести возможное повреждение здоровых клеток интенсивным ультрафиолетовым излучением лазера -вплоть до повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты и возникновения мутаций.

Возможен отрыв биопленки от поверхности, на которой она располагалась, под действием лазерного излучения в слое жидкости (заявка Японии №2004-275979, опубл. 07.10.2004). Хотя принцип действия не раскрывается, можно предположить, что в этом случае генерируются ударные волны, отрывающие биопленку от поверхности (Song W.D., Hong М.Н., Lukyanchuk В. Laser-induced cavitation bubbles for cleaning of solid surfaces / W.D. Song [et al.] // Journal of applied physics. - 2004. - vol. 95(6). - P. 2952-2956). Этот способ с определенными допущениями (по механической прочности) применим к абиотическим поверхностям, однако на поверхности тканей может вызывать разрушения клеток здоровой ткани и микрососудов крови (Shen N., Datta D., Schaffer СВ. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor / N. Shen [et al.] // Mech. Chem. Biosyst. - 2005. - vol. 2(1). - P. 17-25).

Наиболее близким аналогом является способ разрушения биопленок лазерным излучением с использованием композиции, содержащей серебро (публикация международной заявки WO 2014/089552, опубл. 12.06.2014). Разрушение биопленки на поверхности раны предполагается под действием локальной ударной волны, генерированной наносекундным лазерным излучением (длина волны 1064 нм) в слое серебросодержащей композиции на поверхности биопленки и вдавливающей бактерицидную композицию вглубь раны под действием последовательных лазерных импульсов. Основным недостатком метода является прямое лазерное воздействие на ткани, а также сложность оптимальной фокусировки, позволяющей под действием ударной волны обеспечить разрушение биопленки и транспорт композиции вглубь, но одновременно избежать разрушения компонент и целых клеток здоровой такни, а также микрососудов.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин.

Поставленная задача достигается тем, что способ снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл энрофлоксацина с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Proteus vulgaris АТСС 6380 или изолята Proteus vulgaris выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течении 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат снижения биопленкообразования, определяют по изменению интенсивности биопленкообразования, путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Результат снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин определяли согласно методике (O'Toole G.A. Biofilm formation as microbial development / G.A. O'Toole // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - N. 54. - P. 49-79). Использование данного способа позволяет оценить способность лечебной композиции, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин препятствовать образованию биопленок у Proteus vulgaris.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Препарат Арговит представляет собой комплекс высокодисперсных частиц кластерного серебра, поливинилпирролидона и водного раствора, полученного электронно-лучевой обработкой водного раствора. Препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, спорообразующих и аспорогенных бактерий в виде монокультур и микробных ассоциаций (ООО НПЦ «Вектор-Вита», vectot-vita@ngs.ru).

Препарат Энрофлоксацин антибактериальный лекарственный препарат группы фторхинолонов, обладает широким спектром антибактериального действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. (Организация-разработчик «Hebei Yuanzheng Pharmaceutical Co., Ud.» /«Хэбэй Юаньчжэн Фармасьютикал Ко., Лтд.», КНР).

Пример 1

Способ снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин, заключался следующим образом: в стерильный 96 луночный планшет вносят 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл энрофлоксацина с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Proteus vulgaris АТСС 6380 или изолята Proteus vulgaris выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течении 24 ч при Т=37,5±0,5°С.

После инкубации, планктонные микроорганизмы из каждой лунки удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Затем в лунки вносят по 0,125 мл 0,1% раствора генциан фиолетового, окрашивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее раствор удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Планшет высушивают на воздухе и в каждую лунку вносят 0,2 мл 95% этилового спирта, инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, затем полученную спиртовую вытяжку в объеме 0,125 мл переносят в чистый 96 луночный планшет и замеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Пример 2

Способ снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин, продемонстрирован в сравнении с действием антибактериального препарата Лактобай на референтном штамме Proteus vulgaris АТСС 6380 или изоляте Proteus vulgaris выделенном от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Результаты исследования показали, что применение лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин при мастите коров вызванного Proteus vulgaris позволило снизить срок клинического проявления болезни в 1,2 раза по сравнению с лечением Лактобай, при этом установлено снижение интенсивности процесса биопленкообразования с 2,12±0,01 до 0,69+0,01 усл. ед.

Применение препарата Энрофлон гель вызывало рост биопленкообразования более чем на 1,35 раза с 2,12+0,01 до 2,87+0,01

Изучение влияние лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин на референтный штамм Proteus vulgaris АТСС 6380 позволило установить снижение процесса биопленкообразования с 1,47±0,01 до 0,82±0,01 усл. ед., что подтверждает исследование изолята Proteus vulgaris выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Антибактериальный препарат Энрофлон гель как и при исследовании с изолятом Proteus vulgaris вызывал рост процесса биопленкообразования в 1,3 раза с 1,47±0,01 до 1,94±0,01 усл. ед. Влияние препаратов различных фармакологических групп на процесс биопленкообразования Proteus vulgaris, усл. ед представлены в таблице 1.

Проведенные исследования показали, что применение лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин значительно снижал уровень биопленкообразования как у референтного штамма Proteus vulgaris АТСС 6380, так и у его изолята Proteus vulgaris.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способу снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией. Способ снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл энрофлоксацина с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Proteus vulgaris АТСС 6380 или изолята Proteus vulgaris, выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат снижения биопленкообразования определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Вышеописанное изобретение позволяет снизить биопленкообразование Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин. 1 табл., 2 пр.

Способ снижения биопленкообразования Proteus vulgaris лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и энрофлоксацин, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл энрофлоксацина с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Proteus vulgaris АТСС 6380 или изолята Proteus vulgaris, выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат снижения биопленкообразования определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.