Способ исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацин Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 C12Q1/18 

Изобретение относится к областям медицины и ветеринарии и может быть использовано для разрушения биопленок.

Биопленки представляют собой сообщества микроорганизмов, прикрепленных к поверхности, живущих в самогенерируемой матрице внеклеточных полимерных веществ (Donlan R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms / R.M. Donlan, J.W. Costerton // Clin microbiol rev. - 2002. - V. 15(2). - P. 167-193; Mulcahy L.R. Pseudomonas aeruginosa biofilms in disease / L.R. Mulcahy [et al.] // Microb Ecol. - 2014. - V. 68(1). - P. 1-12.).

Особое значение имеет образование биопленок патогенными бактериями. Известно, что 80% всех инфекционных заболеваний, свыше 60% всех внутрибольничных инфекций вызываются микроорганизмами, находящимися в биопленках (Pintucci, J.P. Biofilms and infections of the upper respiratory tract / J.P. Pintucci [et al.] // Eur rev med pharmacol sci. - 2010. - V. 14(8). - P. 683-690; Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека / С.В. Сидоренко // Инфекции в хирургии. - 2012. - №3. - С. 16-20).

С наличием биопленок связывают течение длительно рецидивирующих хронических инфекционных заболеваний, трудно поддающихся стандартной терапии (Smith A., Buchinsky FJ, Post JC. Eradicating chronic ear, nose, and throat infections: a systematically conducted literature review of advances in biofilm treatment / A. Smith [et al.] // Otolaryngol head neck surg. - 2011. - V. 144(3). - P. 338-347; Романова Ю.М. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Журн. микробиол. - 2011. - №3. - С .99-109).

Вследствие этого лечение и профилактика вызываемых биопленками заболеваний представляет большие трудности (Romling U. Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative treatment strategies (Review) / U. Romling, С J. Balsalobre // Intern Med. - 2012. - V. 272. - P. 541- 561. doi: 10.1111/joim.12004; Gupta P. Biofilm, pathogenesis and prevention - a journey to break the wall: a review / P. Gupta, S. Sarkar, B. Das // Arch microbiol. - 2015. - V. 198(1). - P. 1-15. doi 10.1007/s00203-015-1148-6).

Нарастание резистентности бактерий к уже имеющимся препаратам и дефицит структур, которые потенциально могли бы лечь в основу новых антибиотиков, поставили на повестку дня поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами.

Известен также способ разрушения биопленок прямым воздействием излучения фемтосекундного лазера (патент Украины №104321, 27.01.2014), предполагающий длительное (10-20 минут) высокоинтенсивное облучение ультрафиолетовыми лазерными импульсами варьируемой мощности и длины волны. К недостаткам способа можно отнести возможное повреждение здоровых клеток интенсивным ультрафиолетовым излучением лазера -вплоть до повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты и возникновения мутаций.

Возможен отрыв биопленки от поверхности, на которой она располагалась, под действием лазерного излучения в слое жидкости (заявка Японии №2004-275979, опубл. 07.10.2004). Хотя принцип действия не раскрывается, можно предположить, что в этом случае генерируются ударные волны, отрывающие биопленку от поверхности (Song W.D. Laser-induced cavitation bubbles for cleaning of solid surfaces / W.D. Song, M.H. Hong, B. Lukyanchuk // Journal of applied physics. - 2004. - V. 95(6). - P. 2952-2956). Этот способ с определенными допущениями (по механической прочности) применим к абиотическим поверхностям, однако на поверхности тканей может вызывать разрушения клеток здоровой ткани и микрососудов крови (Shen N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor / N. Shen, D. Datta, C.B. Schaffer // Mech. Chem. Biosyst. - 2005. - V. 2(1). - P. 17-25).

Наиболее близким аналогом является способ разрушения биопленок лазерным излучением с использованием композиции, содержащей серебро (публикация международной заявки WO 2014/089552, опубл. 12.06.2014). Разрушение биопленки на поверхности раны предполагается под действием локальной ударной волны, генерированной наносекундным лазерным излучением (длина волны 1064 нм) в слое серебросодержащей композиции на поверхности биопленки и вдавливающей бактерицидную композицию вглубь раны под действием последовательных лазерных импульсов. Основным недостатком метода является прямое лазерное воздействие на ткани, а также сложность оптимальной фокусировки, позволяющей под действием ударной волны обеспечить разрушение биопленки и транспорт композиции вглубь, но одновременно избежать разрушения компонент и целых клеток здоровой такни, а также микрососудов.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацина.

Поставленная задача достигается тем, что способ исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацина, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл ципрофлоксацина с содержанием действующего вещества 2 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Escherichia coli АТСС 25922 или изолята Escherichia coli выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат исследования снижения биопленкообразования, определяют по изменению интенсивности биопленкообразования, путем использования раствора генцианового фиолетового и измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Результат исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli, лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацина определяли согласно методике (O'Toole G.A. Biofilm formation as microbial development / G.A. O'Toole, H.B. Kaplan // Ann. Rev. Microbiol. 2000. V. 54. P. 49-79). Использование данного способа исследования позволяет оценить способность лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацина препятствовать образованию биопленок у Escherichia coli.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Препарат арговит представляет собой комплекс высокодисперсных частиц кластерного серебра, поливинилпирролидона и водного раствора, полученного электронно-лучевой обработкой водного раствора. Препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, спорообразующих и аспорогенных бактерий в виде монокультур и микробных ассоциаций (ООО НПЦ «Вектор-Вита», vectot-vita@ngs.ru).

Препарат ципромаг в качестве действующего вещества в 1 мл содержит ципрофлоксацин 100 мг. Антибактериальный лекарственный препарат группы фторхинолонов обладает широким спектром антибактериального действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (ПАВ «Красфарма», г. Красноярск, ул. 60 лет Октября, 2, Россия).

Пример 1

Способ исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацина, заключался следующим образом: в стерильный 96 луночный планшет вносят 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл ципрофлоксацина с содержанием действующего вещества 2 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Escherichia coli АТСС 25922 или изолята Escherichia coli выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С.

После инкубации, планктонные микроорганизмы из каждой лунки удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Затем в лунки вносят по 0,125 мл 0,1% раствора генциан фиолетового, окрашивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее раствор удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Планшет высушивают на воздухе и в каждую лунку вносят 0,2 мл 95% этилового спирта, инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, затем полученную спиртовую вытяжку в объеме 0,125 мл переносят в чистый 96 луночный планшет и замеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Пример 2

Способ исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацина, продемонстрирован в сравнении с действием антибактериального препарата ципромаг на референтном штамме Escherichia coli АТСС 25922 или изоляте Escherichia coli выделенном от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Применение препарата ципромаг вызывало рост биопленкообразования более чем на 1,34 раза с 2,07±0,01 до 2,78±0,01 усл. ед. Изучение влияние лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацина на референтный штамм Escherichia coli АТСС 25922 позволило установить снижение процесса биопленкообразования с 1,20±0,01 до 0,64±0,01 усл. ед., что подтверждает исследование изолята Escherichia coli выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Антибактериальный препарат ципромаг как и при исследовании с референтным штаммом Escherichia coli АТСС 25922 вызывал рост процесса биопленкообразования в 1,27 раза с 1,20±0,01 до 1,82±0,01 усл. ед. Влияние препаратов различных фармакологических групп на процесс биопленкообразования Escherichia coli, усл. ед. представлены в таблице 1.

Проведенные исследования показали, что применение лечебной композиции содержащей наночастицы серебра и ципромага, где в качестве в качестве действующего вещества содержится ципрофлоксацин значительно снижал уровень биопленкообразования как у референтного штамма Escherichia coli АТСС 25922, так и у его изолята Escherichia coli.

Изобретение относится к областям медицины и ветеринарии. Раскрыт способ исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацин, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл ципрофлоксацина с содержанием действующего вещества 2 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Escherichia coli АТСС 25922 или изолята Escherichia coli, выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат исследования снижения биопленкообразования определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем использования раствора генцианового фиолетового и измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Изобретение обеспечивает возможность исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli. 1 табл., 2 пр.

Способ исследования снижения биопленкообразования Escherichia coli лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и ципрофлоксацин, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл ципрофлоксацина с содержанием действующего вещества 2 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Escherichia coli АТСС 25922 или изолята Escherichia coli, выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат исследования снижения биопленкообразования определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем использования раствора генцианового фиолетового и измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.