Способ снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes препаратом, содержащим наночастицы серебра Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/24 C12N1/20 

Изобретение относится к областям медицины и ветеринарии и может быть использовано для разрушения биопленок.

Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде. Подобный способ существования бактерий создает большие проблемы, как в медицине, так и ветеринарии. В настоящее время стало известно, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантируемого оборудования - линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхности этих устройств (Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. - 2004. - Т. 40, №11. - С. 1445-1456).

Вследствие этого лечение и профилактика вызываемых биопленками заболеваний представляет большие трудности (Romling U., Balsalobre С.. Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative treatment strategies (Review). J Intern Med. - 2012. - vol. 272. - P. 541- 561. doi: 10.1111/joim.12004; Gupta P., Sarkar S., Das В., Bhattacharjee S., Tribedi P. Biofilm, pathogenesis and prevention - a journey to break the wall: a review. Arch Microbiol. - 2015. - vol. 198(1). - P. 1-15. doi 10.1007/s00203-015-1 148-6).

Нарастание резистентности бактерий к уже имеющимся препаратам и дефицит структур, которые потенциально могли бы лечь в основу новых антибиотиков, поставили на повестку дня поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами.

Известен также способ разрушения биопленок прямым воздействием излучения фемтосекундного лазера (патент Украины №104321, 27.01.2014), предполагающий длительное (10-20 минут) высокоинтенсивное облучение ультрафиолетовыми лазерными импульсами варьируемой мощности и длины волны. К недостаткам способа можно отнести возможное повреждение здоровых клеток интенсивным ультрафиолетовым излучением лазера - вплоть до повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты и возникновения мутаций.

Возможен отрыв биопленки от поверхности, на которой она располагалась, под действием лазерного излучения в слое жидкости (заявка Японии №2004-275979, опубл. 07.10.2004). Хотя принцип действия не раскрывается, можно предположить, что в этом случае генерируются ударные волны, отрывающие биопленку от поверхности (Song, W.D., Hong, M.H., Lukyanchuk, В., & Chong, Т.С.(2004). Laser-induced cavitation bubbles for cleaning of solid surfaces. Journal of applied physics 95(6), 2952-2956). Этот способ с определенными допущениями (по механической прочности) применим к абиотическим поверхностям, однако на поверхности тканей может вызывать разрушения клеток здоровой такни и микрососудов крови (Shen, N., Datta, D., Schaffer, С. В., LeDuc, P., Ingber, D.E., & Mazur, E. (2005). Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst, 2(1), 17-25.).

Наиболее близким аналогом является способ разрушения биопленок лазерным излучением с использованием композиции, содержащей серебро (публикация международной заявки WO 2014/089552, опубл. 12.06.2014). Разрушение биопленки на поверхности раны предполагается под действием локальной ударной волны, генерированной наносекундным лазерным излучением (длина волны 1064 нм) в слое серебросодержащей композиции на поверхности биопленки и вдавливающей бактерицидную композицию вглубь раны под действием последовательных лазерных импульсов. Основным недостатком метода является прямое лазерное воздействие на ткани, а также сложность оптимальной фокусировки, позволяющей под действием ударной волны обеспечить разрушение биопленки и транспорт композиции вглубь, но одновременно избежать разрушения компонент и целых клеток здоровой такни, а также микрососудов.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes препаратом, содержащим наночастицы серебра.

Поставленная задача достигается тем, что способ снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes препаратом, содержащим наночастицы серебра, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Streptococcus pyogenes АТСС 19615 или изолята Streptococcus pyogenes выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течении 24 ч при T=37,5±0,5°С, результат снижения биопленкообразования, определяют по изменению интенсивности биопленкообразования, путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Результат снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes препаратом, содержащим наночастицы серебра определяли согласно методике (O'Toole G.A. et al. 2000). Использование данного способа позволяет оценить способность препаратов серебра препятствовать образованию биопленок у Streptococcus pyogenes.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Препарат Арговит представляет собой комплекс высокодисперсных частиц кластерного серебра, поливинилпирролидона и водного раствора, полученного электронно-лучевой обработкой водного раствора. Препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, спорообразующих и аспорогенных бактерий в виде монокультур и микробных ассоциаций (ООО НПЦ «Вектор-Вита», vectot-vita@ngs.ru).

Пример 1

Способ снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes препаратом, содержащим наночастицы серебра заключался следующим образом: в стерильный 96 луночный планшет вносят 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Streptococcus pyogenes АТСС 19615 или изолята Streptococcus pyogenes выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течении 24 ч при T=37,5±0,5°С.

После инкубации, планктонные микроорганизмы из каждой лунки удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Затем в лунки вносят по 0,125 мл 0,1% раствора генциан фиолетового, окрашивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее раствор удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Планшет высушивают на воздухе и в каждую лунку вносят 0,2 мл 95% этилового спирта, инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, затем полученную спиртовую вытяжку в объеме 0,125 мл переносят в чистый 96 луночный планшет и замеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Пример 2

Способ снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes препаратом, содержащим наночастицы серебра, продемонстрирован в сравнении с действием антибактериального препарата мастисан на референтном штамме Streptococcus pyogenes АТСС 19615 или изолята Streptococcus pyogenes выделенном от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Результаты исследования показали, что применение препарата содержащего наночастицы серебра арговит при мастите коров вызванного Streptococcus pyogenes позволило снизить срок клинического проявления болезни в 1,4 раза по сравнению с лечением мастисан, при этом установлено снижение интенсивности процесса биопленкообразования с 1,32±0,02 до 0,97±0,01 усл. ед.

Применение препарата мастисан вызывало рост биопленкообразования более чем на 1,9 раза с 1,32±0,02 до 2,47±0,01 усл. ед.

Изучение влияние наночастиц препарат арговит на референтный штамм Streptococcus pyogenes АТСС 19615 позволило установить снижение процесса биопленкообразования с 1,04±0,02 до 0,82±0,01 усл. ед., что подтверждает исследование изолята Streptococcus pyogenes выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Антибактериальный препарат мастисан как и при исследовании с изолятом Streptococcus pyogenes вызывал рост процесса биопленкообразования в 1,6 раза с 1,04±0,02 до 1,64±0,01 усл. ед. Влияние препаратов различных фармакологических групп на процесс биопленкообразования Streptococcus pyogenes, усл. ед представлены в таблице 1.

Проведенные исследования показали, что применение препарата арговит содержащего наночастицы серебра значительно снижал уровень биопленкообразования как у референтного штамма Streptococcus pyogenes АТСС 19615, так и у изолята Streptococcus pyogenes.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes препаратом, содержащим наночастицы серебра, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл вносят 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Streptococcus pyogenes АТСС 19615 или изолята Streptococcus pyogenes выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Τ=37,5±0,5°С, результат снижения биопленкообразования определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Изобретение позволяет снизить биопленкообразование Streptococcus pyogenes. 1 табл.

Способ снижения биопленкообразования Streptococcus pyogenes, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл вносят 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Streptococcus pyogenes АТСС 19615 или изолята Streptococcus pyogenes выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат борьбы с биопленками определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.