Способ исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур Российский патент 2024 года по МПК G01N33/15 C12Q1/18 A61K31/545 A61K33/38 

Изобретение относится к областям медицины и ветеринарии и может быть использовано для разрушения биопленок.

Биопленки являются формой микробных сообществ, фиксированных на различных абиотических и биотических поверхностях. Биопленки состоят из микробных клеток и ассоциированного с ними внеклеточного матрикса собственного производства, который состоит из полисахаридов, белков и ДНК (Donlan R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms / R.M. Donlan, J.W. Costerton // Clin microbiol rev. - 2002. - vol. 15(2). - P. 167-193).

Особое значение имеет образование биопленок патогенными бактериями. Известно, что 80% всех инфекционных заболеваний, свыше 60% всех внутрибольничных инфекций вызываются микроорганизмами, находящимися в биопленках (Pintucci, J.P. Biofilms and infections of the upper respiratory tract / J.P. Pintucci [et al.] // Eur rev med pharmacol sci. - 2010. - vol. 14(8). - P. 683-690.; Сидоренко, С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека / С.В. Сидоренко // Инфекции в хирургии. - 2012. - №3. - С. 16-20).

К настоящему времени накопилось значительное количество данных о том, что микроорганизмы в составе биопленки влияют на течение хронических воспалительных заболеваний. Биопленки обладают высоким уровнем толерантности к антителам, антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам и фагоцитам (Афиногенова, А.Г. Микробные биопленки ран: состояние вопроса / А.Г. Афиногенова, Е.Н. Даровская // Травматология и ортопедия России. - 2011. - №3. - С. 119-125). Стандартные методы антибактериального лечения направлены на отдельно существующие планктонные клетки, тогда как бактерии внутри биопленки размножаются и вновь диссеминируют после завершения курса лечения, нередко формируя очаги хронической персистирующей инфекции, способствуя рецидивированию заболевания (Lewis K. Persister cells and the riddle of biofilm survial /K. Lewis // Biochemistry. - 2005. - №54. - P. 49-79).

Вследствие этого лечение и профилактика вызываемых биопленками заболеваний представляет большие трудности (Romling U., Balsalobre С.Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative treatment strategies (Review) / U. Romling, C. Balsalobre // J intern med. - 2012. - vol. 272. - P. 541-561. doi: 10.1111/joim.l2004; Gupta P., Sarkar S., Das B. Biofilm, pathogenesis and prevention - a journey to break the wall: a review / P. Gupta, S. Sarkar, B. Das // Arch microbiol. - 2015. - vol. 198(1). - P. 1-15. doi 10.1007/s00203-015-l148-6).

Нарастание резистентности бактерий к уже имеющимся препаратам и дефицит структур, которые потенциально могли бы лечь в основу новых антибиотиков, поставили на повестку дня поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами.

Известен также способ разрушения биопленок прямым воздействием излучения фемтосекундного лазера (патент Украины №104321, 27.01.2014), предполагающий длительное (10-20 минут) высокоинтенсивное облучение ультрафиолетовыми лазерными импульсами варьируемой мощности и длины волны. К недостаткам способа можно отнести возможное повреждение здоровых клеток интенсивным ультрафиолетовым излучением лазера -вплоть до повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты и возникновения мутаций.

Возможен отрыв биопленки от поверхности, на которой она располагалась, под действием лазерного излучения в слое жидкости (заявка Японии №2004-275979, опубл. 07.10.2004). Хотя принцип действия не раскрывается, можно предположить, что в этом случае генерируются ударные волны, отрывающие биопленку от поверхности (Song W.D., Hong М.Н., Lukyanchuk В. Laser-induced cavitation bubbles for cleaning of solid surfaces / W.D. Song [et al.] // Journal of applied physics. - 2004. - vol. 95(6). - P. 2952-2956). Этот способ с определенными допущениями (по механической прочности) применим к абиотическим поверхностям, однако на поверхности тканей может вызывать разрушения клеток здоровой ткани и микрососудов крови (Shen N., Datta D., Schaffer C.B. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor / N. Shen [et al.] // Mech. Chem. Biosyst. - 2005. - vol. 2(1). - P. 17-25).

Наиболее близким аналогом является способ разрушения биопленок лазерным излучением с использованием композиции, содержащей серебро (публикация международной заявки WO 2014/089552, опубл. 12.06.2014). Разрушение биопленки на поверхности раны предполагается под действием локальной ударной волны, генерированной наносекундным лазерным излучением (длина волны 1064 нм) в слое серебросодержащей композиции на поверхности биопленки и вдавливающей бактерицидную композицию вглубь раны под действием последовательных лазерных импульсов. Основным недостатком метода является прямое лазерное воздействие на ткани, а также сложность оптимальной фокусировки, позволяющей под действием ударной волны обеспечить разрушение биопленки и транспорт композиции вглубь, но одновременно избежать разрушения компонент и целых клеток здоровой такни, а также микрососудов.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур.

Поставленная задача достигается тем, что способ исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus, лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл цефтиофура с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат исследования снижения биопленкообразования, определяют по изменению интенсивности биопленкообразования, путем использования раствора генцианового фиолетового и измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Результат исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур определяли согласно методике (O''Toole G.A. Biofilm formation as microbial development / G.A. O'Toole // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - N. 54. - P. 49-79). Использование данного способа исследования позволяет оценить способность лечебной композиции, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур препятствовать образованию биопленок у Staphylococcus aureus.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Препарат Арговит представляет собой комплекс высокодисперсных частиц кластерного серебра, поливинилпирролидона и водного раствора, полученного электронно-лучевой обработкой водного раствора. Препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, спорообразующих и аспорогенных бактерий в виде монокультур и микробных ассоциаций (ООО НПЦ «Вектор-Вита», vectot-vita@ngs.ru).

Препарат Цефтиофур антибактериальный препарат широкого спектра действия группы цефалоспоринов III поколения, обладает широким спектром антибактериального действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (Производитель "Hebei Hope Harmony Pharmaceutical Co., Ltd", Industrial area, Yuanshi Country, Shijiazhuang, Hebei Province, 050041, Китай).

Пример 1

Способ исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus, лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и цефтиофур, заключался следующим образом: в стерильный 96 луночный планшет вносят 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл цефтиофур с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С.

После инкубации, планктонные микроорганизмы из каждой лунки удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Затем в лунки вносят по 0,125 мл 0,1% раствора генциан фиолетового, окрашивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее раствор удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Планшет высушивают на воздухе и в каждую лунку вносят 0,2 мл 95% этилового спирта, инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, затем полученную спиртовую вытяжку в объеме 0,125 мл переносят в чистый 96 луночный планшет и замеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Пример 2

Способ исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus, лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и цефтиофур продемонстрирован в сравнении с действием антибактериального препарата цефтиофур на референтном штамме Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus выделенном от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Применение препарата цефтиофур вызывало рост биопленкообразования более чем на 1,58 раза с 1,74 ±0,01 до 2,75±0,01 усл. ед.

Изучение влияние лечебной композицией содержащей наночастицы серебра и цефтиофур на референтный штамм Staphylococcus aureus АТСС 25953 позволило установить снижение процесса биопленкообразования с 1,20±0,01 до 0,63±0,01 усл. ед., что подтверждает исследование изолята Staphylococcus aureus выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.

Антибактериальный препарат цефтиофур как и при исследовании с изолятом Staphylococcus aureus вызывал рост процесса биопленкообразования в 1,66 раза с 1,20±0,01 до 1,99±0,01 усл. ед. Влияние препаратов различных фармакологических групп на процесс биопленкообразования Staphylococcus aureus, усл. ед представлены в таблице 1.

Проведенные исследования показали, что применение лечебной композиции содержащей наночастицы серебра и цефтиофур значительно снижает уровень биопленкообразования как у референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25953, так и у его изолята Staphylococcus aureus АТСС 25953.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано для разрушения биопленок. Способ исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур, заключается в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл цефтиофура с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5×10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus, выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С. Результат исследования снижения биопленкообразования определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем использования раствора генцианового фиолетового и измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Изобретение обеспечивает возможность исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур. 1 табл., 2 пр.

Способ исследования снижения биопленкообразования Staphylococcus aureus лечебной композицией, содержащей наночастицы серебра и цефтиофур, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона, 0,2 мл цефтиофура с содержанием действующего вещества 50 мг/мл и 0,2 мл 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25953 или изолята Staphylococcus aureus, выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат исследования снижения биопленкообразования определяют по изменению интенсивности биопленкообразования путем использования раствора генцианового фиолетового и измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.