Способ получения радиомеченных частиц карбоната кальция с использованием тетраксетана в качестве хелатирующего вещества Российский патент 2023 года по МПК A61K9/14 A61K51/02 A61K51/08 A61K51/12 

Настоящее изобретение относится к получению биологически инертных и биодеградирующих нано- и микроструктур гибридного состава (неорганические и полимерные нано- и микроструктуры), включающим хелатирующие соединения и вещества, позволяющие обеспечить удержание радиоизотопов и продуктов их распада, и может быть применено в радионуклидной терапии и визуализации онкологических заболеваний.

Наиболее актуальные разработки в области создания радиофармакологических препаратов используют молекулярные векторы, таких как моноклональные антитела, пептиды малые молекулы; наночастицы органического или неорганического состава, липосомы и микросферы [Peltek OO, Muslimov AR, Zyuzin MV, Timin AS. Correction to: Current outlook on radionuclide delivery systems: from design consideration to translation into clinics. J Nanobiotechnology. 2020 Jan 2;18(1):2. doi: 10.1186/s12951-019-0558-z] в качестве агента, доставляющего терапевтический/диагностический радионуклид к очагу интереса.

Молекулярные векторы могут быть веществами белковой природы: антителами, пептидами (аналоги соматостатина, бомбезина) или малыми молекулами (производные мочевины - ингибиторы

Глутаматкарбоксипептидазы II), которые взаимодействуют с антигенами и рецепторами на поверхности опухолевых клеток, либо имитируют вещества, участвующие в тканевом и клеточном метаболизме [Воронцова М.С. Изучение эффективности модульных нанотранспортеров для радионуклидной терапии злокачественных опухолей (экспериментальное исследование). 2019]. Настоящее изобретение относится к гибридным биодеградирующим нано- и микроструктурам, предназначенным для применения в радиоизотопной терапии и диагностике физиологических и патологических процессов.

Следующие примеры в литературе являются примерами соответствующих публикаций уровня техники, которые никоим образом не должны быть истолкованы как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения. Например, Ибритумомаб тиуксетан представляет собой моноклональное антитело анти-CD20, конъюгированное с радиоактивным Иттрием-90 [

WO 2004054615, опубл. 01.07.2004]. Также, описана композиция [Ас-225]-p-SCN-Bn-DOTA/HuM195K, представляющая собой моноклональное антитело, конъюгированное с актинием [WO 2011011592, - 27.01.2011]. Также, описан протокол мечения рекомбинантных гуманизированных мини-антител, специфичных к раковоассоциированному антигену HER2/neu, диагностическим γ-излучающим радиоизотопом или короткоживущими α-излучающими радиоизотопами [RU 2537175, опубл. 27.12.2014].

Недостатком применения данного вида направляющих молекул являются особенности, связанные со способом присоединения радиоактивной метки. Использование хелатирующих агентов, химическая энергия связи которых с радионуклидом меньше, чем энергия отдачи, образующаяся после первого распада; делают невозможным эффективное применение моноклональных антител для доставки ряда радионуклидов способных к каскаду распадов, так как дочерние изотопы вылетают из структуры хелатирующей агента моноклонального антитела и оказывают токсическое воздействие на клетки и ткани вне очага интереса.

Понятие молекулярного вектора также включает в себя пептиды, являющиеся лигандами для клеточных рецепторов. Они успешно применяются для рецепторной визуализации и адресной радионуклидной терапии и имеют ряд преимуществ по сравнению с моноклональными антителами. Низкая молекулярная масса рассматриваемых соединений позволяет им быстро выводится из нецелевых тканей, помимо этого, пептиды за счет размеров легче проникают внутрь органов, демонстрируя лучшую фармакокинетику, а также преимущественно не являются иммуногенными. В качестве примера для описываемых соединений можно указать смесь йодида и альфа-фетопротеина [RU 2404812, опубл.-27.11.2010]. Описана также композиция 18FcMet-связывающих пептидов [WO 2012022676, опубл. 23.02.2012] и новые способы присоединения радиоизотопа к полипептидам [RU 2537175, опубл. 27.12.2014].

Среди недостатков данных соединений необходимо отметить их низкую потенциальную устойчивость к разрушению в процессе метаболизма [Richter S. and Wuest F. 18F-Labeled Peptides: The Future Is Bright. Molecules, 2014, 19, 12, 20536-20556.]. На данный момент существуют препараты на основе лютеция-177 [Benešová M., Schafer M., Bauder-Wust U., et al. Preclinical evaluation of a tailor-made DOTA-conjugated PSMA inhibitor with optimized linker moiety for imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. The Journal of Nuclear Medicine, 2015, 56, 914-920]; [Weineisen M., Schottelius M., Simecek J., et al. 68Ga- and 177Lu-labeled PSMA I&T: optimization of a PSMA-targeted theranostic concept and first proof-of-concept human studies. The Journal of Nuclear Medicine, 2015, 56, 1169-1176].

Кроме того, использование хелатирующих агентов, химическая энергия связи которых с радионуклидом меньше, чем энергия отдачи, образующаяся после первого распада; делают невозможным эффективное применение указанного типа направляющих молекулярных векторов для доставки радионуклидов способных к каскаду распадов, так как дочерние изотопы вылетают из структуры хелатирующего агента и оказывают токсическое воздействие на клетки и ткани вне очага интереса. Также разрабатываются радиофармакологические препараты на основе бомбезина - пептида земноводных, являющегося гомологом гастрин-релизинг пептида у животных. Однако, необходимы дальнейшие исследования, по изучению корреляции между данными доклинических исследований на моделях онкологических заболеваний in vivo и потенциальной эффективностью разрабатываемых препаратов в клинических исследованиях [Ferreira C., Fuscaldi L. L., Townsend D. М., Rubello D., Barros A. L. B. Radiolabeled bombesin derivatives for preclinical oncological imaging. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 87, 58-72].

Липосомальные системы доставки, представляющие из себя фосфолипидные везикулы с одним или более билипидными слоями, активно используются для инкапсуляции и доставки различного рода биологически активных веществ, в том числе радионуклидов. Размеры данных носителей могут варьировать в широких пределах: от < 100 нанометров до > 1000 нанометров, в зависимости от выбранного способа синтеза. В случае наноразмерных липосом важной их особенностью является тенденция к накоплению в очагах опухоли, обеспечивающая пассивную доставку лекарственного вещества [Greish, K. Enhanced permeability and retention (EPR) effect of anticancer nanomedicine drug targeting. Methods in Molecular Biology, 2010, 624, 25-37]. Кроме того, адресность может быть достигнута путем модификации поверхности липосом различными молекулярными векторами, однако данные способы модификации зачастую являются трудоемкими и сложно воспроизводимыми [Sercombe L., Veerati T., Moheimani F., Wu S. Y., Sood A. K., and Hua S. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology, 2015, 6, 286]. Существуют подходы, позволяющие инкорпорировать радиоактивные изотопы в липосомальные системы. Липиды внутреннего билипидного слоя могут быть модифицированы хелатирующими агентами и мечение с радиоактивной меткой происходит на этапе синтеза [Kim J., Pandya D. N., Lee W., Park J. W., Kim Y. J., Kwak W., et al. Vivid tumour imaging utilizing liposome-carried bimodal radiotracer. ACS Medicinal Chemistry Letters. 2015, 5, 390-394]. Также, радионуклид может быть включен в уже сформированную структуру липосом за счет использования липофильных хелатирующих агентов (BMEDA, HMPAO), способствующих проникновению сквозь липидный бислой [Goins B., Bao A., Phillips W. T. Techniques for Loading Technetium-99m and Rhenium186/188 Radionuclides into Preformed Liposomes for Diagnostic Imaging and Radionuclide Therapy. Methods in Molecular Biology, 2017, 1522, 155-178]. Основным недостатком липосомальных систем является нестабильность самих липосом внутри организма, большая часть разрабатываемых препаратов доходит лишь до доклинической фазы испытаний. Тем не менее, некоторые радиофармперпараты на основе липосомальных систем направленной доставки изучаются в клинических исследованиях. Один из этих препаратов включает в себя Рений-188 (¹⁸⁸Re) в качестве одновременно и терапевтического, и диагностического изотопа, связанного с BMEDA, выполняющего роль хелатирующего агента [Schmid G. Nanoparticles: From Theory to Application. 2nd ed: John Wiley & sons, 2011].

Следующим типом носителей для доставки радионуклидов являются наночастицы и микрочастицы органического, неорганического состава и комплексного состава, к числу которых можно отнести изобретение, описываемое в настоящей заявке. Наночастицы состоят из различного рода материалов, размер которых варьирует, а сами они демонстрируют свойства, отличные от свойств субстанций, из которых они изготовлены [Yang M., Cheng K., Qi S., Liu H., Jiang Y., Jiang H., et al. Affibody modified and radiolabeled gold-iron oxide heteronanostructures for tumour PET, optical and MR imaging. Biomaterials, 2013, 34, 2796-2806]. Можно выделить наночастицы, ядра которых состоят из синтетических и природных полимеров, металлов, а также неметаллов. Примером металлических наночастиц являются описанные ранее композитные носители радионуклидов [RU 2013132610, 20.01.2015]. Из неорганических наночастиц неметаллической природы следует выделить наноразмерные (<10 нм) частицы оксида кремния, содержащие в себе флуоресцентный краситель Cy5 и диагностический изотоп йод-124. Указанные частицы не были токсичны в небольшой группе пациентов с метастазирующей меланомой [Phillips E., Penate-Medina O., Zanzonico P. B. Clinical translation of an ultrasmall inorganic optical-PET imaging nanoparticle probe. Science Translational Medicine, 2014, 6, 260, 149]. Также существует ряд разработок по использованию микросфер для направленной доставки радионуклидов. Под ними подразумеваются сферические структуры от 20 до 100 микрон, в полость которых помещается радионуклид. на данный момент зарегистрировано всего два препарата, допущенных к клиническому применению: TheraSphere и SIR-Sphere [Allison C.Yttrium-90 microspheres (TheraSphere and SIR-Spheres) for the treatment of unresectable hepatocellular carcinoma. Issues in Emerging Health Technologies, 2007, 102, 1-6].

Оба препарата в качестве радионуклида содержат в себе Иттрий-90 (⁹⁰Y) и состоят из неразрушающейся оболочки, которая препятствует высвобождению иттрия. TheraSphere представляют собой сферы, оболочка которых состоит из стекла, а SIR-Sphere - из смолы. Их размер колеблется в пределах от 20 до 30 микрон для TheraSphere и от 20 до 60 микрон для SIR-SPHERE.

Из органических носителей радионуклидов стоит отметить описанные ранее полимерные наноструктуры меченые рением-188, получаемые суспендированием частиц органического полимера в растворе, содержащем водорастворимые соли олова (II) и Re-188 [US 2008219923, 11.09.2008], полимерные наночастицы, хелатирующие радиоактивные изотопы и имеющие поверхность, модифицированную с помощью специфических молекул, нацеленных на рецептор Глутаматкарбоксипептидазы II

[WO 2020188318, 24.09.2020], а также частицы, имеющие гидродинамический диаметр 8-40 нм и образующие хелатный комплекс, центральная часть которого содержит сшитую полимерную каркасную структуру и/или разветвленную полимерную каркасную структуру из мономерных звеньев [WO 2015144891, 01.102015]. Указанные носители могут иметь размер, позволяющий применять их для локальной и системной радионуклидной терапии, могут быть модифицированы направляющими лигандами, описанными ранее и, в зависимости от выбранного хелатирующего агента, позволяют включать в свою структуру различные радионуклиды, в том числе альфа-эмиттеры, однако, недостатком этого класса носителей является невозможность удерживать дочерние изотопы, отсоединяющиеся от хелатирующего агента в составе наночастицы. Указанные продукты распада оказывают токсическое воздействие на клетки и ткани вне очага интереса, тем самым существенно ограничивая широту применения указанных носителей в реальной клинической практике.

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является описанная ранее технология получения микрочастиц карбоната кальция (CaCO₃), радиоактивно меченного ²²⁴Ra [WO 2017005648, 12.01.2017], выходящая за объем настоящего изобретения, преимуществом которого является использование пористой неорганической матрицы в качестве ядра, покрытого полимерными биодеградируемыми слоями, формирующими структуру типа "ядро-оболочка". Биологически активное вещество и/или радионуклид включаются в структуру ядра, размер и форма пор которого может быть задана путем изменения условий синтеза, а также могут быть включены в состав полимерных слоев в чистом виде или в составе комплексных соединений. Использование технологии заявленного изобретения позволяет добиться монодисперсной и полидисперсной фракции получаемых носителей в широком диапазоне, кроме того, указанные носители обладают агрегативной устойчивостью и биосовместимостью. Время и характер деградации полученных нано- и микроструктур может быть задано на этапе синтеза. Также путем модификации поверхности носителей молекулярными векторами становится возможным применение их в целях адресной доставки, а включение в состав различных органических и неорганических агентов делает возможными дистанционную и контролируемую активацию деградации носителей с использованием различных внутренних и внешних стимулов химической (включая, но не ограничиваясь pH, температура) и электромагнитных (включая, но не ограничиваясь ультразвук, магнитное поле) стимулов.

К недостаткам ближайшего аналога можно отнести отсутствие возможности доставки в очаг интереса сочетания биологически активных веществ и радиоизотопов для реализации комплексного подхода в диагностике и коррекции различных физиологических и патологических процессов in vitro, ex vivo и in vivo. Это обусловлено отсутствием этапа создания структуры «ядро-оболочка» в технологии рассматриваемого аналога. Процесс формирования устойчивой полимерной оболочки позволяет модифицировать носители и использовать их как для загрузки биологически активных веществ, так и радиоизотопов. Благодаря такой технологии настоящее изобретение применимо для комплексного подхода к диагностике и терапии.

Технической проблемой является необходимость разработки способа получения радиомеченных частиц карбоната, лишенного вышеприведенных недостатков.

Технический результат состоит в обеспечении возможности получения радиомеченных частиц карбоната кальция, пригодных доставки в очаг интереса сочетания биологически активных веществ и радиоизотопов.

Технический результат достигается тем, что в способе получения частиц карбоната кальция с включенным структуру радиоизотопом, в ходе которого подготавливают раствор с человеческим сывороточным альбумином и хелатирующим веществом ДОТА, после чего осуществляют радиомечение полученного раствора изотопом и включают полученные радиомеченные биомолекулы в структуру карбоната кальция, согласно изобретению перед добавлением в раствор человеческий сывороточный альбумин массой 20 г очищают путем смешивания с 200 мкл деионизированной воды и 100 мкл насыщенного раствора диэтилентриаминпентауксусной кислоты, с последующей инкубацией при перемешивании и нагревании до 37°C в течение 30 мин, после чего человеческий сывороточный альбумин очищают от диэтилентриаминпентауксусной кислоты на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/м н и промывают 3 раза 0,1 М водным растворов буфера раствором 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислоты с pH 8.5, а затем очищенный от примесей человеческий сывороточный альбумин разбавляют 0,1 М водным раствором раствором 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислоты до объема 1.8 мл и добавляют 3 мг хелатирующего агента ДОТА в 75 мкл этанола 99.5% и 30 мкл 2 M одного раствора Na₂CO₃, причем модификацию проводят при 37°C в течение 30 минут и при 4°C в течение 24 часов, а полученный модифицированный раствор ДОТА-ЧСА на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/м н и промывают 3 раза 0.05 M водным раствором NH₄Ac с pH 7.5, после чего очищенный раствор ДОТА-ЧСА разбавляют 0,05 М водным растворов NH₄Ac с pH 7.5 до концентрации 3 мг/мл, после чего осуществляют мечение полученного раствора радиоизотопом ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu или ²²⁵Ac, а затем включают полученные радиомеченные биомолекулы в структуру частиц карбоната кальция путем добавления полученного раствора к водному раствору карбоната кальция, перемешивания при 1000 об/мин в течение 30 с до образования осадка и промывают 1 раз 95% раствором этанола и 2-3 раза деионизированной водой, после чего поверхность полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом последовательно покрывают 1 мл водных растворов человеческого сывороточного альбумина в концентрации 6 мг/мл и ДК в концентрации 4 мг/мл с последующей отмывкой водой 1 мл и центрифугированием, после чего процедуру с момента покрытия поверхности полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом растворами повторяют 6-7 раз до формирования устойчивой полимерной оболочки, включающей не менее 7 слоев.

Полученные в рамках заявляемого продукта частицы могут быть использованы для реализации комплексного подхода в диагностике и коррекции различных физиологических и патологических процессов in vivo для обеспечения возможности доставлять в очаг интереса сочетание биологически активных веществ и радиоизотопов. Для онкологических заболеваний, проявляющихся в форме злокачественных солидных образований (карциномы и саркомы), максимально эффективным подходом к и терапии является брахитерапия. Брахитерапия - это высокоточный контактный метод лучевой терапии с использованием радиоактивного источника, который внедряется в очаг злокачественной опухоли, разрушая ее изнутри.

Использование заявленного изобретения в качестве радиоактивного источника позволяет сконцентрировать весь терапевтический потенциал непосредственно внутри образования, что приводит к максимальному эффекту терапии при минимальном воздействии на окружающие здоровые ткани. Существует несколько клинически релевантных примеров:

1) Саркома мягких тканей. Ведущая роль в лечении данного заболевания отводится хирургическому вмешательству, однако в 37-57% случаев остается резидуальная опухоль. Внедрение в терапию облучения ложа опухоли методом непосредственного введения источников излучения на основе предложенного изобретения способствует повышению эффективности терапии;

2) Карцинома простаты. Рутинные методы лечения (хирургия, дистанционное облучение и гормональная терапия) рака простаты характеризуются множеством побочных эффектов (интраоперационные кровопотери, нарушение эрекции, риск в повреждении окружающих тканей, развитие тяжелых нарушений функции печени), которые значительно влияют на качество жизни пациента после терапии. Использование предложенного изобретения в брахитерапии в данном случае является наиболее щадящим подходом, не имеющим тенденции к осложнениям;

3) Карцинома шейки матки. Сегодня рак шейки матки является заболеванием, которое вылечивается полностью благодаря дополнению дистанционного облучения брахитерапией. Введение источников излучения в форме карбоната кальция возможно как непосредственно в опухоль, так и в полость матки, в зависимости от локализации злокачественного образования

Использование носителей на основе карбоната кальция вместо классических пластиковых катетеров или металлических игл для брахитерапии представляет преимущество за счет его контролируемой биодеградации.

Сущность заявляемого изобретения заключается в разработке технологии создания микро- и субмикронных носителей терапевтических и диагностических радионуклидов для биомедицинского применения. Разработанные носители представляют собой гибридные сферические частицы и имеют структуру типа "ядро-оболочка", где ядро представляет собой пористую матрицу карбоната кальция (CaCO₃), содержащую в своем составе радиоизотопный конъюгат, а оболочка состоит из биодеградируемых полимерных слоев. Используя описываемую технологию, можно варьировать размер получаемых частиц в широком диапазоне (100-3000 нм) и включать в структуру полученных носителей различные альфа-, бета и гамма-эмиттеры для нужд лучевой терапии и визуализации физиологических и патологических процессов in vivo методами однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) / позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).

Для синтеза ядер гибридных частиц (CaCO)₃ используется метод совместного осаждения водных растворов неорганических солей (CaCl₂, Na₂CO₃) в присутствии радиомеченных биомолекул или радиоизотопов в индивидуальной форме с последующим послойным формированием биодеградируемой оболочки на поверхности полученных частиц.

В случае использования радионуклидов, для которых характерен каскадный двухступенчатый распад, свойства получаемых с использованием заявленной технологии носителей позволяет удерживать не менее 50-70% дочерних ядер и продуктов распада данного изотопа.

Развитая поверхность частиц, содержащая реакционноспособные группы, позволяет модифицировать носители различными молекулярными лигандами (антитела, пептиды, DARPin и др.) для осуществления адресной доставки радиоизотопов к специфическим тканям и клеткам.

С полученными заявляемым способом частицами были проведены испытания на нескольких моделях опухолевых заболеваний, которые продемонстрировали возможности воздействия разработанным препаратом на паталогические процессы различной локализации. Эффективность при системном введении было исследована на модели метастатического рака легких. Комбинированная терапия частицами карбоната кальция с включенным в структуру изотопом ^l77Lu и противоопухолевым препаратом продемонстрировала специфическое накопление частиц в очаге интереса (легких), а также доказала увеличение эффективности комбинированной терапии по сравнению с моно-терапией. Возможность обеспечения доставки и удержания в очаге интереса при локальном введении была доказана на модели меланомы B16-F10. Локальное введение препарата с загруженным альфа-излучателем ²²⁵Ac в солидное образование показало эффективность данного вида терапии за счет удержания в объеме опухоли терапевтической активности.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

В ходе осуществления способа человеческий сывороточный альбумин массой 20 г очищают путем смешивания с 200 мкл деионизированной воды и 100 мкл насыщенного раствора диэтилентриаминпентауксусной кислоты, с последующей инкубацией при перемешивании и нагревании до 37°C в течение 30 мин. Затем человеческий сывороточный альбумин очищают от диэтилентриаминпентауксусной кислоты на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/м н и промывают 3 раза 0,1 M водным растворов буфера раствором 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислоты с pH 8.5. Далее очищенный от примесей человеческий сывороточный альбумин разбавляют 0,1 M водным раствором раствором 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислоты до объема 1.8 мл и добавляют 3 мг хелатирующего агента ДОТА в 75 мкл этанола 99.5% и 30 мкл 2 M одного раствора Na2CO3. Причем модификацию проводят при 37°C в течение 30 минут и при 4°C в течение 24 часов. Полученный модифицированный раствор ДОТА-ЧСА на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/м н и промывают 3 раза 00.05 M водным раствором NH₄Ac с pH 7.5. Очищенный раствор ДОТА-ЧСА разбавляют 0,05 M водным растворов NH₄Ac с pH 7.5 до концентрации 3 мг/мл. Далее осуществляют мечение полученного раствора радиоизотопом ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu или ²²⁵Ас. Затем включают полученные радиомеченные биомолекулы в структуру частиц карбоната кальция путем добавления полученного раствора к водному раствору карбоната кальция, перемешивания при 1000 об/мин в течение 30 с до образования осадка и промывают 1 раз 95% раствором этанола и 2-3 раза деионизированной водой. После поверхность полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом последовательно покрывают 1 мл водных растворов человеческого сывороточного альбумина в концентрации 6 мг/мл и ДК в концентрации 4 мг/мл с последующей отмывкой водой 1 мл и центрифугированием. Затем процедуру с момента покрытия поверхности полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом растворами повторяют 6-7 раз до формирования устойчивой полимерной оболочки, включающей не менее 7 слоев.

Заявляемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Очистка ЧСА от примесей

Перед модификацией 20 мг ЧСА (раствор 200 мг/мл; 100 мкл) смешивали с 200 мкл деионизированной воды и 100 мкл насыщенного раствора диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА). Смесь инкубировали при перемешивании и нагревании до 37°C в течение 30 мин. ЧСА очищали от ДТПА на ультрафильтрационной ячейке с мембраной из регенерированной целлюлозы (ячейка 0.5 мл, 20 мин, 10.0 об\мин) и промывали 3 раза 0.1 M водным раствором буфера HEPES (pH 8.5).

Пример 2. Модификация ЧСА хелатирующим агентом S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7,10-тетрациклододекан тетрауксусная кислота (ДОТА)

Очищенный от примесей ЧСА разбавили 0.1 M водным раствором 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислоты (HEPES, pH 8.5) до объема 1.8 мл и добавили 3 мг хелатирующего агента ДОТА в 75 мкл этанола (99.5%) и 30 мкл 2 M водного раствора Na₂CO₃. Модификацию проводили при 37°C в течение 30 минут и при 4°C в течение 24 часов. Модифицированный ДОТА-ЧСА очищали на ультрафильтрационной ячейке с мембраной из регенерированной целлюлозы (ячейка 0.5 мл, 20 мин, 10.0 об\мин) и промывали 3 раза 0.05 M водным раствором NH₄Ac (pH 7.5). Очищенный ДОТА-ЧСА разбавляли 0.05 M водным раствором NH₄Ac (pH 7.5) до концентрации 3 мг/мл.

Пример 3. Радиомечение ДОТА-ЧСА изотопом ⁶⁷Ga

100 мкл раствора ДОТА-ЧСА (раствор 3 мг/мл, 300 мкг) в 0.05 M водном растворе NH₄Ac (pH 7.5) смешали со 150 мкл 1 M водного раствора бензоата трис(2-гидроксиэтил)амина, 75 мкл ацетонитрила и 250 мкл раствора [⁶⁷Ga]GaCl₃ в 0.1 M соляной кислоте. Смесь инкубировали при 37°C в течение 15 мин. Модифицированный [⁶⁷Ga]Ga-ДОТА-ЧСА использовался без дополнительной очистки для формирования частиц карбоната кальция (CaCO₃) микронного (1-2 мкм) и/или субмикронного (300-600 нм) размеров.

Пример 4. Радиомечение ДОТА-ЧСА изотопом ⁶⁸Ga

100 мкл раствора ДОТА-ЧСА (раствор 3 мг/мл, 300 мкг) в 0.05 M водном растворе NH₄Ac (pH 7.5) смешали со 150 мкл 1 M водного раствора бензоата трис(2-гидроксиэтил)амина, 75 мкл ацетонитрила и 250 мкл раствора [⁶⁸Ga]GaCl₃ в 0.1 M соляной кислоте. Смесь инкубировали при 37°C в течение 15 мин. Модифицированный [⁶⁸Ga]Ga- ДОТА-ЧСА использовался без дополнительной очистки для формирования частиц карбоната кальция (CaCO₃) микронного (1-2 мкм) и/или субмикронного (300-600 нм) размеров.

Пример 5. Радиомечение ДОТА-ЧСА изотопом ¹⁷⁷Lu

100 мкл раствора ДОТА-ЧСА (раствор 3 мг/мл, 300 мкг) в 0.05 M водном растворе NH₄Ac (pH 7.5) смешали с 25 мкл раствора [¹⁷⁷Lu]LuCl₃ в 0.1 М соляной кислоте. Смесь инкубировали при 37°C в течение 60 мин. Модифицированный [¹⁷⁷Lu]Lu-ДОТА-ЧСА использовался без дополнительной очистки для формирования частиц карбоната кальция (CaCO₃) микронного (1-2 мкм) и/или субмикронного (300-600 нм) размеров.

Пример 6. Радиомечение ДОТА-ЧСА изотопом ²²⁵Ас

100 мкл раствора ДОТА-ЧСА (раствор 3 мг/мл, 300 мкг) в 0.05 M водном растворе NH₄Ac (pH 7.5) смешали с 25 мкл раствора [²²⁵Ас]Ас(NO₃)₃ в 0.1 М соляной кислоте. Смесь инкубировали при 37°C в течение 90 мин. Модифицированный [²²⁵Ас]Ас-ДОТА-ЧСА использовался без дополнительной очистки для формирования частиц карбоната кальция (CaCO₃) микронного (1-2 мкм) и/или субмикронного (300-600 нм) размеров.

Пример 7. Включение радиомеченных биомолекул ([⁶⁷Ga]Ga-ДОТА-ЧСА, [⁶⁸Ga]Ga-ДОТА-ЧСА, [¹⁷⁷Lu]Lu-ДОТА-ЧСА, [²²⁵Ac]Ac-ДОТА-ЧСА) в структуру частиц карбоната кальция (CaCO₃) микронного (1-2 мкм) размеров

1 мл 1 M водного раствора CaCl₂ смешали с 1 мл 1 M водного раствора Na₂CO₃ и 0.575 мл [⁶⁷Ga]Ga-ДОТА-ЧСА или 0.575 мл [⁶⁸Ga]Ga-ДОТА-ЧСА или 0.125 мл [¹⁷⁷Lu]Lu-ДОТА-ЧСА или 0.125 мл [²²⁵Ас]Ас-ДОТА-ЧСА. Реакционную смесь интенсивно перемешивали при 1000 об / мин в течение 30 с при комнатной температуре до образования осадка. Полученный осадок центрифугировали (4000 g) в течение 1-2 мин. и несколько раз промывали (2-3 раза). Затем поверхность полученных частиц CaCO₃ с включенным в структуру радиоизотопом последовательно покрывали водными растворами ЧСА (6 мг/мл) и ДК (4 мг/мл) в объеме 1 мл и инкубации при перемешивании в термошейкере (10 мин, 900 об/мин.) с последующей двукратной отмывкой водой (1 мл) и центрифугированием (1 мин, 400g). Данная процедура повторялась несколько раз (6-7 раз) до формирования устойчивой полимерной оболочки (не менее 7 слоев). Радиохимический выход варьировался в зависимости от типа изотопа: wt(⁶⁷Ga) ~ 75%, wt(⁶⁸Ga) ~ 70%, wt(¹⁷⁷Lu) ~ 85%, wt(²²⁵Ac) ~ 55%.

Пример 8. Включение радиомеченных биомолекул ([⁶⁷Ga]Ga-ДОТА-ЧСА, [⁶⁸Ga]Ga-ДОТА-ЧСА, [¹⁷⁷Lu]Lu-ДОТА-ЧСА, [²²⁵Ac]Ac-ДОТА-ЧСА) в структуру частиц карбоната кальция (CaCO₃) субмикронного (300-600 нм) размеров

5 мл 0.33 M раствора CaCl₂ (этиленгликоль/вода = 5:1) смешали с 0.965 мл 0.33 M раствора Na₂CO₃ (этиленгликоль/вода = 5:1) и 0.575 мл [⁶⁷Ga]Ga-ДОТА-ЧСА или 0.575 мл [⁶⁸Ga]Ga-ДОТА-ЧСА или 0.125 мл [¹⁷⁷Lu]Lu-ДОТА-ЧСА или 0.125 мл [²²⁵Ас]Ас-ДОТА-ЧСА. Реакционную смесь интенсивно перемешивали при 1000 об / мин в течение 20 мин при комнатной температуре до образования осадка. Полученный осадок центрифугировали (10000 об\мин) в течение 1-2 мин., промывали 1 раз 95% раствором этанола и 2-3 раза деионизированной водой. Затем поверхность полученных частиц CaCO₃ с включенным в структуру радиоизотопом последовательно покрывали водными растворами ЧСА (6 мг/мл) и ДК (4 мг/мл) в объеме 1 мл и инкубации при перемешивании в термошейкере (10 мин, 900 об/мин.) с последующей двукратной отмывкой водой (1 мл) и центрифугированием (1 мин, 10000 об\мин). Данная процедура повторялась несколько раз (6-7 раз) до формирования устойчивой полимерной оболочки (не менее 7 слоев). Радиохимический выход варьировался в зависимости от типа изотопа: wt(⁶⁷Ga) ~ 75%, wt(⁶⁸Ga) ~ 70%, wt(¹⁷⁷Lu) ~ 85%, wt(²²⁵Ac) ~ 55%.

Настоящее изобретение относится к способу получения частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом, в ходе которого подготавливают раствор с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) и хелатирующим веществом тетраксетан (ДОТА), после чего осуществляют радиомечение полученного раствора изотопом и включают полученные радиомеченные биомолекулы в структуру карбоната кальция, характеризующемуся тем, что перед добавлением в раствор человеческий сывороточный альбумин массой 20 г очищают путем смешивания с 200 мкл деионизированной воды и 100 мкл насыщенного раствора диэтилентриаминпентауксусной кислоты, с последующей инкубацией при перемешивании и нагревании до 37°С в течение 30 мин, после чего человеческий сывороточный альбумин очищают от диэтилентриаминпентауксусной кислоты на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/мин и промывают 3 раза 0,1 М водным раствором буфера 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты с рН 8.5, а затем очищенный от примесей человеческий сывороточный альбумин разбавляют 0,1 М водным раствором 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты до объема 1.8 мл и добавляют 3 мг хелатирующего агента ДОТА в 75 мкл этанола 99.5% и 30 мкл 2 М водного раствора Na₂CO₃, причем модификацию проводят при 37°С в течение 30 минут и при 4°С в течение 24 часов, а полученный модифицированный раствор ДОТА-ЧСА на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/м н и промывают 3 раза 0.05 М водным раствором NH₄Ac с рН 7.5, после чего очищенный раствор ДОТА-ЧСА разбавляют 0,05 М водным раствором NH₄AC с рН 7.5 до концентрации 3 мг/мл, после чего осуществляют мечение полученного раствора радиоизотопом ⁶⁸Ga, ^l77Lu или ²²⁵Ас, а затем включают полученные радиомеченные биомолекулы в структуру частиц карбоната кальция путем добавления полученного раствора к водному раствору карбоната кальция, перемешивания при 1000 об/мин в течение 20 мин до образования осадка и промывают 1 раз 95% раствором этанола и 2-3 раза деионизированной водой, после чего поверхность полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом последовательно покрывают 1 мл водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 6 мг/мл с последующей отмывкой водой 1 мл и центрифугированием, после чего процедуру с момента покрытия поверхности полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом растворами повторяют 6-7 раз до формирования устойчивой полимерной оболочки, включающей не менее 7 слоев. Настоящее изобретение обеспечивает возможность получения радиомеченных частиц карбоната кальция, пригодных для доставки в очаг интереса сочетания биологически активных веществ и радиоизотопов. 8 пр.

Способ получения частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом, в ходе которого подготавливают раствор с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) и хелатирующим веществом тетраксетан (ДОТА), после чего осуществляют радиомечение полученного раствора изотопом и включают полученные радиомеченные биомолекулы в структуру карбоната кальция, характеризующийся тем, что перед добавлением в раствор человеческий сывороточный альбумин массой 20 г очищают путем смешивания с 200 мкл деионизированной воды и 100 мкл насыщенного раствора диэтилентриаминпентауксусной кислоты, с последующей инкубацией при перемешивании и нагревании до 37°С в течение 30 мин, после чего человеческий сывороточный альбумин очищают от диэтилентриаминпентауксусной кислоты на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/мин и промывают 3 раза 0,1 М водным раствором буфера 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты с рН 8.5, а затем очищенный от примесей человеческий сывороточный альбумин разбавляют 0,1 М водным раствором 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты до объема 1.8 мл и добавляют 3 мг хелатирующего агента ДОТА в 75 мкл этанола 99.5% и 30 мкл 2 М водного раствора Na₂CO₃, причем модификацию проводят при 37°С в течение 30 минут и при 4°С в течение 24 часов, а полученный модифицированный раствор ДОТА-ЧСА на ультрафильтрационной ячейке из регенерированной целлюлозы с ячейкой 0,5 мл в течение 20 мин при 10 об/м н и промывают 3 раза 0.05 М водным раствором NH₄Ac с рН 7.5, после чего очищенный раствор ДОТА-ЧСА разбавляют 0,05 М водным раствором NH₄AC с рН 7.5 до концентрации 3 мг/мл, после чего осуществляют мечение полученного раствора радиоизотопом ⁶⁸Ga, ^l77Lu или ²²⁵Ас, а затем включают полученные радиомеченные биомолекулы в структуру частиц карбоната кальция путем добавления полученного раствора к водному раствору карбоната кальция, перемешивания при 1000 об/мин в течение 20 мин до образования осадка и промывают 1 раз 95% раствором этанола и 2-3 раза деионизированной водой, после чего поверхность полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом последовательно покрывают 1 мл водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 6 мг/мл с последующей отмывкой водой 1 мл и центрифугированием, после чего процедуру с момента покрытия поверхности полученных частиц карбоната кальция с включенным в структуру радиоизотопом растворами повторяют 6-7 раз до формирования устойчивой полимерной оболочки, включающей не менее 7 слоев.