Способ одновременного количественного определения стойких хлорорганических пестицидов в шерсти животных методом газовой хромато-масс-спектрометрии Российский патент 2023 года по МПК G01N33/483 G01N30/04 

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно представляет собой способ одновременного количественного определения хлорорганических пестицидов методом газовой хромато-масс-спектрометрии.

Основным способом количественного определения хлорорганических соединений является использование метода газовой хроматографии с электронно-захватным детектором [RU 2613306 C1; RU 2427832 C1; RU 2741367 C1; М. Тремасова, Т. Борисова. Определение пестицидов Решения Shimadzu. Науки о жизни. 2/2016 (27); RU 2741367 C1].

Известен способ определения гексахлорбензола газохроматографическим методом с использованием детектора электронного захвата [RU 2613306 C1, G01N 33/50, G01N 30/02, опубл. 15.03.2017]. Предложенный способ количественного определения с использованием электронно-захватного детектора (ДЭЗ) позволяет определять гексахлорбензол в крови после предварительной экстракции.

Также известен способ газохроматографического определения гексахлорбензола [RU 2427832 C1, G01N 30/00, опубл. 27.08.2011]. Экстракт образца почвы после предварительной экстракции анализируют на содержание гексахлорбензола методом газовой хроматографии с ДЭЗ.

Недостатками данных способов является необходимость подтверждения структуры хлорорганических соединений методами масс-спектрометрии вследствие наложения времен удерживания соединений, а также велико влияние матрицы на результаты исследования образца, вследствии чего требуется проведение дополнительной идентификации методом газовой хромато-масс-спектроскопии (ГХ-МС).

Известен подбор условий идентификации хлорорганических соединенийметодом ГХ-МС является работа [М. Тремасова, Т. Борисова. Определение пестицидов Решения Shimadzu. Науки о жизни. 2/2016 (27)]. Идентификацию исследуемых соединений проводили в следующих условиях:

Колонка: Rxi-5Sil, 30 м (д.) × 0,25 мм (вн. д.), 0,25 мкм (т.н.ф);

Температура инжектора: 250°С;

Температурная программа термостата: 60°С (1 мин); 25°С/мин; 160°С; 4°C/мин; 240°C; 10°C/мин; 290°C (1 мин);

Режим ввода пробы: без деления потока;

Давление ввода пробы: 250 кПа (1,5 мин);

Режим контроля газа-носителя: постоянная линейная скорость (40,0 см/с);

Объем ввода пробы: 2 мкл;

Температура интерфейса масс-селективного детектора: 300°С;

Температура ионного источника: 200°С;

Время элюирования растворителя: 1,5 мин;

Режим регистрации: FASST (одновременная регистрация в SCAN/SIM-режимах);

Диапазон сканирования масс: 50-600 а.е.м.;

Время события в режиме: SCAN 0,15 с;

Скорость сканирования: 5000 а.е.м./с;

Время события в режиме SIM: 0,3 с.

Недостатком описанного способа является то, что реализован способ полуколичественного определения содержания пестицидов в образце, дорогостоящая пробоподготовка по методу QuEChERS.

Альтернативным способом определения хлорорганических пестицидов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора (УФ-детектор) [RU 2598733 C2, RU 2517075 C1, CN 108896694 B].

Известен способ определения методом ВЭЖХ с детектором УФ в биологическом материале [RU 2598733 C2, G01N 33/00, опубл. 27.09.2016]. Указанный способ определения пестицидов включает в себе экстракцию методом QuEChERS и построение градуировочной зависимости и дальнейший анализ с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором. Данный способ отличается от предложенного тем, что объектом исследования в известном способе является печень рыбы, тогда как в нашей работе реализован способ количественного определения хлорорганических пестицидов в шерсти животных.

Также предложен способ определение тиаклоприда в биологических объектах с использованием ВЭЖХ с УФ-детектором в органах или тканях животного [RU 2517075 C1, G01N 30/95, опубл. 27.05.2014]. В известном способе описывается последовательность действий для экстракции и количественного определения тиаклоприда в органах и тканях животных, что не подходит для проведения количественного определения хлорорганических пестицидов в шерсти животных.

Известен способ скринингового анализа пестицидов в кормах для животных [CN 108896694 B, G01N 30/89, опубл. 27.09.2019]. Предложенный способ разработан для определения пестицидов методом ВЭЖХ-МС в кормах животных, поэтому он не подходит для определения хлоорганических пестицидов в шерсти животных.

Известны условия подтверждения структуры хлорорганических соединений методом ГХ-МС в биоматериалеи известен способ пробоподготовки [RU 2741367 C1, G01N 33/483, G01N 30/04, G01N 1/28, опубл. 25.01.2021]. Недостаток данного способа заключается в неполном разделении хроматографических пиков на хроматограмме, что может затруднить идентификацию и подтверждение структуры исследуемых хлорорганических соединений. Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение, последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой, отличающийся тем, что пробу отбирают из внутренних органов и тканей многоклеточного животного,гомогенизируют и полученный гомогенизированный образец помещают в ацетон и после интенсивного встряхивания добавляют n-гексан при соотношении: навеска образца в г:ацетон в см3:n-гексан в см3, равном 2:4:3, закрывают посуду парафиновой пленкой и оставляют экстрагироваться на лабораторном шейкере со скоростью не более 1 Гц на 25 минут, после чего жидкую фазу декантируют в делительную воронку, содержимое которой двукратно промывают порциями n-гексана по 2-3 см3, после чего в нее вносят 50 см3 1%-ного раствора KCl или NaCl, встряхивают и отстаивают до разделения фаз, после чего водно-ацетоновый слой удаляют, затем осуществляют полное выпаривание n-гексана, для очистки полученного липофильного экстракта от соэкстративных веществ в содержащую его посуду вносят 20-25 см3 n-гексана, тщательно перемешивают и вносят 10 см3 H2SO4 конц, повторно перемешивают содержимое и оставляют на 24 часа, затем отделяют кислоту, а n-гексановый слой переносят в делительную воронку, далее промывают липофильный экстракт в n-гексане порцией 20 см3 1%-ного бикарбоната натрия, а затем порциями бидистиллированной воды объемом 20-30 см3 до нейтральной реакции универсального бумажного индикатора, полученный раствор фильтруют через безводный сульфат натрия и осуществляют полное выпаривание n-гексана.

Техническая задача изобретения состоит в разработке способа одновременного количественного определения стойких хлорорганических пестицидов в шерсти животных методом газовой хромато-масс-спектрометрии с использованием нафталина в качестве внутреннего стандарта.

Технический результат: одновременное количественное определение хлорорганических пестицидов и подтверждение структуры методом ГХ-МС, идентификация хлорорганических пестицидов производится с использованием режима съемки по выделенному иону, характерному для конкретного вещества.

Заявляемый способ одновременного количественного определения стойких хлорорганических пестицидов в шерсти животных методом газовой хромато-масс-спектроскопии включает отбор представительной пробы шерсти не менее 0,0700 г, ее измельчение, взвешивание в конической колбе, растворение в смеси гексана и ацетона в соотношении 3:4, встряхивание и перемешивание на лабораторном шейкере, отделение экстракта от шерсти на фильтровальной бумаге, разделение водорастворимой части от органической, удаление соэкстрактивных липофильных соединений добавлением серной кислоты, нейтрализация 5%-ым раствором карбоната натрия, высушивание экстракта в токе азота, встряхивание виалы с образцом экстракта на вихревом шейкере до полного растворения в гексане, высушивание раствора в токе азота, добавление раствора нафталина к экстракту, полученному после предварительной пробоподготовки, хроматографирование на газовом хромато-масс-спектрометре в режиме съемки по выделенному иону, характерному для конкретного вещества, расчет концентрации хлорорганических пестицидов по градуировочной зависимости, построенной по зависимости соотношения площади определяемого компонента к площади внутреннего стандарта от соотношения концентрации определяемого компонента к концентрации нафталина в диапазоне 0,02-1,00 мкг/мл, пересчет содержания определяемого вещества на навеску пробы шерсти.

Кроме того заявляемое изобретение отличается тем, что в качестве стойких хлорорганических пестицидов используются гептахлор, альдрин, гексахлорциклогексан, группа дихлордифенилтрихлорэтана: дихлордифенилдихлорэтилен, дихлордифенилтрихлорэтан, дихлордифенилдихлорэтан.

Заявленное изобретение по одновременному количественному определению стойких хлорорганических пестицидов методом газовой хромато-масс-спектрометрии с добавлением внутреннего стандарта в шерсти животных состоит из следующих этапов:

1. Пробоподготовка:

1.1 Образец взвешивают в коническую колбу на 100 мл, фиксируя массу навески до 0,0001 знака. Предварительно записывают массу конической колбы с точностью до 0,0001 знака.

1.2. В коническую колбу с образцом помещают 6 мл гексана и 8 мл ацетона. Смесь перемешивают на шейкере в течение 25 минут при скорости 140 оборотов в минуту. После встряхивания жидкую часть переносят в делительную воронку на 250 мл через химическую воронку с фильтровальной бумагой. Коническую колбу промывают гексаном не менее 2 раз по 5 мл. Промывочный раствор добавляют в делительную воронку. Не менее двух раз промывают образец гексаном объемом по 5 мл. Промывочный раствор добавляют в делительную воронку, через химическую воронку с фильтровальной бумагой.

1.3. В делительную воронку помещают 50 мл 1% раствора хлорида натрия. Воронку встряхивают в течение 1 мин и отстаивают до разделения фаз. После удаляют водно-ацетоновый слой (нижний). Бюкс предварительно взвешивают на аналитических весах и фиксируют массу до 0,0001 знака. Гексановый слой переносят в бюкс через безводный сульфат натрия, находящийся в химической воронке с фильтровальной бумагой. Делительную воронку и, отдельно, сульфат натрия промывают по 5 мл гексана. Бюкс с гексановым слоем оставляют высушиваться под током азота. После осушения гексанового слоя бюкс оставляют при комнатной температуре в течение 10 минут. Взвешивают бюкс, массу фиксируют с точностью до 0,0001 знака. Для удаления соэктрактивных соединений в бюкс вносят 20 мл гексана и 10 мл кислоты серной концентрированной и оставляют на 24 часа.

1.4. После реакции с серной кислотой, содержимое бюкса помещают в делительную воронку. Бюкс промывают не менее двух раз 5 мл гексана. Промывной раствор помещают в делительную воронку. Делительную воронку встряхивают в течение 1 мин, затем кислоту отделяют. Если слой кислоты желтого цвета, то повторяют встряхивание с новой порцией кислоты (5 мл) в течение 1 мин. Затем к гексановому слою двукратно добавляют 25 мл 5% раствора карбоната натрия. Воронку встряхивают в течение 1 минуты, отстаивают до разделения фаз и удаляют водный слой. Затем порциями дистиллированной воды по 50 мл промывают органический слой до нейтральной реакции универсальной индикаторной бумаги. Нейтральный гексановый слой фильтруют через безводный сульфат натрия в виалы для хранения объемом 50 мл. Виалы выдерживают под током азота до полного высушивания гексанового слоя. Затем в виалы добавляют по 1,5 мл гексана, тщательно омывают и встряхивают на вихревом шейкере, переносят в виалу на 2 мл. Экстракт высушивают от гексана. Это действие повторяют не менее 3 раз.

2. Приготовление раствора: к полученному экстрактудобавляют раствор нафталина

3. Построение градуировочной зависимости: градуировочная зависимость по отношению площади измеряемого пика в градуировочном растворе к внутреннему стандарту (нафталин) от соотношения концентраций анализируемого пика и внутреннего стандарта в диапазоне 0,02-1,00 мкг/мл.

4. Анализ пробы: анализируют полученный раствор в следующих условиях:

Хроматографические условия

Температура испарителя: 250°С;

Капиллярная колонка RTX-5MS (диметилполисилоксан, 30 м × 0,25 мм, толщина фазы 0,25 мкм);

Температурный режим колонки:старт 60°С, плато 60°С 1 мин, нагрев 25°С/мин до 160°С, нагрев 4°С/мин до 200°С, плато 200°С2 мин, нагрев 10°С/мин до 290°С, плато 290°С 5 мин;

Газ-носитель: гелий марки 6,0;

Скорость потока газа-носителя (гелия): 1,0 мл/мин;

Режим ввода: без деления (Splitless).

Условия детектирования

Детектор: масс-спектрометрический;

Температура источника ионизации: 300°С;

Напряжение источника ионизации: 2,00 кВ (absolute detector gain mode);

Режим съёмки: по выделенному иону (SIM), время сканирования 5-31 мин;

Значения m/z: 181, 219 (гексахлорциклогексан), 246, 318 дихлордифенилдихлорэтилен (ДДЕ), 165, 235 дихлордифенилтрихлорэтан, дихлордифенилдихлорэтан, (ДДТ, ДДД), 100, 272 (гептахлор), 66, 263 (альдрин), 128, 102 (нафталин);

Объем вводимой пробы: 2 мкл.

На фиг. 1 приведена хроматограмма модельной смеси пестицидов с нафталином (1 мкг/мл, нафталин, 0,25 мкг/мл), где время удерживания нафталина 5,80 мин, гексахлорциклогексана - 11,73 мин, гептахлор - 15, 43 мин, альдрин - 17,00 мин, дихлордифенилдихлорэтилен (ДДЕ) - 20,87 мин, дихлордифенилдихлорэтан (ДДД) - 22,11 мин и дихлордифенилтрихлорэтан(ДДТ) - 23,03 мин.

В таблице 1 указаны метрологические параметры градуировки по каждому компоненту.

Таблица 1 - Метрологические параметры градуировки Компонент Диапазон градуировки, мкг/мл Уравнение Коэффициент корреляции ДДЕ 0,019-0,962 y = 7,284×x 0,996 ГХЦГ 0,019-0,974 y = 7,6011×x 0,996 ДДТ 0,018-0,925 y = 14,654×x 0,992 ДДД 0,019-0,974 y = 5,8928×x 0,995 Альдрин 0,020-1,000 y = 4,8807×x 0,995 Гептахлор 0,020-1,000 y = 7,6075×x 0,998

Для каждого градуировочного раствора определяют площадь хроматографического пика. Образец анализируют не менее трех раз. Полученную зависимость содержания компонентов к содержанию внутреннего стандарта методом линейного регрессионного анализа интерполируют. Градуировочная зависимость считается пригодной при коэффициенте корреляции не менее 0,990.

Содержание каждого определяемого компонента в растворе (мкг/мл) рассчитывают по формуле 1:

где C_i - концентрация компонентов в растворе, мкг/мл;

С_ст - концентрация внутреннего стандарта в растворе, мкг/мл;

S_i - площадь хроматографического пика компонента, мВ·с;

S_ст - площадь хроматографического пика внутреннего стандарта, мВ·с;

a - коэффициент градуировочной зависимости.

Содержание пестицидов Х (мкг/г) в анализируемом образце рассчитывают в соответствии с градуировочными графиками по формуле 2:

где m₁ - масса пестицида, найденная по градуировочному графику, мкг;

V₁ - общий объем раствора пробы, из которого взята аликвота для хроматографирования, мл;

m₂ - масса анализируемой пробы, г;

V₂ - объем инжекции, вводимой в хроматограф, мкл.

Ниже приведены примеры использования изобретения

Пример 1. Количественное определение пестицидов в образце шерсти травоядного животного.

Провели пробоподготовку образца шерсти массой 0,1788 г согласно пункту 1.К полученному остатку добавили 200 мкл раствора нафталина (внутренний стандарт) в гексане. Раствор хроматографировали согласно ранее приведенным условиям. Расчет содержания определяемых компонентов проводили с использованием градуировочной кривой (табл.1). Результат расчета содержания пестицидов в образце шерсти травоядного животного представлен в таблице 2. На фиг. 2 представлена хроматограмма образца шерсти травоядного животного, где времена выхода нафталина - 5,75 мин, ГХЦГ - 11,70 мин, ДДТ - 23,10 мин.

Таблица 2 - Содержание пестицидов в образце шерсти травоядного животного Компонент Площадь пика, отн.ед. Содержание, мкг/г ГХЦГ 5886 0,0299 ДДТ 3281 0,0321

Пример 2. Количественное определение пестицидов в образце шерсти хищного животного.

Провели пробоподготовку образца шерсти массой 0,0709 г согласно пункту 1.К полученному остатку добавили 200 мкл раствора нафталина (внутренний стандарт) в гексане. Раствор хроматографировали согласно ранее приведенным условиям. На фиг. 3 представлена хроматограмма образца шерсти хищного животного, где времена выхода нафталина - 5,76 мин, ДДЕ - 20,79 мин, ДДД - 22,03 мин, ДДТ - 22,96 мин. Расчет содержания определяемых компонентов проводили с использованием градуировочной кривой (табл.1). Результат расчета содержания пестицидов в образце шерсти хищного животного представлен в таблице 3.

Таблица 3 - Содержание пестицидов в образце шерсти хищного животного Компонент Площадь пика, отн.ед. Содержание, мкг/г ДДЕ 4655 0,0495 ДДТ 5260 0,1126 ДДД 6598 0,0568

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способу одновременного количественного определения стойких хлорорганических пестицидов в шерсти животных. Способ одновременного количественного определения стойких хлорорганических пестицидов в шерсти животных методом газовой хромато-масс-спектроскопии включает отбор представительной пробы шерсти не менее 0,0700 г, ее измельчение, взвешивание в конической колбе, растворение в смеси гексана и ацетона в соотношении 3:4, встряхивание и перемешивание на лабораторном шейкере, отделение экстракта от шерсти на фильтровальной бумаге, разделение водорастворимой части от органической, удаление соэкстрактивных липофильных соединений добавлением серной кислоты, нейтрализацию 5%-ным раствором карбоната натрия, высушивание экстракта в токе азота, встряхивание виалы с образцом экстракта на вихревом шейкере до полного растворения в гексане, высушивание раствора в токе азота, добавление раствора нафталина в гексане 0,25 мкг/мл к экстракту, полученному после предварительной пробоподготовки, хроматографирование на газовом хромато-масс-спектрометре в режиме съемки по выделенному иону, характерному для конкретного вещества, расчет концентрации хлорорганических пестицидов по градуировочной зависимости, построенной по зависимости соотношения площади определяемого компонента к площади внутреннего стандарта от соотношения концентрации определяемого компонента к концентрации нафталина в диапазоне 0,02–1,00 мкг/мл, пересчет содержания определяемого вещества на навеску пробы шерсти. Вышеописанный способ позволяет одновременно количественно определять хлорорганические пестициды с подтверждением структуры методом ГХ-МС, идентификация хлорорганических пестицидов производится с использованием режима съемки по выделенному иону, характерному для конкретного вещества. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 ил., 2 пр.

1. Способ одновременного количественного определения стойких хлорорганических пестицидов в шерсти животных методом газовой хромато-масс-спектроскопии, включающий отбор представительной пробы шерсти не менее 0,0700 г, ее измельчение, взвешивание в конической колбе, растворение в смеси гексана и ацетона в соотношении 3:4, встряхивание и перемешивание на лабораторном шейкере, отделение экстракта от шерсти на фильтровальной бумаге, разделение водорастворимой части от органической, удаление соэкстрактивных липофильных соединений добавлением серной кислоты, нейтрализацию 5%-ным раствором карбоната натрия, высушивание экстракта в токе азота, встряхивание виалы с образцом экстракта на вихревом шейкере до полного растворения в гексане, высушивание раствора в токе азота, добавление раствора нафталина в гексане 0,25 мкг/мл к экстракту, полученному после предварительной пробоподготовки, хроматографирование на газовом хромато-масс-спектрометре в режиме съемки по выделенному иону, характерному для конкретного вещества, расчет концентрации хлорорганических пестицидов по градуировочной зависимости, построенной по зависимости соотношения площади определяемого компонента к площади внутреннего стандарта от соотношения концентрации определяемого компонента к концентрации нафталина в диапазоне 0,02-1,00 мкг/мл, пересчет содержания определяемого вещества на навеску пробы шерсти.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стойких хлорорганических пестицидов используются гептахлор, альдрин, гексахлорциклогексан, группа дихлордифенилтрихлорэтана: дихлордифенилдихлорэтилен, дихлордифенилтрихлорэтан, дихлордифенилдихлорэтан.