Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале Российский патент 2020 года по МПК G01N1/28 G01N30/02 G01N30/04 

Изобретение относится к способам количественного определения хлорорганических соединений – хлорорганических пестицидов (α-, β-, γ-, δ- гексахлорциклогексана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилтрихлорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилдихдорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилэтилена, дильдрина, эндрина) и полихлорированных бифенилов – газохроматографическими методами в органах и тканях человека и может быть использовано в биологии, экологии, медицине.

Известен способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови, включающий экстракцию пестицидов из крови n-гексаном, очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой, концентрирование n-гексанового экстракта (см. RU № 2414711, МПК G01N 33/50, G01N 33/48, 2011).

Недостатком этого решения является ограниченная область применения из-за невозможности исследования органов и тканей человека.

Известен также способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата n-гексанового экстракта хлорорганических соединений (см. патент РФ № 2543360, МПК G01N 33/483, 2015).

Недостатком этого способа является: низкая эффективность и точность исследования из-за многократности этапов экстракции и очистки экстракта серной кислотой.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение «выхода» хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в концентрат n-гексанового экстракта.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в повышении «выхода» хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в концентрат n-гексанового экстракта, за счет повышения полноты его извлечения из материала проб при исключении многоэтапности процесса очистки концентрированной серной кислотой.

Для решения поставленной задачи предложен способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата n-гексанового экстракта хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов, отличающийся тем, что пробу отбирают из органов и тканей человека, гомогенизируют и полученный гомогенизированный образец используют в размере, обеспечивающем возможность однократной полной очистки концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ, при этом проба большого сальника не превышает 0,6 г, проба желчного пузыря не превышает 12,5 г, проба легких не превышает 38,5 г, проба затылочной доли мозга не превышает 13,9 г, проба лобной доли мозга не превышает 15,6 г, проба целого мозга не превышает 16,4 г, проба мозжечка не превышает 26,1 г, проба продолговатого мозга не превышает 14,4 г, проба мочевого пузыря не превышает 11,0 г, проба паранефроса не превышает 0,8 г, проба печени не превышает 25,1 г, проба подкожной жировой клетчатки не превышает 0,7 г, проба поперечно-полосатой мускулатуры не превышает 8,3 г, проба почки не превышает 5,6 г, проба селезенки не превышает 43,2 г, проба толстой кишки не превышает 1,0 г, проба яичника не превышает 75,1 г, полученный липофильный экстракт, растворенный в 20 см³ n-гексана с концентрированной серной кислоты объемом 10 см³, перемешивают на лабораторном шейкере с частотой 1 Гц.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает возможность повышения «выхода» хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в концентрат n-гексанового экстракта, за счет исключения многоэтапности процесса очистки концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ в ходе реакции с ней липофильного экстракта.

При этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.

Признак «…пробу отбирают из органов и тканей человека …» обеспечивает возможность исследования органов и тканей человека.

Признаки, указывающие, что пробу органов и тканей человека отбирают «в размере, обеспечивающем возможность однократной полной очистки концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ» минимизируют количество кислотных очисток и, тем самым, минимизируют потери экстрагируемых веществ.

Признаки, указывающие, что «проба большого сальника не превышает 0,6 г, проба желчного пузыря не превышает 12,5 г, проба легких не превышает 38,5 г, проба затылочной доли мозга не превышает 13,9 г, проба лобной доли мозга не превышает 15,6 г, проба целого мозга не превышает 16,4 г, проба мозжечка не превышает 26,1 г, проба продолговатого мозга не превышает 14,4 г, проба мочевого пузыря не превышает 11,0 г, проба паранефроса не превышает 0,8 г, проба печени не превышает 25,1 г, проба подкожной жировой клетчатки не превышает 0,7 г, проба поперечно-полосатой мускулатуры не превышает 8,3 г, проба почки не превышает 5,6 г, проба селезенки не превышает 43,2 г, проба толстой кишки не превышает 1,0 г, проба яичника не превышает 75,1 г» обеспечивают очистку липофильного экстракта из упомянутых органов человека концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ за один раз.

Признаки «…полученный липофильный экстракт, растворенный в 20 см³ n-гексана с концентрированной серной кислоты объемом 10 см³ перемешивают на лабораторном шейкере с частотой 1 Гц.…» обеспечивают возможности очистки липофильного экстракта за один раз.

На фиг. 1 показано распределение липидов в органах и тканях человека; на фиг.2 показана сводная хроматограмма определения хлорорганических соединений (ХОС) в биоматериале, где синим цветом обозначены пики, соответствующие полихлорированным бифенилам, розовым и черным цветами обозначены хлорорганические пестициды.

Предел обнаружения хлорорганических соединений определялся из расчета три стандартных отклонения на восемь анализируемых на ХОС образцов. Для анализа следовых концентраций ХОС обычно используют образцы от 1 до 10 г. Однако для более эффективного определения ХОС с высоким коэффициентом «октанол-вода» необходимо учитывать различное содержание липидов в органах и тканях человека, поскольку такой подход позволяет унифицировать дальнейшие этапы, включая экстракцию.

Установлено, что наиболее эффективная очистка концентрированной серной кислотой исследуемых соединений от соэкстрактивных веществ происходит в ходе реакции липофильного экстракта, растворенного в 20 см³ n-гексана, и концентрированной серной кислоты объемом 10 см³ при перемешивании на лабораторном шейкере с частотой 1 Гц. Наибольшая масса липофильного экстракта, которая может быть очищена указанным объемом серной кислоты, составляет 0,5 г.

На фиг. 1 показано распределение липидов в органах и тканях человека, определяющее величину пробы.

В табл. 1 приведен максимальный размер проб, который может быть оптимально очищен при однократной кислотной экстракции.

Таблица. 1

Распределение липидов в органах и тканях человека

Орган % липидов Вес пробы, г Большой сальник 90 0,6 Желчный пузырь 4 12,5 Легкие 1,3 38,5 Мозг (затылочная доля) 3,6 13,9 Мозг (лобная доля) 3,2 15,6 Мозг (целый) 3 16,4 Мозг (мозжечок) 1,9 26,1 Мозг (продолговатый) 3,5 14,4 Мочевой пузырь 4,5 11 Паранефрос 65 0,8 Печень 2 25,1 Подкожная жировая клетчатка 73,6 0,7 Поперечно-полосатая мускулатура 6 8,3 Почка 8,9 5,6 Селезенка 1,2 43,2 Толстая кишка 52,6 1 Яичник 0,7 75,1

Различные органические соединения имеют разные площади пиков на хроматограмме при одинаковой концентрации, что говорит о разных лимитах детектирования (фиг. 2).

Для обеспечения повторяемости исследований обязательны к соблюдению следующие правила сбора проб.

Поперечно-полосатая мускулатура: отбираются мышцы, обычно задействованные в акте дыхания (musculus phrenicus, musculus serratus и др.); в качестве образца собирается поперечный срез мышцы в фасциальном футляре.

Подкожная жировая клетчатка: при висцероабдоминальном типе ожирения сбор образцов ведется с абдоминальной области; при глютеофеморальном типе ожирения сбор образцов ведется с феморальной области.

Желчный пузырь: гомогенизируется весь объем образца, включая обнаруживаемые конкременты любого типа (желчные камни).

Для сбора проб применяется одноразовый инструмент во избежание контаминации анализируемыми веществами.

Пример реализации способа

Отбирают пробу из органов или ткани человека. Все пробы помещают в стеклянные контейнеры достаточного объема и замораживают до температуры -20°С или ниже. Пустая пробирка необходима для контроля чистоты тары.

Пробы органов и тканей человека измельчают на ультрагомогенизаторе механически. Взвешивают такое количество полученного гомогенизированного образца, чтобы получить до 0,5 г сухого липофильного экстракта (табл. 1). В плоскодонную коническую колбу без шлифа вместимостью 100 см³ вносят навеску гомогенизированного образца, после чего добавляют необходимый объем экстрагирующих веществ, (объемы растворителей рассчитываются в соответствии с пропорцией навеска образца: ацетон: п-гексан как 2:4:3, но не менее 8 см³ ацетона и, соответственно, 6 см³ п-гексана), закрывают колбу парафиновой пленкой типа Parafilm и оставляют экстрагироваться.

Полученный липофильный экстракт декантируют через простой фильтр («Белая лента»), смоченный п-гексаном, в делительную воронку ВД-3-250-29/32 с PTFE краном. Содержимое воронки двухкратно промывают порциями п-гексана по 2-3 см³.

На аналитических весах (4 класс точности) взвешивают круглодонную колбу К-1-100-29/32, предварительно просушенную в сушильном шкафу в течение 30-40 минут до стабилизации веса, охлажденную до комнатной температуры в эксикаторе с индикаторным силикагелем. Данные вносят в лабораторный журнал.

Оставшийся в воронке слой фильтруют через безводный сульфат натрия, смоченный в п-гексане, в круглодонную колбу К-1-100-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня – 35°С + вакуум) до полного выпаривания п-гексана. Далее колбу помещают в сушильный шкаф на 102°С до стабилизации веса. После стабилизации веса липофильного экстракта, колбу взвешивают повторно. Данные вносят в лабораторный журнал и рассчитывают массу навески и процентное содержание общих жиров, полученных во время экстракции, для последующего пересчета концентраций ХОС как нг/г липидов (общепринятые измерения концентрации органических загрязняющих веществ в живых организмах).

Для очистки полученного липофильного экстракта от соэкстративных веществ, в вытяжном шкафу, в колбу с липофильным экстрактом вносят 20-25 см³ п-гексана, тщательно перемешивают и вносят 10 см³ H₂SO_4конц. Содержимое перемешивают и оставляют на 24 часа. Отделяют часть кислоты автоматическим кислотостойким дозатором с одноразовым полипропиленовым наконечником и п-гексановый слой переносят в делительную воронку ВД-3-250-29/32 с PTFE краном. Промывают раствор экстрагированных исследуемых соединений в n-гексане порцией 20 см³ 1% бикарбоната натрия, и далее порциями бидистиллированной воды объемом 20-30 см³ до нейтральной реакции универсального бумажного индикатора.

Раствор исследуемых соединений в п-гексане фильтруют через безводный сульфат натрия в коническую колбу KО-30-14/23; КО-30-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня - 35°С) до полного выпаривания п-гексана.

Для загрузки в хроматограф фракции бифенилов и пестицидов ХОС в колбах растворяют в 1 см³ п-гексана, переносят в маркированные виалы объемом 1,5 см³ и после высыхания на воздухе закрывают крышками с PFTE-септами. Партию передают на газохроматографический и/или хроматомасс-спектрометрический анализ.

Определение концентраций хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в образцах проводят на газовом хроматографе с масс-селективным детектором, и на газовом хроматографе с детектором электронного захвата.

Хроматограммы с бифенилами и пестицидами представлены на фиг. 2.

Использовались капиллярные колонки 5ms (в токе защитной смеси газов гелия и азота при стабильном потоке 1 см³/мин) и 5ms (в токе защитного газа гелия при стабильном потоке 1 см³/мин). Температуры колонки, инжектора и детектора газового хроматографа с детектором электронного захвата составили 210°С, 250°С и 280°С, соответственно, газового хроматографа с масс-спектрометрическим детектором – 100-310°С (подъем температуры составляет 7°С в минуту до предела в 310°С), 250°С, 200°С, соответственно. Масс-спектрометр работал в режиме электронной ионизации (EI). Программное обеспечение работало в режиме «поиска и определения». Одно- и двухзарядные ионы учитывались раздельно.

Проба растворяется в 0,5 см³ п-гексана и «закалывается» аликвота в объеме 2 мм³.

Время удержания, массы и объем подтвержденных ионов целевых веществ являлись идентификационными критериями.

Таким образом, показанный способ подготовки пробы для газохроматографического и хроматомасс-спектрометрического определения хлорорганических соединений (ХОС) в органах и тканях человека позволяет сократить расходы на серную кислоту, n-гексан и бидистиллированную воду, и уменьшить трудозатраты на производство одной пробы на 48-72 часа.

Изобретение относится к области пробподготовки. Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в биоматериале включает отбор пробы, ее измельчение, последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата n-гексанового экстракта хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов. Пробу отбирают из органов и тканей человека, гомогенизируют и полученный гомогенизированный образец используют в размере, обеспечивающем возможность однократной полной очистки концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ, при этом проба большого сальника не превышает 0,6 г, проба желчного пузыря не превышает 12,5 г, проба легких не превышает 38,5 г, проба затылочной доли мозга не превышает 13,9 г, проба лобной доли мозга не превышает 15,6 г, проба целого мозга не превышает 16,4 г, проба мозжечка не превышает 26,1 г, проба продолговатого мозга не превышает 14,4 г, проба мочевого пузыря не превышает 11,0 г, проба паранефроса не превышает 0,8 г, проба печени не превышает 25,1 г, проба подкожной жировой клетчатки не превышает 0,7 г, проба поперечно-полосатой мускулатуры не превышает 8,3 г, проба почки не превышает 5,6 г, проба селезенки не превышает 43,2 г, проба толстой кишки не превышает 1,0 г, проба яичника не превышает 75,1 г., полученный липофильный экстракт, растворенный в 20 см3 n-гексана с концентрированной серной кислоты объемом 10 см3 перемешивают на лабораторном шейкере с частотой 1 Гц. Изобретение обеспечивает повышение «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта. 1 табл., 2 ил.

Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата n-гексанового экстракта хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов, отличающийся тем, что пробу отбирают из органов и тканей человека, гомогенизируют и полученный гомогенизированный образец используют в размере, обеспечивающем возможность однократной полной очистки концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ, при этом проба большого сальника не превышает 0,6 г, проба желчного пузыря не превышает 12,5 г, проба легких не превышает 38,5 г, проба затылочной доли мозга не превышает 13,9 г, проба лобной доли мозга не превышает 15,6 г, проба целого мозга не превышает 16,4 г, проба мозжечка не превышает 26,1 г, проба продолговатого мозга не превышает 14,4 г, проба мочевого пузыря не превышает 11,0 г, проба паранефроса не превышает 0,8 г, проба печени не превышает 25,1 г, проба подкожной жировой клетчатки не превышает 0,7 г, проба поперечно-полосатой мускулатуры не превышает 8,3 г, проба почки не превышает 5,6 г, проба селезенки не превышает 43,2 г, проба толстой кишки не превышает 1,0 г, проба яичника не превышает 75,1 г., полученный липофильный экстракт, растворенный в 20 см³ n-гексана с концентрированной серной кислоты объемом 10 см³, перемешивают на лабораторном шейкере с частотой 1 Гц.