Способ количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа Российский патент 2017 года по МПК G01N33/50 G01N30/02 

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения гексахлорбензола (далее - ГХБ) в крови.

Известен способ газохроматографического определения гексахлорбензола в почве (Патент РФ № 2427832). Использование синтетических пестицидов для борьбы с вредными организмами приводит к насыщению биосферы веществами, токсичными для человека, сельскохозяйственных животных, полезной флоры и фауны. Указанный способ определения гексахлорбензола включает в себя экстракцию пробы почвы органическим растворителем после измельчения. При этом в качестве растворителя используют о-ксилол (25 мл экстрагента/10г почвы), а определение осуществляют газохроматографическим методом.

Однако этот способ невозможно использовать при определении концентрации ГХБ в биосредах.

Из Методических указаний МУК 4.1.2112-06 (утверждены Роспотребнадзором 09.08.2006) «Определение массовой концентрации хлороформа, дихлорэтана, тетрахлорметана, хлорбензола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом» известно определение гомолога ГХБ - хлорбензола. Известный способ основан на предварительном концентрировании алифатических хлорированных соединений (хлороформ, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан) и ароматических (хлорбензол) при рН 8-10 из биологического материала (кровь) экстракцией диэтиловым эфиром и последующем газохроматографическом анализе экстрактов. Выполнение измерений массовой концентрации указанных хлорированных углеводородов проводят методом газовой хроматографии с детектором электронного захвата. Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды, алифатические спирты, трихлорэтилен при содержании каждого из указанных веществ не более 0,5 мкг/см³.

Выполнение измерений по указанному способу выполняют следующим образом. Пробу крови в объеме 2 см³ доводят до 50 см³ бидистиллированной водой, помещают в делительную воронку объемом 250 см³, добавляют 30 г высаливателя - хлорида натрия, подщелачивают 30%-ным раствором гидроксида натрия до достижения рН 8-10 и экстрагируют 10 см³ диэтилового эфира. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин, после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку. Далее пробу центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин для денатурации белка. После отстаивания эфирный экстракт сливают в другую пробирку. Полученный центрифугат в объеме 10 мм³ хроматографируют и проводят количественное определение анализируемых соединений в подготовленной пробе по калибровочному графику.

Недостатком указанного известного способа является то, что используются трудоемкие способы подготовки образцов крови к химическому анализу, требующие очистки и концентрирования, а также много операций в подготовке биопроб к химическому анализу.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа, описанный в «Методических указаниях по избирательному газохроматографическому определению хлорорганических пестицидов в биологических средах (моче, крови, жировой ткани и грудном женском молоке)», (утверждены Минздравом СССР 27 ноября 1984 г. № 3151-84). Согласно этому способу цельную кровь (1-2 мл), помещенную в пробирку на шлифе, экстрагируют со средней интенсивностью 5 мл экстрагента-гексана на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, используя приспособление для фиксации пробирок. После разделения слоев гексановый экстракт тщательно отбирают с помощью пипетки, соединенной с грушей, и фильтруют через безводный сульфат натрия. При повышенной свертываемости крови сыворотку и сгусток экстрагируют раздельно. Сгусток отделяют от сыворотки, декантируя последнюю в пробирку на шлифе, затем растирают в фарфоровой ступке с избыточным количеством безводного сульфата натрия (до сыпучего состояния). Гомогенат переносят в колбу на шлифе и заливают 1,5-кратным по объему количеством гексана. Фарфоровую ступку дважды споласкивают гексаном (по 2 мл), который присоединяют к содержимому колбы.

Экстракцию проводят путем настаивания при периодическом перемешивании в течение 15-20 мин. Растворитель декантируют в колбу на шлифе вместимостью 100 мл, дополнительно фильтруя через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Содержимое колбы дополнительно промывают два раза гексаном (по 3-5 мл), присоединяя последний к основному экстракту. С сывороткой поступают так же, как с цельной кровью. Экстракты из сгустка и сыворотки крови объединяют.

Затем производят очистку экстрактов. Объединенные экстракты очищают в плоскодонных колбах на шлифе путем 5-7-минутного встряхивания с 5-10 мл насыщенного раствора безводного сульфата натрия в концентрированной серной кислоте. Экстракт после отстаивания осторожно декантируют в другую колбу. Содержимое колбы с кислотой после первичной очистки споласкивают 1-2 мл гексана, который присоединяют к основному экстракту. Очистку повторяют несколько раз до тех пор, пока слой кислоты после перемешивания не станет бесцветным.

Очищенный экстракт переносят в делительную воронку, приливают 2-5 мл 0,5 н. раствора бикарбоната натрия, затем встряхивают 1-2 мин, водный раствор отбрасывают и далее экстракт промывают дистиллированной водой (2-3 раза по 10-15 мл) до нейтральной реакции промывных вод. Конечный экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия в колбу для отгонки растворителя.

Растворитель упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани 35-40°С под вакуумом до небольшого объема (5-7 мл), затем в токе азота особой чистоты до объема 0,5-1,0 мл и анализируют ГЖХ.

Хроматографирование. Газохроматографический анализ проводят на колонке длиной 1 м с 5% SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS (0,12-0,16 мм). Гексановый экстракт (5 мкл) анализируют с ДЭЗ (детектор электронного захвата) на колонке 1 м с 5% SE-30 с использованием стандартной смеси хлорорганических препаратов.

В указанном известном способе процент выделения ГХБ из крови составляет 79,06%; предел определения 0,5 мкг/л; стандартное отклонение ±17,66%; доверительный интервал ±21,92%.

Недостатками этого известного способа являются:

- невысокая полнота извлечения гексахлорбензола из крови 79,06% при нижнем пределе определения всего 0,0005 мкг/мл;

- анализ выполняется на набивной колонке длиной всего 1 м. На набивных колонках возможно наложение химических соединений (в крови возможно присутствие одновременно и других хлорорганических соединений - хлороформ, тетрахлорметан, хлорбензол и др.), близких по физико-химическим свойствам, что приводит к завышению результата измерений.

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в повышении степени извлечения ГХБ из пробы крови, а также в повышении точности и селективности.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа, включающим отбор пробы крови, экстракцию экстрагентом из указанной пробы гексахлорбензола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, при этом новым является то, что после отбора пробы крови ее подкисляют до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, в качестве экстрагента используют толуол, взятый в объемном соотношении к пробе крови как 0,6 к 1,0 соответственно, а экстракцию ведут дважды последовательно по 5 мин каждую, затем полученный экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 7000 об/мин, далее определяют количество гексахлорбензола методом газохроматографического анализа с использованием детектора электронного захвата на капиллярной колонке НР-1 35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм при температурном режиме: капиллярная колонка - 70°С-230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя - азота - 20 см³/мин.

В качестве раствора серной кислоты используют 1%-ный водный раствор.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая чувствительность определения гексахлорбензола в пробе крови, а также упрощается способ.

Высокая эффективность предлагаемого способа определения гексахлорбензола в крови достигнута путем подбора оптимальных условий газохроматографического анализа: капиллярной колонки серии НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм длиной 35 м и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 μm при оптимальном температурном режиме: колонка - 70 - скорость нагревания 25°С/мин - 180°С - скорость нагревания 10°С/мин - 210°С - скорость нагревания 5°С/мин - 230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя (азот) - 20 см³/мин, и высокоспецифического детектора электронного захвата (ДЭЗ) к хлорорганическим соединениям.

Кроме того, заявляемый способ позволяет с высокой точностью и селективностью определять исследуемое соединение ХГБ на уровне 0,00015-0,005 мг/дм³ при погрешности определения не более 16%. Предел обнаружения (LOD) гексахлорбензола в крови составил C_min=0,000007 мкг/см³. Предел количественного определения (LOQ) гексахлорбензола составил C_min=0,000024 мкг/см³. Полнота извлечения гексахлорбензола из крови составляет 99,9%. Исследования проводятся на капиллярной колонке НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм длиной 35 м, которая обладает высокой разрешающей способностью и оптимально делит мешающие соединения, которые могут находиться в матрице крови.

При реализации предлагаемого способа при подготовке пробы крови к газохроматографическому анализу проводят экстракционное концентрирование ГХБ из пробы крови методом жидкостной экстракции органическим экстрагентом в слабокислой среде. Эта стадия предназначена для перевода ГХБ в более удобную для последующего газохроматографического анализа органическую фазу, для повышения его концентрации в экстракте и для отделения мешающих компонентов из биологической матрицы.

Таким образом, пробоподготовка в предлагаемом способе является значительно более простой, чем в прототипе, как по времени, так и по трудоемкости.

В современном химико-токсикологическом анализе одним из перспективных методов разделения и концентрирования органических соединений является гетерогенная жидкостная экстракция. Задача экстракции состоит в том, чтобы полно и селективно перевести аналит из биологической среды в органическую фазу.

На экстракцию химических веществ органическими растворителями оказывают влияние различные факторы: природа экстрагируемого вещества, экстрагента, число экстракций, объем экстрагента, рН среды, скорость взбалтывания (время достижения равновесия).

Для обеспечения полноты извлечения гексахлорбензола из биосреды (кровь) были подобраны условия экстракции: выбор органического растворителя, объем экстрагента, рН среды, число экстракций и время достижения равновесия.

В ходе экспериментальных работ по выбору экстрагента и для эффективного извлечения гексахлорбензола из крови применена жидкостная экстракция различными органическими растворителями, изучены экстракционные характеристики. Данные приведены в таблице 1.

Результаты исследований полноты экстракции гексахлорбензола из крови различными объемами растворителя (толуол) приведены в таблице 2.

В процессе исследований было установлено время контакта фаз для достижения равновесия в экстракционной системе, обеспечивающее количественный выход гексахлорбензола (таблица 3).

Известно, что чем больше объем органической фазы экстрагента, тем больше степень извлечения экстрагируемого вещества. Однако увеличение числа экстракций сильнее влияет на степень извлечения экстрагируемого вещества, чем увеличение объема экстрагента, поэтому одну и ту же степень извлечения можно получить, уменьшая объем экстрагента, но увеличивая число экстракций. В исследованиях использовали объем экстрагента толуола объемом 3 см³ и применяли 2 последовательные экстракции по 5 мин. Объем пробы крови при этом брали 5 см³. Таким образом, объемное соотношение пробы крови и толуола составляло 1:0,6. Было установлено, что это является оптимальным соотношением, при котором и будет достигнута высокая точность и селективность предлагаемого способа.

В процессе экспериментальных исследований по установлению оптимального значения рН биосреды, при котором наблюдается эффективное извлечение гексахлорбензола из крови и наиболее полное и быстрое выпадение белка в осадок, применяли различные минеральные кислоты: серная, соляная, и щелочи: гидрооксид калия. Кислоты и щелочи при взаимодействии с белком вызывают его денатурацию. Это связано с тем, что кислоты удаляют гидратную оболочку и нейтрализуют заряд молекулы. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Для осаждения белков из крови применяли центрифугирование образца при различных скоростях и оптимально подобранных условиях экстракции (таблица 5).

Оптимальные условия процесса экстракции гексахлорбензола из крови предлагаемым способом представлены в таблице 6.

Максимальная полнота извлечения гексахлорбензола из крови - 99,9 %, достигнута при подобранных оптимальных условиях подготовки пробы для газохроматографического анализа путем подкисления пробы крови до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, концентрирования из крови (время контакта 5 мин) органическим растворителем-экстрагентом, (толуол) объем 3 см³ в две стадии, денатурации белка центрифугированием биосреды при 7000 об/мин в течение 15 мин при рН 6-7, и последующем определении на газовом хроматографе с детектором электронного захвата (ДЭЗ).

Благодаря тому, что образующийся при пробоподготовке экстракт анализируют методом газовой хроматографии с детектором электронного захвата, обеспечивает максимально возможное по чувствительности газохроматографическое определение. Определение количества ГХБ в крови методом газохроматографического анализа проводят с использованием градуировочного графика. Для его построения выполняют следующие действия.

Готовят исходный раствор. Для этого в мерную пробирку объемом 10 см³ дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 4 см³, вводят микрошприцем 2 мм³ ГСО (государственный стандартный образец) гексахлорбензола С=100 мкг/см³. Концентрация исходного раствора будет 0,05 мкг/см³. Срок хранения раствора 12 часов.

Далее готовят градуировочные растворы. Градуировочные растворы гексахлорбензола готовят в мерных пробирках объемом 5 см³. Для этого в каждую пробирку дозатором вносят дистиллированную воду и исходный раствор в соответствии с таблицей 7 и тщательно перемешивают.

Построение градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц⋅с) от массовой концентрации гексахлорбензола (мг/дм³) в стандартном растворе, устанавливают по 6 сериям измерений по 5 концентрациям вещества в каждой серии для каждого диапазона.

В приготовленный градуировочный раствор объемом 5 см³ дозатором добавляют органический растворитель (толуол) объемом 3 см³ и выполняют дважды жидкостную экстракцию (время контакта фаз 5 мин). После экстракции раствор центрифугируют при 7000 об/мин в течение 15 мин. Затем 1 мм³ верхнего слоя органического растворителя (толуол) вкалывают в хроматографическую колонку через испаритель. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков компонента и по средним результатам из 6 серий строят градуировочный график.

Пример реализации предлагаемого способа

Пробы крови объемом 5 см³ помещают в мерную пробирку объемом 10 см³, подкисляют до рН 6-7 водным раствором 1%-ной серной кислоты. Далее дозатором добавляют органический растворитель (толуол) объемом 3 см³ и выполняют жидкостную экстракцию (время контакта фаз 5 мин дважды). Для денатурации белка выполняют центрифугирование биосреды при 7000 об/мин в течение 15 мин при рН 6-7. Затем 1 мм³ верхнего слоя органического растворителя (толуол) вкалывают в хроматографическую колонку через испаритель. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови.

В ходе лабораторных испытаний также были определены оптимальные условия газохроматографического определения гексахлорбензола с применением стандартных растворов.

Были изучены условия определения ГХБ на капиллярных колонках с различными характеристиками неподвижных жидких фаз:

- DB-624-25 m⋅0,32 ⋅ mm ⋅ 5,0 μm (полярная цианопропильная фаза; температурный предел от 60°С до 260/300°С);

- HP-FFAP-50m^⋅0,32mm⋅0,5μm (полярная фаза с покрытием нитротерефталевой кислотой; температурный предел от 60°С до 240/250°С);

- НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм (неполярная фаза с покрытием 100% диметил- (поли)силоксан; температурный предел от 60°С до 325/350°С).

Опыты показали, что полнота разделения гексахлорбензола с другими углеводородами достигнута на капиллярной колонке HP-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм. При этом установленные температурные режимы для нее представлены в таблице 8.

Качественное разделение гексахлорбензола с другими соединениями было достигнуто в режиме 2 (таблица 8) при температурном режиме: колонка - 70°С-скорость нагревания 25°С/мин - 180°С - скорость нагревания 10°С/мин - 210°С - скорость нагревания 5°С/мин - 230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя (азот) - 20 см³/мин.

Для обнаружения гексахлорбензола в биологической среде (кровь) использовали высокоспецифичный электронно-захватный детектор (ДЭЗ).

Характеристики газохроматографического анализа гексахлорбензола представлены в таблице 9.

Предлагаемый способ устанавливает порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовых концентраций гексахлорбензола в пробах крови в диапазоне концентраций от 0,00015 до 0,005 мкг/мл. В заявляемом способе полнота извлечения ГХБ составляет 99,9%; предел определения 0,00015 мкг/мл; стандартное отклонение не более 10%; погрешность 16% и анализ выполняется на капиллярной колонке длиной 35 м.

В известном же способе по прототипу процент выделения ГХБ из крови составляет 79,06%; предел определения 0,0005 мкг/мл; стандартное отклонение ±17,66%; доверительный интервал ±21,92%,

При этом в заявляемом способе определению не мешают хлороформ, тетрахлорметан и другие хлорбензолы в количествах, не превышающих установленную величину.

Длительность анализа, включая экстракцию биопробы, 1 час.

Предлагаемый способ был опробован при оценке воздействия биомаркера экспозиции (гексахлорбензола) на здоровье детей Пермского края.

Для сравнительной оценки уровней ГХБ в крови были выбраны две группы детей: группа наблюдения (n=25), дети которой проживали на территории экологического неблагополучия, и группа сравнения (n=25), дети которой были практически здоровы и проживали вне зоны антропогенного влияния. Разработанная методика позволила определить содержание гексахлорбензола в крови обследуемых детей. Результаты анализа представлены в таблице 10.

В процессе исследований было установлено, что у обследуемых детей группы наблюдения, проживающих в зоне экспозиции, количество проб крови с содержанием гексахлорбензола составило 50% при средней концентрации 0,00003±0,00001 мкг/см³. Установленное количество биопроб с повышенным содержанием гексахлорбензола в крови детей этой группы наблюдения составило 30%. Установлены минимальная и максимальная концентрации гексахлорбензола в крови таких детей C_min=0,00003 и C_max=0,00007 мкг/см³ соответственно.

Проведенные исследования показали, что средние концентрации гексахлорбензола в образцах крови детей, проживающих в зоне экспозиции, достоверно выше (p≤0,0-0,05), чем у детей группы сравнения в 3 раза.

Таким образом, разработанный способ определения ГХБ позволяет адекватно диагностировать химическую нагрузку в крови детей, что является доказательным звеном воздействия химических факторов окружающей среды на здоровье.

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии. Сущность: производят отбор пробы крови, экстракцию экстрагентом из указанной пробы ГХБ и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика. При этом после отбора пробы крови ее подкисляют до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, например, 1%-ной концентрации. В качестве экстрагента используют толуол, взятый в объемном соотношении к пробе крови как 0,6 к 1,0 соответственно. Экстракцию ведут дважды последовательно по 5 мин каждую. Полученный экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 7000 об/мин и далее определяют количество ГХБ методом газохроматографического анализа с использованием детектора электронного захвата на капиллярной колонке НР-1 35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм при температурном режиме: капиллярная колонка - 70°С-230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя - азота - 20 см³/мин. Достигается повышение степени извлечения ГХБ из пробы крови, а также точности и селективности анализа. 1 з.п. ф-лы; 10 табл., 1 пр.

1. Способ количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа, включающий отбор пробы крови, экстракцию экстрагентом из указанной пробы гексахлорбензола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, отличающийся тем, что после отбора пробы крови ее подкисляют до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, в качестве экстрагента используют толуол, взятый в объемном соотношении к пробе крови как 0,6 к 1,0 соответственно, а экстракцию ведут дважды последовательно по 5 мин каждую, затем полученный экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 7000 об/мин, далее определяют количество гексахлорбензола методом газохроматографического анализа с использованием детектора электронного захвата на капиллярной колонке НР-1 35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм при температурном режиме: капиллярная колонка - 70°С-230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя - азота - 20 см³/мин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве раствора серной кислоты используют 1%-ный водный раствор.