ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАРКЕР ДЛЯ СВЯЗАННОГО С HELICOBACTER PYLORI ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6883 G01N33/68 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к генетическому маркеру, который может быть эффективно использован для диагностики и лечения связанного с Helicobacter pylori заболевания.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] В 1983 г. австралийские микробиологи Marchall и Warren впервые обнаружили изогнутую бактерию в биоптатах слизистой оболочки желудка у пациентов с гастритом типа В, затем они культивировали бактерию и установили, что она представляет собой новый вид, относящийся к роду Campylobacter. С тех пор были проведены активные исследования связи между Helicobacter pylori и заболеваниями верхних отделов желудочно-кишечного тракта, такими как гастрит, язва желудка и двенадцатиперстной кишки и тому подобное. Helicobacter pylori представляет собой грамотрицательную бациллу, имеет жгутики, окруженные тонкой мембраной, секретирует большое количество уриназы, как известно, распространяется фекально-пероральным путем и является патогеном, вызывающим большой интерес во всем мире, поскольку в 1994 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила его как несомненный канцероген.

[0003] В настоящее время известно, что патогенез заболевания, вызываемого Helicobacter pylori, является следующим: бактерии, попавшие в просвет желудка вместе с пищей, проникают в слой желудочной слизи за счет жгутиков, обладающих большой подвижностью, населяют верхний эпителиальный слой и межклеточные соединения в слое желудочной слизи и секретируют большие количества уриназы, делая слизистый слой щелочным, что приводит к аномально избыточной стимуляции секреции желудочной кислоты за счет гастрина, что, в свою очередь, ведет к воспалению и возникновению язвы. Кроме того, вследствие недавнего исследования, которое показало, что Helicobacter pylori является важным фактором риска в патогенезе аденокарциномы желудка, Всемирная организация здравоохранения признала Helicobacter pylori канцерогеном I группы.

[0004] В частности, инфекция, вызываемая Helicobacter pylori, по сообщениям, часто встречается в развивающихся странах, в том числе в Южной Корее. По данным национального эпидемиологического обследования, проведенного с участием 5732 человек без симптомов заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта, общая распространенность инфекции Helicobacter pylori составляла 46,6%, и степень инфицирования составляла 69,4% у взрослых людей старше 16 лет и была особенно высока у людей в возрасте старше 40 лет (78,5%). Кроме того, согласно исследованию, проведенному с участием 1031 пациента с язвой желудка и двенадцатиперстной кишки, 66% пациентов с язвой желудка и 79% пациентов с язвой двенадцатиперстной кишки были инфицированы Helicobacter pylori, и 71% пациентов с язвами желудка и двенадцатиперстной кишки, согласно сообщениям, были инфицированы Helicobacter pylori.

[0005] Многие болезненные состояния характеризуются отличиями уровней экспрессии различных генов либо в результате изменения числа копий генетической ДНК, либо в результате изменений в уровнях транскрипции определенных генов (например, за счет контроля инициации, обеспечения предшественниками РНК, процессинга РНК и так далее). Например, потеря и приобретение генетического материала играет важную роль в злокачественной трансформации и ее прогрессировании. Считается, что эти потери и приобретения «приводятся в действие» генами по меньшей мере двух видов, онкогенами и генами-супрессорами опухолей. Онкогены являются положительными регуляторами онкогенеза, в то время как гены-супрессоры опухолей являются отрицательными регуляторами онкогенеза. Таким образом, изменения в уровнях экспрессии (транскрипции) конкретных генов (например, онкогенов или генов-супрессоров опухолей) служат показателями наличия и прогрессирования различных видов рака.

[0006] Инфекция Helicobacter pylori приводит к изменению в противоположном направлении некоторых, или всех, из этих паттернов генной экспрессии. Следовательно, изменение паттернов экспрессии некоторых, или всех, из этих генов можно использовать для мониторинга или прогнозирования эффективности лекарственных препаратов. Анализ изменений генной экспрессии можно проводить в целевой интересующей ткани (например, опухоли) или в некоторой суррогатной клеточной популяции (например, лейкоцитах периферической крови). В последнем случае корреляция изменений генной экспрессии с эффективностью (например, уменьшением размера или отсутствием роста опухоли) должна быть особенно сильной, чтобы паттерн изменения генной экспрессии был использован в качестве маркера эффективности. Многие общепринятые диагностические препараты для обнаружения инфекции Helicobacter pylori известны в данной области (патентный документ 1 и патентный документ 2).

[0007] В настоящее время, однако, информация о группе конкретных генов, паттерны экспрессии которых могут изменяться вследствие инфекции Helicobacter pylori, а также способ диагностики или предсказания развития, прогрессирования и прогноза для связанного с Helicobacter pylori заболевания с использованием данной информации практически отсутствуют.

[0008] Документы предшествующего уровня техники

[0009] Патентные документы

[0010] (Патентный документ 1) Корейская не прошедшая экспертизу патентная публикация № 2003-0001506

[0011] (Патентный документ 2) Корейская не прошедшая экспертизу патентная публикация № 2000-0033013.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

[0012] Целью настоящего изобретения является предложение: композиции для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, содержащей препарат для определения уровня экспрессии гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori; и способа, облегчающего предсказание прогноза и определение стратегии лечения пациента, имеющего связанное с Helicobacter pylori заболевание, с использованием композиции.

[0013] Кроме того, другой целью настоящего изобретения является предложение: способа идентификации и анализа группы генов, экспрессия которых специфически изменяется вследствие инфекции Helicobacter pylori, в образце ткани или клеток млекопитающего; а также способа диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания и прогнозирования эффекта лечения у субъекта-млекопитающего с использованием группы генов в качестве биомаркера.

Техническое решение

[0014] Для достижения вышеуказанной цели один аспект настоящего изобретения относится к композиции и набору для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, содержащим препарат для определения уровня экспрессии гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori.

[0015] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения информации для диагностики или предсказания прогноза, включающему этап определения количества мРНК гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, или белка, экспрессируемого с гена, в биологическом образце от пациента, инфицированного Helicobacter pylori, и сравнение этого количества с количеством, определенным в образце от здорового субъекта.

Полезные эффекты

[0016] При осуществлении настоящего изобретения была идентифицирована группа генов, экспрессия которых специфически повышалась или снижалась в связи с инфекцией Helicobacter pylori, и было установлено, что после преодоления инфекции Helicobacter pylori экспрессия группы генов возвращалась к нормальному состоянию. Таким образом, композицию и набор по настоящему изобретению можно эффективно использовать для диагностики или предсказания прогноза связанного с Helicobacter pylori заболевания.

[0017] Однако полезные эффекты настоящего изобретения не ограничены вышеперечисленными эффектами, и другие, не упомянутые, эффекты будут понятны для специалистов в области, к которой относится настоящее изобретение, из следующего далее описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0018] На ФИГ. 1 представлен график, демонстрирующий типы генов, экспрессия которых специфически повышена в результате инфекции Helicobacter pylori.

[0019] На ФИГ. 2 представлены тепловая карта и результаты электрофореза, демонстрирующие список генов, экспрессия которых возвращалась к нормальному состоянию, когда линию клеток, которые были инфицированы Helicobacter pylori, и в которых, вследствие этого, экспрессия конкретных генов была повышена, обрабатывали экстрактом кимчи по настоящему изобретению.

[0020] На ФИГ. 3 представлен график, демонстрирующий типы генов, экспрессия которых специфически снижена в результате инфекции Helicobacter pylori.

[0021] На ФИГ. 4 представлены тепловая карта и результаты электрофореза, демонстрирующие список генов, экспрессия которых возвращалась к нормальному состоянию, когда линию клеток, которые были инфицированы Helicobacter pylori, и в которых, вследствие этого, экспрессия конкретных генов была снижена, обрабатывали экстрактом кимчи по настоящему изобретению.

[0022] На ФИГ. 5 представлен график, показывающий, что в животной модели экспрессия генов, связанных с ЭР-стрессом, повышенная вследствие инфекции Helicobacter pylori, возвращалась к нормальному состоянию в результате лечения экстрактом кимчи по настоящему изобретению.

[0023] На ФИГ. 6 представлен график, показывающий, что в животной модели экспрессия генов, связанных с антиоксидацией, сниженная вследствие инфекции Helicobacter pylori, возвращалась к нормальному состоянию в результате лечения экстрактом кимчи по настоящему изобретению.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0024] Далее в настоящем документе настоящее изобретение описано подробно.

[0025] Если в настоящем документе не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то значение, которое им обычно придают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. В целом, номенклатура, используемая в настоящем документе, и экспериментальные методы, описанные ниже, хорошо известны и обычно используются в данной области.

[0026] Далее в настоящем документе настоящее изобретение описано более подробно.

[0027] 1. Композиция и набор для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания

[0028] Настоящее изобретение относится к: композиции для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, содержащей препарат для определения уровня экспрессии гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori; и набору для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, включающему композицию. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, экспрессия которого повышена в результате инфекции Helicobacter pylori, может быть выбран из группы, состоящей из FGF21 (фактор роста фибробластов 21, ген №: 26291), CTH (цистатионин-гамма-лиаза, ген №: 1491), CREBRF (белок, связывающий элемент отклика цАМФ, ген №: 153222), DLL4 (дельта-подобный белок 4, ген №: 54567), FGF18 (фактор роста фибробластов 18, ген №: 8817), FOS (протоонкоген FOS, субъединица фактора транскрипции AP-1, ген №: 2353), PDK1 (фосфоинозитидзависимая киназа-1, ген №: 5170), PTPRN (подобный рецепторной тирозин-протеинфосфатазе белок N, ген №: 5798), CLIC4 (хлоридного внутриклеточного канала белок 4, ген №: 25932), PTPRB (протеинтирозинфосфатаза, рецепторная типа B, ген №: 5787), PPP1R15A (протеинфосфатазы 1 регуляторная субъединица 15A, ген №: 23645), PTPRH (протеинтирозинфосфатаза, рецепторная типа H, ген №: 5794), DDIT3 (индуцируемый повреждением ДНК транскрипт 3, ген №: 1649), BIRC3 (бакуловирусный белок 3, содержащий повтор IAP, ген №: 330), FOXO3 (forkhead-бокс O3, ген №: 2309), BCL2 (BCL2, регулятор апоптоза, ген №: 596), PRKCE (протеинкиназа C-эпсилон, ген №: 5581), CHMP4C (заряженный белок мультивезикулярного тельца 4C, ген №: 92421), CLDN14 (клаудин 14, ген №: 23562), SLC7A11 (семейства переносчиков растворенных веществ 7 член 11, ген №: 23657), BOC (связанный с клеточной адгезией, регулируемый онкогенами белок BOC, ген №: 91653), AJUBA (содержащий LIM-домен белок ajuba, ген №: 84962), LMO7 (содержащий LIM-домен белок 7, ген №: 4008), MMP24 (матриксная металлопептидаза 24, ген №: 10893), C3orf58 (дивергентный домен протеинкиназы 2A, ген №: 205428), KLF10 (Kruppel-подобный фактор 10, ген №: 7071), CSGALNACT1 (хондроитинсульфат N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 1, ген №: 55790), CEP120 (центросомальный белок 120, ген №: 153241), CHAC1 (ChaC глутатион-специфическая гамма-глутамилциклотрансфераза 1, ген №: 79094), ASNS (аспарагинсинтетаза (глутамин-гидролизующая), ген №: 440), NFE2L2 (ядерный фактор, эритроид 2-подобный белок 2, ген №: 4780), RIOK3 (RIO киназа 3, ген №: 8780), TXNIP (взаимодействующий с тиоредоксином белок, ген №: 10628), MTR (5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин-метилтрансфераза, ген №: 4548), IFRD1 (интерферон-связанный регулятор развития 1, ген №: 3475), а также их сочетания, но настоящее изобретение не ограничено ими. Определение того, повышена или не повышена экспрессия гена, позволяет диагностировать инфекцию Helicobacter pylori. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, экспрессия которого повышена в результате инфекции Helicobacter pylori, может быть выбран из группы, состоящей из FGF21, CTH, CREBRF, PTPRN, а также их сочетания, но настоящее изобретение не ограничено ими.

[0029] В другом варианте осуществления настоящего изобретения ген, экспрессия которого снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, может быть выбран из группы, состоящей из ADGRA2 (адгезионный связанный с G-белком рецептор A2, ген №: 25960), TBX4 (T-бокс 4, ген №: 9496), OVOL2 (ovo-подобный белок «цинковый палец» 2, ген №: 58495), ACVRL1 (подобный рецептору активина A белок 1, ген №: 94), ALB (альбумин, ген №: 213), JADE1 (семейства jade PHD «палец» 1, ген №: 79960), MLLT11 (MLLT11, кофактор фактора транскрипции 7, ген №: 10962), ADORA1 (аденозиновый рецептор A1, ген №: 134), TNFRSF8 (суперсемейства рецепторов TNF член 8, ген №: 943), NLRP12 (семейства NLR содержащий домен пирина член 12, ген №: 91662), CASP14 (каспаза 14, ген №: 23581), LTA (лимфотоксин альфа, ген №: 4049), SMAGP (гликопротеин адгезии мелких клеток, ген №: 57228), NEO1 (предшественник неогенина 1, ген №: 4756), MTSS1 (MTSS1, содержащий домен I-BAR, ген №: 9788), TSPAN32 (тетраспанин 32, ген №: 10077), CLDN8 (клаудин 8, ген №: 9073), MYBPH (миозин-связывающий белок H, ген №: 4608), SGCE (саркогликан эпсилон, ген №: 8910), CDH15 (кадгерин 15, ген №: 1013), ARHGAP6 (активирующий Rho ГТФазу белок 6, ген №: 395), ZFP36L2 (подобный белку безымянного пальца ZFP36 белок 2, ген №: 678), EHF (фактор, гомологичный ETS, ген №: 26298), SLAMF6 (семейства SLAM член 6, ген №: 114836), HLA-DPB1 (главного комплекса гистосовместимости, класса II, DP-бета 1, ген №: 3115), SSC5D (член семейства богатых цистеином фагоцитарных рецепторов с 5 доменами, ген №: 284297), CCR4 (содержащий C-C мотив хемокиновый рецептор 4, ген №: 1233), CCR7 (содержащий C-C мотив хемокиновый рецептор 7, ген №: 1236), KLRG1 (подсемейства G рецепторов, подобных лектину клеток-киллеров, член 1, ген №: 10219), BLNK (B-клеточный линкер, ген №: 29760), IGFBP1 (связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 1, ген №: 3484), GIF (MIF, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, ген №: 4282), а также их сочетания, но настоящее изобретение не ограничено ими. Определение того, снижена или не снижена экспрессия гена, позволяет диагностировать инфекцию Helicobacter pylori.

[0030] В настоящем изобретении нуклеотидная последовательность гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, как описано выше, и аминокислотная последовательность белка, экспрессируемого с гена, может быть с легкостью получена специалистом в данной области из опубликованной базы данных, такой как GenBank NCBI, или документов. В частности, № гена по настоящему изобретению может быть определен с использованием уникальных идентификаторов (UID) в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) путем поиска генов на сайте NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).

[0031] В одном варианте осуществления настоящего изобретения препарат для определения уровня экспрессии гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, может представлять собой препарат для определения количества мРНК гена или количества белка, экспрессированного с гена. «Препарат для определения количества мРНК гена» означает препарат, способный: специфически связывать и узнавать мРНК гена; или амплифицировать мРНК гена. В качестве конкретного примера, но без ограничения, можно упомянуть пару зондов или зонд, специфически связывающийся с нуклеотидной последовательностью мРНК или кДНК, полученной путем обратной транскрипции мРНК.

[0032] Используемый в настоящей заявке термин «праймер» означает короткую нуклеотидную последовательность, имеющую свободную 3’-концевую гидроксильную группу, с которой спаривается комплементарная матричная цепь и, следовательно, которая служит для создания стартовой точки, когда полимераза нуклеиновой кислоты реплицирует и амплифицирует матричную цепь. Термин «зонд» означает фрагмент нуклеиновой кислоты, имеющий длину от нескольких оснований до сотен оснований и состоящий из последовательности, способной специфически связываться с мРНК или кДНК.

[0033] В одном варианте осуществления настоящего изобретения количество мРНК гена можно определять такими методами, как ПЦР, ОТ-ПЦР, конкурентная ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени, с использованием смыслового и антисмыслового праймеров для последовательности гена, и можно определять такими методами, как нозерн-блоттинг и микрочипы, с использованием зонда, имеющего последовательность, способную специфически связываться с мРНК, или кДНК, полученной путем обратной транскрипции, гена и, кроме того, можно определять такими методами, как анализ защиты от РНКазы и секвенирование; но настоящее изобретение не ограничено ими, и можно использовать любой препарат, необходимый для использования любых методов, известных специалисту в данной области.

[0034] «Препарат для определения количества белка, экспрессированного с гена» означает препарат, способный специфически связывать и узнавать белок. В качестве конкретного примера, он может представлять собой, но без ограничения, антитело или аптамер, специфически связывающий белок.

[0035] Термин «антитело» означает молекулу иммуноглобулина, которая иммунологически специфическим образом связывает эпитоп белка и обладает реакционной способностью, и он должен охватывать, без ограничения, моноклональное антитело, поликлональное антитело, антитело со структурой полноразмерных цепей, антитело в виде функционального фрагмента, имеющего по меньшей мере функцию связывания антигена, а также рекомбинантное антитело. «Аптамер» означает одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую стабильную трехмерную структуру с характерной способностью нацеливаться и специфически связываться с белком, и аптамер, специфический для белка, может быть синтезирован с использованием системной эволюции лигандов при помощи технологии экспоненциального обогащения (SELEX) и тому подобного.

[0036] В одном варианте осуществления настоящего изобретения количество белка, экспрессированного с гена, можно определять такими методами, как вестерн-блоттинг, белковая микропанель (белковый чип), иммуноферментный анализ (ELISA), 2-мерный электрофорез, иммуногистохимия (IHC), иммунофлуоресценция, анализ совместной иммунопреципитации, сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS), радиоиммунный анализ (RIA), радиоиммунодиффузия, времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), и тому подобное, с использованием антитела или аптамера, но настоящее изобретение не ограничено ими, и можно использовать любой препарат, необходимый для использования любых методов, известных специалисту в данной области.

[0037] Композиция, содержащая препарат для определения уровня экспрессии гена, может быть использована для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, а также для предсказания прогноза для пациента, имеющего заболевание. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда уровень экспрессии гена измерен и, как установлено, уровень экспрессии гена повышен или снижен, можно предсказывать, что пациент, имеющий связанное с Helicobacter pylori заболевание, будет иметь плохой прогноз. Вследствие этого, можно разрабатывать стратегии и контрмеры для лечения.

[0038] Используемый в настоящей заявке термин «диагноз» означает установление наличия или характеристик патологического состояния, и для целей настоящего изобретения он означает определение различий в терапевтическом эффекте против рака в зависимости от метастазов у пациента с раком, а также определение того, имеет ли соответствующий субъект рецидив, ответ на лекарственное средство, устойчивость, и так далее, после лечения рака. Предпочтительно, при использовании мутаций генов по настоящему изобретению также возможно предсказание различий в степени выживаемости путем тестирования того, имеются ли мутации в образце от пациента с раком почки. В этом случае различия в терапевтическом эффекте против рака почки в зависимости от метастазов у соответствующего пациента с раком почки и прогноз на будущее для соответствующего пациента можно определять на основании различий в степени выживаемости.

[0039] Используемый в настоящей заявке термин «прогноз» относится к прогрессированию и полному выздоровлению от заболевания, включая, например, рецидив и распространение метастазов связанного с Helicobacter pylori заболевания, а также устойчивость к лекарственному средству. В одном варианте осуществления настоящего изобретения связанное с Helicobacter pylori заболевание может включать, но не ограничивается ими, гастрит, язву желудка, рак желудка и тому подобное.

[0040] Используемый в настоящей заявке термин «рак» должен охватывать любого представителя класса заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Термин охватывает все известные виды рака и неопластических состояний, характеризуются ли они как злокачественные, доброкачественные, мягких тканей или солидные, а также рак всех стадий и категорий, включая рак до и после метастазирования.

[0041] Используемый в настоящей заявке термин «ген», и его варианты, охватывает фрагменты ДНК, вовлеченные в синтез полипептидных цепей, и включает области выше и ниже от кодирующей области, например, промотор и 3’-нетранслируемую область, соответственно, а также включает промежуточные последовательности (интроны) между соответствующими кодирующими фрагментами (экзонами).

[0042] В одном варианте осуществления настоящего изобретения мутация гена может включать любую одну или более мутаций, и может, например, представлять собой по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации укорочения, миссенс-мутации, нонсенс-мутации, мутации со сдвигом рамки, мутации внутри рамки, сплайс-мутации и мутации сайта сплайсинга. Мутация со сдвигом рамки может представлять собой по меньшей мере одну мутацию, выбранную из мутации вставки со сдвигом рамки (FS ins) и мутации делеции со сдвигом рамки (FS del). Мутация внутри рамки может представлять собой по меньшей мере одну мутацию, выбранную из мутации вставки в рамке (IF ins) и мутации делеции в рамке (IF del).

[0043] Обозначение «X#Y» в контексте мутации в полипептидной последовательности известно специалистам в данной области, где «#» указывает на местонахождение мутации, соответствующее номеру аминокислоты в полипептиде, «X» соответствует аминокислоте, находящейся в данном положении в аминокислотной последовательности дикого типа, и «Y» соответствует мутантной аминокислоте в данном положении.

[0044] Примерами аналитического метода определения прогноза для связанного с Helicobacter pylori заболевания на основании повышения или снижения экспрессии гена, являются: метод секвенирования нового поколения (NGS), ОТ-ПЦР, метод прямого секвенирования нуклеиновой кислоты, микрочипы и тому подобное, но настоящее изобретение не ограничено ими. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело, или нуклеотидный зонд, для определения повышения или снижения экспрессии гена является меченым детектируемой меткой. Метка может быть выбрана из группы, состоящей из иммунофлуоресцентной метки, хемилюминесцентной метки, фосфоресцентной метки, ферментной метки, радиоактивной метки, авидина/биотина, коллоидных частиц золота, окрашенных частиц и магнитных частиц, но настоящее изобретение не ограничено ими. В другом варианте осуществления настоящего изобретения повышение или снижение экспрессии гена можно определять с использованием радиоиммунного анализа, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресцентного анализа, иммуноферментного анализа, анализа иммунопреципитации, хемилюминесцентного анализа, иммуногистохимического анализа, дот-блоттинга, слот-блоттинга или проточной цитометрии, но настоящее изобретение не ограничено ими.

[0045] Используемый в настоящей заявке термин «полинуклеотид», как правило, означает любой полирибонуклеотид или полидезоксирибонуклеотид, который может представлять собой не модифицированную РНК или ДНК, либо модифицированную РНК или ДНК. Таким образом, в настоящей заявке термин «полинуклеотид» может, без ограничения, охватывать одно- и двухцепочечные ДНК, ДНК, содержащие одно- и двухцепочечные области, одно- и двухцепочечные РНК, и РНК, содержащие одно- и двухцепочечные области, а также гибридные молекулы, включающие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, более конкретно, двухцепочечными, или могут включать одно- и двухцепочечные области. Таким образом, ДНК или РНК, имеющие модифицированный каркас для стабильности или по другой причине, соответствуют термину «полинуклеотид», определение которому дано в настоящем документе. Кроме того, ДНК или РНК, содержащие необычные основания, такие как инозин, или модифицированные основания, например, меченое тритием основание, охвачены термином «полинуклеотид», определение которому дано в настоящем документе. Как правило, термин «полинуклеотид» охватывает все химически, ферментативно и/или метаболически модифицированные формы не модифицированного полинуклеотида. Полинуклеотид можно получать различными методами, включая in vitro технологию рекомбинантных ДНК, и получать путем экспрессии ДНК в клетках и организмах, но настоящее изобретение не ограничено перечисленным.

[0046] Набор по настоящему изобретению включает композицию по настоящему изобретению, описанную выше, и является очень экономичным за счет экономии времени и расходов в сравнении с общепринятыми способами поиска генов. В одном варианте осуществления настоящего изобретения набор праймеров, позволяющих определять уровень экспрессии разных генов, может быть собран на одном чипе в наборе по настоящему изобретению и, таким образом, время и расходы могут быть сэкономлены в сравнении с общепринятыми способами.

[0047] 2. Способ получения информации, необходимой для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания

[0048] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения информации, необходимой для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания у субъекта, включающему этапы: получения образца ДНК из образца от субъекта; амплификации образца ДНК с использованием композиции или набора по настоящему изобретению и определения уровня экспрессии гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, на основании результатов амплификации.

[0049] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения информации, необходимой для принятия решения о различии в терапевтическом эффекте у субъекта, инфицированного Helicobacter pylori, включающему этапы: лечения субъекта, у которого идентифицирован ген, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, любым потенциальным терапевтическим материалом для лечения связанного с Helicobacter pylori заболевания, или лечения субъекта любым способом; и выбора любого потенциального терапевтического материала или любого способа в качестве потенциального терапевтического материала или терапевтического способа, который подходит для пациента, в случае облегчения или лечения заболевания при использовании любого потенциального терапевтического материала или любого терапевтического способа.

[0050] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения информации, необходимой для диагностики, например, определения прогноза, связанного с Helicobacter pylori заболевания у пациента, инфицированного Helicobacter pylori, включающему этапы: получения образца ДНК из образца от пациента, инфицированного Helicobacter pylori; амплификации образца ДНК с использованием композиции или набора по настоящему изобретению и определения уровня экспрессии гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, на основании результатов амплификации.

[0051] Определение «композиции и набора для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания» является таким же, как описанное в разделе «1. Композиция и набор для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания», и, следовательно, их подробное описание опущено.

[0052] Любой потенциальный терапевтический материал может представлять собой терапевтическое средство, обычно используемое для лечения связанного с Helicobacter pylori заболевания, или новый материал, терапевтический эффект которого в отношении заболевания неизвестен, но настоящее изобретение не ограничено ими. Обладает или не обладает любой потенциальный терапевтический материал терапевтическим эффектом для определенной группы пациентов, можно определять путем лечения пациента, инфицированного Helicobacter pylori, любым потенциальным терапевтическим материалом для проверки терапевтического эффекта. Если потенциальный терапевтический материал проявляет терапевтический эффект в отношении гастрита, возникающего в результате инфекции Helicobacter pylori, можно прогнозировать, что потенциальный терапевтический материал будет проявлять высокий терапевтический эффект, если потенциальный терапевтический материал будет использован для группы пациентов, имеющих другое заболевание, возникающее в результате инфекции Helicobacter pylori, например, язву желудка или рак желудка, тем самым получая полезную информацию для определения стратегии лечения. Кроме того, если терапевтический эффект отсутствует в отношении гастрита, возникающего в результате инфекции Helicobacter pylori, при использовании любого потенциального терапевтического материала, нет необходимости в проведении ненужного лечения, приостанавливая терапию, для группы пациентов, имеющих другое заболевание, возникающее в результате инфекции Helicobacter pylori, например, язву желудка или рак желудка. Таким образом, может быть эффективно определена стратегия лечения.

[0053] Используемый в настоящей заявке термин «образец» должен охватывать, без ограничения, любой биологический образец, полученный от пациента. В одном варианте осуществления настоящего изобретения образец может включать, без ограничения, тонкоигольный пунктат, полученный из желудка пациента (например, пунктат, полученный при тонкоигольной аспирационной биопсии), образец ткани (например, ткани, пораженные гастритом, язвой желудка, раком желудка), например, биоптат опухоли (полученный, например, при аспирационной биопсии, хирургической резекции опухоли), а также клеточные экстракты из них. В одном варианте осуществления образец представляет собой, например, фиксированный в формалине залитый парафином (FFPE) образец ткани, пораженной гастритом, язвой желудка или раком желудка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения образец представляет собой лизат или экстракт ткани, полученный из замороженной ткани субъекта, имеющего гастрит, язву желудка или рак желудка.

[0054] Используемый в настоящей заявке термин «субъект» может относиться ко всем животным, таким как крысы, мыши и домашний скот, включая людей. В частности, субъектом может быть субъект, инфицированный, или предположительно инфицированный, Helicobacter pylori. В качестве другого примера субъектом может быть субъект, имеющий или имеющий риск развития связанного с Helicobacter pylori заболевания. Более конкретно, субъектом может быть пациент, инфицированный Helicobacter pylori.

[0055] Используемый в настоящей заявке термин «пациент», как правило, должен означать людей, но также охватывает и других животных, таких как другие приматы, грызуны, собаки, кошки, лошади, овцы, свиньи и тому подобное.

[0056] Используемый в настоящей заявке термин «облегчение» означает, без ограничения, все действия, приводящие по меньшей мере к снижению таких параметров, как степень тяжести симптома, которые связаны с лечением.

[0057] Используемый в настоящей заявке термин «предотвращение» должен охватывать все действия, приводящие к ингибированию или отсрочке возникновения симптома связанного с Helicobacter pylori заболевания.

[0058] Используемый в настоящей заявке термин «лечение» должен охватывать все действия, приводящие к ослаблению или изменению в лучшую сторону симптома связанного с Helicobacter pylori заболевания.

[0059] Кроме того, используемый в настоящей заявке термин «введение» означает введение заранее определенного вещества субъекту соответствующим образом.

[0060] В соответствии с настоящим изобретением экспрессию гена, экспрессия которого повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, раскрытого в настоящем документе, в образце от пациента, имеющего связанное с Helicobacter pylori заболевание, можно анализировать для определения прогноза для субъекта, от которого получен целевой образец, в отношении связанного с Helicobacter pylori заболевания. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, экспрессия которого повышена в результате инфекции Helicobacter pylori, может быть выбран из группы, состоящей из FGF21, CTH, CREBRF, DLL4, FGF18, FOS, PDK1, PTPRN, CLIC4, PTPRB, PPP1R15A, PTPRH, DDIT3, BIRC3, FOXO3, BCL2, PRKCE, CHMP4C, CLDN14, SLC7A11, BOC, AJUBA, LMO7, MMP24, C3orf58, KLF10, CSGALNACT1, CEP120, CHAC1, ASNS, NFE2L2, RIOK3, TXNIP, MTR, IFRD1, а также их сочетания, и, в частности, может быть выбран из группы, состоящей из FGF21, CTH, CREBRF, PTPRN, а также их сочетания, но настоящее изобретение не ограничено ими. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ген, экспрессия которого снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, может быть выбран из группы, состоящей из ADGRA2, TBX4, OVOL2, ACVRL1, ALB, JADE1, MLLT11, ADORA1, TNFRSF8, NLRP12, CASP14, LTA, SMAGP, NEO1, MTSS1, TSPAN32, CLDN8, MYBPH, SGCE, CDH15, ARHGAP6, ZFP36L2, EHF, SLAMF6, HLA-DPB1, SSC5D, CCR4, CCR7, KLRG1, BLNK, IGFBP1, GIF, а также их сочетания, но настоящее изобретение не ограничено ими.

[0061] Авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что повышение или снижение экспрессии генов может быть использовано в качестве диагностического маркера, позволяющего предсказывать различия в терапевтическом эффекте для пациента, имеющего связанное с Helicobacter pylori заболевание, или определять прогноз для пациента, имеющего связанное с Helicobacter pylori заболевание. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения информации, необходимой для определения прогноза связанного с Helicobacter pylori заболевания, по настоящему изобретению может быть использован для диагностики наличия заболевания, повышения степени выживаемости или снижения частоты рецидивов у пациента, имеющего заболевание. В другом варианте осуществления настоящего изобретения за счет использования способа по настоящему изобретению может быть предсказан терапевтический эффект в отношении заболевания, или может быть предсказана степень выживаемости или частота рецидивов для пациента, имеющего заболевание, и, таким образом, может быть получена информация для нахождения терапевтических средств и выбора терапевтических способов, подходящих для каждого пациента. Соответственно, может быть эффективно разработана стратегия лечения связанного с Helicobacter pylori заболевания.

[0062] Настоящее изобретение относится к способам диагностики и определения прогноза заболевания путем анализа изменений в экспрессии генов in vivo после инфекции Helicobacter pylori. В одном варианте осуществления настоящего изобретения классификация позволяет оптимизировать лечение и определять, стоит ли продолжать определенную терапию, и как оптимизировать дозу, выбирать лечение и тому подобное. Анализ паттернов экспрессии группы генов для одной клетки также позволяет идентифицировать и разрабатывать лечение, которое направлено на мутации и/или пути в пораженных болезнью клетках.

[0063] В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ изучения и анализа экспрессии одного или более генетических маркеров в образце ткани или клеток млекопитающего. В одном варианте осуществления экспрессия одного или более генетических маркеров указывает на то, что субъект-млекопитающее, от которого получен образец ткани или клеток, весьма вероятно имеет связанное с Helicobacter pylori заболевание.

[0064] В одном варианте осуществления настоящего изобретения симптом связанного с Helicobacter pylori заболевания может быть уменьшен или устранен в результате употребления в пищу субъектом, инфицированным Helicobacter pylori, кимчи, содержащего молочнокислые бактерии, или введения субъекту кимчи, содержащего молочнокислые бактерии. В одном варианте осуществления настоящего изобретения кимчи может представлять собой, но не ограничивается ими, кимчи, содержащее Leuconostoc mesenteroides CJLM119 и Lactobacillus plantarum CJLP133. Leuconostoc mesenteroides CJLM119 представляет собой микробный штамм, депонированный в Генном банке Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии под регистрационным номером KCTC 13043BP, и способ выделения и идентификации штамма описан в корейском патенте № 1807995. Кроме того, Lactobacillus plantarum CJLP133 представляет собой микробный штамм, депонированный в Генном банке Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии под регистрационным номером KCTC 11403BP, и способ выделения и идентификации штамма описан в корейском патенте 1486999.

[0065] Термин «кимчи» должен охватывать, без ограничения, продукты питания, приготовленные путем соления и заправки специями овощей, с последующей их ферментацией. Например, овощи могут представлять собой капусту кимчи, дайкон, зеленый лук, листья горчицы, огурцы и тому подобное. В частности, овощи могут представлять собой капусту кимчи, а также любые другие овощи могут быть использованы в качестве сырья для кимчи. В одном варианте осуществления настоящего изобретения овощи могут представлять собой, но без ограничения, капусту кимчи, и в частности, капусту кимчи с высоким содержанием ликопина.

[0066] В одном варианте осуществления настоящего изобретения набор специй получают путем смешивания таких ингредиентов, как порошок красного перца, чеснок, имбирь, соленая рыба и так далее, и в дополнение к ним, в качестве ингредиентов, составляющих смесь специй, можно добавлять, или исключать, любые другие ингредиенты, по мере необходимости, в зависимости от личных предпочтений, методов ферментации, периода ферментации и так далее. Кимчи по настоящему изобретению можно получать способом, включающим смешивание засоленных овощей, например, засоленной капусты кимчи, с набором специй, с последующей их ферментацией, в соответствии с общепринятым способом получения кимчи. В случае использования китайской капусты может быть более подходящим использование китайской капусты с высоким содержанием ликопина. Однако настоящее изобретение не ограничено перечисленным, и обычную китайскую капусту можно использовать без ограничения для получения кимчи.

[0067] В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессия генов, таких как гены, связанные с ЭР-стрессом, гены, связанные с окислительным стрессом, гены, связанные с регенерацией тканей, гены, связанные с ангиогенезом, и тому подобное, может быть повышена в результате инфекции Helicobacter pylori in vitro или in vivo (смотри ФИГ. 1, ФИГ. 2 и ФИГ. 5).

[0068] В другом варианте осуществления настоящего изобретения экспрессия генов, таких как гены, связанные с клеточной защитной реакцией, гены, связанные с регенерацией тканей, гены, связанные с антиоксидацией, гены, связанные с клеточной адгезией, и тому подобное, может быть снижена в результате инфекции Helicobacter pylori in vitro или in vivo (смотри ФИГ. 3, ФИГ. 4 и ФИГ. 6).

[0069] Следовательно, список генов, экспрессия которых повышена или снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, идентифицированных в настоящей заявке, можно с пользой применять для предотвращения, лечения или облегчения различных заболеваний, которые могут быть вызваны Helicobacter pylori, например, гастрита, язвы желудка и рака желудка.

[0070]

[0071] Далее настоящее изобретение описано подробно с помощью примеров и экспериментальных примеров.

[0072] Однако следующие далее примеры и экспериментальные примеры лишь иллюстрируют настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения не ограничено следующими далее примерами и экспериментальными примерами.

[0073] В следующих далее примерах и экспериментальных примерах статистический анализ проводили с использованием программ GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) и SPSS (версия 12.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Статистически значимые различия между группами определяли с использованием U-критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.

[0074] Пример 1: Получение инфицированных Helicobacter pylori клеток рака желудка и животных моделей

[0075] <1-1> Модель инфицированных Helicobacter pylori клеток рака желудка

[0076] Линию клеток аденокарциномы желудка (AGS) приобретали у ATCC (Manassas, VA), хранили и использовали. Все клетки не использовали более 6 месяцев после реанимации. Клетки AGS культивировали при 37°C, 5% CO₂ в среде, содержащей раствор для культивирования RPMI-1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) и 10% эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС, Gibco BRL). Клетки вносили в 6-луночный планшет в концентрации 10⁵ клеток/мл, оставляли для адсорбции на 24 часа, а затем подвергали воздействию Helicobacter pylori в дозе 50 MOI (500⁵ КОЕ) в течение 6 часов для инфицирования клеток.

[0077] <1-2> Получение противоракового кимчи

[0078] Кимчи получали общепринятым способом получения кимчи. Противораковое кимчи (далее в настоящем документе иногда называемое «прКимчи» или «ПРК») получали таким же способом, как и стандартное кимчи (далее в настоящем документе иногда называемое «сКимчи» или «СК»), за исключением того, что: в качестве основного материала использовали китайскую капусту с высоким содержанием ликопина вместо обычной китайской капусты, и использовали два вида молочнокислых бактерий, Leuconostoc mesenteroides CJLM119 и Lactobacillus plantarum CJLP133. Leuconostoc mesenteroides CJLM119 представляет собой микробный штамм, депонированный в Генном банке Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии под регистрационным номером KCTC 13043BP, и способ выделения и идентификации штамма конкретно описан в корейском патенте № 10-1807995. Кроме того, Lactobacillus plantarum CJLP133 представляет собой микробный штамм, депонированный в Генном банке Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии под регистрационным номером KCTC 11403BP, и способ выделения и идентификации штамма конкретно описан в корейском патенте № 10-1486999. Соответственно, их подробное описание опущено.

[0079] <1-3> Получение концентрата экстракта кимчи

[0080] Кимчи, полученное в примере <1-2>, лиофилизировали, а затем измельчали в порошок. К порошку добавляли 20-кратный избыток по массе метанола, а затем проводили экстракцию с перемешиванием в течение 12 часов. Экстрагированный супернатант фильтровали через фильтровальную бумагу, к оставшемуся преципитату вновь добавляли метанол для проведения экстракции в течение 12 часов. Экстракт концентрировали путем нагревания при температуре примерно 40°C в устройстве для концентрирования, получая концентрат, и концентрат хранили при 4°C для использования в последующих экспериментах.

[0081] <1-4> Препарат для in vitro и in vivo экспериментальных моделей

[0082] Для in vitro эксперимента концентрат экстракта кимчи, полученный в примере <1-3>, использовали в концентрации 5 мг/мл и 10 мг/мл, соответственно. Употребление в пищу кимчи для in vivo эксперимента было следующим: обычно кореец употребляет в пищу кимчи в количестве от примерно 30 до 100 г в день в зависимости от личных предпочтений; концентрат экстракта противоракового кимчи смешивали с пищевыми гранулами для модельных животных один раз в неделю, в два раза больше по массе, в соотношениях 1,7 г/кг/сутки и 5,1 г/кг/сутки, и полученную смесь использовали в пересчете на обычное употребление в пищу кимчи корейцем.

[0083] <1-5> Выделение РНК и проведение ОТ-ПЦР

[0084] Культуральную среду от инфицированных Helicobacter pylori клеток рака желудка, полученных в примере <1-1>, удаляли аспирацией, затем клетки дважды промывали PBS Дульбекко. В планшет добавляли RiboEX (500 мкл, GeneAll, Seoul, South Korea), инкубировали при 4°C в течение 10 минут. RiboEX собирали и помещали в 1,5-мл пробирку, добавляли 100 мкл хлороформа и медленно перемешивали. После 10 минут инкубации на льду образцы центрифугировали при 10000 g в течение 30 минут. Супернатант смешивали с 200 мкл изопропанола, и смесь инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После центрифугирования при 13000 g в течение 30 минут осадок промывали 70% (об/об) этанолом. Этанол полностью выпаривали, осадок растворяли в 100 мкл воды, обработанной диэтиленпирокарбонатом (DEPC) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). кДНК получали при помощи фермента обратной транскриптазы из вируса лейкоза мышей Молони (Promega, Madison, WI). ПЦР проводили с использованием 30 циклов по 20 секунд при 94°C, 30 секунд при 58°C и 45 секунд при 72°C.

[0085] <1-6> Секвенирование мРНК

[0086] Библиотеку получали из 2 мкг суммарной РНК с использованием набора SMARTer Stranded RNA-Seq kit (Clontech Laboratories, Inc., USA). Выделение мРНК проводили с использованием набора Poly(A) RNA Selection Kit (LEXOGEN, Inc., Austria). Выделенную мРНК использовали для синтеза и расщепления кДНК. Индексирование проводили с использованием индексов Illumina 1-12, и амплификацию проводили методом ПЦР. Затем оценивали средний размер фрагментов путем анализа библиотеки на биоанализаторе Agilent 2100 (DNA High Sensitivity Kit). Для количественного определения использовали набор для количественного анализа библиотеки при помощи StepOne™ системы ПЦР в реальном времени (Life Technologies, Inc., USA). Высокопроизводительное секвенирование проводили путем секвенирования спаренных концов с прочтением 100 нуклеотидов с использованием HiSeq 2500 (Illumina, Inc., USA).

[0087] <1-7> Анализ данных

[0088] Для анализа мРНК-сек использовали программу TopHat (Cole Trapnell et al., 2009) для получения файла выравнивания. Дифференциально экспрессированные гены определяли на основании подсчета чтений при уникальных и множественных выравниваниях с использованием покрытия Bedtools (Quinlan AR, 2010). Данные RT (подсчет чтений) обрабатывали методом квантильной нормализации при помощи EdgeR в статистической программе R (R development Core Team, 2016) с использованием Bioconductor (Gentleman et al., 2004). Файлы выравнивания также были использованы для сборки транскриптов, оценки их распространенности и обнаружения дифференциальной экспрессии генов или изоформ при помощи Cufflinks. Показатель фрагментов на килобазу экзона на миллион фрагментов (FPKM) использовали для определения уровней экспрессии генных областей. Классификация генов основана на результатах поиска, выполненных с DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/).

[0089] Пример 2: Гены со специфически повышенной экспрессией после инфекции Helicobacter pylori

[0090] <2-1> Идентификация генов методом РНК-сек

[0091] Проводили анализ РНК-сек для обнаружения генов-мишеней, индуцируемых инфекцией Helicobacter pylori, и среди генов были идентифицированы 126 генов, экспрессия которых была повышена в результате инфекции Helicobacter pylori, но нормализовалась при комбинированной обработке прКимчи. Установлено, что эти гены представляют собой гены, связанные с ЭР-стрессом, гены, связанные с окислительным стрессом, гены, связанные с регенерацией тканей, гены, связанные с ангиогенезом, и так далее (ФИГ. 1).

[0092] <2-2> Валидация методом ОТ-ПЦР результатов РНК-сек

[0093] Результат анализа тепловой карты РНК-сек подтверждали методом ОТ-ПЦР. Среди генов, связанных с ангиогенезом, экспрессия DLL4 (дельта-подобный белок 4) и FGF18 (фактор роста фибробластов 18) была значительно снижена после комбинированной обработки прКимчи. Экспрессия FGF21 (фактор роста фибробластов 21), CTH (цистатионин-лиаза) и CREBPF (белок, связывающий элемент отклика цАМФ) среди генов, связанных с ЭР-стрессом, и экспрессия FOS, PDK1 (фосфоинозитидзависимая киназа-1) и PTPRN (подобный рецепторной тирозин-протеинфосфатазе белок N) среди генов, связанных с окислительным стрессом, также была значительно снижена после комбинированной обработки прКимчи (ФИГ. 2).

[0094] Пример 3: Гены, экспрессия которых снижается в результате инфекции Helicobacter pylori

[0095] <3-1> Идентификация генов методом РНК-сек

[0096] Среди генов анализировали гены, экспрессия которых была снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, но нормализовалась и, следовательно, повышалась при обработке прКимчи. Всего было идентифицировано 262 гена. Гены, экспрессия которых была снижена в результате инфекции Helicobacter pylori, но нормализовалась при комбинированной обработке прКимчи, были классифицированы на гены, связанные с клеточной защитной реакцией, гены, связанные с регенерацией тканей, гены, связанные с антиоксидацией, гены, связанные с клеточной адгезией, и так далее (ФИГ. 3).

[0097] <3-2> Валидация методом ОТ-ПЦР результатов РНК-сек

[0098] Результат анализа тепловой карты РНК-сек подтверждали методом ОТ-ПЦР. Для генов ALB, NEO1 (предшественник неогенина 1), CLDN8 (клаудин 8), KLRG1 (подсемейства G рецепторов, подобных лектину клеток-киллеров, член 1) и IGFBP1 (связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 1) было установлено, что экспрессия генов, которая была снижена, нормализовалась после обработки прКимчи (ФИГ. 4).

[0099] Пример 4: In vivo верификация генов, экспрессия которых специфически повышается в результате инфекции Helicobacter pylori

[00100] В эксперименте с животной моделью инфекции Helicobacter pylori было установлено, что экспрессия генов, связанных с ЭР-стрессом, совпадала с результатами РНК-сек. В группе 2 животных, инфицированных Helicobacter pylori, экспрессия генов, связанных с ЭР-стрессом, была значительно повышена, что согласуется с результатами РНК-сек. Экспрессия этих генов, вовлеченных в ЭР-стресс, в значительной степени нормализовалась в группах 3 и 4 животных, получавших прКимчи, что также согласовалось с результатами РНК-сек (ФИГ. 5).

[00101] Пример 5: In vivo верификация генов, экспрессия которых специфически снижается в результате инфекции Helicobacter pylori

[00102] В животной модели инфекции Helicobacter pylori было установлено, что экспрессия генов, связанных с антиоксидацией, совпадала с результатами РНК-сек. Экспрессия генов, связанных с антиоксидацией, была значительно снижена в группе 2 животных, инфицированных Helicobacter pylori, но в значительной степени повышалась и восстанавливалась в обеих группах, 3 и 4, животных, получавших прКимчи (ФИГ. 6).

[00103] Хотя иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения описаны выше, объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления, описанными выше; специалист в данной области может вносить в настоящее изобретение изменения в пределах объема, определяемого формулой настоящего изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено применение FGF21, т.е. гена фактора роста фибробластов 21, для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания. Также предложено применение гена FGF21 для получения набора для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания. Указанный ген может применяться с одним или более генов выбранных из группы, состоящей из генов CTH, CREBRF, DLL4, FGF18, FOS, PDK1, PTPRN, CLIC4, PTPRB, PPP1R15A, PTPRH, DDIT3, BIRC3, FOXO3, BCL2, PRKCE, CHMP4C, CLDN14, SLC7A11, BOC, AJUBA, LMO7, MMP24, C3orf58, KLF10, CSGALNACT1, CEP120, CHAC1, ASNS, NFE2L2, RIOK3, TXNIP, MTR, IFRD1, ALB, NLRP12, NEO1, CLDN8, CCR7, KLRG1, IGFBP1, GIF и их комбинации. Также предложен способ определения экспрессии гена FGF21 отдельно или в комбинации с вышеуказанными генами для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания у пациента, инфицированного Helicobacter pylori. Изобретение может быть эффективно использовано для диагностики или прогноза связанного с Helicobacter pylori заболевания. 7 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

1. Применение FGF21, т.е. гена фактора роста фибробластов 21 для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания.

2. Применение генов для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, где гены представляют собой: (i) FGF21, т.е. ген фактора роста фибробластов 21; и (ii) один или более генов выбранных из группы, состоящей из CTH, т.е. цистатионин-гамма-лиаза и CREBRF, т.е. ген белка, связывающего элемент отклика цАМФ.

3. Применение генов для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, где гены представляют собой: (i) FGF21, т.е. ген фактора роста фибробластов 21; и (ii) один или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов: DLL4, т.е. дельта-подобный белок 4, FGF18, т.е. фактор роста фибробластов 18, FOS, т.е. протоонкоген FOS, субъединица фактора транскрипции AP-1, PDK1, т.е. фосфоинозитидзависимая киназа-1, PTPRN, т.е. подобный рецепторной тирозин-протеинфосфатазе белок N, CLIC4, т.е. хлоридного внутриклеточного канала белок 4, PTPRB, т.е. протеинтирозинфосфатаза, рецепторная типа B, PPP1R15A, т.е. протеинфосфатазы 1 регуляторная субъединица 15A, PTPRH, т.е. протеинтирозинфосфатаза, рецепторная типа H, DDIT3, т.е. индуцируемый повреждением ДНК транскрипт 3, BIRC3, т.е. бакуловирусный белок 3, содержащий повтор IAP, FOXO3, т.е. forkhead-бокс O3, BCL2, т.е. BCL2, регулятор апоптоза, PRKCE, т.е. протеинкиназа C-эпсилон, CHMP4C, т.е. заряженный белок мультивезикулярного тельца 4C, CLDN14, т.е. клаудин 14, SLC7A11, т.е. семейства переносчиков растворенных веществ 7 член 11, BOC, т.е. связанный с клеточной адгезией, регулируемый онкогенами белок BOC, AJUBA, т.е. содержащий LIM-домен белок ajuba, LMO7, т.е. содержащий LIM-домен белок 7, MMP24, т.е. матриксная металлопептидаза 24, C3orf58, т.е. дивергентный домен протеинкиназы 2A, KLF10, т.е. Kruppel-подобный фактор 10, CSGALNACT1, т.е. хондроитинсульфат N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 1, CEP120, т.е. центросомальный белок 120, CHAC1, т.е. ChaC глутатион-специфическая гамма-глутамилциклотрансфераза 1, ASNS, т.е. аспарагинсинтетаза, т.е. глутамин-гидролизующая, NFE2L2, т.е. ядерный фактор, эритроид 2-подобный белок 2, RIOK3, т.е. RIO киназа 3, TXNIP, т.е. взаимодействующий с тиоредоксином белок, MTR, т.е. 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин-метилтрансфераза, IFRD1, т.е. интерферон-связанный регулятор развития 1, ALB, т.е. альбумин, NLRP12, т.е. семейства NLR содержащий домен пирина член 12, NEO1, т.е. предшественник неогенина 1, CLDN8, т.е. клаудин 8, CCR7, т.е. содержащий C-C мотив хемокиновый рецептор 7, KLRG1, т.е. подсемейства G рецепторов, подобных лектину клеток-киллеров, член 1, IGFBP1, т.е. связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 1, GIF, т.е. MIF, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, а также их сочетания.

4. Применение FGF21, т.е. гена фактора роста фибробластов 21 для получения набора для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания.

5. Применение генов для получения набора для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания, где гены представляют собой: (i) FGF21, т.е. ген фактора роста фибробластов 21; и (ii) один или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов CTH, CREBRF, DLL4, FGF18, FOS, PDK1, PTPRN, CLIC4, PTPRB, PPP1R15A, PTPRH, DDIT3, BIRC3, FOXO3, BCL2, PRKCE, CHMP4C, CLDN14, SLC7A11, BOC, AJUBA, LMO7, MMP24, C3orf58, KLF10, CSGALNACT1, CEP120, CHAC1, ASNS, NFE2L2, RIOK3, TXNIP, MTR, IFRD1, ALB, NLRP12, NEO1, CLDN8, CCR7, KLRG1, IGFBP1, GIF и их комбинации.

6. Способ определения экспрессии FGF21, т.е. гена фактора роста фибробластов 21 для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания у пациента, инфицированного Helicobacter pylori,

где способ включает стадию определения уровня экспрессии FGF21, т.е. гена фактора роста фибробластов 21, экспрессия которого повышена в результате инфекции Helicobacter pylori.

7. Способ определения экспрессии генов для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания у пациента, инфицированного Helicobacter pylori, где способ включает стадию определения уровня экспрессии генов, экспрессия которых повышается или снижается в результате инфекции Helicobacter pylori;

где гены представляют собой: (i) FGF21, т.е. ген фактора роста фибробластов 21; и (ii) один или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов CTH, CREBRF, DLL4, FGF18, FOS, PDK1, PTPRN, CLIC4, PTPRB, PPP1R15A, PTPRH, DDIT3, BIRC3, FOXO3, BCL2, PRKCE, CHMP4C, CLDN14, SLC7A11, BOC, AJUBA, LMO7, MMP24, C3orf58, KLF10, CSGALNACT1, CEP120, CHAC1, ASNS, NFE2L2, RIOK3, TXNIP, MTR, IFRD1, ALB, NLRP12, NEO1, CLDN8, CCR7, KLRG1, IGFBP1, GIF и их комбинации.

8. Способ определения экспрессии генов для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания по п. 6 или 7, где этап определения уровня экспрессии гена представляет собой определение количества мРНК генов, количества белка, экспрессированного с гена, или и то, и другое.

9. Способ определения экспрессии генов для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания по п. 8, где определение количества мРНК генов выполняют с использованием праймера или зонда, который специфически связывается с мРНК или кДНК генов.

10. Способ определения экспрессии генов для диагностики связанного с Helicobacter pylori заболевания по п. 8, где определение количества белка, экспрессированного с генов, выполняют с использованием антитела или аптамера, специфического для белка, экспрессированного с генов.