СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПАРОДОНТИТА НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2023 года по МПК A61B17/00 G09B23/28 A61C7/00 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано при моделировании пародонтита с целью изучения особенностей патогенеза и клинического течения пародонтита, а также для оценки эффективности новых методов лечения воспалительных заболеваний пародонта.

Пародонтит - инфекционное заболевание, которое приводит к разрушению опорных структур зуба, постепенной потере эпителиального, соединительнотканного прикрепления и костной ткани челюсти, образованию пародонтального и костного карманов, характеризуется выраженным дисбиозом в полости рта. Результаты недавних исследований говорят о том, что распространенность заболеваний пародонта у взрослых людей составляет около 46% (а среди лиц пожилого возраста - до 82%) и рассматривается как одна из наиболее частых причин потери зубов [Nazir М., Al-Ansari A., Al-Khalifa K., Alhareky М., Gaffar В., Almas K. Global Prevalence of periodontal disease and lack of its surveillance. Scientific World Journal. -2020; - 2146160. doi: 10.1155/2020/2146160.]. Все более актуальной становится проблема сочетанных поражений тканей пародонта и пульпы зубов. Такой сложный морфофункциональный симптомокомплекс получил название эндо-пародонтального поражения (ЭПП). К сожалению, на сегодняшний день отсутствуют научно обоснованные алгоритмы комплексного лечения этой патологии. Кроме того, одной из основных проблем остается отсутствие диагностических алгоритмов, позволяющих врачу правильно поставить диагноз. Ряд авторов сегодня предлагают новые методы лечения пародонтита и ЭПП [Румянцев В.А., Федотова Т.А., Заблоцкая М.В., Юсупова Ю.И., Рябиков М.Д., Моисеев Д.А. Новый метод комплексного лечения эндодонто-пародонтальных поражений с помощью наноимпрегнации и купрал-кюретажа. Тверской медицинский журнал. -2017. - №4. С. 4-9. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=32389625.]. Однако, исследование эффективности новых способов лечения и препаратов на больных затруднительно и связано с рядом ограничений. В этом случае возникает необходимость в проведении исследований на лабораторных животных. В известных моделях экспериментального пародонтита (аналогах) ключевая роль отводится механической травме тканей пародонта.

В частности, известен способ получения модели хронического пародонтита у крыс [RU 2545923 С1, ИХТТ УрО РАН, 10.04.2015], который осуществляют под анестезией путем нанесения острой механической травмы тканей десны. Для этого, под общей анестезией на фоне тиопенталового наркоза, вводят цельнометаллическую иглу длиной 12 мм в десневой край с вестибулярной поверхности правого нижнего зуба с медиального края вплотную вдоль зуба с небольшим усилием для разрыва тканей и внедрения в костную ткань челюсти.

Недостатком способа является значительная травматизация тканей и стресс для животного. Кроме того, сроки воспроизведения пародонтита составляют 25 суток, что достаточно длительно. Введение иглы производится под общей анестезией на фоне тиопенталового наркоза, что сложно воспроизводимо, учитывая то, что тиопентал натрия относится к списку сильнодействующих веществ (список №1), а оборот его ограничен.

Известен также способ получения модели пародонтита [RU 2252009 С2, Буранбаев Р.З., 20.05.2005], при котором создают искусственную зубную бляшку вокруг шейки верхних и нижних резцов при помощи стоматологического цемента, причем зубная бляшка имеет шероховатую поверхность и заходит на 1-1,5 мм под десну. Экспериментальные животные помещаются по 10-11 особей в клетку. В процессе моделирования экспериментальные животные получают кашицеобразную пищу. Болезнь развивается через 20-30 дней от начала воздействия. Эксперимент проводят под эфирным наркозом или внутривенным наркозом тиопенталом натрия.

Недостатком способа является его длительность: заболевание развивается через 25-30 дней. Кроме того, моделирование пародонтита проводится под внутривенным тиопенталовым наркозом, что сложно воспроизводимо, учитывая то, что тиопентал натрия относится к списку сильнодействующих веществ (список №1), а оборот его ограничен. Кроме того, модель предполагает заведомо стрессовые условия для животных.

Известен также способ моделирования пародонтита в эксперименте [патент RU 2699497 С2, "Северо-Осетинская государственная медицинская академия", опубл. 05.09.2019]. Острый пародонтит моделировали путем наложения под тиопенталовым наркозом в дозе 10 мг/кг, металлической лигатуры у десневого края нижних резов восьмиобразно, которую фиксировали к гребню альвеолярного отростка шелковой нитью. Со вторых по седьмые сутки, ежедневно, крыс помещают в клетки площадью 0,008 м² на шесть часов, причем с 1 по 7 сутки крысы находятся на высокоуглеводистой диете по Евдокимову без ограничения водного режима. Пародонтит развивается на 7-е сутки. Эксперимент проводили под тиопенталовым наркозом.

Недостатком способа является то, что местное воздействие ограничивается только использованием металлической лигатуры и не учитывает инфекционную природу пародонтита. Кроме того, данная модель не учитывает патогенетические механизмы развития пародонтита: расстройства микроциркуляции (ишемия, стаз, повышенная сосудистая проницаемость), нарушения антиоксидантной защиты и другие. Кроме того, модель предполагает заведомо стрессовые условия для животных.

Прототипом патентуемого способа является способ, описанный в публ. Светлакова Е.Н., Мандра Ю.В., Полушина Л.Г., Максимова А.Ю., Базарный В.В., Медведева С.Ю. Создание экспериментальной модели пародонтита на лабораторных животных // Международный конгресс «Стоматология Большого Урала» 29 ноября - 1 декабря 2017 года Молодежная научная школа по проблемам фундаментальной стоматологии. Издательский Дом «ТИРАЖ». 2018. С. 107-109]. Для воспроизведения модели пародонтита у крыс применяется комплексное воздействие на ткани пародонта - механическое повреждение (разрыв круговой связки зуба), микробное инфицирование раневой поверхности, нарушение микроциркуляции тканей. Животному выполняется наркоз, разрывается круговая связка зуба при помощи серповидной гладилки и вводятся зубные отложения - зубной налет и зубной камень от пациента, зубы шинируются. Фиксируется развитие пародонтита на 21-35 сутки.

Недостатками прототипа являются длительность воспроизведения модели: максимальные морфологические сдвиги фиксируются на 21-35 сутки; сильная травматизация тканей пародонта путем разрыва круговой связки зуба и введения в рану зубного камня, полученного от пациента, фиксация зубного камня в ране затруднительна. Кроме того, шинирование зубов является методом лечения пародонтита и обеспечивает функциональную стабильность зубочелюстного сегмента, а в прототипе, используется как иммобилизационный стресс, главным образом негативно влияющий на организм животного в целом, и, опосредованно, на состояние тканей пародонта. Это снижает достоверность моделируемого заболевания.

Настоящее изобретение направлено на решение проблемы сокращения сроков создания модели, снижения травмирующего действия на ткани пародонта, исключения иммобилизационного стресса и приближения условий возникновения пародонтита к таковым у человека, в чем и состоит технический результат изобретения.

Патентуемый способ моделирования пародонтита на крысах включает комплексное воздействие на ткани пародонта с нарушением микроциркуляции тканей и микробным инфицированием.

Отличие состоит в следующем. Проводят восьмиобразное наложение металлической проволочной лигатуры на пришеечную область отдельно верхних и нижних резцов крысы.

после наложения металлической лигатуры на пришеечную область каждого резца верхней и нижней челюсти между лигатурой и краем десны крысы помещают зубной налет от пациента с хроническим пародонтитом, затем под слизистую оболочку десны с вестибулярной стороны, в области каждого резца верхней и нижней челюсти проводят инъекции раствора никотина 0,001 мг/л в физиологическом растворе в объеме 0,05 мл, а спустя 10 минут - 50% раствора этилового спирта в объеме 0,05 мл, причем указанные инъекции проводят ежедневно в течение 7 дней.

Таким образом, способ позволяет осуществить моделирование в короткие сроки (7 суток), не предполагает применения травмирующих элементов и заведомо стрессовых условий содержания животных.

Способ реализуют следующим образом.

Лабораторным крысам, под наркозом, на пришеечную область верхних и нижних резцов восьмиобразно накладывается проволочная лигатура диаметром 0,3 мм. Края проволоки скручиваются и загибаются, не травмируя слизистую оболочку. Под проволоку с помощью гладилки помещается зубной налет, полученный от пациента с пародонтитом, собранный путем соскабливания с коронковых и пришеечных частей зубов. Под слизистую оболочку десны с вестибулярной стороны, в области исследуемых зубов, проводится инъекция раствора никотина в физиологическом растворе (концентрация никотина 0,001 мг/л) в объеме 0,05 мл, а спустя 10 минут - 50% раствора этилового спирта в объеме 0,05 мл. Инъекции проводятся ежедневно, в течение 7-ми дней. Все крысы размещаются в стандартных клетках группами по два животных, находятся на высокоуглеводной диете по Евдокимову без ограничения водного режима. Все процедуры выполняются под комбинированным внутримышечным наркозом с использованием, например, Золетила-50 (Virbac, Франция): 1 мг/кг и Ксиланита (Нита-Фарм, Россия) 0,05 мл/кг - 0,1 мл/кг. Средняя продолжительность пребывания животного под наркозом - 1 час.

Пример. Лабораторным крысам, под наркозом, на пришеечную область верхних и нижних резцов восьмиобразно накладывали лигатуру из проволоки диаметром 0,3 мм. Края проволоки скручивали и загибали. Под проволоку с помощью гладилки помещали зубной налет, полученный от пациента с хроническим пародонтитом. Под слизистую оболочку десны с вестибулярной стороны, в области передних зубов, проводили инъекции раствора никотина в физиологическом растворе (концентрация никотина 0,001 мг/л) в объеме 0,05 мл, а спустя 10 минут - 50% раствора этилового спирта в объеме 0,05 мл. Инъекции проводили ежедневно, в течение 7-ми дней. Все крысы размещались в стандартных клетках группами по два животных, находились на высокоуглеводной диете по Евдокимову без ограничения водного режима. Все процедуры выполнялись под комбинированным внутримышечным наркозом с использованием Золетила-50 (Virbac, Франция): 1 мг/кг и Ксиланита (Нита-Фарм, Россия) 0,05 мл/кг - 0,1 мл/кг. Средняя продолжительность пребывания животного под наркозом - 1 час. По окончании эксперимента все животные подвергались эвтаназии путем передозировки наркотических средств. Проводили аутопсию с получением сагиттальных срезов толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином для дальнейшего описательного гистологического анализа.

На вторые сутки от начала эксперимента десна животных приобретала синюшно-розовый оттенок (Фиг. 1), при травмировании иглой в месте инъекции была цианотична, зубодесневая бороздка не зондировалась. На четвертые сутки консистенция десны становилась рыхлой, нижние резцы приобретали подвижность. К 7-м суткам симптомы воспаления нарастали, у животных зондировались пародонтальные карманы глубиной до 4 мм.

В образцах срезов, наблюдалась картина разлитого воспаления (Фиг. 2): фиксировались признаки экссудативного воспаления - лейкоцитарной инфильтрации, макрофагальной реакции в собственной пластинке слизистой и в эпителии, расслоение эпителия на уровне слоя «колючих» клеток (Фиг. 3). Сглажены гребни базальноклеточного слоя. Многослойный плоский ороговевающий сулькулярный эпителий неравномерно истончен, отслоен от эпителия прикрепления. В отдельных образцах наблюдали серозное, гнойное и геморрагическое (эритроцитарная и лейкоцитарная инфильтрация) воспаление в собственной пластинке слизистой (Фиг. 4). Разрастание грануляционной ткани с воспалительной инфильтрацией в ткани десны, фибриноидное набухание соединительной ткани десны, бесструктурные коллагеновые волокна определялись в полученных образцах. Изменение костных структур челюстей также говорило о выраженном пародонтите. В альвеолярных отростках необратимая остеокластическая резорбция костных структур: воспалительный инфильтрат в области вершины альвеолярного отростка, деструкция костной ткани со стороны периоста и эндооста, пазушное рассасывание со стороны эндооста - разрушение костных структур в результате аутолиза (Фиг. 5).

Таким образом, проведенные исследования показали, что патентуемый способ позволяет осуществить моделирование в короткие сроки (за 7 суток), не предполагает применения травмирующих элементов и заведомо стрессовых условий содержания животных.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к стоматологии. Проводят восьмиобразное наложение металлической проволочной лигатуры на пришеечную область отдельно верхних и нижних резцов крысы. Затем на пришеечную область каждого резца верхней и нижней челюсти между лигатурой и краем десны крысы помещают зубной налет от пациента с хроническим пародонтитом. Затем под слизистую оболочку десны с вестибулярной стороны, в области каждого резца верхней и нижней челюсти проводят инъекции раствора никотина 0,001 мг/л в физиологическом растворе в объеме 0,05 мл, а спустя 10 минут - 50% раствора этилового спирта в объеме 0,05 мл, причем указанные инъекции проводят ежедневно в течение 7 дней. Способ обеспечивает возможность моделирования в короткие сроки (за 7 суток), без применения травмирующих элементов и заведомо стрессовых условий содержания животных. 5 ил., 1 пр.

Способ моделирования пародонтита на крысах, включающий комплексное воздействие на ткани пародонта с нарушением микроциркуляции тканей и микробным инфицированием, отличающийся тем, что проводят восьмиобразное наложение металлической проволочной лигатуры на пришеечную область отдельно верхних и нижних резцов крысы, после наложения металлической лигатуры на пришеечную область каждого резца верхней и нижней челюсти между лигатурой и краем десны крысы помещают зубной налет от пациента с хроническим пародонтитом, затем под слизистую оболочку десны с вестибулярной стороны, в области каждого резца верхней и нижней челюсти проводят инъекции раствора никотина 0,001 мг/л в физиологическом растворе в объеме 0,05 мл, а спустя 10 минут - 50% раствора этилового спирта в объеме 0,05 мл, причем указанные инъекции проводят ежедневно в течение 7 дней.