СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЗАДЕРЖКИ РАЗВИТИЯ ПЛОДА Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования задержки развития плода.

Задержка развития плода, также известная как задержка роста плода, является распространенным осложнением беременности, которое связано с различными неблагоприятными перинатальными исходами (Ходжаева 3. С, Шмаков Р. Г., Ярыгина Т.А. и соавт. Недостаточный рост плода, требующий предоставления медицинской помощи матери (задержка роста плода). Клинические рекомендации. 2022. С.3). Задержка развития плода является следствием плацентарной недостаточности и характеризуется тем, что плоды имеют более высокий риск перинатальной смертности по сравнению с плодами того же гестационного возраста (Kesavan К., Devaskar S. U. Intrauterine Growth Restriction: Postnatal Monitoring and Outcomes / Pediatric Clinics of North America. 2019. 66 (2): p.403. doi:10.1016/j. pel.2018.12.009; Камилова М.Я., Давлатова З.Д., Давудова Ф.М. Оценка факторов риска развития синдрома задержки развития плода // Вестник последипломного образования в сфере здравоохранения. 2020. №2. С.23).

Изучение патофизиологических механизмов задержки развития плода, определение эффективности ее лечения, возможно благодаря моделированию задержки развития плода лабораторных животных (Чеботарева Ю.Ю., Овсянников В.Г., Хутиева М.Я., Подгорный И.В. Роль глюкокортикоидной диерегуляции в развитии гестационного пиелонефрита, плацентарной недостаточности в эксперименте // Нефрология. 2017. Т. 21. №5. С.76-79 ttps://doi.org/10.24884/1561-6274-2017-21-5-109-118).

Несмотря на наличие различных способов моделирования задержки развития плода, всем им присущ ряд недостатков, таких как трудоемкость, низкая воспроизводимость задержки развития плода, имеющего клинические признаки как в клинической практике и высокие показатели антенатальной гибели плода (Lopez-Tello J, Arias-Alvarez М, Gonzalez-Bulnes A, Sferuzzi-Perri AN. Models of Intrauterine growth restriction and fetal programming in rabbits. Mol Reprod Dev. 2019 Dec;86(12): 1781-1809. doi: 10.1002/mrd.23271. Epub 2019 Sep 20. PMID: 31538701; Limesand S.W., Camacho L.E., Kelly A.C., Antolic A.T. Impact of thermal stress on placental function and fetal physiology. Anim Reprod. 2018 Aug 3;15 (Suppl 1): 886-898. doi: 10.21451/1984-3143-AR2018-0056. PMID: 36249845; PMCID: PMC9536067).

Поэтому разработка новых способов моделирования задержки развития плода, имеющего клинические признаки, максимально сходные с клинической картиной у пациентов, с целью изучения патогенеза, усовершенствования способов диагностики и лечения задержки развития плода является актуальной задачей современной экспериментальной медицины.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлены способы моделирования задержки развития плода.

В работе Louey S. et al. описано моделирование задержки развития плода путем пупочно-плацентарной эмболизации, которую проводят беременным овецематкам с 120 дней беременности до срока родов (срок примерно 147 дней) (Louey S., Cock M.L., Stevenson К.М., Harding R. Placental insufficiency and fetal growth restriction lead to postnatal hypotension and altered postnatal growth in sheep. Pediatr Res. 2000 Dec; 48(6): 808-14. doi: 10.1203/00006450-200012000-00018. PMID: 11102551).

В исследовании Bassan H. et al. задержку развития плода воспроизводят хирургической перевязкой 25-30% маточно-плацентарных сосудов у кроликов, которую проводят в последней трети гестации (Bassan Н., Trejo L.L., Kariv N., Bassan M. et al. Experimental intrauterine growth retardation alters renal development. Pediatr Nephrol. 2000 Dec; 15(3-4): 192-5. doi: 10.1007/s004670000457. PMID: 11149109).

Недостатками указанных выше способов является инвазивность и трудоемкость, также отмечались антенатальные потери (Lopez-Tello J, Arias-Alvarez М, Gonzalez-Bulnes A, Sferuzzi-Perri AN. Models of Intrauterine growth restriction and fetal programming in rabbits. Mol Reprod Dev. 2019 Dec;86(12):1781-1809. doi: 10.1002/mrd.23271. Epub 2019 Sep 20. PMID: 31538701).

В эксперименте Sugimura M. et al. задержку развития плода воспроизводят введением мышам в 8, 11 и 14 дни беременности в хвостовую вену фильтрованных микровезикул фосфатидилсерина /фосфатидилхолина с максимальным диаметром менее 0,3 мкм, которые представляют собой прокоагулянтные фосфолипиды, полученные из активированных тромбоцитов (Sugimura М., Kobayashi Т., Shu F., Kanayama N. et al. Annexin V inhibits phosphatidylserine-induced intrauterine growth restriction in mice. Placenta. 1999 Sep;20 (7): 555-60. doi: 10.1053/plac. 1999.0420. PMID: 10452909).

К недостаткам способа относится трудоемкость, инвазивность и возможность развития фосфолипид-индуцированного гиперкоагуляционного состояния в плацентарном кровообращении у мышей (Shu F., Sugimura М., Kobayashi Н., Kobayashi Т. et al. Activated protein С prevents development of phosphatidylserine-induced intrauterine growth restriction in mice. Semin Thromb Hemost. 2001;27(2):99-105. doi: 10.1055/s-2001-14067. PMID: 11372777).

В работе Regnault T.R.H. et al. (Regnault T.R.H., de Vrijer В., Galan H.L., Wilkening R.B. et al. Development and mechanisms of fetal hypoxia in severe fetal growth restriction // Journal Placenta. - 2007. - V. 28. №7. P. 714-723) описан способ моделирования задержки развития плода, включающий воздействие на экспериментальное животное. Экспериментальное животное - овцу, в возрасте от 2 до 3 лет, беременную одним плодом, с начала гестации содержат 24 часа в термонейтральном помещении при температуре около 21°С и относительной влажности - 30%. С 38 дня гестации в течение 80 дней в помещении поддерживается гипертермия: 40°С в течение 12 ч, затем 35°С в течение 12 ч; относительная влажность - 35%.

Недостатками способа является недостаточная воспроизводимость модели задержки развития плода, так как тепловой стресс может вызывать не только гипогликемию, но и тяжелую гипоксию плода, что может привести к его гибели (Limesand S.W., Camacho L.E., Kelly А.С, Antolic А.Т. Impact of thermal stress on placental function and fetal physiology. Anim Reprod. 2018 Aug 3;15(Suppl. 1):886-898. doi: 10.21451/1984-3143-AR2018-0056. PMID: 36249845; PMCID: PMC9536067).

Наиболее близким техническим решением, взятым за прототип, является способ моделирования задержки развития плода, включающая воздействие на экспериментальное животное - морскую свинку (Nevin С, Formosa Е., Maki Y., Matushewski В. et al. Maternal Nutrient Restriction in Guinea Pigs as an Animal Model for Studying Growth Restricted Offspring with Post-Natal Catch-Up Growth // American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 2018/01/10 Vol.314. doi: 10.1152/ aj-pregu.00317.201).

Морскую свинку кормят 70% от нормального рациона (ad libitum) до беременности. В нормальный рацион входит - кормление 2 раза в день по 20 г овса, 20 г отрубей, 25 г молока, 80 г капусты, 40 г моркови, свеклы и картофеля, 50 г сена, 350 г травы, зелени - 15 г. На 35 день беременности морскую свинку кормят 90% от нормального рациона.

Недостатком прототипа является возможность выкидыша плода экспериментального животного и развития таких пороков, как задержка окостенения (Lopez-Tello J., Arias-Alvarez М., Gonzalez-Bulnes A., Sferuzzi-Perri A.N. Models of Intrauterine growth restriction and fetal programming in rabbits. Mol Reprod Dev. 2019 Dec;86(12):1781-1809. doi: 10.1002/mrd.23271. Epub 2019 Sep 20. PMID: 31538701).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа моделирования задержки развития плода.

Техническим результатом, проявляющимся при реализации данного способа, является повышение воспроизводимости модели задержки развития плода, имеющей клинические признаки максимально схожие с клинической картиной у пациентов и исключение выкидыша плода.

Указанный технический результат достигается, тем, что воздействуют на экспериментальное животное, в качестве которого используют первобеременную самку крысы линии Wistar в возрасте 5-8 месяцев, массой 150-200 грамм. Экспериментальное животное с первого дня беременности в течение 20 дней кормят два раза в день утром и вечером по 15 г сухого корма для мелких грызунов. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рационы включают смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 грамм манной крупы.

Лекарственный препарат Дюфастон (Duphaston), регистрация №: ГПЧ 011987/01, дата перерегистрации: 27.12.2021. Код ATX: G03DB01 (Дидро-гестерон). Активное вещество дидрогестерон (dydrogesterone). Лекарственная форма таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг.Таблетки, покрытые пленочной оболочкой белого цвета, круглые, двояковыпуклые, со скошенными краями, с риской на одной стороне, с гравировкой "155" с обеих сторон от риски. Дидрогестерон в 1 табл.10 мг. Клинико-фармакологическая группа: гестаген. Фармакотерапевтическая группа: гестаген. Дюфастон (дидрогестерон) - это прогестаген, активный при приеме внутрь и показанный во всех случаях эндогенной недостаточности прогестерона (https://www.vidal.ru/drugs/duphaston_1048).

Подробное описание способа.

Первобеременную самку крысы линии Wistar в возрасте 5-8 месяцев, массой 150-200 грамм помещают в клетку на время всего эксперимента со свободным доступом к воде. Все манипуляции с экспериментальным животным выполняют в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Начиная с 1-го дня беременности в течение 20 дней крысу кормят два раза в день, утром и вечером по 15 г сухого корма для грызунов, например, специализированного корма для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рацион включают смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 грамм манной крупы.

Смесь получают следующим образом: одну таблетку препарата Дюфастон, содержащую 10 мг активного вещества дидрогестерон, растирают и получают порошок. Дозу 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» отмеряют путем взвешивания на аналитических весах. Затем 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» тщательно перемешивают с 10 г манной крупы.

На 21 день беременности проводят эвтаназию экспериментального животного, предварительно введя 0,2 мл нембутала. Проводят забор плодов и последов для изучения морфологических изменений. Определяют вес и рост плодов. Последы помещают в 4% раствор формальдегида. Затем из них делают гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Проводят гистологическое исследование и определяют наличие или отсутствие в последах клеток Кащенко-Гофбауэра. Наличие низких параметров веса плодов менее 4000 мг и роста плодов менее 30 мм, а также отсутствие в последах клеток Кащенко-Гофбауэра свидетельствует о задержке развития плода (Чеботарева Ю.Ю., Овсянников В.Г., Хутиева М.Я., Подгорный И.В. Роль глюкокортикоидной дисрегуляции в развитии гестационного пиелонефрита, плацентарной недостаточности в эксперименте // Нефрология. 2017. Т. 21. №5. С.78; Овсянников В.Г., Чеботарева Ю.Ю., Подгорный И.В. Моделирование гестационных осложнений в условиях эксперимента на крысах // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2019. №1. С.116-117).

Практическая реализуемость заявляемого способа иллюстрируется примерами моделирования задержки развития плода.

Пример 1: первобеременную самку крысы линии Wistar в возрасте 7 месяцев, массой 150 грамм помещали в клетку на время всего эксперимента со свободным доступом к воде. С первого дня беременности в течение 20 дней крысу кормили два раза в день утром и вечером по 15 г специализированного корма для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рацион включали смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 грамм манной крупы.

Смесь получали следующим образом: одну таблетку препарата Дюфастон, содержащую 10 мг активного вещества дидрогестерон, растирают и получают порошок. Дозу 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» отмеряют путем взвешивания на аналитических весах. Затем 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» тщательно перемешивают с 10 г манной крупы. Выкидыши плодов не регистрировалось.

На 21 день беременности провели эвтаназию, предварительно введя крысе 0,2 мл нембутала. Провели забор двух плодов и двух последов для изучения морфологических изменений, определили вес и рост плодов. Два плода. 1 плод: вес - 1100 мг и рост - 24 мм. 2 плод: вес -1143 мг и рост - 25 мм. Последы помещали в 4% раствор формальдегида. Затем из них делали гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Проведенное гистологическое исследование показало отсутствие в последах клеток Кащенко - Гофбауэра. Наличие низких параметров веса плодов менее 4000 мг и роста плодов менее 30 мм, отсутствие в последах клеток Кащенко-Гофбауэра свидетельствовало о развитии задержки развития плода, что подтвердило реализацию модели.

Пример 2. первобеременную самку крысы линии Wistar в возрасте 6 месяцев, массой 200 грамм помещали в клетку на время всего эксперимента со свободным доступом к воде. С первого дня беременности в течение 20 дней крысу кормили два раза в день утром и вечером по 15 г специализированного корма для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рацион включали смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 грамм манной крупы.

Смесь получали следующим образом: одну таблетку препарата Дюфастон, содержащую 10 мг активного вещества дидрогестерон, растирают и получают порошок. Дозу 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» отмеряют путем взвешивания на аналитических весах. Затем 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» тщательно перемешивают с 10 г манной крупы.

Выкидыши плодов не регистрировалось.

На 21 день беременности провели эвтаназию, предварительно введя крысе 0,2 мл нембутала. Провели забор трех плодов и трех последов для изучения морфологических изменений, определили вес и рост плодов. Три плода. 1 плод: вес - 1750 мг и рост - 22 мм. 2 плод: вес -1123 мг и рост - 23 мм. 3 плод: вес -1301 мг и рост - 20 мм Последы помещали в 4% раствор формальдегида. Затем из них делали гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Проведенное гистологическое исследование показало отсутствие в последах клеток Кащенко - Гофбауэра. Наличие низких параметров веса плодов менее 4000 мг и роста плодов менее 30 мм, отсутствие в последах клеток Кащенко-Гофбауэра свидетельствовало о развитии задержки развития плода, что подтвердило реализацию модели.

Пример 3. первобеременную самку крысы линии Wistar в возрасте 8 месяцев, массой 175 грамм помещали в клетку на время всего эксперимента со свободным доступом к воде. С первого дня беременности в течение 20 дней крысу кормили два раза в день утром и вечером по 15 г специализированного корма для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рацион включали смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 грамм манной крупы.

Смесь получали следующим образом: одну таблетку препарата Дюфастон, содержащую 10 мг активного вещества дидрогестерон, растирают и получают порошок. Дозу 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» отмеряют путем взвешивания на аналитических весах. Затем 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» тщательно перемешивают с 10 г манной крупы.

Выкидыши плодов не регистрировалось.

На 21 день беременности провели эвтаназию, предварительно введя крысе 0,2 мл нембутала. Провели забор трех плодов и трех последов для изучения морфологических изменений, определили вес и рост плодов. Три плода. 1 плод: вес - 1432 мг и рост - 20 мм. 2 плод: вес -1207 мг и рост - 24 мм. 3 плод: вес -1234 мг и рост - 21 мм. Последы помещали в 4% раствор формальдегида. Затем из них делали гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Проведенное гистологическое исследование показало отсутствие в последах клеток Кащенко - Гофбауэра. Наличие низких параметров веса плодов менее 4000 мг и роста плодов менее 30 мм, отсутствие в последах клеток Кащенко-Гофбауэра свидетельствовало о развитии задержки развития плода, что подтвердило реализацию модели.

Пример 4. первобеременную самку крысы линии Wistar в возрасте 5 месяцев, массой 177 грамм помещали в клетку на время всего эксперимента со свободным доступом к воде. С первого дня беременности в течение 20 дней крысу кормили два раза в день утром и вечером по 15 г специализированного корма для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рацион включали смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 грамм манной крупы.

Смесь получали следующим образом: одну таблетку препарата Дюфастон, содержащую 10 мг активного вещества дидрогестерон, растирают и получают порошок. Дозу 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» отмеряют путем взвешивания на аналитических весах. Затем 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» тщательно перемешивают с 10 г манной крупы.

Выкидыши плодов не регистрировалось.

На 21 день беременности провели эвтаназию, предварительно введя крысе 0,2 мл нембутала. Провели забор трех плодов и трех последов для изучения морфологических изменений, определили вес и рост плодов. Три плода. 1 плод: вес - 1565 мг и рост - 23 мм. 2 плод: вес -1234 мг и рост - 21 мм. 3 плод: вес -1422 мг и рост - 25 мм. Последы помещали в 4% раствор формальдегида. Затем из них делали гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Проведенное гистологическое исследование показало отсутствие в последах клеток Кащенко - Гофбауэра. Наличие низких параметров веса плодов менее 4000 мг и роста плодов менее 30 мм, отсутствие в последах клеток Кащенко-Гофбауэра свидетельствовало о развитии задержки развития плода, что подтвердило реализацию модели.

Согласно предлагаемому способу было проведено моделирование задержки развития плода у 31 первобеременых крыс линии Wistar весом 150-200 грамм. На время проведения эксперимента крыс помещали в отдельные клетки со свободным доступом к воде. С первого дня беременности в течение 20 дней крыс кормили два раза в день утром и вечером по 15 г специализированного корма для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рацион включали смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 грамм манной крупы. Смесь получали следующим образом: одну таблетку препарата Дюфастон, содержащую 10 мг активного вещества дидрогестерон, растирали и получали порошок. Дозу 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» отмеряли путем взвешивания на аналитических весах. Затем 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» тщательно перемешивали с 10 г манной крупы.

Выкидыши плодов не регистрировалось ни в одном случае.

На 21 день беременности провели эвтаназию, предварительно введя крысам 0,2 мл нембутала. Провели забор плодов и последов для изучения морфологических изменений, определили вес и рост плодов. Вес плодов варьировался от 1299 мг до 1679 мг, рост плодов варьировался от 25,6 до 26,0 мм. Последы помещали в 4% раствор формальдегида. Затем из них делали гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Проведенное гистологическое исследование показало отсутствие в последах всех 31 крыс (100%) клеток Кащенко - Гофбауэра. Наличие низких параметров веса менее 4000 мг и роста плодов менее 30 мм, отсутствие во всех 31 случаев в последах клеток Кащенко-Гофбауэра свидетельствовало о задержке развития плода у всех экспериментальных животных, что подтвердило высокую достоверность и воспроизводимость модели задержки развития плода.

Таким образом, предлагаемый способ моделирования задержки развития плода достоверен, имеет клинические признаки максимально схожие с клинической картиной у пациентов, подтверждается результатами измерения роста, веса плодов, гистологического исследования последов, позволяет получить морфологически верифицированную картину патологии, эффективен, легко воспроизводим и практически исключает выкидыши у экспериментальных животных.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования задержки развития плода. Первобеременную самку в возрасте 5-8 месяцев, массой 150-200 г с первого дня беременности в течение 20 дней кормят два раза в день утром и вечером по 15 г сухого корма для грызунов. В течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рационы включают смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 г манной крупы. Изобретение обеспечивает повышение воспроизводимости модели задержки развития плода, имеющей клинические признаки, максимально схожие с клинической картиной у пациентов, и исключение выкидыша плода. 4 пр.

Способ моделирования задержки развития плода, включающий воздействие на экспериментальное животное, отличающийся тем, что в качестве экспериментального животного используют первобеременную самку крысы линии Wistar в возрасте 5-8 месяцев, массой 150-200 г, которую с первого дня беременности в течение 20 дней кормят два раза в день утром и вечером по 15 г сухого корма для мелких грызунов, причем в течение первых 14 дней эксперимента в утренний и вечерний рационы включают смесь, содержащую 0,5 мг порошка препарата «Дюфастон» и 10 г манной крупы.