Способ профилактики задержки внутриутробного развития (ЗВУР) и резорбции эмбрионов у лабораторных мышей Российский патент 2025 года по МПК A61D19/00 A61K31/95 A61P15/00 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и ветеринарии и может быть использовано в качестве профилактики задержки внутриутробного развития (ЗВУР) и резорбции эмбрионов у лабораторных мышей.

Благополучие животных, используемых в экспериментальных целях, находится под особым вниманием. Подавляющее большинство лабораторных животных – это мыши, живущие в маленьких клетках, которые не предлагают большого разнообразия [Lewejohann L. et al., 2020]. Вследствие уменьшения жизнеспособности животных, выращиваемых методом тесного инбридинга (внутриродственного спаривания), работа по выведению и сохранению линий требует большого внимания специалистов. На выведение одной чистой линии затрачиваются не менее 8-10 лет тщательно выполняемой работы. Ранняя гибель детенышей является хорошо известной проблемой при разведении мышиных линий, но до сих пор часто считается «нормальной» или даже упускается из виду из-за применяемых процедур подсчета. Несмотря на то, что снижение продуктивности размножения указывает на снижение благополучия животных, эта проблема, по-видимому, недооценивается в лабораторном разведении мышей [Leidinger C.S. et al., 2019].

Актуальность предлагаемого способа профилактики задержки внутриутробного развития (ЗВУР) и резорбции эмбрионов определяется значительными экономическими потерями питомников вследствие снижения выхода мышат, а также рождения потомства, имеющего низкую устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды. Несмотря на то, что мыши чаще всего используются в биомедицинских исследованиях, имеется мало информации о том, какие факторы следует учитывать для профилактики вышеописанных проблем.

ЗВУР является одним из основных осложнений беременности, более того, она чаще прочих патологий ассоциирована с мертворождением. Несмотря на большое количество исследований, проведенных на протяжении последних 50 лет, общепринятой схемы терапии не разработано. Эффективность ни одного из множества предложенных для лечения и профилактики препаратов не доказана; кроме того, спустя годы апробации появляются новые данные о побочных эффектах использованных ранее лекарственных средств.

ЗВУР можно определить, как отставание плода в массе тела (МТ) или росте более чем на 2 стандартных отклонения (δ) и ниже среднего значения для данного гестационного возраста (ГВ), либо как МТ при рождении. Патофизиология ЗВУР является многофакторной и в большинстве случаев связана с материнской, фетальной, плацентарной, инфекционной или генетической патологией. В большинстве случаев ЗВУР рассматривается как следствие плацентарной дисфункции. Иногда выявить причину ЗВУР не представляется возможным. [Zygula A. et al., 2020]. Появляется все больше доказательств того, что окислительный стресс может играть ключевую роль в этой патологии беременности [Joo E.H. et al., 2021].

Уровень техники

Из уровня техники известны различные способы профилактики задержки развития и гибели эмбрионов, преимущественно у продуктивных сельскохозяйственных животных, включающие в себя парентеральное введение прогестагенного препарата пролонгированного действия прогестамаг [Способ профилактики задержки развития и гибели эмбрионов у коров. RU 2668497 C1], внутримышечное введение коровам гонадолиберина сурфагона и дополнительного внутримышечного введения иммуномодулятора тимогена [Способ повышения выживаемости эмбрионов у коров. RU 2272630 C2], парэнтеральное введение бычьего рекомбинантного интерферона-тау трижды [Способ профилактики эмбриональной смертности и внутриутробной задержки развития эмбрионов у молочных коров. RU 2684784 C1], внутримышечное введение сывороточного гонадотропного препарата Фоллимаг коровам в день осеменения в дозе 750 ИЕ в сочетании с селенсодержащим препаратом Селемаг [Способ снижения эмбриональной смертности и профилактики внутриутробной задержки развития эмбрионов у крупного рогатого скота. RU 2688053 C1].

Однако известные способы преимущественно повышают только оплодотворяемость и снижают перинатальную смертность потомства, при этом имеют ряд существенных недостатков, а именно: эффективность применения гормональных препаратов во многом зависит от индивидуальной чувствительности и состояния клеток-мишеней; необходимость многократных инъекций раствора прогестерона может подавлять гормональные функции желтого тела, а также является стрессовым фактором для животных и требует дополнительных затрат времени и большого количества препарата; введение иммуномодулирующих препаратов и интерферона может существенно изменить баланс про- и противовоспалительных звеньев в организме. Но главным недостатком описанных способов является то, что эти вмешательства могут значительно повлиять на физиологическое состояние потомства мышей, предназначенного для различных экспериментов.

Наиболее близким по технической сущности, по нашему мнению, является способ введения антиоксиданта мелатонина беременным овцам и курам, что предотвращает разрушение гематоэнцефалического барьера, аксонопатию и улучшает паттерны поведения у потомства с ЗВУР. Также мелатонин повышает уровень глюкозы крови, уменьшает жесткость коронарных артерий, восстанавливает коронарную функцию после гипоксемического состояния у эмбрионов цыплят. Однако мелатонин сам по себе не предотвращает развитие ЗВУР, а лишь уменьшает его негативные последствия [Miller S.L. et al., 2014].

В свою очередь, мыши представляют собой проблему, которая часто не учитывается исследователями: большинство штаммов лабораторных мышей не продуцируют мелатонин, в то время как штаммы CBA и C3H продуцируют значительное его количество в течение позднего темнового периода. Поэтому применять этот препарат для профилактики ЗВУР у мышей сложно и теоретически необоснованно [Kennaway D.J., 2019].

Технической проблемой, решаемой предлагаемым изобретением, является разработка способа профилактики задержки внутриутробного развития (ЗВУР) и резорбции эмбрионов у лабораторных мышей без дальнейшего влияния на физиологическое состояние потомства мышей, предназначенного для различных экспериментов.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом изобретения является обеспечение экономически выгодной, простой и в то же время эффективной профилактики ЗВУР и резорбции эмбрионов на этом фоне у лабораторных мышей в условиях лаборатории и вивария, за счет введения α-липоевой кислоты (АЛК) в определенной дозировке в сочетании с обогащением окружающей среды, влияя таким образом на различные звенья патогенеза ЗВУР.

Технический результат способа достигается за счет следующих приемов.

За 7 дней до ссаживания самок с самцами и на протяжении всего периода беременности самкам мышей в воду для питья добавляют α-липоевую кислоту (АЛК), растворенную в питьевой воде, в дозе 10 мг/кг/сутки, при этом с начала беременности самки мышей находятся в клетках с обогащенной окружающей средой, представляющей собой пластиковую лестницу, картонный тоннель и 2 бумажные салфетки.

Α-липоевая кислота (АЛК) - это встречающееся в природе дитиольное соединение, которое синтезируется в митохондриях растениями и животными. Физиологически АЛК является кофактором комплекса α-кетоглутаратдегидрогеназы для защиты митохондрий от окислительной атаки. Это мощный агент, который может напрямую поглощать активные формы кислорода (АФК), хелатные металлы и регенерировать другие антиоксиданты, проявляя антиоксидантные биохимические свойства. Обладая как липорастворимыми, так и водорастворимыми двойными свойствами, АЛК может полноценно функционировать внутриклеточно и внеклеточно [Goraca A. et al., 2015].

Благодаря своим убедительным антиоксидантным свойствам и доказанной безопасности, АЛК широко используется для лечения заболеваний, связанных с окислительным стрессом, таких как диабет, неврологические заболевания и сердечно-сосудистые заболевания. Общепризнана роль окислительного стресса в патогенезе многих заболеваний, и хорошо доказано взаимодействие АЛК с иммунной системой. С одной стороны, АЛК могут играть физиологическую роль в передаче сигналов всех видов иммунных клеток, с другой - избыточное количество АЛК усугубляет воспаление и нарушает баланс в иммунной системе [Lightfoot Y.L. et al., 2017; Huang X. et al., 2015].

АЛК является эндогенным антиоксидантом, обладающим иммуномодулирующими свойствами, а также уменьшает уровень системного воспаления (снижает уровень С-реактивного белка, интерлейкина-6 и активатора плазминогена-1), и улучшает функцию эндотелия [Saboori S. et al., 2018; Sola S. et al., 2005], влияя таким образом на различные звенья патогенеза ЗВУР.

Обогащение окружающей среды (ООС) – это среда обитания, в которой лабораторным животным создают условия сложной физической, сенсорной, когнитивной и/или социальной стимуляции, обеспечивающей лабораторным животным более совершенный жизненный опыт по сравнению со стандартными условиями содержания. В целом, ООС улучшает метаболическую функцию, что приводит к уменьшению жировой массы, увеличению мышечной массы и улучшению усвоения глюкозы [Queen N.J. et al., 2021].

Считается, что вклад в фенотипическую изменчивость обусловлен не только генотипом, но и многочисленными факторами окружающей среды, которые варьируются от кормления и микробиологических изменений до таких, казалось бы, простых, переменных, как условия содержания. Более того, эти улучшенные условия выращивания были использованы для изучения смягчающего потенциала окружающей среды в различных моделях болезней животных [Kentner A.C. et al., 2021].

Базовый протокол ООС включает в себя такие элементы, как социальное взаимодействие, физические упражнения, когнитивная стимуляция, манипулируемые объекты, изменчивость окружающей среды и сенсорная стимуляция и может быть легко изменен под нужды лаборатории и вивария [Smith K.B. et al., 2024].

Осуществление изобретения

За 7 дней до ссаживания самок с самцами и на протяжении всего периода беременности самкам мышей в воду для питья добавляют α-липоевую кислоту (АЛК), растворенную в питьевой воде, в дозе 10 мг/кг/сутки. При этом с начала беременности самки мышей находятся в клетках с обогащенной окружающей средой, представляющей собой пластиковую лестницу, картонный тоннель и 2 бумажные салфетки.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. На модели, характеризующейся ЗВУР в сочетании с преэклампсией и спонтанной резорбцией эмбрионов

Мыши содержались при соотношении светлых и темных циклов 12:12 ч с неограниченным доступом к стандартному рациону грызунов и воде. Использовали 10–12-недельных мышей линий CBA (самки) и DBA/2 (самцы) массой тела 23–25 г для моделирования беременности, сопровождающейся высоким уровнем спонтанных эмбриональных потерь и ЗВУР [Clark D.A. 2014].

За 7 дней до ссаживания с самцами и на протяжении всего периода гестации самки мышей получали АЛК, растворенную в питьевой воде, в дозе 10 мг/кг. В качестве обогащения окружающей среды для беременных самок мышей использовали 2 бумажные салфетки, пластиковую лестницу, картонный тоннель и увеличенную в сравнении с контрольной группой клетку, например, размерами (19×60×37см). Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Эффективность применения заявляемого способа профилактики на модели ЗВУР в сочетании с преэклампсией и спонтанной резорбцией эмбрионов

Контрольная группа
(без применения способа профилактики) (n=36) Опытная группа
с применением способа профилактики)
(n=32) Длина
тела плодов, см
(Me (Q1;Q3)) 2,30 (2,30;2,38) 2,50 (2,30;2,50)* Масса тела плодов, г
(Me (Q1;Q3)) 1,35 (1,21;1,48) 1,60 (1,30;1,80)* Частота резорбции эмбрионов на 14 день беременности (Me (Q1;Q3)) 37% 28%* Примечание: *различия значимы, p<0,05

Пример 2. На модели ЗВУР, обусловленной дефицитом калорий

Мыши C57/Bl6 содержались при соотношении светлых и темных циклов 12:12 ч с неограниченным доступом к стандартному рациону грызунов и воде. В возрасте 10-12 недель самцов и самок мышей спаривали в течение ночи, и наличие вагинальной пробки у самки было обозначено как 1-й день беременности. Беременных самок переводили в отдельные клетки и выращивали на одной и той же диете, представляющей собой полноценный рацион. На 10-й день беременности мыши были подвергнуты редукции рациона, обеспечивающего теперь 50% (масс.) суточной дозы вплоть до 19-го дня беременности [Chen P.Y. et al., 2013].

За 7 дней до ссаживания с самцами и на протяжении всего периода гестации самки мышей C57/Bl6 получали АЛК, растворенную в питьевой воде, в дозе 10 мг/кг. В качестве обогащения окружающей среды использовали 2 бумажные салфетки, пластиковую лестницу, картонный тоннель, увеличенную в сравнении с контрольной группой клетку. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Эффективность применения заявляемого способа профилактики на модели ЗВУР, обусловленной дефицитом калорий

Контрольная группа
(без применения способа профилактики)
(n=35) Опытая группа
(с применением способа профилактики)
(n=36) Длина
тела плодов, см
(Me (Q1;Q3)) 1,95 (1,9; 2,30) 2,25 (2,20;2,60)* Масса тела плодов, г
(Me (Q1;Q3)) 1,30 (1,30;1,38) 1,60 (1,60;1,68)* Частота резорбции эмбрионов на 14 день беременности (Me (Q1;Q3)) 18% 13%^# Примечание: *различия значимы, p<0,05
^#-тенденция к значимости различий, p<0,1

Во всех случаях уровень резорбции эмбрионов оценивали на 14 день беременности отношением резорбированных эмбрионов к общему количеству эмбрионов в матке.

Массу и длину тела (копчиково-теменное расстояние) потомства измеряли в первый день жизни.

Высокий профилактический эффект заявляемого изобретения достигается за счет нивелирования проявлений окислительного стресса и иммунорегулирующих свойств антиоксиданта α-липоевой кислоты, а также положительного влияния обогащенной окружающей среды на метаболические процессы организма мышей.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

• Lewejohann L., Schwabe K., Häger C., Jirkof P. Impulse for animal welfare outside the experiment. Lab Anim. 2020 Apr; 54(2):150-158. doi: 10.1177/0023677219891754

• Leidinger C.S., Thöne-Reineke C., Baumgart N., Baumgart J. Environmental enrichment prevents pup mortality in laboratory mice. Lab Anim. 2019 Feb; 53(1): 53-62. doi: 10.1177/0023677218777536

• Zygula A., Kosinski P., Wroczynski P., Makarewicz-Wujec M., Pietrzak B., Wielgos M., Giebultowicz J. Oxidative Stress Markers Differ in Two Placental Dysfunction Pathologies: Pregnancy-Induced Hypertension and Intrauterine Growth Restriction. Oxid Med Cell Longev. 2020 Jun 30; 2020: 1323891. doi: 10.1155/2020/1323891

• Joo E.H., Kim Y.R., Kim N., Jung J.E., Han S.H., Cho H.Y. Effect of Endogenic and Exogenic Oxidative Stress Triggers on Adverse Pregnancy Outcomes: Preeclampsia, Fetal Growth Restriction, Gestational Diabetes Mellitus and Preterm Birth. Int J Mol Sci. 2021 Sep 19; 22(18): 10122. doi: 10.3390/ijms221810122

• Goraca A., Huk-Kolega H., Kowalczyk A., Skibska B. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of lipoic acid in rat liver. Postepy Hig Med Dosw (Online). 2015

• Lightfoot Y.L., Blanco L.P., Kaplan M.J. Metabolic abnormalities and oxidative stress in lupus. Curr Opin Rheumatol. 2017 Sep; 29(5): 442-449

• Huang X., Chen L., Liu W., Qiao Q., Wu K., Wen J., Huang C., Tang R., Zhang X. Involvement of oxidative stress and cytoskeletal disruption in microcystin-induced apoptosis in CIK cells. Aquat Toxicol. 2015 Aug; 165: 41-50. doi: 10.1016/j.aquatox.2015.05.009

• Queen N.J., Deng H., Huang W., Mo X., Wilkins R.K., Zhu T., Wu X., Cao L. Environmental Enrichment Mitigates Age-Related Metabolic Decline and Lewis Lung Carcinoma Growth in Aged Female Mice. Cancer Prev Res (Phila). 2021 Dec;14(12):1075-1088. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-21-0085

• Kentner A.C., Speno A.V., Doucette J., Roderick R.C. The Contribution of Environmental Enrichment to Phenotypic Variation in Mice and Rats. eNeuro. 2021; 8(2): ENEURO.0539-20.2021. doi: 10.1523/ENEURO.0539-20.2021

• Smith K.B., Murack M., Sharani S.A., Ismail N. Environmental Enrichment Cage for Laboratory Mice: A Downloadable Alternative. Curr Protoc. 2024 Jan; 4(1): e913. doi: 10.1002/cpz1.913

• Способ профилактики задержки развития и гибели эмбрионов у коров. RU 2668497 C1

• Способ повышения выживаемости эмбрионов у коров. RU 2272630 C2

• Способ профилактики эмбриональной смертности и внутриутробной задержки развития эмбрионов у молочных коров. RU 2684784 C1

• Способ снижения эмбриональной смертности и профилактики внутриутробной задержки развития эмбрионов у крупного рогатого скота. RU 2688053 C1

• Miller S.L., Yawno T., Alers N.O., et al. Antenatal antioxidant treatment with melatonin to decrease newborn neurodevelopmental deficits and brain injury caused by fetal growth restriction. J Pineal Res. 2014; 56(3): 283-294. DOI: 10.1111/jpi.12121

• Kennaway D.J. Melatonin research in mice: a review. Chronobiol Int. 2019 Sep; 36(9): 1167-1183. doi: 10.1080/07420528.2019.1624373

• Saboori S., Falahi E., Eslampour E., Zeinali Khosroshahi M., Yousefi Rad E. Effects of alpha-lipoic acid supplementation on C-reactive protein level: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled clinical trials. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2018 Aug; 28(8): 779-786. doi: 10.1016/j.numecd.2018.04.003

• Sola S., Mir M.Q., Cheema F.A., Khan-Merchant N., Menon R.G., Parthasarathy S., Khan B.V. Irbesartan and lipoic acid improve endothelial function and reduce markers of inflammation in the metabolic syndrome: results of the Irbesartan and Lipoic Acid in Endothelial Dysfunction (ISLAND) study. Circulation. 2005 Jan 25; 111(3): 343-8. doi: 10.1161/01.CIR.0000153272.48711.B9

• Smith K.B., Murack M., Sharani S.A., Ismail N. Environmental Enrichment Cage for Laboratory Mice: A Downloadable Alternative. Curr Protoc. 2024 Jan; 4(1): e913. doi: 10.1002/cpz1.913

• Clark D.A. The use and misuse of animal analog models of human pregnancy disorders. J Reprod Immunol. 2014 Jun; 103: 1-8. doi: 10.1016/j.jri.2014.02.006

• Chen P.Y., Ganguly A., Rubbi L., Orozco L.D., Morselli M., Ashraf D., Jaroszewicz A., Feng S., Jacobsen S.E., Nakano A., Devaskar S.U., Pellegrini M. Intrauterine calorie restriction affects placental DNA methylation and gene expression. Physiol Genomics. 2013 Jul 15; 45(14): 565-76. doi: 10.1152/physiolgenomics.00034.2013

• Love C.J., Gubert C., Renoir T., Hannan A.J. Environmental enrichment and exercise housing protocols for mice. STAR Protoc. 2022 Dec 16; 3(4): 101689. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101689

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно акушерству и гинекологии. За 7 дней до ссаживания самок с самцами и на протяжении всего периода беременности самкам мышей вводят в качестве питья α-липоевую кислоту (АЛК), растворенную в питьевой воде в дозе 10 мг/кг/сутки. С начала беременности самки мышей находятся в клетках с обогащенной окружающей средой, представляющей собой пластиковую лестницу, картонный тоннель и 2 бумажные салфетки. Способ обеспечивает профилактику задержки профилактики внутриутробного развития (ЗВУР) и резорбции эмбрионов у лабораторных мышей за счет нивелирования проявлений окислительного стресса и иммунорегулирующих свойств антиоксиданата α-липоевой кислоты, а также положительного влияния обогащенной окружающей среды на метаболические процессы организма мышей, без дальнейшего влияния на физиологическое состояние потомства, что в свою очередь дает возможность использовать потомство для различных экспериментов. 2 табл., 2 пр.

Способ профилактики задержки внутриутробного развития (ЗВУР) и резорбции эмбрионов у лабораторных мышей, отличающийся тем, что за 7 дней до ссаживания самок с самцами и на протяжении всего периода беременности самкам мышей вводят в качестве питья α-липоевую кислоту (АЛК), растворенную в питьевой воде, в дозе 10 мг/кг/сутки, при этом с начала беременности самки мышей находятся в клетках с обогащенной окружающей средой, представляющей собой пластиковую лестницу, картонный тоннель и 2 бумажные салфетки.