БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ХЕЛАТОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РАДИОФАРМПРЕПАРАТОВ Российский патент 2023 года по МПК C07D257/02 A61K51/04 

Область техники

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно создания радиотерапевтических и радиодиагностических препаратов и направлено на решение задачи возможно более простого и эффективного получения широкого круга прекурсоров для радиофармацевтических препаратов, прежде всего содержащих пептиды в качестве векторов, нацеленных на мишени в опухоли. Изобретение заключается в использовании альдегидной функции для создания ковалентной связи между бифункциональным хелатором и вектором, и может обеспечивать способ получения прекурсоров с использованием реакции конденсации альдегида и гидразида, диамина и другими функциональными группами.

Уровень техники

Термин функционализированный хелатирующий агент или бифункциональный хелатор относится к соединениям, имеющим хелатирующий фрагмент, способный образовывать хелатный комплекс иона металла и фрагмента, ковалентно связанного с хелатирующим фрагментом, способного служить в качестве средства ковалентного присоединения к антителу, фрагменту антитела или к другой векторной молекуле.

Бифункциональные хелаторы являются соединениями, имеющими двойную функциональность и пригодными для терапевтического и диагностического использования, когда они, например, находятся в комплексе с радиоактивными ионами металлов и ковалентно связаны со специфичным вектором. Эти типы комплексов используются, в частности, для транспортировки радиоактивных металлов к опухолевым клеткам, которые являются мишенью для специфичных векторных фрагментов.

Технология радиоизотопной маркировки биомолекулы была разработана для использования физиологически активных веществ, таких как пептиды, белки и антитела и т.п., в целях молекулярной визуализации или диагностики/лечения заболеваний. Для получения прекурсоров радиофармпрепаратов в основном используется способ связывания хелатора с физиологически активным веществом. Этот способ представляет собой метод, при котором физиологически активное вещество химически связывается с отдельным хелатором, что требует определенных условий, таких как высокая скорость и условия реакции, подходящие для физиологически активного вещества (вектора), например, отсутствие высокой температуры, сильнокислой или основной среды, отрицательного влияния растворителя и т.п.

Бифункциональные хелаторы, содержащие альдегидную функцию позволяют получать прекурсоры радиофармацевтических препаратов в мягких условиях, в одну стадию, например, реакцией с аминами, диолами, диаминами, гидразинами, гидразидами и др.

ДОТА (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота) - наиболее часто используемый хелатор. Создано большое количество его производных с различными функциональными группами.

Известны хелаторы ДОТА с производными алифатических альдегидов, могущими легко реагировать путем восстановительного аминирования со свободными аминогруппами, присутствующими в векторе (WO 9732862 A1 от 12.09.1997, A61K 49/00, A61K 49/06, A61K 49/08, A61K 51/00; WO 9532741A1 от 07.12.1995, A61K 47/48, A61K 49/00, A61K 49/08). Эта реакция особенно полезна, когда вектор представляет собой небольшую молекулу, модификация поверхности которой может резко повлиять на взаимодействие с сайтом-мишенью. Восстановительное аминирование сохраняет общий заряд вектора, чего не происходит, когда конъюгация достигается за счет амидной связи (Barge A., Tei L., Upadhyaya D. et al. Bifunctional ligands based on the DOTA-monoamide cage. Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 1176-1184).

Остатки лизина в образцах пептида, белков и моноклонального антитела в мягких условиях быстро и селективно метили зондом на основе ДОТА (Tanaka K, Masuyama Т at al. A submicrogram-scale protocol for biomolecule-based PET imaging by rapid 6pi-azaelectrocyclization: visualization of sialic acid dependent circulatory residence ot glycoproteins. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(l):102-5).

Описан метод модификации с использованием ДОТА с фрагментом 2-пиридинальдегида, используемым в конденсации с N-концом широкого спектра пептидов и белков. Эта реакция характеризуется мягкими условиями реакции, отличной сайт-специфичностью, многообещающим потенциалом масштабирования (MacDonald, J., Munch, Н., Moore, Т. et al. One-step site-specific modification of native proteins with 2-pyridinecarboxyaldehydes. Nat Chem Biol 2015, 11, 326-331).

Альдегидное производное ДОТА использовалось для получения конъюгатов с функционализированным Tyr³-октреотатом (ТАТЕ). Этот пептид включает в себя несколько различных функциональных аминокислотных боковых цепей, таких как амин, алифатический и ароматический спирт и дитиоловая связь, которые должны оставаться нетронутыми во время реакций связывания с различными синтонами ДОТА (С.Wängler et al. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, 3864-3874).

В известном патенте (US 2020023085 от 23.01.2020, A61K 51/04, A61K 51/08, A61K 51/10, A61K 51/12) использовали ДОТА с альдегидным фрагментом для присоединения к вектору, содержащему орто-фенилендиаминный фрагмент.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является патент (WO 2018093566, от 05.24.2018, A61K 31/704; A61K 9/16; A61L 24/06; А61Р 35/00) в котором альдегидная группа использовалась для присоединения хелатора к эмболическим микросферам.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является совершенствование методов получения широкого круга прекурсоров для радиофармацевтических препаратов, прежде всего содержащих пептиды в качестве векторов, нацеленных на мишени в опухоли.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является получение бифункционального хелатора ДОТА для производства прекурсоров радиофармпрепаратов.

Для достижения технического результата предложен бифункциональный хелатор для получения прекурсоров радиофармпрепаратов включающий в себя хелатор ДОТА с присоединенным к нему через метиленовую группу 4-метоксибензальдегидом следующей формулы:

Осуществление изобретении

Заявленный бифункциональный хелатор получают в две стадии: алкилированием коммерчески доступного DO₃A-(t-Bu)₃ (Соединение 1, Схема 1) хлоралкильным производным анисового альдегида получают соединение 2, далее его ацидолизом посредством соляной кислоты в ацетонитриле удаляются трет-бутильные группы с получением целевого соединения 3.

Схема 1

Прекурсоры для радиофармпрепаратов с использованием заявляемого хелатора могут быть получены путем взаимодействия альдегидной группой хелатора и биомолекулы в мягких условиях. Альдегидная группа может взаимодействовать с аминогруппой, гидразидной группой, диолами и другими функциональными группами биомолекул.

Растворитель, который может использоваться в реакции по настоящему изобретению, конкретно не ограничен, но предпочтительно представляет собой водорастворимый растворитель и может представлять собой, например, метанол, диметилсульфоксид, диметилформамид, тетрагидрофуран или т.п. Получение конъюгата заявляемого бифункционального хелатора на примере гидразида пептида приведено ниже, в примерах осуществления изобретения.

Все реактивы для синтеза получены от Acros Organics, ABCR, Sigma-Aldrich и использовались без дополнительной очистки. Пептид Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe синтезировали известным ранее способом (А.Н. Балаев, В.Н. Осипов, К.А. Охманович, М.А Барышникова., Д.С Хачатрян, Изв. АН. Сер. хим., 2016, 2948). Регистрация ИК-спектров выполнена с применением ИК-Фурье спектрометра ИнфраЛЮМ ФТ-08 (Люмэкс) с приставкой нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) (MIRacle ATR, PIKE), оснащенной алмазным кристаллом на селениде цинка. Спектры ЯМР регистрировали на Фурье ЯМР-спектрометре Bruker AVANCE III NanoBay 300 МГц (спектры регистрировали в режиме стабилизации по дейтерию, термостабилизация 25°С, внутренний стандарт - тетраметилсилан) в ДМСО-d6. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (8), КССВ - в герцах. Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографической системе Agilent LC/MS 1200, с использованием колонки Reprosil - Pur Basic C18 (5 мкм), 4.6×240 мм, подвижная фаза: буфер А - 0.1% TFA в воде, буфер Б - 0.1% TFA в ацетонитриле, элюирование градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 5 до 100% за 20 мин; скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм. Масс-спектры ионизации электрораспылением (ИЭР) получены на масс-спектрометре amaZon Bruker Daltonics с ионной ловушкой. Измерение проводилось в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне m/z от 70 до 2200. Напряжение на капилляре распылителя составляло - 4500 В. В качестве газа-носителя использовался азот с температурой 100°С и расходом 6 л⋅мин^-1. Полноту протекания реакций контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах TLC Silicagel 60 F₂₅₄, элюент - хлороформ/метанол 3:1.

Пример 1

Получение три-tert-бутил 2,2',2''-(10-(2-метокси-5-формилбензил)-1,4,7,10-тетразаациклододекан-1,4,7-триил)триацетата (Соединение 2).

К раствору смеси DO₃A-(t-Bu)₃ (1.20 г, 2.00 ммоль) и 4-метокси-3-хлорметилбензальдегида (0.44 г, 2.40 ммоль) в 6 мл сухого ДМФА добавили поташ (0.83 г, 6.00 ммоль), и перемешивали в течение 40 часов при комнатной температуре. Растворитель отгоняли в вакууме, получили светло-желтое масло. Растерли масло с диэтиловым эфиром (30 мл), и осадок отфильтровали. После сушки на воздухе получили соединение 2 в виде белого порошка 1.27 г (96%). Т.пл. 173°С (с разл). Спектр ЯМР ¹H (300 МГц, ДМСО-d6, δ м.д., J/Гц): 1.43 (уш.с, 27 Н); 1.79-2.39 (м, 11 Н); 2.61-3.22 (м, 11 Н); 3.78 (уш.с, 2 Н); 3.91 (с, 3 Н); 7.23 (д, J=8.9, 1 Н); 7.85-7.91 (м, 2 Н); 9.87 (с, 1 Н). ¹³С ЯМР (76 МГц, ДМСО-d₆) δ 27.5, 27.7, 27.8, 52.0, 55.9, 56.2, 81.6, 111.8, 129.4, 133.7, 172.4, 172.7, 191.2. Масс-спектр (ИЭР), m/z: 663.4 [М+Н]⁺. Вычислено m/z для [М+Н]⁺: 663.4. ИК-спектр (НПВО), v/cm^-1: 3336 (ОН); 2978, 2937, 2850 (СН); 2817 (ОС-Н); 1733, 1716, 1694 (С=O); 1155 (С-О-С).

Пример 2

Получение 2,2',2''-(10-(2-метокси-5-формилбензил)-1,4,7,10-тетразаациклододекан-1,4,7-триил)триуксусная кислота (Соединение 3).

В 9 мл смеси концентрированной соляной кислоты и ацетонитрила 1:10 растворили соединение 2 (300 мг, 0.45 ммоль), перемешивали 12 часов при комнатной температуре. Контроль за полнотой протекания реакции осуществляли с помощью ТСХ, элюент хлористый метилен - метанол соотношение 10:1 и 2 капли триэтиламина (по исчезновению соединения 2). Выпавший осадок отфильтровали, промыли ацетонитрилом и сушили на воздухе, получив белый порошок 200 мг (90%). Т. пл. 280°С (с разл). Спектр ЯМР ¹Н (300 МГц, ДМСО-d₆, δ м. д., J/Гц): 3.08-3.31 (м, 16 Н); 3.94 (с, 3 Н); 3.98-4.51 (м, 6 Н); 7.30 (д, J=8.5, 1 Н); 8.02-8.12 (m, 2 Н); 9.92 (s, 1 Н). Масс-спектр (ИЭР), m/z: 495.5 [М+Н]⁺. Вычислено m/z для [М+Н]⁺: 495.2.

Пример 3

Получение Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NH-NH₂.

Раствор пептида Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe (300 мг, 0.34 ммоль) в 3 мл метанола нагревали до 40°С и по каплям добавили к раствору гидразин гидрата (180 мкл, 3.60 ммоль) в 3 мл метанола в течение 15 минут. Реакционную смесь перемешивали в течение 40 часов (контроль по ТСХ). Выпавший осадок отфильтровали, промыли метанолом и сушили на воздухе, получили целевой гидразид в виде белого порошка массой 174 мг (58%). Т.пл. 131°С (с разложением). Спектр ЯМР ¹Н (200 МГц, ДМСО-d₆, δ м. д., J/Гц): 1.00 (d, J=6.3, 3 Н); 1.03-1.12 (м, 2 Н); 1.14-1.32 (м, 9 Н); 1.36 (с, 12 Н); 1.41-1.71 (м, 3 Н); 2.51-2.96 (м, 7 Н); 3.01-3.12 (м, 1 Н); 3.89-4.00 (м, 1 Н); 4.02-4.13 (м, 1 Н); 4.13-4.28 (м, 4 Н); 4.40-4.63 (м, 4 Н); 4.76 (д, J=4.7, 1 Н); 6.70 (т, J=6.0, 1 Н); 6.89-7.10 (м, 7 Н); 7.15 (с, 1 Н); 7.30 (д, J=7.9, 1 Н); 7.57-7.70 (м, 2 Н); 7.92 (д, J=6.9, 1 Н); 8.24 (д, J=7.8, 1 Н); 8.37 (д, J=7.6, 1 Н); 8.90 (с, 1 Н); 10.78 (с, 1 Н). ¹³С ЯМР (76 МГц, ДМСО-d₆) δ 19.9, 22.4, 27.7, 28.2, 29.2, 31.2, 37.5, 38.7, 39.0, 39.2, 39.5, 39.8, 40.1, 40.3, 40.9, 41.7, 52.8, 53.8, 58.5, 61.8, 66.2, 77.3, 80.0, 111.2, 118.1, 118.5, 120.8, 123.9, 126.0, 127.7, 129.1, 136.1, 137.2, 152.7, 155.5, 169.7, 170.0, 170.4, 171.5. Масс-спектр (ИЭР), m/z: 910.3 [М+Н]⁺. Вычислено m/z для [М+Н]⁺: 910.4.

Пример 4

Получение конъюгата хелатора с пептидом (Соединение 4)

Схема 2

Раствор гидразида пептида (Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NHNH₂) (92 мг, 0.1 ммоль) в 2 мл метанола добавили к раствору соединения 3 (50 мг, 0.1 ммоль) в 2 мл метанола при нагревании 40°С. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 4 часов. Контроль за полнотой протекания реакции осуществляли с помощью ТСХ. Выпавший осадок отфильтровали, промыли холодным метанолом (2 мл) и сушили на воздухе. Получили 70 мг (45%) целевого продукта в виде белых кристаллов. Масс-спектр (ИЭР), m/z: 1386.5 [М+Н]⁺. Вычислено m/z для [М+Н]⁺: 1386.7.

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к бифункциональному хелатору для получения радиофармпрепаратов, включающему в себя хелатор ДОТА с присоединенным к нему через метиленовую группу 4-метоксибензальдегидом указанной ниже формулы. Изобретение направлено на решение задачи, возможно, более простого и эффективного получения широкого круга прекурсоров для радиофармацевтических препаратов, прежде всего, содержащих пептиды в качестве векторов, нацеленных на мишени в опухоли. Техническим результатом является получение бифункционального хелатора ДОТА для производства прекурсоров радиофармпрепаратов. 4 пр.

Бифункциональный хелатор для получения радиофармпрепаратов, включающий в себя хелатор ДОТА с присоединенным к нему через метиленовую группу 4-метоксибензальдегидом следующей формулы: