Способ введения под кожу культивируемых рыб семейства лососевых оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными индикаторными красителями Российский патент 2023 года по МПК A01K61/10 A61B5/1455 

Изобретение относится к рыбоводству, а именно к отслеживанию и долговременной неинвазивной регистрации различных физиологических параметров организма культивируемых рыб путем введения оптических микросенсоров на основе микрочастиц (микронного размера) с флуоресцентными индикаторными красителями под кожу рыб. Способ может быть применен при искусственном разведении рыбы на рыбных фермах с целью предотвращения заболеваемости рыб.

Различные имплантируемые оптические микродатчики являются одним из новых инструментов, которые могут обеспечить постоянный мониторинг различных внутренних физиологических параметров организма в режиме реального времени. Использование имплантируемых микродатчиков открывает новые горизонты контроля здоровья не только в медицине, но и в животноводстве, в том числе в аквакультуре. Большинство имплантируемых датчиков содержат электронные компоненты [Bian, S.; Zhu, В.; Rong, G.; Sawan, M. Towards wearable and implantable continuous drug monitoring: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis 2021, 11(1), p.1-14; Singh, R.; Bathaei, M.J.; Istif, E.; Beker, L. A Review of Bioresorbable Implantable Medical Devices: Materials, Fabrication, and Implementation. Advanced Healthcare Materials 2020, 9(18), 2000790; Sonmezoglu, S; Fineman, J.R.; Maltepe, E.; Maharbiz, M.M. Monitoring deep-tissue oxygenation with a millimeter-scale ultrasonic implant. Nature Biotechnology 2021, 39, p.855-864], но они, как правило, имеют крупные размеры и сложны в производстве. В предлагаемом изобретении речь идет о более совершенном способе имплантации микродатчиков на основе микрочастиц (микронного размера - размером порядка 1-100 микрон), содержащих флуоресцентные красители, изменяющие свои оптические характеристики в ответ на изменение параметров окружающей среды, в данном случае - внутренней среды организма, иначе говоря, состава жидкостей организма [Rong, G.; Turtle, Е.Е.; Neal Reilly, A.; Clark, H.A. Recent developments in nanosensors for imaging applications in biological systems. Annual Review of Analytical Chemistry 2019, 12, p.109-128; Kaefer, K. et al. Implantable Sensors Based on Gold Nanoparticles for Continuous Long-Term Concentration Monitoring in the Body. Nano Letters 2021, 21(7), p. 3325-3330; Gurkov, A.; Shchapova, E.; Bedulina, D.; Baduev, В.; Borvinskaya, E.; Meglinski, I.; Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Scientific Reports 2016, 6(1), p. 1-8]. Изготовление такого сенсора относительно просто и может быть выполнено в большинстве биохимических лабораторий.

Хотя большинство имплантируемых сенсоров разрабатываются для человека и млекопитающих [Rong, G. et al. Recent developments in nanosensors for imaging applications in biological systems. Annual Review of Analytical Chemistry 2019, 12, p. 109-128], другие животные также заслуживают внимания. Например, аквакультура рыбы производит около половины всего количества рыбы, потребляемой человеком, и этот рынок продолжает расти [Jahangiri, L.; Esteban, М.Á.; Administration of probiotics in the water in finfish aquaculture systems: a review. Fishes 2018, 3(3), p.33; Lulijwa, R. et al. Advances in salmonid fish immunology: A review of methods and techniques for lymphoid tissue and peripheral blood leucocyte isolation and application. Fish & Shellfish Immunology 2019, 95, p.44-80.]. Выращиваемые рыбы страдают от инфекционных заболеваний [Rodger, H.D. Fish disease causing economic impact in global aquaculture. In Fish vaccines. Springer, Basel, 2016, pp.1-34] и плохого качества воды [Hoseini, S.M. et al. Mitigation of transportation stress in common carp, Cyprinus carpio, by dietary administration of turmeric. Aquaculture 2022, 546, 737380], а численность этих животных в стаде слишком велика, чтобы регулярно контролировать состояние каждой особи [Assefa, А.; Abunna, F. Maintenance of fish health in aquaculture: review of epidemiological approaches for prevention and control of infectious disease of fish. Veterinary Medicine International 2018, Article ID 5432497, https://doi.org/10.1155/2018/5432497]. В ближайшем будущем дешевые имплантируемые датчики, регистрирующие физиологические параметры организма, могут стать одним из новых инструментов, которые помогут автоматизировать мониторинг здоровья выращиваемой рыбы на рыбных фермах.

Фундаментальной проблемой при использовании имплантируемых микросенсоров, в том числе на основе микрочастиц с флуоресцентным красителем, является реакция распознавания и отторжения чужеродного тела иммунной системой.

Известен способ введения бионеразлагаемых микрочастиц, содержащих флуоресцентный краситель, в кровоток рыбок Danio rerio путем инъекции в почку рыбы суспензии микрочастиц в изотоническом растворе (0,9% водный раствор NaCl) [Borvinskaya Е., Gurkov A., Shchapova Е., Mutin A., Timofeyev М. 2021. Histopathological analysis of zebrafish after introduction of non-biodegradable polyelectrolyte microcapsules into the circulatory system. PeerJ 9:el 1337 http://doi.org/10.7717/peerj.11337]. Известен также способ введения бионеразлагаемых микрочастиц, содержащих флуоресцентный краситель, в центральный кровеносный сосуд ракообразных на примере амфипод Eulimnogammarus verrucosus, путем инъекции суспензии микрочастиц в изотоническом растворе (0,9% водный раствор NaCl) в центральный гемолимфатический сосуд амфипод [Shchapova Е., Nazarova A., Gurkov А., Borvinskaya Е., Rzhechitskiy Y., Dmitriev I., Meglinski I., Timofeyev M. Application of PEG-Covered Non-Biodegradable Polyelectrolyte Microcapsules in the Crustacean Circulatory System on the Example of the Amphipod Eulimnogammarus verrucosus. Polymers 2019, 11, 1246; doi:10.3390/polym11081246]

Гистологические исследования в обоих случаях показали, что микрокапсулы, нагруженные флуоресцентным зондом, распознаются и поглощаются фагоцитирующими клетками в течение первых суток после введения, тем самым теряя свою функциональность. Таким образом, чтобы продлить время работы микросенсора, требуется уменьшить скорость распознавания импланта иммунной системой.

Известен один из подходов к решению этой проблемы: создание физического барьера между иммунными клетками и микрочастицами с помощью биосовместимых бионеразлагаемых гидрогелей. Гидрогели представляют собой трехмерный полимерный каркас, удерживающий большое количество воды (40-98% объема геля), что позволяет биологическим молекулам свободно проходить через него. При этом размер пор геля можно отрегулировать так, чтобы из него не выходили микрочастицы и в него не проникали иммунные клетки.

Ранее многообещающая биосовместимость с сохранением функциональности имплантированных микросенсоров в течение многих лет была показана для гелей на основе поли(2-гидроксиэтилметакрилата), поли(этиленгликоль)диакрилата, и т.д. [например: M.F. Montero-Baker, et al. The First-in-Man "Si Se Puede" Study for the use of micro-oxygen sensors (MOXYs) to determine dynamic relative oxygen indices in the feet of patients with limb-threatening ischemia during endovascular therapy. JOURNAL OF VASCULAR SURGERY. Volume 61, Issue 6, June 2015. Pp.1501-1510, http://dx.doi.org/10.1016/j.jvs.2014.12.060; X. Hu, X. Gong. A new route to fabricate biocompatible hydrogels with controlled drug delivery behavior, Journal of Colloid and Interface Science (2016), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.jcis.2016.02.037; Wisniewski N.A. et al. Tissue-Integrating Oxygen Sensors: Continuous Tracking of Tissue Hypoxia. Adv Exp Med Biol. 2017; 977: 377-383. doi:10.1007/978-3-319-55231-6_49; M.A. Lee et al. Implanted Nanosensors in Marine Organisms for Physiological Biologging: Design, Feasibility, and Species Variability // ACS sensors. - 2018. - T. 4. - №. 1. - C. 32-43, https://doi.org/10.1021/acssensors.8b00538; Kaefer, K. et al. Implantable Sensors Based on Gold Nanoparticles for Continuous Long-Term Concentration Monitoring in the Body. Nano Letters 2021, 21(7), p.3325-3330]. Недостатком этих гелей является то, что после полимеризации они принимают постоянную форму. Соответственно, для их введения под кожу применяют сложные пневматические устройства, толстые транспондерные иглы или хирургическое вмешательство (Montero-Baker et al. 2015; Lee et al., 2019; Kaefer et al., 2021). Такие подходы сложны, травматичны и неприменимы к мелким животным.

Также проблемой в использовании микродатчиков на основе микрочастиц, содержащих флуоресцентные красители, является то, что получение сигнала сенсора требует имплантации хотя бы в минимально прозрачные ткани. Выращиваемые в аквакультуре виды рыб, например, семейства лососевых, обладают большими размерами, толстой кожей и зачастую имеют выраженную окраску. Все это мешает прохождению света от имплантированного оптического микросенсора через кожу на поверхность тела, где сигнал может быть зарегистрирован прибором для считывания.

Известен способ применения инъекционного флуоресцентного датчика для отслеживания кислотности тканей рыбок данио (Danio rerio) [Borvinskaya, Е.; Gurkov, А.; Shchapova, Е.; Baduev, В.; Shatilina, Z.; Sadovoy, A.; Meglinski, I.; Timofeyev, M.; Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biology Open 2017, 6(5), 673-677], однако в силу небольших размеров эти рыбы имеют довольно прозрачное тело и тонкую кожу. Таким образом, для имплантации флуоресцентных микросенсоров для иного вида рыб требуется подбор удобных полупрозрачных участков на поверхности тела.

К примеру, радужная форель, типичный представитель рыб семейства лососевых, демонстрирует значительные различия в окраске в зависимости от генетической линии и условий произрастания [Colihueque, N.; Parraguez, М.; Estay, F.J.; Diaz, N.F. Skin color characterization in rainbow trout by use of computer-based image analysis. North American Journal of Aquaculture 2011, 73(3), p.249-258]. Тем не менее кожу на основном теле этого вида можно разделить на: темную кожу на спинной части, кожу вдоль боковой линии с розовым оттенком и светлую кожу на брюшной части. При этом нами было показано, что вне зависимости от окраски, разные типы кожи на теле форели одинаково плохо пропускают свет (см. фиг 2А, фиг. 2В, фиг. 3А). Наличие или отсутствие чешуи также не влияет на проницаемость для света.

Прозрачные участки кожи на теле форели включают: кожу на голове, окологлазничную область, кожу в основании лучевых плавников, жировой плавник.

Кожа на голове рыб не эластична и плотно прилегает к костям черепа; поэтому для инъекции в этих местах недостаточно подкожного пространства. Окологлазничная область довольно мясистая, имеет достаточный объем для введения импланта и применяется в рыбоводстве для введения различных меток чипов [Bailey, R.E.; Irvine, J.R.; Dalziel, F.C.; Nelson, T.C. Evaluations of visible implant fluorescent tags for marking coho salmon smolts. North American Journal of Fisheries Management 1998, 18(1), p. 191-196], но интенсивное освещение вблизи рыбьего глаза для возбуждения флуоресценции вызовет дополнительное беспокойство, и, потенциально, повреждение сетчатки, и поэтому не рекомендуется при физиологических измерениях.

Основания спинного и грудных плавников довольно мясистые и подходят для введения эластичного геля и также используются для маркировки рыб с помощью инъекций меток. Известен способ маркировки молоди радужной форели с помощью меток из окрашенного эластомера, который вводили под кожу у основания спинного плавника и между лучами хвостового плавника [Leblanc, С.А.; Noakes, D.L. Visible implant elastomer (VIE) tags for marking small rainbow trout. North American Journal of Fisheries Management 2012, 32(4), pp. 716-719.]. Недостатком данного способа является то, что в случае введения флуоресцентного датчика в основание спинного или брюшного плавника, сигнал от него можно будет регистрировать только с одной стороны рыбы (откуда был сделан укол). Также плавник с датчиком внутри, вероятно, придется ампутировать перед продажей, что существенно портит состояние и товарный вид выращиваемой рыбы.

Известен способ применения имплантируемых флуоресцентных наносенсоров для мониторинга физиологических состояний ряда гидробионтов (Lee М.A. et al. Implanted Nanosensors in Marine Organisms for Physiological Biologging: Design, Feasibility, and Species Variability // ACS sensors. - 2018. - T. 4. - №. 1. - C. 32-43), наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату (принят за прототип). В качестве носителя использовали биосовместимый гидрогель на основе поли(этиленгликоль)диакрилата (PEGDA). Датчики применяли на 9 видах гидробионтов, имплантируя их в ткани с различной окраской, чтобы исследовать влияние окраски на видимость флуоресценции, к примеру, золотым рыбкам (Carassius auratus) вводили в мышцу в области спинного плавника, звездчатой кошачьей акуле (Scyliorhinus stellaris) - подкожно в область спины на уровне второго спинного плавника, синей акуле (Prionace glauca) - в различные участки кожи, имеющие окраску от темно-синего до белого цвета, морской черепахе (Caretta caretta) - в участки кожи, покрытые чешуей и лишенные чешуи. Далее визуализировали датчик рибофлавина с флуоресценцией в инфракрасном диапазоне под кожей гидробионтов. Недостатком данного способа-прототипа является, во-первых, возможность визуализации флуоресценции датчика только в определенных типах кожи у определенных видов рыб. Сами авторы исследования отмечают, что темные участки поверхности кожи гидробионтов плохо пропускали излучение от флуоресцентного имплантированного датчика в инфракрасном диапазоне. При этом, учитывая высокое пропускание биологическими тканями света в инфракрасном диапазоне [Golovynskyi, S.; Golovynska, I.; Stepanova, L.I.; Datsenko, О.I.; Liu, L.; Qu, J.; Ohulchanskyy, T.Y. Optical windows for head tissues in near-infrared and short-wave infrared regions: Approaching transcranial light applications. Journal of Biophotonics 2018, 11(12), e201800141], предлагаемые в заявляемом нами способе датчики, испускающие свет в видимом диапазоне, как ожидается, будут неприменимы в тех же условиях. Во-вторых, недостатком способа-прототипа, как уже ранее отмечалось, является то, что в данном исследовании использовали гидрогель на основе поли(этиленгликоль)диакрилата, что потребовало применения толстых транспондерных игл, обычно применяющихся для установки микрочипов (которые предварительно извлекали из игл), что травматично и неприменимо для лососевых рыб.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа введения под кожу культивируемых рыб семейства лососевых оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными индикаторными красителями, с использованием такого биосовместимого бионеразлагаемого гидрогеля, который после застывания не принимает постоянную форму, а остается мягким и гибким, следовательно, не требует применения травматичных для рыб способов введения (например, транспондерных игл), при этом обеспечивает удовлетворительную прозрачность тканей в месте введения для прохождения оптического сигнала от имплантированного микросенсора, а также с выбором такого места введения на теле лососевых рыб, которое обеспечит максимальную видимость и считываемость оптического сигнала от имплантированного микросенсора.

Технический результат - улучшение прохождения света от имплантированного флуоресцентного оптического микросенсора через кожу на поверхность тела лососевых рыб.

Поставленная задача достигается тем, что предлагается способ введения под кожу культивируемых рыб семейства лососевых оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными индикаторными красителями, изменяющими свои оптические характеристики в ответ на изменение состава жидкостей организма рыб, в котором в качестве носителя флуоресцентных микрочастиц используют биосовместимый бионеразлагаемый гидрогель. В качестве биосовместимого бионеразлагаемого гидрогеля, используют 2,5%-ный полиакриламидный гель. Введение микрочастиц с носителем под кожу рыб выполняют путем инъекции шприцем. В качестве места инъекции используют жировой плавник лососевых рыб.

Применение полужидких инъекционных гидрогелей, таких как 2,5%-ный полиакриламидный гель (ПАГ), который после полимеризации образует текучие гель-золи, позволяет устранить такой недостаток прототипа, как применение толстой транспондерной иглы, изначально предназначенной для микрочипирования. Данные гели можно многократно набирать и выпускать из шприца без нарушения их структуры. Несмотря на текучесть, гель довольно липкий и при надавливании удерживает заполимеризованные внутри микрочастицы, не давая им выпасть из геля. Более плотные ПАГ (3,3% и выше) при подобном механическом воздействии рушатся на кусочки с неровными рваными краями и могут забивать иглу шприца. На фиг 1. проиллюстрированы физические свойства полиакриламидных гелей, где А - структура 2,5%-ный ПАГ, В - структура 3,3%-ный ПАГ, С - мазок микрокапсул с флуоресцентным красителем в 2,5%-ный ПАГ, 1 - стрелки указывают на границу геля, 2 - головки стрелок указывают на флуоресцентные микрокапсулы, D - увеличенное изображение микрокапсул с флуоресцентным красителем в 2,5%-ный ПАГ, 2 - головки стрелок указывают на флуоресцентные микрокапсулы, 3 - двухсторонняя стрелка указывает границу между краем геля и микрокапсулой.

2,5%-ный ПАГ имеет историю использования в качестве косметического филлера в 1990-х годах в Китае, Восточной Европе и Южной Америке (торговое название Interfall, Aquamid и др.), соответственно, накоплены данные о долгосрочных осложнениях, связанных с его инъекциями. В основном сообщается о жалобах на долговременные последствия от введения ПАГ, таких как фиброз и воспаление в месте инъекции (Peng H.L., Cheng Y.H., Lin Y.H., Ko С.Н. Unusual presentation of a late complication in a polyacrylamide gel-injected breast. Formos.1 Surg 2017; 50: 77-80; Dashtimoghadam, E., Fahimipour, F., Keith, A.N. et al. Injectable non-leaching tissue-mimetic bottlebrush elastomers as an advanced platform for reconstructive surgery. Nat Commun 12,3961 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-23962-8).

Отмечается, что ПАГ в организме неохотно покрывается толстой фиброзной капсулой (Chen L., Sha L., Huang S.P., Li S.R., Wang Z.X. Treatment for displacement of PAG mixture after injection augmentation mammoplasty. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(3): 3360-3370. Published 2015 Mar 15; Peng et al., 2017), что вызывает косметические дефекты из-за миграции геля из места введения. При этом сообщалось, что в метаболически активной мышечной ткани ПАГ инкапсулируется лучше, чем в инертной соединительной ткани кожи и молочных желез (Chen et al., 2015; Peng et al. 2017). В целом, по нашей оценке, на основе литературных данных, учитывая примерное количество выполненных косметических процедур и количество обращений с жалобами на воспаление, частота осложнений на этот имплантат составляет 1-5%. Учитывая то, что в косметологии использовались огромные объемы вводимого материала (до 6% от массы тела), можно говорить об удовлетворительной биосовместимости данного носителя для целей введения 10-100 мкл микроимпланта в животных (не более 0,1% от массы тела для молоди рыб). При этом известно (Christensen L.H., Breiting V.B., Aasted A., Jørgensen A., Kebuladze I. Long-term effects of polyacrylamide hydrogel on human breast tissue. Plast Reconstr Surg. 2003 May; 111(6): 1883-90. doi: 10.1097/01.PRS.0000056873.87165.5A. PMID: 12711948), что незначительные объемы отложений ПАГ не вызывают какой-либо реакции в окружающих тканях у людей.

Примечательно, что сообщаемое время от инъекции ПАГ до появления осложнений у человека колеблется от 6 месяцев до десятилетий (DeLuca М. et al., Complications 18 years after polyacrylamide hydrogel augmentation mammoplasty: a case report and histopathological analysis. Journal of Surgical Case Reports, Volume 2021, Issue 6, June 2021, rjab276, https://doi.org/10.1093/jscr/rjab276), что более чем достаточно для проведения исследований с помощью микроимплантов на животных моделях. Есть сообщение (Zhou Z., Ru K-Н. Observation on biologic characterization of polyacrylamide gel and silicon gel infused into mammary gland of domestic musk swine [in Chinese]. 2001; JOURNAL OF PRACTICAL AESTHETIC AND PLASTIC SURGERY 12: 69-71) о том, что через 2 недели после инъекций полиакриламидного геля в грудную ткань свиньи наблюдали образование вокруг него фиброзной ткани, однако в течение 4 месяцев после инъекций капсула постепенно истончалась, и в конечном итоге в ней осталось 3-5 слоев фибробластов. Из этого можно предварительно предположить, что развивающееся вокруг импланта воспаление умеренное, а образующаяся в результате фиброзная оболочка проницаема для метаболитов и не будет мешать работе имплантируемого сенсора при введении его под кожу рыб. Нужно отметить, что авторами заявляемого изобретения не выявлено среди общедоступных источников информации сведений о применении 2,5%-ного ПАГ в качестве носителя оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными красителями для имплантации в ткани рыб.

Жировой плавник лососевых не содержит эндоскелет [Weisel, G.F. The salmonoid adipose fin. Copeia 1968, 1968(3), p.626-627; Stewart, T.A.; Smith, W.L.; Coates, M.I. The origins of adipose fins: an analysis of homoplasy and the serial homology of vertebrate appendages. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 2014, 281(1781), 20133120] и лишен всех вышеперечисленных недостатков, характерных для введения имплантируемых меток в кожу на голове рыб, окологлазничную область, кожу в основании лучевых плавников. Он достаточно компактный, чтобы быстро найти датчик с любой стороны тела рыбы и достаточно мясистый для имплантации. Плавник интенсивно иннервируется рядом нервов и, по-видимому, служит механочувствительным органом во время плавания [Buckland-Nicks, J.А. New details of the neural architecture of the salmonid adipose fin. Journal of Fish Biology, 2016, 89(4), 1991-2003], что предполагает хорошее кровоснабжение. Таким образом внутренняя среда внутри жирового плавника рыб оперативно отражает текущее состояние метаболизма рыб в целом. Жировой плавник можно удалить без ущерба для товарного состояния рыбы, как это уже практикуется в некоторых странах для маркировки заводских лососевых [Buckland-Nicks, J.A. New details of the neural architecture of the salmonid adipose fin. Journal of Fish Biology, 2016, 89(4), 1991-2003]. Кожа на жировом плавнике отличается от других типов кожи отсутствием толстого слоя плотных пучков коллагеновых волокон (как показано на фиг. 3В), ориентированных параллельно поверхности тела и, соответственно, препятствующего прохождению вглубь ткани лучу света. Сердцевина жирового плавника в основном состоит из коллагенового матрикса [Weisel, G.F. The salmonoid adipose fin. Copeia 1968, 1968(3), p. 626-627], состоящего из воды, связанной редкими нерегулярными коллагеновыми волокнами, что также делает плавник полупрозрачным в проходящем свете.

На фиг. 2А показано общее строение тела радужной форели, где: 4 - жаберная крышка, 5 - грудной плавник, 6 - боковая линия, 7 - спинной плавник, 8 - брюшной плавник, 9 - анальный плавник, 10 - жировой плавник, 11 - хвостовой плавник, а также показано увеличенное изображение жирового плавника (10), а на фиг. 2В представлены графики проницаемости жирового плавника и кожи на спине рыб для света на разных длинах волн, где 12 - график проницаемости жирового плавника, 13 - график проницаемости кожи форели с чешуей.

На фиг. 3А показана оптическая плотность (обозначена на графике как OD) разных типов кожи форели и жирового плавника при 650 нм, на фиг. 3В - поперечный срез жирового плавника, где: 14 - плотный слой регулярных коллагеновых волокон, 15 - чешуя, 16 - эпидермис. Сравнение оптических свойств разных типов кожи форели и жирового плавника показывают, что они имеют одинаковое пропускание в диапазоне от ультрафиолетового до синего (как показано также на графике на фиг. 2В), но в диапазоне 500-1000 нм жировой плавник пропускает свет в три и более раз лучше, чем на других участках кожи. Это позволяет возбуждать флуоресценцию микродатчика в диапазоне длин волн 510-845 нм, обладающих низкой фототоксичностью для кожи. Проведенные авторами изобретения тесты показали, что при подкожном введении фотосигнал от имплантированного датчика с тестовым красителем SNARF-1 (пик испускания 650 нм) успешно измеряется из всех частей тела, но регистрируемая на поверхности интенсивность флуоресценции примерно в 18 раз больше в жировом плавнике, чем в других частях тела с обычным кожным покровом, следовательно, введение в жировой плавник позволяет существенно уменьшить количество дорогостоящего молекулярного зонда. Таким образом, мы проанализировали различные части тела выращиваемой радужной форели (как типичного представителя рыб семейства лососевых) в качестве мест имплантации флуоресцентных датчиков и предлагаем жировой плавник в качестве оптимального выбора места инъекции.

ПРИМЕР

Флуоресцентные микрочастицы готовили согласно ранее апробированной и опубликованной методике (например, Borvinskaya Е, Gurkov A, Shchapova Е, Karnaukhov D, Sadovoy A, Meglinski 1, Timofeyev М. 2018b. Simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection. Journal of Visualized Experiments 136:e57491 DOI 10.3791/57491).

Для синтеза пористых микроядер СаСО₃, содержащих флуоресцентный краситель, смешивали 2 мл раствора флуоресцентного красителя в концентрации около 2 мг/мл (можно использовать любой флуоресцентный краситель, сшитый с полимером, такой как FITC-BSA, FITC-Dextran и т.д.) с 0,6 мл 1 моль/л раствора CaCl₂ и 0,6 мл 1 моль/л раствора Na₂CO₃ при быстром перемешивании. После перемешивания в течение 5-10 с переносили суспензию в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в течение 15 с при 10000-12000 g для осаждения микроядер СаСО₃, затем удаляли супернатант, промывали ядра 2 мл деионизированной воды и ресуспендировали осадок путем встряхивания. Затем повторяли процедуру центрифугирования-промывки три раза. После последнего центрифугирования отбрасывали супернатант. Полученные микроядра инкубировали в течение 1 мин в ультразвуковой ванне, чтобы уменьшить их агрегацию.

Для нанесения первого полимерного слоя ресуспендировали ядра в 2 мл раствора 4 мг/мл поли(аллиламин гидрохлорида) в 1 моль/л NaCl. Выдерживали микроядра в растворе 5 мин при постоянном встряхивании. Через 15 с центрифугирования отбрасывали надосадочную жидкость с не связавшимся полимером. Далее промывали покрытые микроядра деионизированной водой не менее 3 раз с помощью нескольких этапов центрифугирования и промывки. После последнего центрифугирования отбрасывали супернатант и инкубировали микроядра в течение 1 мин в ультразвуковой ванне, чтобы уменьшить их агрегацию. Для нанесения второго полимерного слоя повторяли вышеописанные процедуры с 2 мл раствора 4 мг/мл поли(4-стиролсульфоната натрия) в растворе 1 моль/л NaCl. Далее последовательно наносили слои с поли(аллиламин гидрохлоридом) и поли(4-стиролсульфонатом) натрия по шесть раз, чтобы нанести 12 полимерных слоев. Если применяемый флуоресцентный краситель являлся катионным, первым слоем накладывали поли(4-стиролсульфоната натрия) в 1 моль/л NaCl. Ядра СаСО₃ растворяли в 2 мл 0,1 моль/л раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (доведенный до рН 7,1 с помощью NaOH). После 5 мин инкубации микрокапсулы центрифугировали в течение 45 с и сливали супернатант с ЭДТА. Повторяли процедуру дважды, затем промывали микрокапсулы 0,9%-ным раствором NaCl три раза (путем осаждения-ресуспендирования). После последнего шага центрифугирования отбрасывали супернатант. Исходный раствор капсул доводили до концентрации 1-10 млн/мкл и хранили в растворе антибиотика ампициллина (100 мг/л) при 4°С.

Смесь для инъекций готовили с соблюдением стерильности в ламинарном шкафу с использованием автоклавного лабораторного пластика. Смешивали в микропробирке 5 мкл 29%-ного раствора акриламида, содержащего 1%-ный N,N'-метиленбисакриламид, с 53,2 мкл стокового раствора микрокапсул. Далее добавляли 0,9 мкл 10%-ного персульфата аммония и 0,9 мкл 10%-ного тетраметилэтилендиамина для инициации полимеризации. Полученную смесь сразу отбирали из пробирки с помощью стерильного инсулинового шприца. Затем шприц устанавливали в орбитальный смеситель и вращали в течение 20 минут со средней скоростью для предотвращения оседания капсул до полной полимеризации геля. Готовый гель хранили при 4°С до процедуры имплантации.

Рыб по отдельности анестезировали в эмульсии гвоздичного масла или MS-222 до переворачивания на бок и прекращения реакции на легкое щипание плавника (около 2 мин). Особей иммобилизовывали на столе, жировой плавник промывали спиртом из поливалки и с помощью инсулинового шприца вводили в сердцевину плавника около 2-10 мкл микрокапсул в 2,5%-ный ПАГ. Для каждой особи использовали индивидуальную одноразовую иглу (29G). Возвращали рыбу в емкость с хорошей аэрацией для восстановления.

На фиг. 4 представлен результат гистологического исследования (разрез) места введения ПАГ с микрокапсулами через две недели после инъекции, а также ответная экспрессия генов иммунного ответа в жировом плавнике. При этом:

А - показан инъекционный канал с ПАГ, лежащий в коллагеновом матриксе, где: 17 - стрелки указывают на границу между гелем и тканью, образованную монослоем из моноцитов, 18 - кончики стрелок указывают на места привлечения большего числа макрофагов, где идет слабая воспалительная реакция, g - гель с микрокапсулами, m - коллагеновый матрикс, hd - гиподерма, d - дерма, ed - эпидермис;

В - показана экспрессия гена TNFa1 и С - экспрессия гена il8 в тканях в месте инъекции при введении микрокапсул (микрочастиц) с флуоресцентным красителем без носителя, с использованием в качестве носителя 2,5%-ный ПАГ и при введении физраствора (0,9%-ный NaCl). Следовательно, собственные гистологические исследования подтверждают, что через 2 недели после инъекции микрочастиц с флуоресцентным красителем с 2,5%-ным ПАГ согласно заявляемому способу в жировой плавник форели воспалительная реакция вокруг него развивается слабо, а многослойная фиброзная оболочка вокруг импланта не формируется. Было показано, что гель устойчив в течение как минимум 2 недель в организме рыб. При этом введение микрочастиц без ПАГ вызывает повышение провоспалительных цитокинов FoxP3B, nlL1, IL-1β, TNF-α и IL-8 в месте инъекции, указывая на воспаление, тогда как в жировом плавнике рыб, которым вводили микрочастицы в 2,5%-ный ПАГ или физраствор, такая реакция отсутствовала. Это подтверждает, что ПАГ замедляет распознавание микрочастиц иммунными клетками. Таким образом, ПАГ показал удовлетворительную устойчивость и биосовместимость в тканях рыб, что позволяет применять его для имплантации микросенсоров или меток. Можно заключить, что ПАГ является перспективным носителем для имплантации микросенсоров с целью долгосрочного непрерывного мониторинга состава жидкостей организма рыб.

Следует отметить, что 2,5%-ный ПАГ интегрируется в ткани без образования толстой фиброзной капсулы и тем самым не снижает прозрачность тканей в месте имплантации.

Жировой плавник рыб также имеет прозрачную кожу, благодаря тонкому дермальному слою и отсутствию чешуи, коллагеновый матрикс в сердцевине жирового плавника также прозрачен и проницаем для света в видимом диапазоне. Благодаря совокупности данных признаков предлагаемого способа (использование в качестве носителя микрочастиц (микрокапсул) с флуоресцентным красителем 2,5%-ным ПАГ и выбор в качестве места инъекции жирового плавника рыб) достигается технический результат - улучшение прохождения света от имплантированного флуоресцентного оптического микросенсора через кожу на поверхность тела рыб, что повышает эффективность неинвазивного долговременного мониторинга различных физиологических параметров организма культивируемых рыб семейства лососевых.

В качестве носителя для имплантируемых микросенсоров 2,5%-ный ПАГ имеет и иные преимущества: гель легко вводится с помощью шприца; плохо проницаем для иммунных клеток и удерживает микрокапсулы; снижает раздражающее действие от вводимого препарата и помогает уменьшить реакцию на инородное тело; не мешает заживлению; мягкий, гибкий, устойчив к сдавливанию; имитирует внеклеточный матрикс; не рассасывается в организме в течение нескольких недель.

Жировой плавник в качестве места для введения имплантируемых микросенсоров имеет также следующие преимущества: благодаря прозрачности плавника снятие оптического сигнала регистратором возможно со всех сторон тела рыбы; в силу компактного размера и отсутствия в нем жизненно важных органов жировой плавник может быть ампутирован перед продажей без потери товарного состояния выращиваемой рыбы.

Работа, в ходе которой было создано предлагаемое изобретение, выполнена по гранту Российского научного фонда (РНФ), соглашение №20-64-47011 от 20.05.2020 г., наименование: «Разработка подходов к использованию D-лактата для раннего определения патологических процессов, ассоциированных с бактериофлорой, у рыб в аквакультуре».

Способ введения под кожу культивируемых лососевых рыб оптических микросенсоров, в котором в качестве носителя флуоресцентных микрочастиц используют биосовместимый бионеразлагаемый гидрогель - 2,5%-ный полиакриламидный гель. Введение микрочастиц с носителем под кожу рыб выполняют путем инъекции шприцем. В качестве места инъекции используют жировой плавник лососевых рыб. Изобретение обеспечивает лучшее прохождения света от имплантированного флуоресцентного оптического микросенсора, на поверхность тела лососевых рыб. 4 ил., 1 пр.

Способ введения под кожу культивируемых рыб семейства лососевых оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными индикаторными красителями, изменяющими свои оптические характеристики в ответ на изменение состава жидкостей организма рыб, в котором в качестве носителя флуоресцентных микрочастиц используют биосовместимый бионеразлагаемый гидрогель, отличающийся тем, что в качестве биосовместимого бионеразлагаемого гидрогеля используют 2,5%-ный полиакриламидный гель, введение микрочастиц с носителем под кожу рыб выполняют путем инъекции шприцем, а в качестве места инъекции используют жировой плавник лососевых рыб.