НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6844 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, и может применяться для качественного выявления ДНК генетически модифицированного атлантического лосося AquAdvantage® Salmon методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Генетически модифицированный лосось AquAdvantage® Salmon (ГМ лосось), первое в мире ГМ животное, одобренное для непосредственного употребления в пищу, был создан в 1989 году. В США одобрен в 2015 году, в Канаде - для продажи в 2016 году. В ЕС выращивание и использование ГМ лосося запрещено. В настоящее время ГМ лосось производится компанией AquaBounty Technologies Inc. на заводах в США и Канаде. Геном ГМ лосося модифицирован путем вставки кодирующей последовательности гена гормона роста GH1 чавычи (Oncorhynchus tshawytscha) и промоторной последовательности гена антифризного белка AFP из генома американской бельдюги Zoarces americanus. Трансгенная конструкция присутствует в геноме AquAdvantage Salmon в одной копии и состоит из 3'-сегмента промоторной области гена Afp, непосредственно кодирующей последовательности гена GH1, полной последовательности терминатора гена Afp Zoarces americanus и части 5' области промотора Afp. Внесенный ген гормона роста позволяет ГМ лососю расти круглый год, а не сезонно и значительно быстрее достигать товарного размера.

В настоящее время существует несколько ПЦР методик обнаружения ДНК ГМ лосося: с электрофоретической детекцией (Castro C. et al. A method to assemble DNA fragments mimicking junctions of transgenic elements: Application to the AquAdvantage salmon //Food Control. - 2017. - Т. 82. - С. 179-183.) и с детекцией в режиме реального времени (Soga K. et al. Development of a novel method for specific detection of genetically modified Atlantic salmon, AquAdvantage, using real-time polymerase chain reaction //Food chemistry. - 2020. - Т. 305. - С. 125426. Debode F. et al. Detection of transgenic Atlantic and Coho salmon by real-time PCR //Food Analytical Methods. - 2018. - Т. 11. - №. 9. - С. 2396-2406.).

Методика Debode F. et al (2018) основана на выявлении двух фрагментов трансгенной конструкции: первый - на стыке между промоторной областью Afp и последовательностью гена гормона роста GH1, второй - между GH1 и последовательностью терминатора. В качестве внутреннего контроля использован фрагмент гена гормона роста типа 2 (GH2). Однако в данной методике отсутствует информация о возможности ее использования для исследования образцов кулинарной продукции и кормов для животных. Также ограничением применения данной методики может быть недостаточная специфичность в случае создания других линий ГМ рыб, содержащих в своем геноме аналогичную конструкцию.

Методика Soga K. et al. (2020) основана на детекции участка соединения геномной ДНК лосося и 5’-конца промотора гена Afp трансгенной конструкции. В качестве внутреннего контроля авторы использовали фрагмент гена гормона роста GH1. Недостатками данной методики является отсутствие данных по отработке условий ПЦР на образцах кулинарной продукции и кормов.

В базе данных Европейского патентного ведомства размещен патент Liu Erlong et al. (2017), представляющий олигонуклеотидные праймеры и зонд для детекции ДНК ГМ лосося методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (CN106282377 (A) Transgenic salmon AquAdvantage line-specific real-time fluorescent PCR (polymerase chain reaction) detection primers, detection method and kit). Как и в методике Soga K. et al. (2020), в патенте Liu Erlong et al. (2017) последовательности олигонуклеотидов используются для обнаружения области соединения между экзогенной последовательностью вставки генетической конструкции и геномом лосося. К недостаткам изобретения можно отнести: отсутствие информации о внутреннем контроле; использование ограниченной панели для оценки специфичности набора олигонуклеотидов, состоящей только из образцов свежей рыбы нескольких видов, не включающих близкородственных атлантическому лососю (Salmo salar); отсутствие информации о исследовании образцов, подвергавшимся кулинарной обработке, и кормов для животных.

В РФ в настоящее время отсутствуют методики и коммерческие наборы реагентов для выявления ДНК ГМ лосося. На отечественном рынке представлены наборы реагентов на основе ПЦР в режиме «реальном времени», предназначенные для обнаружения ДНК немодифицированных рыб семейства лососёвых: лосось атлантический (Salmo salar), кижуч (Oncorhynchus kisutch), кета (Oncorhynchus keta), горбуша (Oncorhynchus gorbusсha), нерка (Oncorhynchus nerka), радужная форель (Oncorhynchus mykiss) и голец (Salvelinus spp), (ООО «НПФ Синтол», ООО «Органик Тест», ФБУН ЦНИИ Эпидимиологии, ООО «ВЕТ ФАКТОР», Россия).

Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для ПЦР в режиме «реального времени», используемых для обнаружения ДНК ГМ лосося AquAdvantage® Salmon в продукции из рыбы, сырье и кормах для животных.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность набора олигонуклеотидов, с помощью которого возможно детектировать ДНК ГМ лосося не только в продукции из свежей рыбы, но и в обработанной продукции и в кормах для животных.

Технический результат достигается конструированием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зондов, меченных разными флуоресцентными красителями, имеющий следующий нуклеотидный состав:

Aqua-GH1-F GGCAGCGATAGAAAACCAA

Aqua-GH1-R TGCGTTCATCAGGCAACA

Aqua-GH1-Z (ROX) - CTCAGAAAATGTTCAATGACTTTGACGGTA- (BHQ2)

Rps10-F GCTGGTGAGAGGCATTTGA

Rps10-R TTTCACATGACTGGGCAGG

Rps10-Z (Cy5) - TGTTGGTTCTGTGCCCACCCT - (BHQ2)

VE289-F AGCGTGTCTGTCCTTTATTAAATTG

VE289-R TCAAATAATCCGAGAGATGAGGTC

VE289-Z (R6G) - TTTCCACATTATCAGTTGCCATGGA - (BHQ1)

Данный набор позволяет в одной пробирке в трех независимых ПЦР выявлять фрагмент генетической конструкции, характерной для ГМ лосося совместно с двумя последовательностями эндогенных внутренних контролей. Первый контроль необходим для подтверждения наличия ДНК животного происхождения, качество которой приемлемо для получения ПЦР продукта, второй - для подтверждения наличия в исследуемом образце ДНК лосося атлантического Salmo salar.

Для выбора и анализа целевых мишеней использовали референсные геномы рыб, сельскохозяйственных животных и птицы, ДНК которых также может содержаться в целевой продукции (например, в кормах для животных смешанного состава), опубликованных в базе NCBI. К анализу были добавлены геномы человека (Homo sapiens) и животных (мыши (Mus musculus), крысы (Rattus norvegicus)), ДНК которых может попасть в анализируемые пробы из-за контаминации на производстве, при фасовке, хранении продуктов, при отборе проб.

В заявленном изобретении выявление фрагмента трансгенной конструкции, характерной для ГМ лосося, проводится при помощи ПЦР, праймеры для которой локализованы в разных экзонах транскрипта последовательности гена GH1, а зонд приходится на стык экзонов. При таком дизайне флуоресцентный сигнал будет наблюдаться только в присутствии генно-инженерной вставки в геноме.

Так как генноинженерная вставка присутствует в геноме лосося AquAdvantage в количестве одной копии, то в качестве последовательностей для внутренних контролей были выбраны однокопийные последовательности. В заявленном изобретении для контроля выделения ДНК и контроля её качества используются праймеры и зонд, комплементарные последовательности геномного элемента VE289. Данный элемент представляет собой тканеспецифичный энхансер, высококонсервативной среди рыб, млекопитающих и птиц. Использование такого контроля позволяет исключить ложноотрицательный результат ПЦР, возникающий вследствие неудачной экстракции ДНК.

Использование однокопийных геномных элементов VE в качестве внутреннего контроля для анализа пищевой продукции изложено в патенте Гергель М.А. и др. (2022) (RU 2 769 226 C1 Набор олигонуклеотидов для полуколичественной оценки содержания ДНК курицы в мясной продукции методом ПЦР в режиме реального времени). В документе RU 2 769 226 C1 описано применение консервативного у млекопитающих и птиц элемента VE1800 в качестве внутреннего контроля, относительно содержания которого проводится полуколичественная оценка содержания ДНК курицы в мясной продукции. Тогда как используемый в заявленном изобретении геномный элемент VE289 высококонсервативен не только у млекопитающих и птиц, но и у рыб, что является несомненным преимуществом при анализе продукции из рыбы на наличие ГМ лосося.

Второй внутренний контроль, использующийся для подтверждения присутствия в образце видоспецифичной ДНК Salmo salar, детектируется с помощью олигонуклеотидов, подобранных к окрестностям 2 экзона гена Rps10, кодирующего белок S10 малой субъединицы рибосомы. В области отжига обратного праймера и 3’-конца зонда последовательность Salmo salar резко отличается от последовательностей родственных рыб, что обеспечивает высокую специфичность данного набора. Видоспецифичная ПЦР не дает флуоресцентного сигнала при наличии в пробе ДНК нецелевых рыб, в первую очередь близкородственных и употребляемых в пищу, а также млекопитающих и птиц, ДНК которых также может содержаться в целевой продукции (пример 1).

Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов производили на онлайн-ресурсе «PCR Primer Design». С помощью онлайн-программ «Oligo Analysis Tool» и «PCR Primer Stats» оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования гомодимеров, гетеродимеров и «шпилек»; при помощи «Primer-Blast» биоинформатически оценивали специфичность данного набора. Далее были оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зондов, параметры температурного циклирования.

Выбранные олигонуклеотидные праймеры и зонды имеют следующую структуру:

Aqua-GH1-F GGCAGCGATAGAAAACCAA

Aqua-GH1-R TGCGTTCATCAGGCAACA

Aqua-GH1-Z (ROX) - CTCAGAAAATGTTCAATGACTTTGACGGTA- (BHQ2)

VE289-F AGCGTGTCTGTCCTTTATTAAATTG

VE289-R TCAAATAATCCGAGAGATGAGGTC

VE289-Z (R6G) - TTTCCACATTATCAGTTGCCATGGA - (BHQ1)

Rps10-F GCTGGTGAGAGGCATTTGA

Rps10-R TTTCACATGACTGGGCAGG

Rps10-Z (Cy5) - TGTTGGTTCTGTGCCCACCCT - (BHQ2)

Аналитическая чувствительность ПЦР с использованием данного набора олигонуклеотидов составляет 80 геномных копий в реакцию или 8*10³ копий/см³. Специфичность набора олигонуклеотидов составляет 100% при исследовании контрольной панели ДНК из образцов тканей рыб, млекопитающих, птиц, ракообразных, головоногих и растений.

Также заявленное изобретение было протестировано на термически обработанных модельных образцах из рыб разных видов, консервированной рыбной продукции, пробах пищевой продукции, кормах для кошек и собак для оценки возможности выявления ДНК ГМ лосося, ДНК Salmo salar и фрагмента внутреннего контроля. Во всех анализируемых образцах обнаружен фрагмент внутреннего контроля, что подтверждает наличие ДНК животного происхождения. Выявление видоспецифичного фрагмента ДНК Salmo salar во всех образцах соответствовало ожидаемому результату.

Таким образом, применение настоящего набора олигонуклеотидов в отличие от перечисленных выше европейских аналогов распространяется не только на продукцию из сырой рыбы, но и на продукцию, подвергавшуюся обработке; сырье на всех этапах переработки; консервированную (кроме паштетов) и кулинарную продукцию; корма для животных.

Выделение ДНК осуществляют сорбционным методом. Проводят мультиплексную ПЦР в одной пробирке в конечном объеме 25 мм³ со следующими компонентами реакционной смеси: ДНК-матрица; праймеры Aqua-GH1-F, Aqua-GH1-R, VE289-F, VE289-R, Rps10-F, Rps10-R; зонды Aqua-GH1-Z, VE289-Z и Rps10-Z; раствор дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 25 ммоль/дм³ (ООО «НПФ Синтол», Россия); Taq ДНК-полимераза (ООО «НПФ Синтол», Россия); ПЦР-буфер с магнием (ООО «НПФ Синтол», Россия), деионизованная вода.

Амплификацию осуществляют в приборах Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия) или Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия). Детектирование флуоресцентного сигнала проводится на каналах: Orange для ДНК ГМ лосося, Red для ДНК Salmo salar и Yellow для ДНК животного происхождения. Результаты амплификации интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией. Полученные значения порогового цикла ПЦР используют для интерпретации результатов качественного выявления ДНК ГМ лосося атлантического в анализируемых пробах.

Пример 1. Проверка специфичности набора олигонуклеотидов и выявление фрагментов трансгенной конструкции, ДНК Salmo salar и геномного элемента VE289

С целью подтверждения специфичности амплификацию проводили с ДНК, выделенной из образцов тканей позвоночных различных классов (рыбы - 40 видов, млекопитающие - 9 видов, птицы - 2 вида), а также беспозвоночных (ракообразные - 1 вид, головоногие - 1 вид) и растений (3 вида).

В рамках проанализированной панели образцов специфичность составляет 100%. По каналу Yellow (геномный элемент VE289) наблюдается амплификация во всех ПЦР, в которых использовали ДНК рыб, млекопитающих и птиц. Таким образом, ПЦР внутреннего контроля обладает необходимой универсальностью для подтверждения наличия в образце ДНК животного происхождения, качество которой приемлемо для получения ПЦР продукта.

По каналу Red (видоспецифичный ген Rps10) наблюдается амплификация только в ПЦР, где использовали ДНК, выделенную из филе лосося атлантического (Salmo salar), из готовых пищевых продуктов или кормов для животных, содержащих лосось. Таким образом, ПЦР внутреннего контроля обладает необходимой специфичностью, благодаря которой не выявляются фрагменты ДНК близкородственных видов рыб из подсемейств Лососевые Salmoninae и Сиговые Coregoninae, рыб других семейств и других позвоночных.

По каналу Orange (трансгенная конструкция) наблюдается амплификация только в ПЦР, где использовали раствор плазмидной ДНК, содержащий клонированный фрагмент генетической конструкции, характерной для ГМ лосося. В остальных образцах амплификация отсутствует и фрагменты ДНК других организмов не выявляются.

Пример 2. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов для выявления ДНК ГМ лосося

Для определения аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов использовали растворы плазмидной ДНК на основе вектора pAL2-ТА, содержащие соответствующие клонированные фрагменты: генетической конструкции, характерной для ГМ лосося Aqua-GH1, гена Rps10 и элемента VE289. Готовили серии из десятикратных разведений плазмидной ДНК в ТЕ буфере для каждого фрагмента в отдельности с начальной концентрацией плазмидной ДНК 8*10⁸ копий/см³. Для каждой серии разведений проводили ПЦР в не менее чем в двух повторах. За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию раствора плазмидной ДНК, которая воспроизводимо давала продукт в двух повторах ПЦР (Фиг. 1).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Набор

олигонуклеотидов для выявления ГМ лосося методом ПЦР.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2023-03-28">

<ApplicantFileReference>01-2023</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и

стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», (ФГБУ

«ВГНКИ»)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Institution The Russian

State Center for Quality and Standardization of Veterinary Drugs and

Feed (FGBU VGNKI)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор олигонуклеотидов для

выявления генетически модифицированного атлантического лосося методом

ПЦР в режиме реального времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggcagcgatagaaaaccaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgcgttcatcaggcaaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcagaaaatgttcaatgactttgacggta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Salmo salar</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctggtgagaggcatttga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Salmo salar</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttcacatgactgggcagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Salmo salar</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgttggttctgtgcccaccct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agcgtgtctgtcctttattaaattg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcaaataatccgagagatgaggtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttccacattatcagttgccatgga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан набор олигонуклеотидов для выявления ДНК генетически модифицированного атлантического лосося AquAdvantage® Salmon методом ПЦР в режиме реального времени. Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность набора олигонуклеотидов, с помощью которого возможно детектировать ДНК ГМ лосося не только в продукции из свежей рыбы, но и в обработанной продукции и в кормах для животных. 1 ил., 2 пр.

Набор олигонуклеотидов для выявления ДНК генетически модифицированного атлантического лосося методом ПЦР в режиме реального времени, характеризующийся тем, что имеет следующий нуклеотидный состав:

Aqua-GH1-F GGCAGCGATAGAAAACCAA

Aqua-GH1-R TGCGTTCATCAGGCAACA

Aqua-GH1-Z (ROX)–CTCAGAAAATGTTCAATGACTTTGACGGTA– (BHQ2)

Rps10-F GCTGGTGAGAGGCATTTGA

Rps10-R TTTCACATGACTGGGCAGG

Rps10-Z (Cy5) – TGTTGGTTCTGTGCCCACCCT – (BHQ2)

VE289-F AGCGTGTCTGTCCTTTATTAAATTG

VE289-R TCAAATAATCCGAGAGATGAGGTC

VE289-Z (R6G) – TTTCCACATTATCAGTTGCCATGGA – (BHQ1).