Настоящее изобретение относится к области ветеринарных вакцин; более конкретно, изобретение относится к композиции и вакцинам, содержащим инактивированный ортореовирус рыб (PRV), способам получения указанной композиции или указанной вакцины и применению указанной композиции и вакцины для защиты рыб от инфекций или болезней, вызываемых PRV.
Аквакультура рыб и креветок стала важным средством производства животного белка для пищевых продуктов и кормов. Наибольшую ценность из них имеет аквакультура лососевых рыб, особенно атлантического лосося, которая является наиболее промышленно развитым видом рыбоводства. Крупные производители выращиваемого атлантического лосося находятся в районах с холодным морем в Норвегии, Чили, Канаде, Шотландии и Исландии. Непосредственная близость большого количества животных и их контакт с естественной средой делают такие культуры чувствительными к вспышкам болезней. Это причиняет значительный дискомфорт животным, а также наносит экономический ущерб фермерам. Существует множество вакцин, доступных для использования в аквакультуре, однако регулярно появляются новые патогены.
Ортореовирус рыб (PRV) был идентифицирован в 2010 г. (Palacios et al., 2010, PloS one, vol. 5, e11487) как возбудитель различных заболеваний у лососевых рыб, таких как лосось и форель, например, воспаления сердечной и скелетных мышц (HSMI), анемии, идиопатического синдрома радужной форели (ISRT) и синдрома эритроцитарных телец-включений (EIBS). Во всех случаях исходными клетками-мишенями для PRV являются эритроциты, которые у рыб являются ядросодержащими. Описаны подтипы вируса PRV с дифференциальной патогенностью, встречающиеся преимущественно среди разных типов лососевых (Wessel et al., 2019, Frontiers in Immunology, vol. 9, article 2018.3182).
Реовирусы имеют сегментированный двухцепочечный геном РНК. Частица вириона не имеет оболочки, но имеет структуру двойного капсида. Подробная информация о вирусном геноме PRV была опубликована в 2013 г. (Murkussen et al., 2013, PloS one, vol. 8, e70075), сам вирус был классифицирован как ортореовирус, поскольку его геном состоит из 10 сегментов, который не является фузогенным. Однако аминокислотная идентичность с другими представителями семейства Orthoreovirideae относительно низкая, и PRV имеет консервативные элементы, напоминающие Aquareovirideae. Изучение PRV затруднено, поскольку отсутствует отлаженная процедура его культивирования in vitro. Кроме того, его роль в заболевании изначально была неопределенной, поскольку этот вирус также часто встречается у здоровых и выздоравливающих рыб (Wessel et al., 2017, PloS one, vol. 12, e0183781).
Описано несколько попыток разработать вакцину против вызываемых PRV инфекции и заболевания путем тестирования инактивированных вакцин, ДНК-вакцин или субъединичных вакцин.
В заявках WO 2005/121325, WO 2015/028565 и CA 2.988.038 описан способ культивирования PRV в клетках рыб, и выдвинуто предположение, что вакцина может быть получена путем инактивации вируса (без описания предпочтительного способа инактивации). Однако в действительности вакцины не были получены и протестированы. То же самое относится к документам WO 2011/041789 и JP 2017029102, в которых в общем виде описаны многочисленные возможности для получения вакцин на основе PRV, но в действительности ни одна вакцина не была произведена и протестирована.
В WO 2015/185605 и WO 2016/075277 описаны штаммы PRV, выделенные из форели, диагностические способы детектирования и потенциальные (но не полученные в действительности) вакцины.
В WO 2019/110664 описаны субъединичные PRV вакцины на основе вирусных белков, в частности, неструктурных белков PRV.
Вакцина на основе цельного инактивированного вируса описана Wessel et al. 2018 (J. of Fish Diseases, vol. 41, p.1411-1419). Для инактивации PRV авторы использовали формальдегид. Вакцину адъювировали минеральным маслом и готовили в виде эмульсии вода-в-масле. Несмотря на удовлетворительный уровень защиты, наблюдаемый у рыб, зараженных путем инъекции, эта защита практически не распространялась на рыб, зараженных в результате совместного проживания с рыбами, инфицированными PRV. Поскольку заражение при совместном проживании ближе всего к естественному пути передачи PRV и инфицирования в полевых условиях, такую вакцину нельзя считать эффективной.
Это объясняет, почему до сегодняшнего дня в продаже нет вакцины от PRV. Следовательно, существует потребность в эффективной вакцине от PRV.
Таким образом, целью настоящего изобретения является преодоление недостатка предшествующего уровня техники и удовлетворение этой потребности в данной области путем создания эффективной инактивированной вакцины от PRV.
Известно большое разнообразие способов инактивации вируса для получения вакцины на основе инактивированного вируса. Целью таких способов обычно является повреждение структуры, белков или нуклеиновых кислот вируса, чтобы сделать его неинфекционным или утратившим способность к пролиферации. В этих способах используется химическая или физическая инактивация. Примерами физической инактивации являются: нагревание, высокое усилие сдвига, высокое давление или воздействие ионизирующего излучения, например УФ-света, рентгеновских лучей или гамма-лучей. Примерами химической инактивации являются воздействие высокого или низкого pH или добавление фермента, детергента, органического растворителя, хаотропного агента, формальдегида, лактона или азиридина.
Азиридины представляют собой органохимические соединения, содержащие азиридиновое кольцо. Эти соединения используются в медицине человека в качестве противораковых средств благодаря их склонности повреждать нуклеиновые кислоты в результате реакции алкилирования, вызывая перекрестное связывание и разрывы цепей. В биотехнологии это свойство азиридинов используется для инактивации микроорганизмов, таких как вирусы.
Хорошо известным азиридином, используемым для инактивации вирусов, является этиленимин (EI), в основном используемый в форме бинарного этиленимина (BEI). Это описано H. Bahnemann (1990, Vaccine, vol. 8, p. 299-303).
По сравнению с инактивацией другими химическими веществами, такими как формалин, EI более избирательно реагирует с нуклеиновыми кислотами. Однако также были описаны некоторые реакции с белком, а именно алкилирование сульфгидрильной группы аминокислоты цистеина в тиоэфир аллилена, что может отрицательно сказаться на иммуногенности: Chen et al. (1999, J. of Exp. Med., vol. 189, p.1757-1764) описывают потерю антигенности в результате S-алкилирования цистеинов в белках. По этой же причине в нескольких статьях рекомендованы меры предосторожности для уменьшения действия азиридинов на белки во время реакции инактивации: в WO 98/51660 описана разработка полимеров EI, которые являются более специфичными в отношении нуклеиновых кислот. Кроме того, в WO 98/45415 описана инактивация EI при кислом уровне pH для уменьшения реакции с вирусными белками.
Следовательно, потенциальные недостатки использования азиридина для инактивации вируса хорошо известны.
Неожиданно было обнаружено, что цель изобретения является достижимой, и следовательно, один или более недостатков предшествующего уровня техники могут быть преодолены путем создания вакцины на основе PRV, инактивированного альтернативным способом.
Когда авторы изобретения изучили результаты оценки вакцин предшествующего уровня техники на основе инактивированного PRV, выяснилось, что иммунологическая эффективность вакцины на основе инактивированного формалином PRV, например как описано в Wessel et al. 2018 (см. выше), является недостаточной для обоснования разработки эффективной коммерческой вакцины. Впоследствии были рассмотрены другие способы производства вакцины PRV. Одним из подходов была инактивация вирусных нуклеиновых кислот облучением УФ-светом. Тем не менее, вакцина, приготовленная из УФ-инактивированного PRV, не могла защитить лососевых рыб от HSMI, развивающегося после контрольного заражения PRV в модели совместного проживания, т.е. оказалась не намного лучше, чем вакцинация отрицательным контролем.
При отсутствии каких-либо указаний в уровне техники, впоследствии авторы изобретения обнаружили, что иммунологическая эффективность композиции, содержащей инактивированный PRV, может быть значительно увеличена при применении другого способа инактивации PRV, а именно путем инкубации с азиридином. Неожиданно оказалось, что это приводит не к ухудшению иммуногенности антигенов PRV, а, скорее, к образованию инактивированного антигена PRV, который при использовании в вакцине способен существенно ослабить признаки заболевания HSMI, даже при контрольном заражении в модели совместного проживания.
Это совершенно не следовало ни из одного источника информации предшествующего уровня техники: нельзя было предсказать, что один из способов инактивации вируса (азиридин) приведет к получению значительно более эффективных антигенов PRV, чем при использовании других способов (формальдегид, УФ-свет). Напротив, инкубация с азиридином часто противопоказана в предшествующем уровне техники из-за вызываемого им ухудшения иммуногенности белка.
Точно неизвестно, как и почему PRV, инактивированный азиридином, более эффективно индуцирует защитный иммунный ответ против инфекции PRV у лососевых рыб по сравнению с PRV, обработанным альтернативными способами инактивации вируса.
Не ограничиваясь какой-либо теорией или моделью, которые позволили бы объяснить эти открытия, авторы изобретения выдвинули предположение, что полученный благоприятный результат может быть вызван комбинированными эффектами инкубации с азиридином: алкилированием нуклеиновых кислот, и некоторым уровнем алкилирования одного или более вирусных белков. Так или иначе, это позволяет создавать, разрабатывать или выявлять антигены, которые могут вызвать более сильную или более эффективную активацию иммунного ответа у рыб против вызываемых PRV инфекции и заболевания.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к композиции, содержащей инактивированный ортореовирус, отличающейся тем, что ортореовирус инактивирован путем инкубации с азиридином.
В одном из вариантов осуществления композиции, содержащей инактивированный ортореовирус по изобретению, ортореовирус представляет собой рыбий ортореовирус (PRV).
«Композицию» по изобретению обычно получают из жидкости на водной основе, такой как вода, буфер или культуральная среда. Композиция обычно состоит из фармацевтически приемлемых ингредиентов и имеет физиологический состав. Композиция может содержать дополнительные вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы и консерванты.
Определение композиции охватывает как жидкие, так и твердые формы композиции по изобретению; примерами твердой формы являются случаи замороженной или лиофилизированной композиции.
Термин «содержащий» (а также такие варианты, как «содержать», «содержит» и «содержащийся»), используемый в настоящем описании, относится ко всем элементам и в любой возможной комбинации, допустимой для изобретения, которые охвачены или включены в раздел, абзац описания, пункт формулы изобретения и т.д., в которых используется этот термин, даже если такие элементы или комбинации не указаны в явном виде; и не относится к исключению любого из таких элементов или комбинаций. Следовательно, любой такой раздел, абзац описания, пункт формулы изобретения и т.д. также может относиться к одному или более вариантам осуществления, в которых термин «содержит» (или его варианты) заменен такими терминами, как «состоит из», «состоящий из» или «в основном состоящий из».
Композиция по изобретению может содержать PRV различного происхождения и полученного различными способами: PRV может быть продуцирован in vitro, например, в системе культивирования клеток, и композиция может представлять собой всю культуру или ее часть, такую как супернатант или осадок, или фильтрат, или ретентат.Альтернативно, PRV может быть продуцирован in vivo, например, в организме рыбы, которую содержат в некотором ограниченном объеме, и композиция может содержать содержащие PRV жидкости, клетки и/или ткани рыбы, такие как кровь, селезенка, головная почка или мышца; композиция может представлять собой препарат из таких клеток или тканей, такой как экстракт, гомогенизат, полученный в результате обработки ультразвуком, или лизат, или может представлять собой (полу)очищенный вариант такого препарата, например путем хроматографии, фильтрации или центрифугирования.
В контексте изобретения вирус считается «инактивированным», когда он больше не способен инфицировать и/или реплицироваться в клетках-хозяевах или в организме животного-мишени, при этом такие клетки-хозяева или организм животного-мишени как правило являются подходящими для размножения «живого» (т.е. неинактивированного) вируса.
Действительно ли PRV был инактивирован, можно легко определить с помощью обычных способов. Одним из способов является тестирование одной из опубликованных клеточных линий, подходящих для выращивания PRV в течение нескольких пассажей. Затем можно наблюдать признаки инфекции по наличию цитопатогенного действия путем микроскопического исследовании или по обнаружению репликации вируса, например, с помощью ОТ-кПЦР (количественной ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени), ELISA, иммунофлуоресценции или проточной цитометрии.
В качестве альтернативы такой тест для контроля инактивации может быть выполнен in vivo путем инокуляции лососевым рыбам, включая соответствующие положительные и отрицательные контроли, и обнаружения любой инфекции PRV с помощью гистопатологического скрининга через 2-8 недель после инокуляции и/или с помощью ОТ-кПЦР или путем иммуноокрашивания через 2 недели после инокуляции (p.i.).
«Рыбий ортореовирус» относится к вирусам из таксономического рода Orthoreovirus семейства Reoviridae. Такой вирус имеет характерные черты своей таксономической группы, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также биологические характеристики, такие как физиологическое, иммунологическое или патологическое поведение. Известно несколько подтипов PRV, которые могут поражать различные виды костных рыб, особенно лососевых. Описание характеристик и эффектов PRV в аквакультуре можно найти у Wessel et al., 2019 (см. выше) и Kibenge, 2019 (Current Opinion in Virology, vol. 34, p. 97-103). Kibenge также предлагает изменить классификацию PRV на два генотипа и 4 субгенотипа.
Как известно в данной области, отнесение микроорганизма к конкретной таксономической группе основано на комбинации его признаков. Таким образом, изобретение также включает варианты видов PRV, которые каким-либо образом подразделены, например, на подвиды, штаммы, изоляты, генотипы, варианты, подтипы или подгруппы и т.п.
Кроме того, специалисту в области, к которой относится изобретение, очевидно, что, хотя конкретный PRV, использованный в изобретении, в настоящее время может быть отнесен к этому виду, однако это является таксономической классификацией, которая со временем может подвергаться изменениям по мере появления новых фактов, которые могут привести к пересмотру классификации с образованием новой или другой таксономической группы. Однако, поскольку это изменение не затрагивает сам вирус или его антигенный репертуар, а касается только его научного названия или классификации, такие повторно классифицированные вирусы входят в объем настоящего изобретения.
Образцы PRV для использования в изобретении могут быть получены из различных источников, например в виде полевого изолята, выделенного из организма рыбы, обитающей в дикой природе или аквакультуре, или из различных лабораторий, (депозитарных) учреждений или (ветеринарных) университетов. Кроме того, большая часть генетической информации о PRV доступна в цифровом виде в общедоступных базах данных последовательностей, таких как GenBank NCBI и EBI EMBL.
В контексте настоящего изобретения «лососевые» представляют собой костистых рыб семейства лососевых. В это семейство входят такие рыбы, как лосось, форель, голец, пресноводный сиг и хариус; например: из рода Salmo: атлантический лосось (Salmo salar L.), адриатическая форель (Salmo obtusirostris), плоскоголовая форель (Salmo platycephalus), мраморная форель (Salmo marmoratus), охридская форель (Salmo letnica), севанская форель (Salmo ischchan) и таймень (Salmo trutta); из рода Salvelinus: арктический голец (Salvelinus alpinus); и из рода Oncorhynchus: радужная форель (Oncorhynchus mykiss), кижуч (Oncorhynchus kisutch) и чавыча (Oncorhynchus tshawytscha).
«Азиридин» представляет собой органохимическое соединение, содержащее азиридиновое кольцо, и имеет структурную формулу (1):
Азиридиновое кольцо представляет собой трехчленный гетероцикл, состоящий из одной амино- и двух метиленовых групп. Кольцо очень реакционноспособно и может раскрыться в результате реакции одного из метиленов с нуклеофильной группой. Для белка такая реакция обычно приводит к алкилированию сульфгидрильной группы цистеина или тиоэфира аминокислоты метионина.
Боковая группа R1 в формуле (1) представляет собой Н или алкил, такой как алкенил, алкинил, алкарил, аралкил или циклоалкил.
Широко используемыми азиридинами для инактивации вирусов являются этиленимин (R1=H) и N-ацетилэтиленимин (R1=этанон).
NB: азиридины являются токсичными и мутагенными химическими веществами, которые необходимо хранить, работать с ними и утилизировать безопасным и соответствующим образом. Азиридины можно нейтрализовать инкубацией с тиосульфатом, например с тиосульфатом натрия (Na2S2O3).
Инактивация PRV путем «инкубации с азиридином» по изобретению относится к инкубации композиции, содержащей PRV, с азиридином в таких условиях и в течение времени, которые являются достаточными для инактивации PRV. Такую инкубацию можно проводить при самых разных условиях и параметрах, которые хорошо известны специалисту в области, к которой относится изобретение, и, при необходимости, могут быть легко оптимизированы и адаптированы обычными способами.
Был ли образец вируса «инактивирован путем инкубации с азиридином» в отличие от инактивации другим агентом или способом, можно определить стандартными способами и методами путем обнаружения специфических эффектов, вызванных инкубацией с азиридином, таких как перекрестное связывание и разрушение нуклеиновой кислоты, которое можно обнаружить с помощью гель-электрофореза и соответствующего окрашивания. Аналогично, алкилирование аминокислот можно обнаружить с помощью масс-спектрометрии или ВЭЖХ. Конечно, использование инкубации с азиридином в соответствии с настоящим изобретением также можно определить по высокой иммунологической активности образца PRV с неизвестной историей при сравнении с образцом PRV с аналогичной антигенной массой, который не был инкубирован с азиридином.
Более подробно варианты осуществления и дополнительные аспекты изобретения описаны ниже.
Как указывалось выше, PRV существует в разных вариантах, которые изначально были названы подтипами 1, 2 и 3. Недавно Kibenge (2019, см. выше) предложил другое название и деление на генотипы I и II, а также подгенотипы Ia, Ib, IIa и IIb. PRV подтипа 1 и генотипа I в основном обнаруживают у атлантического лосося, а PRV подтипов 2 и 3 и генотипа II - у кижуча и различных видов форели.
Настоящее изобретение, раскрытое в настоящем описании, одинаково эффективно при использовании любого типа, подтипа или варианта PRV. Следовательно, в варианте осуществления композиции по изобретению PRV представляет собой один или более PRV, выбранных из подтипов PRV-1, PRV-2 и PRV-3.
Предпочтительно PRV относится к подтипу PRV-1.
Альтернативно, при использовании новой классификации PRV: в варианте осуществления композиции по изобретению PRV представляет собой один или более PRV, выбранных из генотипа I и генотипа II.
Предпочтительно PRV относится к генотипу I.
В варианте осуществления композиции по изобретению азиридин представляет собой одно или более азиридиновых соединений, выбранных из: этиленимина, 2-этилэтиленимина, 1-ацетилэтиленимина, 2-метилэтиленимина, 1-этиленимин-этанола и 2-изобутил-этиленимина. Более предпочтительно, азиридин представляет собой этиленимин.
В предпочтительном варианте осуществления азиридина применяется одно или более условий, выбранных из:
- этиленимин предпочтительно имеет номер CAS 151-56-4,
- 2-этилэтиленимин предпочтительно имеет номер CAS 2549-67-9,
- 1-ацетилэтиленимин предпочтительно имеет номер CAS 460-07-1,
- 2-метилэтиленимин предпочтительно имеет номер CAS 75-55-8,
- 1-этиленимин-этанол предпочтительно имеет номер CAS 1072-52-2 и
- 2-изобутилэтиленимин предпочтительно имеет номер CAS 3647-37-8.
Получение композиции с PRV по изобретению и инактивацию PRV путем инкубации с азиридином можно выполнить, используя обычные способы и материалы, легко доступные специалисту в данной области техники.
Следовательно, еще один аспект изобретения относится к способу получения композиции, содержащей инактивированный азиридином PRV, включающему этапы:
а. получения композиции, содержащей PRV, и
b. инактивации PRV в указанной композиции путем инкубации с азиридином.
Как указано выше, существует множество способов «получения композиции, содержащей PRV». Они зависят от способа амплификации и сборки вируса и могут относиться, например, к амплификации вируса in vitro, например, в культуре клеток. В качестве альтернативы PRV можно амплифицировать in vivo, например, путем заражения рыб и сбора тканей и/или органов этих рыб. Этот собранный материал может быть частично или полностью очищен и может храниться в охлажденном или замороженном виде до дальнейшего использования в способе получения по изобретению.
После получения PRV следующим этапом способа получения по изобретению является инактивация PRV в полученной композиции, содержащей PRV, в частности, путем инкубации с азиридином. Эту инкубацию с азиридином можно выполнять в самых разных условиях и с разными параметрами, которые хорошо известны специалисту в области, к которой относится изобретение, и которые, при необходимости, могут быть легко оптимизированы и адаптированы обычными способами.
Например, указанную инкубацию можно осуществлять в широком диапазоне температур.
В варианте осуществления способа получения по изобретению инкубацию с азиридином выполняют при температуре выше нуля градусов Цельсия.
Более предпочтительной является температура от 1 до 55°С, от 5 до 50°С, от 10 до 40°С или даже от 15 до 40°С в порядке предпочтительности.
Аналогичным образом, в способе получения по изобретению инкубацию с азиридином можно осуществлять в широком диапазоне значений рН.
В варианте осуществления способа получения по изобретению инкубацию с азиридином осуществляют при рН 4 или выше.
Более предпочтительно инкубацию с азиридином осуществляют при рН выше 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7 или даже при рН выше 7,5 в порядке предпочтения.
Верхний предел значения рН для инкубации с азиридином в способе получения по изобретению легко определить относительно других параметров инкубации.
Предпочтительно инкубацию с азиридином осуществляют при рН ниже 12, ниже 10 или даже ниже 9 в порядке предпочтения.
Как известно специалисту в данной области техники, поскольку во время инактивации азиридин расходуется в ходе реакции алкилирования, его концентрацию можно с уверенностью указать только в начале инкубации.
Следовательно, в варианте осуществления способа получения по изобретению концентрация азиридина в начале инкубации составляет по меньшей мере 0,1 миллимоля.
Более предпочтительно концентрация азиридина в начале инкубации составляет по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, 30, 40 или даже по меньшей мере 50 миллимолей в указанном порядке предпочтения.
Верхний предел концентрации азиридина в начале инкубации можно легко определить. Предпочтительно концентрация азиридина в начале инкубации ниже 1 моля, ниже 0,5 моля или даже ниже 0,1 моля, в порядке предпочтения.
В варианте осуществления способа получения по изобретению продолжительность инкубации композиции, содержащей PRV, с азиридином составляет по меньшей мере 10 минут.
Более предпочтительно продолжительность инкубации содержащей PRV композиции с азиридином составляет по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60 минут, 90 минут, 2 часа, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 24 или 36 часов или даже всю ночь (т.е. от 12 до 18 часов) в порядке предпочтения.
В варианте осуществления способа получения по изобретению способ включает дополнительный этап, который выполняют после инкубации с азиридином, причем этот дополнительный этап предусматривает нейтрализацию любого азиридина, оставшегося после реакции инкубации.
В предпочтительном варианте осуществления этап нейтрализации осуществляют путем добавления к смеси для инкубации после реакции инкубации соответствующего количества тиосульфата и инкубации в течение соответствующего периода времени для завершения нейтрализации. Например, нейтрализацию осуществляют путем добавления от 10 до 100 мМ тиосульфата натрия и инкубации в течение от 15 до 90 минут при температуре от 15 до 30°C.
Поскольку азиридин является опасным химическим веществом, его предпочтительно используют в способе получения по изобретению в разбавленном виде.
Когда азиридин представляет собой этиленимин, его обычно получают, используя так называемый «бинарный этиленимин» (BEI). BEI представляет собой продукт реакции циклизации бромэтиламин гидробромида (BEA) в щелочных условиях и при умеренном нагревании, т.е. примерно до 37°С. Щелочные условия обычно получают путем добавления, например, гидроксида натрия. Все это хорошо известно в данной области, см., например, Bahnemann, 1990 (см. выше).
Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способа получения по изобретению азиридин представляет собой этиленимин или бинарный этиленимин.
В варианте осуществления способа получения по изобретению способ включает дополнительный этап, который выполняют перед инкубацией с азиридином и на котором получают BEI. Предпочтительно BEI получают в результате реакции BEA с гидроксидом.
Затем соответствующее количество полученного BEI используют в качестве азиридина для инкубации с композицией, содержащей PRV.
В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей инактивированный азиридином PRV, отличающейся тем, что указанная композиция может быть получена способом по изобретению для получения такой композиции.
Как указано выше, инактивированный азиридином PRV оказался значительно более эффективным иммуногеном против вызываемых PRV инфекции и заболевания по сравнению с PRV, инактивированным другим способом. Следовательно, инактивированный азиридином PRV идеально подходит для применения в качестве вакцины против инфекции и/или заболевания, вызванного инфекцией PRV.
Поэтому в другом аспекте изобретение относится к композиции по изобретению или к композиции, которую можно получить способом получения по изобретению для применения в вакцине, предназначенной для защиты рыб от вызываемой PRV инфекции или заболевания.
В другом аспекте изобретение относится к вакцине для защиты рыб от вызваемой PRV инфекции или заболевания, причем указанная вакцина содержит композицию по изобретению или композицию, полученную способом получения по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.
«Вызываемые PRV инфекция и заболевание» относится к заражению лососевых рыб PRV и хорошо известным последующим патологическим симптомам и последствиям, таким как, например, описано для HSMI, анемии, ISRT и EIBS.
«Защита» относится к снижению вирусной нагрузки или сокращению продолжительности репликации PRV при заражении вакцинированной рыбы. В свою очередь, это приводит к уменьшению количества, интенсивности или тяжести поражений, сопутствующих симптомов и клинических признаков заболевания, вызванного инфекцией PRV.
Результатом такой защиты является восстановление здоровья вакцинированных рыб, что, в свою очередь, приводит к повышению экономических показателей вакцинированных рыб. Это отражается в одном или более параметрах, таких как уменьшение падежа, улучшенный среднесуточный привес, улучшенная конверсия корма, снижение затрат на здравоохранение и т.д.
Одним из симптомов заболевания, вызванного инфекцией PRV, является образование меланиновых пятен в мышцах атлантического лосося. Эти черные пятна вызывают снижение качества филе и, таким образом, наносят значительный экономический ущерб (Bjørgen et al., 2015, Vet. Res., vol. 46, p. 89). Вакцина по изобретению позволяет уменьшить или даже предотвратить образование таких меланизированных пятен.
В дополнение к уменьшению симптомов заболевания защита касается снижения вероятности заражения PRV. Это происходит в результате уменьшения выделения в окружающую среду PRV вакцинированными рыбами после инфицирования, т.е. среду обитания других рыб или в пределах географического района. Следовательно, защита по изобретению также может привести к снижению распространения PRV.
Хорошо известно, что «вакцина» представляет собой композицию, содержащую иммуноген и фармацевтически приемлемый носитель. Иммуноген вызывает у вакцинированной мишени иммунологический ответ, который эффективен для защиты от заболевания или инфекции или ее последствий.
Рыбы, подлежащие охране в соответствии с изобретением, предпочтительно относятся к лососевым.
Следовательно, в вариантах осуществления композиции для применения в качестве вакцины по изобретению и вариантах осуществления вакцины по изобретению вакцина предназначена для лососевых рыб.
Более предпочтительно лососевых рыб выбирают из лосося, форели, гольца, пресноводного сига и хариуса; еще более предпочтительно лососевых рыб выбирают из лосося и форели; еще более предпочтительно лосося выбирают из атлантического лосося, стальноголового лосося, чавычи, кижуча, горбуши, кеты и нерки; и форель выбирают из радужной, ручьевой, озерной и коричневой форели; еще более предпочтительно, лососевые рыбы относятся к роду Salmo.
«Фармацевтически приемлемый носитель» облегчает производство, введение и/или хранение вакцины, не вызывая (тяжелых) побочных эффектов. Такой носитель может представлять собой водный раствор, например воду, буфер, физиологический раствор или культуральную среду.
Предпочтительным фармацевтически приемлемым носителем для вакцины по изобретению является буфер, такой как фосфатно-солевой буфер (PBS), или «буфер для разбавления вируса», например как описано James et al., 2016 (Sci. Rep.6, 36826; doi: 10.1038/srep36826), содержащий 150 мМ NaCl, 15 мМ MgCl2 и 10 мМ Трис при рН 8,2.
Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может содержать дополнительные добавки и вспомогательные вещества, такие как стабилизатор или консервант. Детали и примеры хорошо известны, например, описаны в таких справочниках, как: «Remington: the science and practice of pharmacy» (2000, Lippincott, USA, ISBN: 683306472) и «Veterinary vaccinology» (P. Pastoret et al., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
Кроме того, вакцина по изобретению может содержать адъювант. В случае инактивированных вирусных вакцин адъювант может усиливать иммунный ответ мишени против вирусного антигена.
Следовательно, в вариантах осуществления композиции для применения в качестве вакцины по изобретению и в вариантах осуществления вакцины по изобретению вакцина отличается тем, что она содержит адъювант.
«Адъювант» представляет собой хорошо известный ингредиент вакцины, который неспецифическим образом стимулирует иммунный ответ мишени. В данной области техники известно множество различных адъювантов. Примерами адъювантов являются: полный или неполный адъювант Фрейнда, витамин Е или альфа-токоферол, неионогенные блок-полимеры и полиамины, такие как сульфат декстрана, Carbopol™, пиран, сапонин, например Quil A™ или Q-vac™. Сапонин и компоненты вакцины могут быть объединены в ISCOM™. Кроме того, можно использовать пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин и тафтсин. Также можно использовать соли алюминия, такие как фосфат алюминия или гидроксид алюминия, которые доступны, например, в виде Alhydrogel™ (Brenntag Biosector), Rehydragel™ (Reheis) и Rehsorptar™ (Armour Pharmaceutical).
Часто используемым адъювантом является масло, например, минеральное масло, такое как светлое (белое) минеральное (парафиновое) масло; или неминеральное масло, такое как сквален; сквалан; растительные масла или их производные, т.е. этилолеат. Также можно успешно использовать комбинированные продукты, такие как ISA™ (Seppic) или DiluvacForte™ и Xsolve™ (оба - MSD Animal Health).
См. справочник по адъювантам, их применению и действию: «Vaccine adjuvants» (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana Press, NJ, ISBN: 0896037355).
Адъювант может быть объединен с композицией для применения по изобретению или может быть включен в вакцину по изобретению несколькими способами. Когда адъювант содержит масло, композиция по изобретению может быть предоставлена в водной форме и может быть приготовлена в виде эмульсии с маслом различными способами: в виде эмульсии вода-в-масле (В/М), масло-в-воде (М/В) или в виде двойной эмульсии В/М/В или М/В/М.
«Эмульсия» представляет собой смесь по меньшей мере двух несмешивающихся жидкостей, в результате чего одна диспергируется в другой. Обычно капли дисперсной фазы очень малы, в диапазоне микрометров или менее. Способы и оборудование для приготовления эмульсии любого масштаба хорошо известны в данной области техники. Для стабилизации эмульсии можно использовать один или более эмульгаторов.
«Эмульгатор» представляет собой молекулу с амфифильными свойствами, имеющую как гидрофобную, так и гидрофильную сторону. В данной области техники известно множество эмульгаторов с различными свойствами. Большинство из них являются коммерчески доступными и имеют разную степень чистоты. Обычными эмульгаторами для вакцин являются сорбитан моноолеат (Span® 80) и полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (полисорбат 80 или Tween® 80).
Особенно предпочтительными в качестве эмульгатора для вакцины, предназначенной для лососевых рыб, являются эмульгаторы, описанные в PCT/EP 2019/077851.
Обычными стабилизаторами эмульсии являются бензиловый спирт и триэтаноламин.
Хорошо известно, что для характеристики свойств (смесей) эмульгаторов используется число HLB (гидрофильно-липофильный баланс; Griffin 1949, J. Soc. Cosm. Chem., vol. 1, p. 311-326). Обычно эмульгатор или смесь эмульгаторов с числом HLB ниже 10 лучше подходит для эмульсий типа В/М, тогда как эмульгатор (смесь) с числом HLB от 10 до 16 лучше подходит для эмульсий М/В.
В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению, содержащей адъювант, адъювант представляет собой масло.
Более предпочтительно масло представляет собой минеральное масло. Еще более предпочтительным минеральным маслом является светлое (или белое) жидкое парафиновое масло, например: Drakeol® 6VR (Penreco), Marcol® 52 (Exxon Mobile) и Klearol® (Sonneborn).
В предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению содержит в качестве адъюванта масло и составлена в виде эмульсии вода-в-масле.
Когда композиция по изобретению находится в твердой форме, ее можно комбинировать с адъювантом, таким как масло, в виде суспензии, т.е. путем смешивания композиции по изобретению в лиофилизированной форме с масляным адъювантом.
В вакцине по изобретению инактивированный азиридином PRV содержится в количестве, которое является иммунологически эффективным. Определение количества, которое является «иммунологически эффективным» количеством PRV в вакцине по изобретению, находится в пределах компетенции обычного специалиста в данной области техники и может быть определено, например, путем мониторинга иммунологического ответа после вакцинации и контрольного заражения, например, путем мониторинга признаков заболевания у мишеней, клинических показателей или путем повторного выделения возбудителя и сравнения этих результатов с реакцией на контрольное заражение, наблюдаемой у ложно вакцинированных животных.
Количество инактивированного азиридином PRV, необходимое для включения в вакцину по изобретению, можно указывать различными способами, например, в виде вирусного титра PRV в композиции по изобретению до реакции инактивации. Титрование может быть выполнено, например, путем определения титра в организме рыбы или эритроцитах рыбы, или в клеточной линии и выражено в виде титра в ID50/мл.
Количественное определение PRV также может быть выполнено с помощью биохимических или молекулярно-биологических тестов. Например, с помощью гель-электрофореза и сравнения со стандартными образцами с известными количествами белка. Для количественного определения числа копий одного из генов PRV эффективным также является использование ОТ-кПЦР. Оно также включает сравнение значения Cq (количественной оценки цикла), полученного для образца PRV, со значением Cq, полученным в результате ПЦР на плазмиде, несущей выбранный ген, например, ген сигма 1. Поскольку точно известно, сколько плазмиды было добавлено в реакцию ПЦР и, соответственно, количество копий гена, это дает представление о количестве копий генома PRV на единицу объема.
Кроме того, количество антигена PRV может быть определено до или после реакции инактивации с помощью серологического или биохимического теста, такого как ELISA или AlphaLisa™, и выражено в относительных единицах по сравнению с соответствующим эталонным стандартом. Когда вакцина приготовлена в виде эмульсии, количество инактивированного азиридином PRV может быть проанализировано в готовой эмульсии вакцины с помощью стандартных биохимических лабораторных процедур, например, путем разрушения эмульсии и тестирования водной фазы с помощью SDS-PAGE, ELISA, HPLC или масс-спектрометрии, хорошо известные в данной области техники. Затем определяют количество путем сравнения с известными количествами в эталонном образце белка или вируса. См., например: The Protein Protocols Handbook, 2-nd edition, September 2002, ed. J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Chapter 29, p.237-242.
Вакцину по изобретению можно использовать в качестве профилактического, метафилактического или терапевтического лечения.
Вакцину по изобретению можно использовать для эффективной примирующей вакцинации, за которой впоследствии может следовать повторная вакцинация той же или другой вакциной и которая может быть усилена такой вакцинацией.
Предпочтительным может быть создание дополнительных комбинаций вакцины по настоящему изобретению с дополнительными иммуноактивными компонентами. Такое комбинирование можно использовать для усиления уже имеющейся иммунной защиты или для распространения ее на другие патогены.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления вакцина по изобретению содержит по меньшей мере один дополнительный иммуноактивный компонент.
Такой «дополнительный иммуноактивный компонент» может представлять собой антиген, иммуностимулирующее вещество, адъювант или иммуномодулятор, такой как цитокин или иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая неметилированный CpG, вакцину или любую их комбинацию. Это обеспечивает преимущества с точки зрения стоимости, эффективности и целевого благополучия. Альтернативно, вакцина по изобретению сама может быть добавлена в другую вакцину.
В предпочтительном варианте осуществления дополнительный антиген представляет собой еще один патоген лососевых рыб или получен из такого дополнительного патогена; более предпочтительно дополнительный патоген выбирают из бактерий, вирусов, водорослей, грибов и эндо- или эктопаразитов.
Предпочтительно бактериальный патоген представляет собой один или более патогенов, выбранных из Aeromonas salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum и Moritella viscosa.
Предпочтительно дополнительный вирусный патоген представляет собой один или более вирусов, выбранных из вируса болезни поджелудочной железы лосося (SPDV), вируса инфекционного панкреонекроза (IPNV), вируса сонной болезни (SDV), вируса геморрагической септицемии (VHSV), вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV), вируса инфекционной анемии лососевых (ISA) и вируса инфекционного панкреонекроза (IPNV).
Предпочтительно паразитический патоген представляет собой эктопаразита, предпочтительно, из таксономического семейства Caligidae; более предпочтительно из рода Lepeophtheirus или Caligus.
В варианте осуществления вакцины по изобретению дополнительная вакцина представляет собой комбинированную вакцину для лососевых рыб, содержащую несколько вирусных и/или бактериальных антигенов. Предпочтительно дополнительную комбинированную вакцину для лососевых рыб выбирают из Forte® VII (Aqua Health, Novartis), ALPHA JECT® micro 6 (Pharmaq), Aquavac® PD3 или Aquavac® PD7 (MSD Animal Health) и BLUEGUARD® IPN+SRS+As+Vo+ISA от Centrovet (Virbac).
В одном из вариантов осуществления вакцины по изобретению применяют одно или более условий, выбранных из группы, состоящей из следующего:
- вакцина предназначена для лососевых рыб; более предпочтительно лососевых рыб выбирают из лосося, форели, гольца, пресноводного сига и хариуса; еще более предпочтительно лососевых рыб выбирают из лосося и форели; еще более предпочтительно лосося выбирают из атлантического лосося, стальноголового лосося, чавычи, кижуча, горбуши, кеты и нерки; и форель выбирают из радужной, ручьевой, озерной и коричневой форели; еще более предпочтительно, лососевые рыбы принадлежат роду Salmo;
- фармацевтически приемлемый носитель для вакцины по изобретению представляет собой фосфатно-солевой буфер (PBS) или буфер для разбавления вируса;
- вакцина содержит адъювант; предпочтительно адъювант представляет собой масло; более предпочтительно масло представляет собой минеральное масло; еще более предпочтительно минеральное масло представляет собой легкое жидкое парафиновое масло;
- вакцина по изобретению содержит масло в качестве адъюванта и составлена в виде эмульсии вода-в-масле;
- вакцина содержит по меньшей мере один дополнительный иммуноактивный компонент; предпочтительно дополнительный антиген представляет собой еще один патоген лососевых или происходит от такого дополнительного патогена лососевых; более предпочтительно дополнительный патоген лососевых выбирают из бактерий, вирусов, водорослей, грибов и эндо- или эктопаразитов;
- бактериальный патоген лососевых представляет собой один или более выбранных из Aeromonas salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum и Moritella viscosa;
- дополнительный вирусный патоген лососевых представляет собой один или более вирусов, выбранных из вируса болезни поджелудочной железы лосося (SPDV) и вируса инфекционного панкреонекроза (IPNV);
- паразитический возбудитель лососевых является эктопаразитом, предпочтительно, из таксономического семейства Caligidae; более предпочтительно из рода Lepeophtheirus или Caligus; и
- дополнительная вакцина представляет собой комбинированную вакцину для лососевых, включающую несколько вирусных и/или бактериальных антигенов; предпочтительно дополнительную комбинированную вакцину для лососевых выбирают из Forte® VII (Aqua Health, Novartis), ALPHA JECT® micro 6 (Pharmaq), Aquavac® PD3 или Aquavac® PD7 (MSD Animal Health) и BLUEGUARD® IPN+SRS+As+Vo+ISA от Centrovet (Virbac).
В варианте осуществления вакцины по изобретению вакцина предназначена для лосося или форели и составлена в виде эмульсии с адъювантом на основе минерального масла, которое представляет собой легкое жидкое парафиновое масло.
Для индукции защитного иммунологического эффекта композицию для применения по изобретению и вакцину по изобретению необходимо ввести рыбе.
Следовательно, в следующем аспекте изобретение относится к способу защиты рыбы от вызываемой PRV инфекции или заболевания, который включает введение указанной рыбе вакцины по изобретению.
«Введение» рыбе вакцины по изобретению может быть осуществлено любым возможным способом и путем. Как правило, оптимальный способ введения будет определяться типом применяемой вакцины, а также характеристиками рыбы и болезни, вызываемой патогеном, против которого она предназначена. В зависимости от состава вакцины по изобретению могут применяться разные способы ее введения. Например, вакцину по изобретению в форме эмульсии М/В можно вводить, например, энтеральным путем или через слизистую оболочку, т.е. путем погружения. Другой возможностью является метод массового введения, например, с кормом.
Альтернативно, вакцину по изобретению в форме эмульсии В/М предпочтительно вводить парентеральным путем.
В варианте осуществления способа защиты рыбы по изобретению введение осуществляют парентеральным путем.
«Парентеральное» относится к введению через кожу, например, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным, подслизистым или подкожным путем.
Предпочтительным парентеральным путем является внутрибрюшинная инъекция.
Очевидно, что оптимальный путь введения вакцины по изобретению будет зависеть от специфики используемой вакцины и от конкретных характеристик рыб. Специалист в данной области техники вполне способен выбрать и, при необходимости, оптимизировать такой путь и способ введения.
Объем дозы вакцины по изобретению, например, при парентеральном введении представляет собой объем, приемлемый для рыбы-мишени, и может, например, составлять от примерно 0,001 до примерно 5 мл. Предпочтительно одна доза представляет собой объем от 0,005 до 3 мл, от 0,01 до 1 мл или даже от 0,025 до 0,5 мл в указанном порядке предпочтения.
В контексте изобретения термин «примерно» означает ± 25% от указанного значения, предпочтительно «примерно» означает ± 20, 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% от указанного значения или даже «примерно» означает ± 1% от указанного значения в указанном порядке предпочтения.
Мишенью для вакцины по изобретению являются лососевые рыбы, нуждающиеся в вакцинации от вызываемой PRV инфекции или заболевания. Возраст, вес, пол, иммунологический статус и другие параметры рыб-мишеней, подлежащих вакцинации, не являются критическими, хотя очевидно, что благоприятнее вакцинировать здоровых, неинфицированных рыб, и как можно раньше.
Способ, сроки и объем введения вакцины по изобретению могут быть адаптированы и оптимизированы для конкретного типа рыб, подлежащих вакцинации; включая также время и стадию, когда рыба может быть подвержена воздействию патогена.
Для способа защиты рыбы по изобретению и в случае, когда рыба представляет собой атлантического лосося, введение предпочтительно осуществляют на стадии смолта незадолго до переноса в соленую воду.
Введение вакцины по изобретению предпочтительно интегрируют в существующие схемы вакцинации другими вакцинами, которые могут потребоваться рыбе-мишени для снижения стресса у рыбы и снижения трудозатрат. Эти другие вакцины можно вводить одновременно, параллельно или последовательно в соответствии с их лицензированным использованием.
Существуют многочисленные возможности для изготовления вакцины по изобретению.
Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к применению композиции по изобретению или композиции, полученной способом получения по изобретению, для изготовления вакцины для защиты рыб от вызываемой PRV инфекции или заболевания.
Кроме того, в еще одном аспекте изобретение относится к способу изготовления вакцины для защиты рыб от вызываемой PRV инфекции или заболевания, который включает этап приготовления в виде вакцины композиции по изобретению или композиции, получаемой способом приготовления по изобретению.
Составление композиции, содержащей инактивированный азиридином PRV, в виде вакцины можно осуществить с помощью хорошо известных способов и оборудования. Обычно это относится к составлению смеси с дополнительными вспомогательными веществами, такими как фармацевтически приемлемый носитель, как указано в настоящем описании, и необязательно стабилизаторы, консерванты и/или адъюванты. Консерванты представляют собой, например, тиомерсал, феноксиэтанол, формалин или антибиотики (например, гентамицин). Стабилизаторы представляют собой, например декстран, глицерин, желатин, аминокислоты или буферы.
Составление смеси с адъювантом может включать простое смешивание водных композиций, например, когда адъювант представляет собой соль алюминия. Альтернативно, когда адъювант представляет собой масляную фазу, вакцина может быть приготовлена в виде эмульсии с масляным адъювантом. Эмульсионная вакцина может быть приготовлена с помощью целого ряда оборудования, предназначенного для эмульгирования, которое доступно для работы при требуемой низкой, средней или высокой величине сдвига, например, с помощью роторно-статорных смесителей, например, смесителя Silverson® (турбинный); блендера Ultra Turrax®; коллоидной мельницы; IKA MagicLab, модуля UTL или реактора Dispax; Heidolph Silent Crusher M; и т.д. Вариантом высокоскоростного перемешивания является реактор SpinPro™ (Flowid, Eindhoven, Нидерланды), представляющий собой реактор с вращающимся диском. Оборудование для гомогенизации под высоким давлением включает процессор Microfluidizer™, гомогенизатор высокого давления Avetin, мини-лабораторию Rannie или гомогенизатор Gaulin.
Общие методы и положения, применимые к производству вакцин в соответствии с общеизвестными стандартами фармацевтического производства, описаны, например, в правительственных директивах и постановлениях (Фармакопея, 9CFR) и в известных справочниках («Veterinary vaccinology» и «Remingtin», см. оба выше). Обычно такие вакцины готовят стерильными с использованием наполнителей фармацевтического класса качества.
Такие препараты могут включать микробиологические тесты на стерильность и отсутствие посторонних агентов; и могут включать исследования in vivo или in vitro для подтверждения эффективности и безопасности. После завершения тестов по определению качества, количества, стерильности, безопасности и эффективности вакцина может быть утверждена для продажи. Все это хорошо известно специалисту в данной области техники.
Далее изобретение описано с помощью приведенных ниже неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1: Материалы и методы
1.1. Амплификация PRV
150 интактных особей атлантического лосося перед смолтом инокулировали для амплификации вируса in vivo для получения антигена и исследования методом контрольного заражения. Инокулят представлял собой изолят норвежского штамма PRV, V3279, который, в свою очередь, получали путем обработки ультразвуком цельной крови инфицированного атлантического лосося. Инокулят в количестве 0,1 мл на рыбу вводили внутрибрюшинно. Инокулят готовили в день заражения, разбавляли 1:10 в EMEM и хранили на льду до инокуляции. Затем пресмолты содержали в пресной воде в течение 2 недель при температуре 12°C.
После этого кровь, полученную из рыб, инокулированных 150 PRV, собирали одноразовыми шприцами и объединяли в покрытых гепарином 2 мл Vacutainers™ (2-4 рыбы на пробирку). После гепаринизации кровь объединяли в 50 мл центрифужных пробирках и центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут при 4°C. Плазму крови (примерно 26 мл) удаляли, и осадок эритроцитов ресуспендировали в 5-кратном объеме (125 мл) среды L 15 (Sigma) и 50 мкг/мл гентамицина.
1.2. Выделение и очистка антигена PRV
Затем осажденные инфицированные эритроциты обрабатывали ультразвуком на льду для лизиса клеток и высвобождения PRV. Используемое оборудование представляло собой цифровой ультразвуковой аппарат модели SPLe (Branson) с 50 мл центрифужными пробирками, при этом для ультразвуковой обработки использовали примерно 25 мл образца на обработку. Образцы обрабатывали 8 импульсами по 10 секунд с частотой 25 кГц с 30-секундными паузами между импульсами. Затем обработанные ультразвуком препараты центрифугировали при 2000 g в течение 5 минут при 4°C для осаждения клеточного дебриса, а надосадочную жидкость, содержащую PRV, собирали и хранили при 4°C до использования.
После этого, обработанный ультразвуком раствор очищали, как описано James et al., 2016 (см. выше), для удаления примесей путем экстракции на смоле. Вкратце, смолу Capto™ Core 700 (GE Healthcare) трижды промывали буфером для разбавления вируса (150 мМ NaCl, 15 мМ MgCl2, 10 мМ Трис, рН 8,2). После окончательной промывки на гранулы наносили равный объем буфера для разбавления вируса с получением суспензии Capto Core. Для выделения PRV из обработанных ультразвуком эритроцитов атлантического лосося готовили смесь, состоящую из 20% суспензии Capto Core и 80% лизированных эритроцитов атлантического лосося, которую инкубировали, перевернув пробирки вверх дном, в течение 45 минут при 4°C. Затем гранулы смолы осаждали центрифугированием при 800 g в течение 10 минут при 4°C, а надосадочную жидкость переносили в свежую пробирку. После этой первой экстракции с помощью Capto Core этот же материал обрабатывали еще 4 раза тем же способом. Выбор 5 циклов очистки в целом представлял собой баланс между потерей вируса и удалением примесей, таких как цитокины и гемоглобин, которые могут мешать вакцинации.
Присутствие PRV подтверждали с помощью ОТ-кПЦР, и чистоту образца подтверждали с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром.
Супернатанты после всех циклов очистки объединяли, в результате чего получали комбинированную композицию, содержащую PRV, в которой значение Cq составляло 23,23, и количество копий гена Sigma1 определяли, равным 1,13×105/мкл.
1.3. Инактивация BEI
BEI готовили путем объединения равных объемов 1,09 М ВЕА и 1,91 М NaOH. Это давало исходный раствор 545 мМ BEI.
Очищенный раствор обработанных ультразвуком эритроцитов, содержащий PRV в буфере для разбавления вируса (см. выше), обрабатывали 10 мМ BEI при 20°C в течение 28 часов на магнитной мешалке. После инкубации любое остаточное количество BEI нейтрализовали 15 мМ Na-тиосульфатом при 20°C в течение 1 часа на магнитной мешалке. Наконец, рН доводили до 7,6 с помощью 4 н. соляной кислоты.
1.4. УФ-инактивация
УФ-инактивацию выполняли на стандартном оборудовании. Вкратце, в общей сложности 40,5 мл PRV в буфере для разбавления вируса (очищенный раствор обработанных ультразвуком эритроцитов) переносили в резервуар с реагентом вместе с 4,5 мл 500 мкМ рибофлавина (витамина B2) в 0,9% NaCl. С помощью 50 мл шприца всю смесь переносили в пакет ELP для R&D производства Terumo™ BCT для УФ-инактивации, и весь оставшийся воздух удаляли с помощью того же шприца. Раствор инактивировали с помощью системы Mirasol® PRT (Terumo BCT), используя программный метод №: 150. После завершения анализа пакет ELP прокалывали иглой 21G для аспирации образца PRV, инактивированного УФ-излучением. Образец переносили в 100 мл стеклянную бутыль и хранили при 4°С до использования.
1.5. Количественная ПЦР
Нуклеиновую кислоту выделяли из очищенных образцов PRV следующим образом: 50 мкл очищенного Capto Core лизата эритроцитов добавляли к 150 мкл буфера для разбавления вируса. Затем добавляли 250 мкл лизирующего буфера из набора MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit™ (Roche). Суммарные нуклеиновые кислоты выделяли с помощью аппарата MagNA Pure™ 96 (Roche), программы «внешнего лизиса» и набора MagNA Pure™ 96 DNA and Viral NA Small Volume™ (Roche).
Кроме того, процесс выделения MagNA Pure включал один образец с PBS в качестве отрицательного контроля. Готовили мастер-микс для одноэтапной ОТ-кПЦР с 17 мкл воды для инъекций; 1 мкл смеси Superscript™ III RT/Platinum Taq (Invitrogen); 25 мкл реакционной смеси 2x SYBR™ Green (Invitrogen); 2 мкл смеси праймеров; и 5 мкл тестового образца. Смесь праймеров состояла из 10 мкМ праймеров FWD S1 и 10 мкМ REV S1:
FWD S1 (SEQ ID NO: 1): 5’-TGCGTCCTGCGTATGGCACC-3’,
REV S1 (SEQ ID NO: 2): 5’-GGCTGGCATGCCCGAATAGCA-3’.
Циклирование ОТ-кПЦР и измерение выполняли с помощью термоциклера CFX96 Real-Time System C1000™ (Bio-Rad). В каждый цикл ОТ-кПЦР включали стандарт, состоящий из ДНК-матрицы гена PRV S1, в 10-кратных разведениях от 4,37×106 до 4,37×101 копий/мкл.
Протокол ОТ-кПЦР начинали с 55,0°C в течение 3 минут для образования кДНК; повышали до 95,0°C в течение 3 минут для инактивации фермента ОТ. Это было началом цикла кПЦР с денатурацией при 92,0°C в течение 5 секунд, отжигом и удлинением при 58,0°C в течение 5 секунд и измерением SYBR green при 77°C в течение 1 секунды. Этот цикл повторяли еще 39 раз. После завершения программы строили кривую плавления, начиная с 73,0°С и выше до 89,5°С с шагом 0,3°С через каждые 5 секунд. Во время этой процедуры измерение SYBR green выполняли каждые 5 секунд. Определяли значения Cq, и количество копий вычисляли с помощью менеджера CFX (BioRad).
1.6. Состав вакцины
Тестируемые вакцины готовили с помощью стандартных процедур в виде эмульсий вода-в-масле с легким жидким парафиновым маслом в качестве адъюванта, которая содержала полисорбат 80 и моноолеат сорбитана в качестве эмульгатора. Объемное соотношение вода:масло в вакцине составляло 40:60. Водные фазы составляли 95% инактивированных образцов PRV. Вакцину отрицательного контроля готовили, используя образец физиологического раствора.
Пример 2: Тест на инактивацию вируса
Эффективность инактивации двумя используемыми способами (облучение УФ-светом и инкубация с азиридином) проверяли in vivo на образцах из одной и той же партии PRV, который не был инактивирован, а также на образце положительного контроля PRV.
Каждый образец испытывали в группе из 10 предсмолтов атлантического лосося, производимого Stofnfiskur. Рыбу акклиматизировали в течение 1 недели в пресной воде при температуре 12°C. Содержание кислорода в воде составляло от 65 до 100%. Затем рыбу анестезировали и внутрибрюшинно инокулировали 0,1 мл из одной из трех проб. Всех рыб в группе метили путем обрезания плавника. До инокуляции все образцы хранили на льду.
Через 3 дня после инокуляции из всех групп отбирали по 5 животных; получали образцы плазмы, и ОТ-кПЦР этих образцов служила исходным уровнем для ОТ-кПЦР образцов плазмы, взятых через 14 дней после инокуляции.
2.1. Полученные результаты
Амплификация PRV не была обнаружена ни в одном из образцов рыб, инокулированных BEI-инактивированным или УФ-инактивированным вирусом ни при 3, ни при 14 dpi. Все образцы с необработанным PRV и большинство образцов из группы положительного контроля дали положительный результат на PRV при 14 dpi.
Был сделан вывод, что оба метода инактивации обеспечивают полную инактивацию PRV.
Пример 3: Исследование методом контрольного заражения
Использовали молодь атлантического лосося, производимого Stofnfiskur, весом 25-35 граммов. Популяцию проверяли на наличие большинства патогенов, обычно наблюдаемых у лосося, вирусных и бактериальных, включая PRV, с помощью ОТ-кПЦР. Для заражения использовали только рыбу с отрицательным результатом, которая, судя по внешнему виду, была интактной и здоровой. Во время акклиматизации и иммунизации рыб содержали в пресной воде, и во время контрольного заражения - в морской воде (соленость 32 промилле, 70% кислорода). В обоих случаях вода имела температуру 12°С. Средний исходный вес рыбы определяли в начале акклиматизации.
Тестовые группы содержали по 26 рыб, и невакцинированная контрольная группа включала 32 рыбы. Также 10 рыб использовали в качестве контроля дня 0. При контрольном заражении через 6 недель после вакцинации к общему количеству рыб, использованных в эксперименте, добавляли инфицированных рыб, распространителей вируса, в соотношении 1:5.
Рыб метили транспондерной меткой за 2 недели до эксперимента, и их акклиматизацию осуществляли в тестовом аквариуме за 5 дней до эксперимента. Перед вакцинацией рыбы голодали в течение 48 часов, получали седативное средство и анестезию бензокаином и изоэвгенолом. Вакцинацию осуществляли 0,1 мл внутрибрюшинной инъекцией. Заражение путем совместного проживания начинали через 6 недель после вакцинации и продолжали еще 14 недель.
Образцы крови брали через 4, 6 и 8 недель после заражения. Образцы тканей брали через 6 и 8 недель после заражения: образцы сердца хранили в 4% формалине. Кровь гепаринизировали и центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин при 4°С. Плазму и клетки хранили отдельно при -80°C до использования.
3.1. Гистопатологическая оценка
Срезы сердечной мышцы для гистопатологии обрабатывали и окрашивали гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными процедурами. Отдельные образцы исследовали на наличие поражений сердца в соответствии с HSMI. Степень изменений оценивали по шкале от 0 до 4 баллов с использованием критериев, описанных в таблице 1.
Оценка поражений сердца, связанных с HSMI - Эпикард
3.2. Статистический анализ
Результаты ОТ-кПЦР для PRV и гистопатологическую оценку анализировали статистически с использованием критерия сравнения Манна-Уитни. Весь описанный статистический анализ выполняли с помощью программы GraphPad™ Prism (GraphPad Software Inc., США), и значимыми считали значения p ≤0,05.
3.3. Результаты
Средняя масса рыбы на момент мечения составляла 30,8 грамма, при вакцинации - 32,9 грамма.
Таким образом, процент рыб со специфическим для HSMI поражением сердца, соответствующим 2 баллам или выше, через 8 недель после контрольного заражения составил в группе:
- физраствора: 92%;
- УФ-обработанного PRV: 67%;
- BEI-обработанного PRV: 0%.
Был сделан вывод, что эксперимент методом заражения прошел успешно, так как все невакцинированные рыбы имели заболевание с признаками тяжелого HSMI. Вакцина УФ-инактивированного PRV практически не обеспечивала никакой защиты. Напротив, вакцина BEI-инактивированного PRV давала превосходную защиту от инфицирования PRV без признаков HSMI.
Пример 4: результаты кПЦР в исследовании методом контрольного заражения
4.1. Количественное определение дозы вакцины
Очищенный пул PRV, из которого были приготовлены вакцины для оценки вакцинации при контрольном заражении, как описано выше в примере 3, тестировали на содержание антигена с помощью кПЦР, как описано выше в примере 1.5, и было показано, что количество копий гена Sigma1 составило 1,13×105/мкл.
Учитывая разбавление, которое произошло во время приготовления вакцины, получаем количество частиц PRV, использованных для вакцинации, равное 4,6×106 на дозу, вводимую животному.
Для тестирования образцов ткани сердца лосося, собранные во время исследования в примере 3, использовали дополнительный протокол кПЦР.
4.2. Дополнительный тест кПЦР
Нуклеиновую кислоту выделяли с помощью RNAlater™ из консервированных образцов-зондов сердца лосося следующим образом: 2×2×2 мм образца добавляли к 600 мкл буфера RLT, и суммарные нуклеиновые кислоты выделяли с помощью набора RNeasy® 96 Kit (Qiagen) вместе с TissueLyser™ II (Qiagen) для гомогенизации образца ткани.
Мастер-микс для одностадийной ОТ-кПЦР (Thermo Scientific Verso™ 1-Step Q-RT-PCR Kit low ROX) готовили с использованием 1,85 мкл воды, свободной от РНКазы; 0,25 мкл ферментной смеси Verso; 12,5 мкл смеси 2x 1-этапной кПЦР с низким содержанием ROX и 1,25 мкл RT Enhancer. Затем 15,85 мкл мастер-микса добавляли к 2,25 мкл прямого праймера FWD L1 и 2,25 мкл обратного праймера REV L1; 0,65 мкл зонда TaqMan; и 4 мкл тестового образца. Праймеры и зонд (использовали по 10 мкМ каждый) были следующими:
FWD L1: 5’-TGCTAACACTCCAGGAGTCATTG-3’ (SEQ ID NO: 3)
REV L1: 5’-TGA ATCCGCTGCAGATGAGTA-3’: (SEQ ID NO: 4)
Зонд TaqMan L1: 5’-6FAM-CGCCGGTAGCTCT-MGBNFQ-3’ (SEQ ID NO: 5)
Циклирование ОТ-кПЦР и измерение выполняли с помощью системы для обнаружения последовательностей ABI PRISM® 7500 FAST (Applied Biosystems).
Протокол ОТ-кПЦР начинали с 50,0°C в течение 30 минут для образования кДНК; повышали до 95,0°C в течение 15 минут для инактивации фермента ОТ. Это было началом цикла кПЦР с денатурацией при 95,0°C в течение 15 секунд, а также отжигом и удлинением при 60,0°C в течение 1 минуты. Этот цикл повторяли еще 39 раз. Значения Cq определяли с помощью программного обеспечения 7500 FAST™ System Software v1.5.1 (Applied Biosystem) с пороговым значением 0,1 и базовым уровнем от 3 до 15 циклов.
4.3. Результаты кПЦР для образца-зонда сердца
Для оценки эффективности вакцинации через 8 недель после заражения тестировали уменьшение вирусной нагрузки с помощью количественной ПЦР образцов-зондов желудочков сердца лосося. В группах 1 и 2 (имитационная вакцина и вакцина УФ-инактивированного PRV, соответственно) все образцы оказались положительными на PRV. Напротив, в группе 3 (вакцина BEI-инактивированного PRV) только 8 из 12 животных оказались положительными на PRV. Кроме того, количество вируса, обнаруженное в образцах группы 3, положительных на PRV, было существенно ниже по сравнению с количеством, обнаруженным в образцах групп 1 и 2: средние значения Cq в группах 1 и 2 составили 22,1 и 22,0, соответственно (n=12). Следует отметить, что в группе 3 среднее значение Cq составило 30,6 (n=8). Порог отрицательной оценки в этом эксперименте составил Cq=40.
4.4. Выводы
Защитная эффективность вакцины на основе BEI-инактивированного PRV оказалась на удивление хорошей: в результате вакцинации количество животных, имеющих PRV в крови после контрольного заражения, уменьшилось на 1/3. Кроме того, вирусная нагрузка у животных, вакцинированных BEI-PRV, была существенно снижена.
Такие показатели эффективности ранее не наблюдались и не описаны в литературе. Оба этих результата свидетельствуют о сильном снижении репликации PRV, что указывает на значительный клиренс вируса и/или устойчивость к инфекции.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>Intervet International BV
<120>ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ОРТОРЕОВИРУСА РЫБ
<130>24910
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Праймер ОТ-кПЦР: FWD S1
<400>1
tgcgtcctgc gtatggcacc 20
<210>2
<211>21
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Праймер ОТ-кПЦР: REV S1
<400>2
ggctggcatg cccgaatagc a 21
<210>3
<211>23
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Праймер ОТ-кПЦР: FWD L1
<400>3
tgctaacact ccaggagtca ttg 23
<210>4
<211>21
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Праймер ОТ-кПЦР: REV L1
<400>4
tgaatccgct gcagatgagt a 21
<210>5
<211>13
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>TaqMan зонд L1
<400>5
cgccggtagc tct 13
<---
Изобретение относится к вирусологии. Предложена композиция для применения в вакцине, содержащая ортореовирус, инактивированный путем инкубации с азиридином. Предложен способ получения композиции, содержащей инактивированный азиридином PRV. Способ включает стадии: а) получения композиции, содержащей PRV,
b) инактивации PRV в указанной композиции путем инкубации с азиридином и с) нейтрализации любого азиридина, оставшегося после реакции инкубации. Предложена вакцина для рыб от вызываемой PRV инфекции или заболевания, содержащая композицию и фармацевтически приемлемый носитель; способ защиты рыбы от вызываемой PRV инфекции или заболевания, включающий введение указанной рыбе вакцины; применение композиции для получения вакцины для защиты рыб от инфекции или заболевания, вызванного PRV; и способ получения вакцины для защиты рыб от вызываемой PRV инфекции или заболевания. Иммуногенность ортореовируса рыб (PRV) может быть значительно улучшена путем инактивации вируса инкубацией с азиридином. Эффективность вакцины против заражения при совместном проживании значительно повышается. Это позволило разработать эффективную инактивированную вакцину против вызываемых PRV инфекций и заболеваний. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.
1. Композиция для применения в вакцине, содержащая инактивированный ортореовирус, отличающаяся тем, что ортореовирус инактивирован путем инкубации с азиридином.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что ортореовирус представляет собой рыбий ортореовирус (PRV).
3. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что азиридин представляет собой этиленимин.
4. Способ получения композиции, содержащей инактивированный азиридином PRV, включающий стадии:
а) получения композиции, содержащей PRV,
b) инактивации PRV в указанной композиции путем инкубации с азиридином, и
с) нейтрализации любого азиридина, оставшегося после реакции инкубации.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что азиридин представляет собой этиленимин или бинарный этиленимин.
6. Вакцина для рыб от вызываемой PRV инфекции или заболевания, содержащая композицию по любому из пп. 1-3 или композицию, полученную способом по п. 4 или 5, и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Вакцина по п. 6, отличающаяся тем, что вакцина содержит адъювант.
8. Способ защиты рыбы от вызываемой PRV инфекции или заболевания, включающий введение указанной рыбе вакцины по п. 6 или 7.
9. Применение композиции по любому из пп. 1-3 или композиции, полученной способом по п. 4 или 5, для получения вакцины для защиты рыб от инфекции или заболевания, вызванного PRV.
10. Способ получения вакцины для защиты рыб от вызываемой PRV инфекции или заболевания, включающий стадию составления композиции по любому из пп. 1-3 или композиции, полученной способом по п. 4 или 5, в вакцину.
| Qystein Wessel et al | |||
| Inactivated Piscine orthoreovirus vaccine protects against heart and skeletal muscle inflammation in Atlantic salmon, J | |||
| of Fish Diseases, 2018, vol | |||
| Механический грохот | 1922 |
|
SU41A1 |
| Станок для получения тонких и узких полосок древесины (лапши), предназначенных для приготовления целлюлозы | 1925 |
|
SU1411A1 |
| WO 2018140766 (A2), 02.08.2018 | |||
| IRIS DELRUE et al | |||
| Inactivated virus vaccines from chemistry to prophylaxis: merits, risks and | |||
