СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ЭКСТРАКТА АЛЛЕРГЕНА Российский патент 2023 года по МПК A61K35/35 A61K35/36 A61K35/646 

Область техники

Изобретение относится к способам получения частично очищенных и очищенных экстрактов аллергенов, а также фармацевтических композиций и вакцин для применения в диагностике и лечении аллергии.

Уровень техники

Аллергия представляет собой патологию, связанную с приобретенной гиперчувствительностью иммунной системы, которая запускается при воздействии безвредных веществ, содержащихся в окружающей среде и известных как аллергены. Реакция гиперчувствительности I типа характеризуется аллергическими реакциями и приводит к выработке избыточных количеств IgE-антител, которые в свою очередь активируют базофилы и тучные клетки, вызывая воспалительную реакцию в организме. Проявления могут быть системными, такими как расширение кровеносных сосудов (вазолидация), секреция слизи, стимуляция нервов или сокращение гладких мышц, приводящее к анафилактической реакции, или ограниченными, т.е. относящимися к отдельным частям организма, например, к респираторной системе.

Phleum pratense

Аллергия на цветущие травы представляет собой одну из наиболее распространённых и преобладающих форм аллергии, которая поражает сенсибилизированных людей во время определенного времени года. Пыльца трав присутствует в воздухе в месяцы поздней весны и раннего лета, что вызывает аллергические риниты, аллергические конъюнктивиты и астму. Непосредственный контакт кожи с травами во время сидения на траве или стрижки газона может вызывать кожный зуд, крапивницу и атопический дерматит. Одним из наиболее распространенных видов таких трав является Phleum pratense. В виде Phleum pratense обнаружены по меньшей мере девять различных аллергенов, включая такие как Phl p 1, бета-экспансин с 27 кДа; Phl p 2, группа трав II/III с 10-12 кДа; Phl p 4, белок с 55 кДа, Phl p 5 с 32 кДа, Phl p 6 с 11 кДа, Phl p 7 или кальций-связующей белок с 6 кДа, Phl p 11 или родственный Ole e 1 белок с 20 кДа, Phl p 12 или профилин с 14 кДа и Phl p 13 или полигалактуроназа с 55 кДа.

Olea europaea

В Средиземноморском регионе оливковый поллиноз представляет собой серьезную проблему для местного здравоохранения ввиду обширного культивирования оливковых деревьев (маслин). Оливковые деревья выбрасывают в атмосферу большие количества пыльцы. В настоящее время Подкомитетом по номенклатуре аллергенов WHO/IUIS описаны 12 аллергенов, выделяемых O. europaea, 11 из которых содержатся в пыльце и один (тауматин, также известный как as Ole e 13), пищевой аллерген, содержится в плодах (маслинах). Ole e 1 представляет собой основной аллерген, распознаваемый более 70% сенсибилизируемых оливковой пыльцой пациентов. Другие аллергены включают профилин (Ole e 2), полкальцины (Ole e 3 и Ole e 8), глюканазы (Ole e 4 и Ole e 9), супероксиддисмутазу (Ole e 5), белок-переносчик липида (Ole e 7), гликозил-гидролазу (Ole e 10), пектин-метилэстеразу (Ole e 11) и Ole e 6.

Dermatophagoides pteronyssinus

Клещи являются главным мировым источником сенсибилизации, особенно в регионах, где температура и влажность способствуют их распространению. В настоящее время домашние пылевые клещи (house dust mites - HDM), относящиеся к семейству Pyroglyphidae, являются самыми распространенными пылевыми клещами в закрытых помещениях и, соответственно, представляют собой основной источник аллергенов в жилье человека. Подкомитетом по номенклатуре аллергенов WHO/IUIS описаны девятнадцать аллергенов, выделяемых D. pteronyssinus, 9 из которых представляют собой протеазы, обладающие активностью, связанной с аллергенностью. Наиболее важными аллергенами являются Der p 1 (цистеин-протеаза с 25 кДа) и Der p 2 (белок семейства NPC2 с 14 кДа).

Пациентов, страдающих аллергией, можно лечить лекарственными препаратами, снижающими проявления симптомов или сглаживающими их пики. Кроме того, их можно лечить посредством специфической иммунотерапии. Однако специфическая иммунотерапия является единственным видом лечения, изменяющим само течение болезни. Специфическая иммунотерапия (SIT) включает введение пациенту все более возрастающих доз экстракта аллергена с целью выработать у него иммунологическую толерантность. Аллергенная иммунотерапия модулирует непосредственно иммунный ответ на аллерген, а не облегчает симптомы, вызванные аллергической реакцией, и может либо снизить потребность в лекарственных препаратах и снизить тяжесть симптомов, либо устранить гиперчувствительность вообще.

Одна из опасностей иммунотерапии состоит в том, что инъекция аллергена сенсибилизированному пациенту может вызвать у него аллергическую реакцию или анафилаксию. С самого первого применения в начале 20-го века было приложено немало усилий для дальнейшего повышения безопасности и эффективности иммунотерапии аллергии. Одним из способов является разработка аллергоидов, которая включает применение аллергенных вакцин с пониженной аллергенностью, но с сохранением иммуногенности.

В EP 0 662 080 (CBF LETI SA) описан способ удаления веществ и других материалов с низкой молекулярной массой для очистки экстрактов аллергенов и повышения в них конечного содержания аллергена/белка. Способ заключается в нарушении электростатических, гидрофобных или других физических сил взаимодействия веществ таким образом, чтобы можно было отделить неаллергенные соединения от аллергенноактивных белков. Способ может включать мягкую кислотную обработке с постепенным понижением pH ниже pH соответствующих аллергенных белков.

Один из многочисленных способов снижения аллергенности заключается в химическом изменении нативных экстрактов аллергенов с помощью альдегида, преимущественно формальдегида и глутаральдегида, в результате чего получают аллергоиды. Указанная альдегидная обработка приводит к образованию продуктов реакции (в основном полимерных), которые утратили часть своей аллергенности (т.е. демонстрируют снижение содержания IgE-реактивных B-клеточных эпитопов) и вызывают более слабые побочные аллергические эффекты. В то же время сохраняется нативная иммуногенность аллергена. Этот путь видоизменения аллергена выбрали некоторые производители аллергенных вакцин для разработки коммерчески доступных продуктов, основанных на этом принципе.

Однако по-прежнему существует потребность в поиске дополнительных способов получения безопасных и эффективных лекарственных препаратов для применения в иммунотерапии аллергических заболеваний путем оптимизации технологического процесса по очистке аллергена для обеспечения отделения белков с низкой молекулярной массой, раздражающих и токсичных компонентов.

Краткое описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что депигментирование экстракта аллергена с помощью основания увеличивает содержание белка, а также может повышать содержание основного аллергена и биологическую активность экстракта.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения депигментированного экстракта аллергена, включающий:

a) подщелачивание нативного экстракта аллергена;

b) удаление молекул размером менее 3,5 кДа; и

c) доведение pH до нейтрального уровня;

с получением депигментированного экстракта аллергена.

Способ может дополнительно включать стадию полимеризации, включающую:

d) приведение депигментированного аллергенного экстракта в контакт с альдегидом; и

e) удаление молекул размером менее 100 кДа;

с получением депигментированного полимеризованного экстракта аллергена.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен депигментированный экстракт аллергена, полученный согласно способу, предложенному в первом аспекте настоящего изобретения.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен депигментированный полимеризованный экстракт аллергена, полученный согласно способу, предложенному в первом аспекте настоящего изобретения.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен очищенный экстракт аллергена для применения в качестве активной терапевтической субстанции при лечении аллергии.

Определения

“Аллерген” можно определить как молекулу, способную индуцировать IgE-ответ и/или аллергическую реакцию Типа I.

Термин «нативный экстракт аллергена» означает экстракт аллергена, экстрагированный из исходного материала и затем обработанный таким образом, чтобы удалить из него несвязанные компоненты с низкой молекулярной массой.

Термин «депигментированный экстракт аллергена», упоминаемый в настоящем документе, может быть определен как частично очищенный экстракт аллергена, полученный из нативного экстракта аллергена путем удаления из него веществ, не имеющих отношения к аллергенности экстракта, но связанных с аллергенным белком, включая адсорбированные пигменты.

Термин «депигментированный полимеризованный экстракт аллергена», упоминаемый в настоящем документе, может быть определен как очищенный экстракт аллергена, в котором при гель-электрофорезе SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях не регистрируются полосы с <100 кДа, и который получают посредством полимеризации депигментированного экстракта аллергена.

Подробное описание изобретения

Экстракты аллергенов согласно настоящему изобретению получают из любого исходного материала, содержащего природные аллергены, известные своей способностью вызывать нежелательную IgE-опосредованную иммунную реакцию у индивидуума. Подобные аллергены могут включать переносимые по воздуху аллергены (например, пыльцу трав, деревьев, культурных растений, сорняков, пылевых клещей, грибы и плесень), пищевые аллергены (например, арахис), аллергены насекомых (например, тараканов и блох, пчелиный и осиный яд) и эпителиальные аллергены (шерсть и перхоть животных, например, перхоть кошек и собак).

Исходным материалом может быть любой аллерген, включая пищевые аллергены (например, арахис), переносимые по воздуху аллергены (например, пыльцу (такую как пыльца деревьев, пыльца сорняков, пыльца трав и пыльца злаков), пылевых клещей, грибы и плесень), эпителиальные аллергены (шерсть и перхоть животных, например, кошачью шерсть и перхоть, и собачью шерсть и перхоть) и аллергены насекомых (например, тараканов и блох, пчелиный и осиный яд).

Пыльцевые аллергены деревьев, трав и сорняков происходят из таксономической группы порядка Fagales (например, Alnus и Betula), Lamiales (например, Olea и Plantago), Poales (например, Phleum pratense), Asterales (например, Ambrosia и Artemisia), Cayophyllales (например, Chenopodium и Salsola), Rosales (например, Parietaria), Proteales (например, Platanus) и т.д. Пылевые клещи относятся к группе порядка Astigmata (например, Dermatophagoides и Euroglyphus). Аллергены, переносимые по воздуху, происходят из плесени и грибов, относящихся к порядку Pleosporales (например, Alternaria), Capnodiales (например, Cladosporium) и т.д.

Переносимые по воздуху аллергены могут быть выбраны из следующих групп: пыльца деревьев (Alnus glutinosa, Betula alba, Corylus avellana, Cupressus arizonica, Olea europaea, Platanus sp), пыльца трав (Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis), пыльца сорняков (Ambrosia elatior, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali) и пыльца злаков (Avena sativa, Hordeum vulgare, Secale cereale, Triticum aestivum, Zea mays), пылевые клещи (Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei), амбарные клещи (Acarus siro, Blomia tropicalis, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, Glycyphagus domesticus, Chortoglyphus arcuatus) и грибки и плесени (Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus).

Эпителиальные аллергены могут быть выбраны из аллергенов любого животного, включая кошачью шерсть и перхоть, собачью шерсть и перхоть, лошадиную шерсть и перхоть, волосы и перхоть человека, шерсть и перхоть кроликов, шерсть и перхоть крыс, шерсть и перхоть мышей, шерсть и перхоть морских свинок, а также перья птиц.

Аллергены членистоногих могут быть выбраны из аллергенов насекомых, например, муравьев, блох, тараканов, осиного и пчелиного яда, или клещей (Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae и Chortoglyphus arcuatus).

На обработку основаниями особенно хорошо реагируют пыльцевые аллергены. Пыльцевые аллергены включают пыльцу деревьев, пыльцу трав, пыльцу сорняков и пыльцу злаков и происходят из группы таксономических порядков Fagales (например, Alnus и Betula), Lamiales (например, Olea и Plantago), Poales (например, Phleum pratense), Asterales (например, Ambrosia и Artemisia), Cayophyllales (например, Chenopodium и Salsola), Rosales (например, Parietaria), Proteales (например, Platanus) и т.п.

В одном варианте реализации настоящего изобретения экстракт аллергена получают из исходного материала, представляющего собой пыльцу. Пыльца может быть выбрана из пыльцы растений Phleum pratense, Olea europaea and Betula alba (pendula).

Более предпочтительно исходный материал выбирают из арахиса (Arachis hypogaea), пыльцы (Phleum pratense, Olea europaea и Betula alba (pendula)), клещей (Dermatophagoides pteronyssinus) и частиц эпителия (кошачья перхоть).

В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения исходный материал выбирают из пыльцы (Phleum pratense, Olea europaea и Betula alba (pendula)) и клещей (Dermatophagoides pteronyssinus).

В частности, исходный материал выбирают из Phleum pratense, Olea europaea и Betula alba (pendula).

В еще более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения исходным материалом является Phleum pratense.

В качестве альтернативы, исходный материал представляет собой Olea europaea.

В качестве альтернативы, исходный материал представляет собой Dermatophagoides pteronyssinus.

Далее в настоящем изобретении описан один из способов получения нативного экстракта аллергена, хоть и понятно, что специалистам в данной области известны и другие подходящие способы получения нативного экстракта аллергена, который можно применять в качестве исходного материала для способа депигментации согласно настоящему изобретению.

Способ получения нативного экстракта аллергена из исходного материала может включать:

i) приведение исходного материала или первого остатка исходного материала в контакт с жидким экстрагентом аллергенов, с получением второй смеси аллергенов, растворенной в жидкой фазе, и твердую фазу, содержащую второй остаток исходного материала;

ii) подвергание указанной второй смеси второй стадии разделения для отделения аллергенов, растворенных в жидкой фазе с получением сырого экстракта аллергена;

iii) подвергание указанного сырого экстракта аллергена стадии удаления низкомолекулярной фракции для удаления молекул размером менее 1-10 кДа, предпочтительно менее 3,5 кДа при 3-10°C;

iv) проведение стадии (iii) при 3-10°C до тех пор, пока электропроводность экстракта аллергена, измеренная при комнатной температуре, не станет менее 900 мкСм/см с получением нативного экстракта аллергена.

Исходный материал можно предварительно обработать для обеспечения максимальной площади его контакта с жидким экстрагентом аллергена. Исходный материал можно гомогенизировать, перемешать, раздробить или размолоть с получением однородной пульпы для жидкостной экстракции.

В некоторых случаях необходимы предварительные стадии обезжиривания, которые могут включать:

i) приведение исходного материала, содержащего аллерген, в контакт с жидким экстрагентом липидов, с получением первой смеси, содержащей липиды, растворенные в жидкой фазе, и твердую фазу, содержащую первый остаток исходного материала, включающий аллергены и белки; и

ii) подвергание указанной первой смеси первой стадии разделения для отделения первого остатка исходного материала.

Предварительные стадии обезжиривания могут потребоваться в случаях, когда исходный материал представляет собой пыльцу, частицы эпителия или пищевой продукт, такой как орехи, например, арахис. На стадии экстракции липидов или «обезжиривания» из исходного материала удаляют липофильные соединения, такие как липиды и жирные кислоты.

Жидкий экстрагент липидов может представлять собой ацетон, эфир или другой аналогичный органический растворитель, который может быть холодным. Предпочтительно жидкий экстрагент липидов представляет собой ацетон. Стадия экстракции липидов может быть проведена при массовом соотношении исходного материала и жидкого экстрагента липидов 1:1 или при любом другом массовом соотношении, при котором масса жидкого экстрагента липидов превышает массу исходного материала, например, 1:2, 1:3, 1:5, 1:10. Стадию экстракции липидов предпочтительно проводят при соотношении 1 кг исходного материала и 2 л жидкого экстрагента липидов. Стадию экстракции липидов предпочтительно проводят в течение достаточного времени, чтобы липиды исходного материала растворились в жидком экстрагенте липидов, что может составлять 1 минуту, предпочтительно 5 минут, более предпочтительно 30 минут и наиболее предпочтительно 1 час или более. Стадию жидкостной экстракции липидов можно проводить при 2-25°C, но предпочтительно проводить на холоде, при 2-6°C, и еще предпочтительно - при 3-5°C. При проведении стадии экстракции липидов исходный материал предпочтительно перемешивать или встряхивать вместе с жидким экстрагентом липидов.

Первая стадия разделения может представлять собой любую подходящую стадию разделения, известную специалистам, например, первой стадией разделения может быть фильтрование или другой подходящий способ.

После первой стадии разделения остаток исходного материала можно промыть жидким экстрагентом липидов. Первый остаток исходного материала можно необязательно подвергать дополнительной экстракции жидким экстрагентом липидов, после чего отделять. В предпочтительном варианте проводят одну, две или более дополнительных стадий экстракции липидов. Фильтрование жидкого экстрагента можно проводить неоднократно, до тех пор, пока он не станет прозрачным. Можно также использовать и другие подходящие способы разделения, известные специалистам в данной области техники.

После экстракции липидов и разделения смеси остаток исходного материала можно высушить. Сушить остаток исходного материала можно при 2-25°C, предпочтительно при комнатной температуре. Стадию сушки предпочтительно проводить в течение достаточного времени, чтобы дать возможность удалить жидкий экстрагент липидов из остатка исходного материала, что может составлять от 1 до 24 часов, от 6 до 18 часов, однако предпочтительно проводить сушку в течение по меньшей мере 12 часов.

Аллергены можно получать из («обезжиренного») первого остатка исходного материала путем экстракции жидким экстрагентом аллергена, с получением сырого экстракта аллергена, содержащего аллергены, растворенные в жидкой фазе, и твердую фазу, содержащую «нежелательные» неаллергенные остатки. Жидкий экстрагент аллергенов может представлять собой водный раствор и предпочтительно содержать буферный агент. Жидкий экстрагент аллергенов может содержать фосфатный буфер (PBS) и/или NaCl, например, он может представлять собой водный раствор 0,01 M PBS/0,15 M NaCl или водный раствор бикарбоната аммония ((NH₄)HCO₃) и/или NaCl, например, водный раствор 0,125 M (NH₄)HCO₃/0,15 M NaCl. Первый остаток исходного материала можно экстрагировать жидким экстрагентом аллергенов при любом массовом отношении, при котором масса жидкого экстрагента аллергенов превышает массу первого остатка исходного материала, например, при массовых отношениях 1:2, 1:3, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:80. В предпочтительном варианте первый остаток исходного материала экстрагируют жидким экстрагентом аллергенов в массовом отношении между первым остатком исходного материала и жидким экстрагентом аллергенов, равном 1:10. Массовое отношение между первым остатком исходного материала и жидким экстрагентом аллергенов можно варьировать, однако следует выбирать такое, чтобы аллергены, содержащиеся в первом остатке исходного материала, могли раствориться в жидком экстрагенте аллергенов. Экстракцию первого остатка исходного материала жидким экстрагентом аллергенов предпочтительно проводят в течение достаточного времени, позволяющего аллергенам из первого остатка исходного материала раствориться в жидком экстрагенте аллергенов, что может составлять от 30 минут до 12 часов, предпочтительно от 1 до 6 часов, предпочтительно от 2 до 5 часов и наиболее предпочтительно - около 4 часов. Стадию экстракции аллергена можно проводить при 2-25°C, но предпочтительно проводить ее на холоде, при 2-6°C, и наиболее предпочтительно - при 3-5°C. При проведении стадии экстракции аллергенов первого остаток исходного материала предпочтительно перемешивать или встряхивать вместе с жидким экстрагентом аллергенов.

После стадии экстракции аллергенов аллергены, растворенные в жидкой фазе, можно отделять от вторичного остатка исходного материала с получением сырого экстракта аллергена. Стадия разделения в предпочтительном варианте представляет собой центрифугирование, однако можно применять и другие способы разделения твердых веществ и жидкостей, хорошо известные специалистам в данной области техники. Аллергены, растворенные в жидкой фазе, предпочтительно центрифугируют при 2-6°C, предпочтительно при 3-5°C, в течение времени, достаточного для осаждения остатка исходного материала в виде плотной гранулы, например, в течение промежутка времени от 1 минуты до 1 часа или более 1 часа. Сырой экстракт аллергена (т.е. надосадочную жидкость, содержащую растворенные аллергены) можно хранить при 2-6°C. Гранулы второго остатка исходного материала можно дополнительно экстрагировать жидким экстрагентом аллергенов при тех же условиях экстрагирования, что и на первой стадии экстракции аллергенов, и предпочтительно в течение более продолжительных периодов экстрагирования, например, в течение 4-8 часов, 8-12 часов или более 12 часов. После второй стадии экстракции аллергенов аллергены, растворенные в жидкой фазе можно отделять от вторичного остатка исходного материала, в результате чего получать сырой экстракт аллергена. Сырые экстракты аллергенов, полученные на первой и второй стадиях экстракции аллергенов, предпочтительно объединяют для последующей обработки.

Сырой экстракт аллергена можно фильтровать, например, через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Сырой экстракт аллергена можно подвергать стадии удаления низкомолекулярной фракции с целью удаления веществ с малыми размерами молекул, такие как соли и другие неаллергенные соединения. На стадии (iii) можно удалять молекулы размером менее 1-10 кДа, предпочтительно - менее 3,5 кДа. Стадию удаления низкомолекулярной фракции предпочтительно проводят при 3-10, предпочтительно при 3-5°C, до тех пор, пока электропроводность экстракта аллергена не станет менее 900 мкСм/см, или менее 800 мкСм/см, или менее 700 мкСм/см, или менее 600 мкСм/см, или в более предпочтительном варианте - менее 500 мкСм/см (измеренного при комнатной температуре).

Полученный в результате этого нативный экстракт аллергена можно отфильтровать, например, через фильтры с размером пор 0,45 мкм и/или 0,22 мкм.

Нативный экстракт аллергена можно применять для получения фармацевтический композиции или вакцины для стандартизации, диагностики, синтеза и вакцинации.

В настоящем изобретении нативный экстракт аллергена применяют в качестве исходного материала для предложенного способа депигментации.

В настоящем изобретении предложен способ депигментации, включающий подщелачивающую обработку, в котором неаллергенные соединения, связанные с аллергенами/белками адгезионными связями, удаляют с помощью средств, разрывающие электростатические, гидрофобные и прочие физические силы взаимодействия веществ, ответственные за адгезионные связи неаллергенных соединений с белками, с получением депигментированного экстракта.

Подщелачивающая обработка включает:

a) подщелачивание нативного экстракта аллергена;

b) удаление соединений с размером молекул менее 3,5 кДа; и

c) доведение значения pH до нейтрального с получением депигментированного экстракта аллергена.

Подщелачивающая обработка включает либо обработку слабым основанием, либо обработку сильным основанием. В ходе обработки основанием pH раствора аллергенов/белков можно повышать по меньшей мере до pH 7, например, до pH от 7 до 11. Предпочтительно pH раствора аллергенов/белков составляет от 7 до 10, более предпочтительно pH составляет от 7 до 8. Значение pH более 11 может привести к тому, что белковый профиль депигментированного экстракта аллергена окажется неполным, а нейтральный уровень pH, например, pH 6, приводит к неполному выведению неаллергенных соединений из итогового депигментированного экстракта аллергена.

В одном из вариантов реализации обработка основанием включает подщелачивание экстракта аллергена до pH 7, pH 8, pH 9, pH 10 или pH 11.

В одном из вариантов реализации обработка основанием включает подщелачивание экстракта аллергена до pH 7-11 или pH 7-10, предпочтительно в пределах pH 7-pH 8.

pH нативного экстракта аллергена можно повышать с помощью любого подходящего основания. Основание может быть сильным или слабым. Сильные основания включают гидроксид натрия, гидроксид лития и гидроксид калия. Слабые основания включают мочевину, гидроксид аммония и метиламин. В одном из вариантов реализации указанное основание выбирают из списка, включающего гидроксид натрия, гидроксид лития, гидроксид калия, мочевину, гидроксид аммония или метиламин. В частности, указанное основание представляет собой гидроксид натрия.

Подщелоченный экстракт можно выдерживать в щелочном диапазоне pH в течение промежутка времени от 1 минуты до 24 часов, от 1 минуты до 4 часов, от 1 до 60 минут, предпочтительно от 5 до 30 минут, предпочтительно от 10 до 20 минут и наиболее предпочтительно в течение примерно 15 минут.

Молекулы размером менее 3,5 кДа можно удалить на стадии удаления низкомолекулярной фракции.

После подщелачивающей обработки полученный депигментированный аллергенный экстракт можно собрать, и его pH регулировать с помощью подходящей кислоты, например, HCl. pH можно доводить до величины, позволяющей избежать осаждения белков, например, до pH 7,0 и 7,5, в частности, pH 7,3-7,4.

В частности, подщелачивающая обработка может включать:

a) подщелачивание экстракта нативного аллергена до pH 7-11 и выдерживание подщелоченного экстракта при таком pH в течение промежутка времени от 1 минуты до 24 часов, например, от 5 до 30 минут, предпочтительно в течение 15 минут;

b) подвергание экстракта стадии удаления низкомолекулярной фракции для удаления молекул размером менее 3,5 кДа; и

c) доведение pH до значения в пределах от 7,0 до 7,5, в частности, от 7,3 до 7,4, с получением депигментированного экстракта аллергена.

Подщелачивающая обработка может включать подщелачивание нативного экстракта аллергена до pH 7-10.

Стадия удаления низкомолекулярной фракции может представлять собой стадию диализа, на которой экстракт диализируют против диализата, такого как чистая вода или буфер. Стадию удаления низкомолекулярной фракции можно проводить при 2-25°C, но предпочтительно проводить ее на холоде в пределах 2-6°C, и наиболее предпочтительно - в пределах 3-5°C. Стадию удаления низкомолекулярной фракции можно проводить в течение 12-24 часов, при этом растворитель или, в случае диализа, диализат регулярно меняют для поддержания реакции.

Полученный депигментированный экстракт аллергена можно отфильтровать, например, через фильтр с размером пор 0,45 мкм и/или 0,22 мкм, и заморозить или лиофилизировать для последующего хранения.

Экстракты, полученные способом согласно настоящему изобретению, можно подвергать дальнейшей обработке. Указанный способ может дополнительно включать стадию полимеризации, включающую:

d) приведение депигментированного экстракта аллергена в контакт с альдегидом, и после полимеризации

e) удаление молекул размером менее 100 кДа.

Альдегид может представлять собой любой подходящий альдегид, например, глутаральдегид или формальдегид.

Стадия полимеризации может включать:

d) приведение депигментированного экстракта аллергена в контакт с глутаральдегидом или формальдегидом,

e) подвергание указанного экстракта стадии удаления молекулярной фракции для удаления молекул размером менее 100 кДа, и

f) проведение стадии (e) при 3-15°C, предпочтительно 3-5°C до тех пор, пока электропроводность экстракта аллергена, измеренная при комнатной температуре, не станет менее 210 мкСм/см и/или до исчезновения глутаральдегида в указанном экстракте, с получением депигментированного полимеризованного экстракта аллергена.

Если экстракт, подлежащий полимеризации, ранее лиофилизировали, его можно восстановить в буфере, например, 0,01M PBS/0,15M NaCl, до конечной концентрации 0,1-500 мг/мл, предпочтительно до 1-100 мг/мл и наиболее предпочтительно до 10-50 мг/мл.

Реакцию полимеризации предпочтительно проводят до ее завершения, т.е. таким образом, чтобы в депигментированном полимеризованном экстракте аллергена при использовании гель-электрофореза SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях не регистрировались белковые полосы с <100 кДа (например, 14-25 кДа).

Увеличение концентрации глутаральдегида может уменьшить выход полимера и увеличить выход остатка, получаемого на любой стадии центрифугирования, проводимой перед диализом. В противоположность ранее известным условиям полимеризации, в которых концентрация глутаральдегида составляет примерно 5 мг/мл (т.е. 0,009 мл глутаральдегида на 1 мл экстракта аллергена), экспериментально определили, что оптимальная концентрация глутаральдегида примерно вдвое выше ранее известной величины, принятой для некоторых аллергенов (арахиса, кошачьего эпителия и Ambrosia), т.е. составляет 10 мг/мл (0,02 мл глутаральдегида на 1 мл экстракта аллергена). Альдегид можно добавлять в диапазоне от 1 до 20 мг/мл. Несмотря на то, что применение ранее известных величин конечной концентрации глутаральдегида также может приводить к некоторой полимеризации аллергенов, предпочтительно добавлять альдегид с конечной концентрацией 5-10 мг/мл или в соотношении 0,01-0,02 мл глутаральдегида на 1 мл экстракта для достижения оптимальной полимеризации.

Снижение скорости добавления глутаральдегида также может вызвать снижение выхода полимера и увеличить выход остатка. Альдегид можно добавлять к экстракту с постоянной скоростью, например, в пределах 0,001-0,5 мл в минуту (1-500 мкл/мин или 60-3000 мкл/час).

Реакцию полимеризации можно поддерживать в пределах от 1 до 12 часов, предпочтительно в течение 7 часов при комнатной или более высокой температуре. Реакцию полимеризации можно остановить посредством применения глицина в пропорции 40 мг на 1 мл раствора депигментированного полимеризованного экстракта аллергена. Реакционную смесь после остановки реакции можно выдержать в течение ночи при 3-5C, предпочтительно при постоянном перемешивании. Депигментированные полимеризованные аллергены, содержащиеся в жидкой фазе, можно отделить от нерастворимого остатка с получением депигментированного полимеризованного экстракта аллергена. Стадия разделения предпочтительно представляет собой центрифугирование, однако можно применять и многие другие способы разделения, хорошо известные специалистам в данной области техники. Предпочтительно экстракт центрифугируют при 2-6°C, предпочтительно при 3-5°C, в течение достаточного времени, чтобы осадить нерастворимый остаток в виде плотной гранулы, например, в течение промежутка времени от 1 минуты до 1 часа или более 1 часа. Надосадочную жидкость (содержащую растворимые депигментированные полимеризованные аллергены) можно собрать и подвергнуть стадии (e) для удаления соответствующей молекулярной фракции.

На стадии (e) удаляют молекулы размером менее 100 кДа.

Стадия удаления соответствующей молекулярной фракции предпочтительно представляет собой стадию диализа, на которой экстракт диализируют против диализата, такого как очищенная вода или буфер, при 3-15°C, предпочтительно 3-5°C. Стадию удаления молекулярной фракции можно продолжать при 3-15°C, предпочтительно 3-5°C до тех пор, пока электропроводность экстракта, измеренная при комнатной температуре, не станет менее 300 мкСм/см, предпочтительно менее 250 мкСм/см и наиболее предпочтительно менее 210 мкСм/см.

Полученный депигментированный полимеризованный экстракт аллергена можно отфильтровать, например, через фильтры с размером пор 0,45 мкм и/или 0,22 мкм, и заморозить или лиофилизировать для последующего хранения.

Любая из стадий удаления молекулярных фракций, описанных в настоящем изобретении, например, стадии (b) или (e), могут включать стадию ультрафильтрации, стадию диафильтрации, стадию диализа или фильтрования.

В своей самой простой форме способ согласно настоящему изобретению может включать приготовление или получение нативного экстракта аллергена и подщелачивание экстракта, например, путем обработки слабым или сильным основанием, для удаления неаллергенных соединений, имеющих малые размеры молекул. Затем экстракт можно подвергнуть полимеризации путем применения альдегида. Нативный экстракт аллергена может представлять собой экстракт аллергенов арахиса, пыльцы, трав, частиц эпителия, плесени, грибов, насекомых или клещей, в частности аллергенов трав, пыльцы или клещей, и в частности аллергенов пыльцы. Способ согласно настоящему изобретению обеспечивает экстракт аллергена, показывающий сниженную IgE-связующую способность, но при этом сохраняющий свою иммуногенную способность.

Настоящее изобретение дополнительно включает лекарственное средство для лечения аллергии и средство для диагностики аллергии, при этом оба средства включают в качестве действующего вещества экстракты аллергенов, полученные способом согласно настоящему изобретению. Аллергия может быть связана с воздействием различных аллергенов, вызывающих нежелательный IgE-опосредованный ответ, как уже обсуждалось в настоящем изобретении.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен депигментированный экстракт аллергена, получаемый способом согласно первому аспекту настоящего изобретения.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен депигментированный полимеризованный экстракт аллергена, получаемый способом согласно первому аспекту настоящего изобретения. Предложен очищенный экстракт аллергена для применения в качестве активного терапевтического вещества.

Указанный экстракт аллергена может быть выбран из аллергенов арахиса (Arachis hypogaea), пыльцы (Phleum pratense, Betula alba Olea europaea, Parietaria judaica и Cupressus arizonica), клещей (Dermatophagoides pteronyssinus) и эпителиальных частиц (кошачья перхоть). В частности экстракт аллергена представляет собой пыльцу, выбранную из пыльцы Olea europaea и Phleum pratense.

Указанный экстракт аллергена можно применять для лечении аллергии. В предпочтительном варианте реализации экстракт аллергена пыльцы Olea europaea или Phleum pratense можно применять для лечения аллергии на пыльцу.

Депигментированный экстракт аллергена можно охарактеризовать следующими физико-химическими и биологическими свойствами:

i. Растворимость в воде,

ii. Отсутствие неполимеризованных аллергенов/белков с молекулярной массой менее 100 кДа (определяемых по полосам при проведении SDS-PAGE электрофореза в невосстанавливающих условиях)

iii. Отсутствие полосы распознавания IgE с молекулярной массой менее 100 кДа (определяемого по иммуноблоту в невосстанавливающих условиях)

iv. Отсутствие полимеризованных молекул с молекулярной массой менее 100 кДа (определенных с помощью SDS-PAGE электрофореза)

v. Снижение биологической активности (95%) по сравнению с нативным экстрактом аллергена (определенное посредством ингибиторного теста ELISA на IgE с использованием специфического пула сывороток, полученных от сенсибилизированных индивидуумов) и

vi. Отсутствие аномальной токсичности у мышей и морских свинок.

В частности, депигментированный полимеризованный экстракт аллергена характеризуется снижением биологической активности (95%) по сравнению с нативным экстрактом аллергена (определенным посредством ингибиторного теста ELISA на IgE при использовании специфического пула сывороток, полученных от сенсибилизированных индивидуумов).

Экстракты аллергенов согласно настоящему изобретению можно применять в качестве действующих компонентов лекарственных средств для лечения индивидуумов, страдающих аллергией, с целью выработать у них толерантность к определенным аллергенам.

Предложено применение экстракта аллергена согласно настоящему изобретению при диагностике иммунологических заболеваний, предпочтительно для выявления аллергии. Предложено применение экстракта аллергена согласно настоящему изобретению для лечения аллергии или для получения лекарственных средств для лечения аллергии, например, аллергии на пыльцу. Также его можно применять для иммунотерапии. Возможно применение для стандартизации, диагностики, синтеза и вакцинации. Возможно применение для целей терапевтического лечения пациентов, предпочтительно для иммунотерапии. Возможно применение для целей мониторинга пациентов во время проведения иммунотерапии.

В качестве альтернативы предложен способ лечения лиц, нуждающихся в лечении аллергии, такой как аллергия на пыльцу аллергия, включающий стадию введения лицам, нуждающимся в лечении, экстрактов аллергенов согласно настоящему изобретению.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая экстракт аллергена согласно настоящему изобретению. Предложена фармацевтическая композиция для лечения аллергии, включающая в качестве активного компонента фармацевтически эффективное количество экстракта аллергена согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Предложена диагностическая композиция на аллергию, включающая в качестве действующего компонента диагностически эффективное количество экстракта аллергена согласно настоящему изобретению.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая экстракт аллергена согласно настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция и вакцина могут дополнительно включать один или более адъювантов, разбавителей, консервантов или их смесей. Фармацевтическая композиция или вакцина могут включать физиологически приемлемый носитель. При использовании в данном документе фраза «фармацевтически приемлемый» предпочтительно означает одобренный регулирующим органом или правительством, или зарегистрированный в Европейской Фармакопее или Фармакопее США, или в другой общепризнанной фармакопее, для применения на людях.

Такими фармацевтически приемлемыми носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно применять в качестве жидких носителей, особенно в составе растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают маннит, человеческий сывороточный альбумин (HSA), крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, карбонат магния, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, обезжиренное сухое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п.

Предложена вакцина, получаемая способом согласно первому аспекту настоящего изобретения. Указанная вакцина может быть выполнена для подкожного, подъязычного или накожного применения.

Предложено применение вакцины согласно настоящему изобретению для лечения аллергии или получения лекарственных средств для лечения аллергии.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ предотвращения аллергической сенсибилизации, включающий стадию воздействия на индивидуума эффективным количеством экстракта аллергена, фармацевтической композиции или вакцины согласно настоящему изобретению.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения аллергии у сенсибилизированного индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества экстракта аллергена, фармацевтической композиции или вакцины согласно настоящему изобретению. Указанный экстракт аллергена, фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить подкожно или подъязычно, при этом введение можно осуществлять в постоянных или возрастающих дозах.

Индивидуум может представлять собой человека или животное, предпочтительно человека.

Краткое описание графических материалов

На Фигуре 1 показано содержание белка в экстрактах P. pratense (определенное методом Лоури-Биурета) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 2 показано содержание белка в экстрактах P. pratense (определенное методом Лоури-Биурета) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 3 показано содержание Phl p 5 (основного аллергена Phleum) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 4 показано содержание Phl p 5 (основного аллергена Phleum) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 5 показана биологическая активность (определенная с помощью исследования ELISA конкурентного типа) экстрактов P. pratense для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 6 показана биологическая активность (определенная с помощью исследования ELISA конкурентного типа) экстрактов P. pratense для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 7 показано количество мкг, необходимое для 50% ингибирования связывания IgE с нативным экстрактом P. pratense, для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 8 показано количество мкг, необходимое для 50% ингибирования связывания IgE с нативным экстрактом P. pratense, для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 9 показаны результаты SDS электрофореза для экстрактов P. pratense, обработанных различными основаниями.

На Фигуре 10 показаны результаты вестерн-блоттинга для экстрактов P. pratense, обработанных различными основаниями.

На Фигуре 11 показано содержание белка в экстрактах O. europaea (определенное методом Лоури-Биурета) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 12 показано содержание белка в экстрактах O. europaea (определенное методом Лоури-Биурета) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 13 показана биологическая активность (определенная с помощью исследования ELISA конкурентного типа) экстрактов O. europaea для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 14 показана биологическая активность (определенная с помощью исследования ELISA конкурентного типа) экстрактов O. europaea для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 15 показано количество мкг, необходимое для достижения 50%-го ингибирования связывания IgE с нативным экстрактом O. europaea, для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 16 показано количество мкг, необходимое для 50% ингибирования связывания IgE с нативным экстрактом O. europaea, для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 17 показаны результаты SDS электрофореза для экстрактов O. europaea, обработанных различными основаниями.

На Фигуре 18 показаны результаты вестерн-блоттинга для экстрактов O. europaea, обработанных различными основаниями.

На Фигуре 19 показаны результаты тонкослойной хроматографии для экстрактов O. europaea. A: образцы, обработанные гидроксидом натрия и гидроксидом лития; B: образцы, обработанные гидроксидом аммония, гидроксидом натрия и мочевиной; C: образцы, обработанные метиламином. Все количественные значения сравнивали со значениями нативного экстракта. В качестве стандартов использовали: 1: хлорогеновую кислоту; 2: кверцитин; 3: рутина тригидрат; 4: изокверцитин; 5: кверцитрин; 6: кемпферол-3-глюкозид; 7: апигенин-7-глюкозид.

На Фигуре 20 показано содержание белка в экстрактах D. pteronyssinus (определенное методом Лоури-Биурета) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 21 показано содержание белка в экстрактах D. pteronyssinus (определенное методом Лоури-Биурета) для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 22 показано содержание основного аллергена в экстрактах D. pteronyssinus, определенное с помощью комплекта для специфического сэндвич-метода ELISA (specific ELISA sandwich kit (Indoor)) на аллергены Der p 1 и Der p 2 для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам

На Фигуре 23 показано содержание основного аллергена в экстрактах D. pteronyssinus, определенное с помощью комплекта для специфического сэндвич-метода ELISA (specific ELISA sandwich kit (Indoor)) на аллергены Der p 1 и Der p 2 для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными кислотами и основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 24 показана биологическая активность (определенная с помощью исследования ELISA конкурентного типа) экстрактов D. pteronyssinus для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 25 показана биологическая активность (определенная с помощью исследования ELISA конкурентного типа) экстрактов D. pteronyssinus для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями. Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 26 показана биологическая активность экстрактов D. pteronyssinus, определенная с помощью ингибиторного исследования ELISA для лиофилизированных образцов, полученных после обработки при различных значениях pH (количество мкг, необходимое для 50% ингибирования реакции связывания IgE с нативным экстрактом). Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 27 показана биологическая активность экстрактов D. pteronyssinus, определенная с помощью ингибиторного исследования ELISA для лиофилизированных образцов, полученных после обработки различными основаниями (количество мкг, необходимое для 50% ингибирования реакции связывания IgE с нативным экстрактом). Планки погрешностей относятся к стандартному отклонению для среднего значения по различным образцам.

На Фигуре 28 показаны результаты SDS электрофореза экстрактов D. pteronyssinus, обработанных различными основаниями.

На Фигуре 29 показаны результаты вестерн-блоттинга экстрактов D. pteronyssinus, обработанных различными основаниями.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, в которых подробно описаны способы получения, очистки и подщелачивания экстрактов, содержащих аллергены.

В способах A-C подробно описаны процессы, применяемые для получения экстрактов аллергенов.

Способы

A. Необязательный процесс обезжиривания сырьевого аллергенного материала

Получали обезжиренный экстракт. В целом, гомогенизированный материал обезжиривали в ацетоне при 3-5°C и фильтровали. Эту стадию повторяли до тех пор, пока ацетон не становился прозрачным. Обезжиренный материал извлекали и сушили при комнатной температуре до полного удаления из него остатков ацетона.

B. Приготовление нативного экстракта аллергена

Высушенный обезжиренный материал взвешивали и экстрагировали раствором 0,01 M PBS/0,15M NaCl, взятым в пропорции 1:10, в течение 4 часов при 3-5°C и перемешивании магнитной мешалкой. После этого раствор центрифугировали в течение 30 минут при 4°C со скоростью 10000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость собирали и хранили при 3-5°C, а полученную гранулу твердого осадка ресуспендировали в растворе 0,01 M PBS/0,15M NaCl, взятым в пропорции 1:10, и экстрагировали в течение ночи при 3-5°C и перемешивании магнитной мешалкой. Раствор центрифугировали в течение 30 минут при 3-5°C со скоростью 10000 об/мин, надосадочную жидкость собирали и смешивали с ранее полученной фракцией. Объединенный экстракт фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и подвергали обширному диализу через диализные мембраны с отсечением на уровне 3 кДа до тех пор, пока электропроводность экстракта не станет менее 500 мкСм/см. Затем экстракт стерилизовали посредством фильтрования через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

C. Приготовление депигментированного экстракта аллергена

Нативный экстракт в водном растворе, хранившийся при 3-5°C, подвергали дальнейшей обработке согласно следующей процедуре. При постоянном перемешивании магнитной мешалкой pH раствора доводили до 7-11 путем добавления гидроксида натрия, гидроксида лития, гидроксида калия, мочевины, гидроксида аммония или метиламина, после чего раствор выдерживали при таких условиях в течение 15 минут. Затем экстракт диализировали через диализные мембраны с отсечением на уровне 3,5 кДа с очищенной водой в течение примерно 17 часов против 10 объемов очищенной воды при 3-5°C. В течение всего этого периода очищенную воду меняли 4 раза. После такой щелочной обработки экстракт собирали и доводили pH до 7,3-7,4 с помощью раствора 0,1M HCl. В заключение экстракт стерилизовали путем фильтрования через фильтр с размером пор 0,22 мкм, замораживали и лиофилизировали.

Определение иммунологических характеристик

Содержание белка

Содержание белка в нативных и депигментированных экстрактах измеряли методом Лоури-Биурета, следуя инструкциям производителя измерительного оборудования.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)

Белковые профили определяли методом гель-электрофореза SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях (образцы инкубировали с β-меркаптоэтанолом и нагревали в течение 10 минут при 95°C) в акриламидных гелях 2,67% C, 15% T акриламида. Образцы и стандарты с низкой молекулярной массой (Low Molecular Weight Standards, BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) исследовали в одном и том же геле. Гели подкрашивали красителем 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (BioRad).

Иммуно-блот

Электрофоретически разделенные (методом SDS-PAGE) белки переносили на ПВДФ-мембрану (Trans-Blot® Turbo TM Transfer Pack, BioRad) и инкубировали в течение ночи с образцами сывороток пациентов, сенсибилизированных каждым аллергеном (Plasmalab International, Everett, WA, USA), разведенным в 0,01M фосфатном буферном растворе (PBS) с 0,1% Tween. Компания Plasmalab International работает в полном соответствии с правилами и нормами Управления контроля пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA). Специфическое связывание IgE с экстрактом обнаруживали с помощью конъюгированных с пероксидазой моноклональных антител antihuman-IgE-PO (Ingenasa, Madrid, Spain), проявляемых в люминольных растворах (комплект Western Immun-Star™ Western CTM Kit, Bio-Rad) и регистрируемых методом хемилюминесценции (ChemiDoc XRS, Bio-Rad).

Количественное определение основного аллергена

Основные аллергены количественно определяли с помощью сэндвич-метода ELISA, используя наборы для анализа на иммуносорбенте с иммобилизированными ферментами (Indoor Biotechnologies, VA, USA). Планшеты Nunc Maxisorp (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) покрывали специфическим моноклональным антителом, разведенным в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH = 9,6), и инкубировали в течение ночи при 4°C. Затем планшеты блокировали раствором BSA 1% в смеси PBS 0,01 M - Tween 0,05 %. После этого добавляли образцы и стандарты сериями с половинными разбавлениями раствором BSA 1% в смеси PBS 0,01 M - Tween 0,05 %. Затем добавляли специфическое вторичное моноклональное антитело (биотинилированное), и в заключение применяли стрептавидин. Реакцию с проявляющим раствором (хромогеном) измеряли по оптической плотности (OD) при 450 нм после ее остановки серной кислотой. Стандартную кривую получали с помощью 4-параметрической логистической аппроксимации по методу наименьших квадратов, при этом для получения необходимых результатов проводили интерполяцию концентраций образцов.

Исследование ELISA конкурентного типа (IgE)

Проводили сравнение способности нативных и депигментированных экстрактов ингибировать связывание IgE с каждым биологически стандартизированным собственным эталонным препаратом (in-house reference preparation - IHRP). Планшеты Nunc (Thermo Scientific) покрывали антителом anti-IgE. В планшете инкубировали объединенную сыворотку от пациентов, сенсибилизированных к аллергену. Разбавленные пробы образцов и IHRP инкубировали с аллергеном, меченым пероксидазой. Смесь добавляли в покрытый планшет и инкубировали. После этого добавляли проявляющий раствор (хромоген), останавливали реакцию серной кислотой и измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм.

Ингибиторное исследование ELISA (IgE)

Аллергенную активность in vitro экстрактов (нативных и депигментированных) исследовали с помощью ингибиторного анализа ELISA, для чего устанавливали 50%-ную точку ингибирования, используя нативный экстракт в качестве эталона. Пластиковые микротитрационные планшеты (Immulon 4HBX; Thermo Scientific) покрывали нативным экстрактом (10 мкг белка/мл) и выдерживали в течение ночи. Производили последовательные разбавления 1:2, исходя из нативного и депигментированных экстрактов в планшете Nunc F (Thermo Scientific). Каждую разбавленную пробу инкубировали с объединенным сывороточным пулом в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого разбавленные пробы переносили в планшеты, покрытые нативным экстрактом, и инкубировали в течение 2 часов. После промывания добавляли по 100 мкл раствора антитела anti-human IgE, конъюгированного с пероксидазой, и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. После промывания планшеты проявляли в течение 30 минут (хромогеном) и останавливали реакцию серной кислотой (1 н.).

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

В качестве положительного контроля использовали флавоноиды растений. Контрольные и стандартные пробы наносили на покрытые силикагелем алюминиевые пластинки для ТСХ 60F (Merck, Darmstadt, Germany). В качестве элюента использовали смесь этилацетата, муравьиной кислоты, уксусной кислоты и воды (100:11:11:27), а для проявления использовали обработку 1%-ным метанольным раствором β-этиламинового эфира дифенилборной кислоты с последующей обработкой 5%-ным этанольным раствором полиэтиленгликоля [Poly(ethylene glycol)-4000].

Примеры

Пример 1: Phleum pratense

Депигментированный экстракт Phleum pratense получали согласно приведенным выше стадиям A-C.

Содержание белка

Максимальное содержание белка получали после обработки метиламмонием при pH 8 (865 мкг белка на 1 мг лиофилизированного экстракта), а минимальное содержание белка соответствовало обработке гидроксидом калия при pH 11 (579 мкг белка на 1 мг лиофилизированного экстракта) (Таблица 1). Среднее значение по всем pH составило 718 мкг белка на 1 мг лиофилизированного экстракта.

Самое высокое содержание белка соответствовало обработке с pH 8 (среднее значение 758 мкг белка/мг лиофилизата), а самое низкое соответствовало pH 9 (694 мкг белка/мг лиофилизата) (Таблица 2) (Фигура 2). Содержание белка при всех значениях pH от 7 до 11 было выше, чем у нативного экстракта и у образца с уровнем pH = 6, который является исходным естественным значением для образцов. Данный образец обрабатывали так же, как и депигментированные образцы, но без подщелачивающего изменения pH.

Что касается различных применяемых оснований, то наиболее высокого содержания белка достигали при применении гидроксида лития (739 мкг белка/мг лиофилизата), а самого низкого - при применении мочевины (668 мкг белка/мг лиофилизата) (Таблица 3, Фигура 2).

Количественное определение основного аллергена

Самый низкий уровень соответствовал обработке гидроксидом аммония при pH 10 (13,0 мкг Phl p 5/мг лиофилизированного экстракта) (Таблица 1). Самые высокие уровни соответствовали обработке гидроксидом лития при pH 8 и обработке гидроксидом аммония при pH 11 (41,0 и 38,0 мкг Phl p 5/мг лиофилизированного экстракта, соответственно). Среднее значение по всем депигментированным экстрактам составляло 26,6 мкг Phl p 5/мг лиофилизированного экстракта.

Самое высокое содержание основного аллергена при обработке pH было получено после обработки при pH 8 (31,5 мкг Phl p 5/мг лиофилизированного экстракта), а самое низкое - при pH 10 (23,2 мкг Phl p 5/мг лиофилизированного экстракта) (Фигура 3, Таблица 2). Однако все варианты обработки основаниями обеспечивали более высокое содержание основного аллергена, чем в нативном экстракте и образце с естественным уровнем pH 6 (без обработки).

Самое низкое содержание основного аллергена при обработке основаниями получали при применении гидроксида натрия (24,1 мкг Phl p 5/мг лиофилизированного экстракта), а самое высокое - при применении гидроксида калия (29,1 мкг Phl p 5/мг лиофилизированного экстракта) (Фигура 4, Таблица 3).

Исследование ELISA конкурентного типа (IgE) - Биологическая активность

Самая высокая биологическая активность соответствовала образцам, обработанным метиламмонием при pH 7 и 9 (3052 и 2909 HEPL/мг лиофилизированного экстракта, соответственно) (Фигуры 5 и 6, Таблица 1). Самое низкое значение соответствовало обработкам гидроксидом калия (среднее значение 984 HEPL/мг лиофилизированного экстракта) и было близко к значению нативного экстракта (952 HEPL/мг лиофилизированного экстракта) (Таблица 3). Различия можно было обнаружить между гидроксидом аммония и другими группами (гидроксид калия P = 0,010, критерий Тьюки; мочевина P = 0,005, гидроксид натрия P = 0,012 и гидроксид лития P = 0,049, критерий Манна-Уитни), кроме метиламина. Также наблюдались различия между метиламином и гидроксидом калия. Среднее значение для депигментированных образцов составляло 1685 HEPL/мг лиофилизированного экстракта, т.е. выше, чем результаты, полученные с нативным экстрактом и образцом с естественным pH 6 (т.е. необработанным) (952 и 1262 HEPL/мг лиофилизированного экстракта, соответственно).

Ингибиторное исследование ELISA (IgE)

Количества микрограмм (мкг) лиофилизированного экстракта, необходимые для 50%-ного ингибирования, не показывают корреляции с величинами HEPL/мг (коэффициент корреляции произведений моментов Пирсона, P > 0,050).

Значения для 50% ингибирования для экстрактов после обработки при pH 8 были значительно выше, чем после обработки при pH 11 и 10 (P = 0,030 и P = 0,017, соответственно, ранговый критерий Манна-Уитни) (Фигура 7, Таблица 2). Самое низкое значение соответствовало обработке гидроксидом калия при pH 11 (0,007 мкг), затем следовало значение, соответствующее обработке гидроксидом аммония при pH 11 (0,020 мкг, соответственно) (Таблица 1). Среднее значение составило 0,102 мкг, что аналогично нативному экстракту и образцу при естественном pH 6 (0,105 и 0,097 мкг, соответственно).

Что касается различных использованных оснований, то наивысшее значение для 50%-ного ингибирования соответствовало обработке мочевиной (в среднем 0,195 мкг) (Фигура 8, Таблица 3). Самые низкие значения наблюдали при обработке метиламином (среднее значение 0,066 мкг). Различия обнаруживали между случаями обработки мочевиной и метиламином, гидроксидом аммония, гидроксидом лития, гидроксидом калия и гидроксидом натрия.

Таблица индивидуальных результатов

Таблица № 1: Индивидуальные данные Образцы мкг белка/мг лиофилизата мкг Phl p 5/мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибир. Нативный 603,0 19,6 952,4 0,105 Без обработки, pH6 584,0 21,6 1261,9 0,097 pH7 NaOH 795,3 21,2 765,0 0,116 pH8 NaOH 764,3 25,8 1134,0 0,117 pH9 NaOH 587,0 19,0 1055,1 0,144 pH10 NaOH 755,0 27,2 2149,1 0,101 pH11 NaOH 726,3 27,3 1902,0 0,099 pH7 LiOH 724,3 26,6 1988,0 0,089 pH8 LiOH 773,0 40,1 2538,0 0,131 pH9 LiOH 753,0 26,2 1407,9 0,141 pH10 LiOH 749,5 23,7 1441,4 0,040 pH11 LiOH 693,0 24,9 1164,0 0,054 pH7 KOH 776,0 31,5 1771,4 0,110 pH8 KOH 751,5 34,7 933,5 0,158 pH9 KOH 797,5 33,7 1098,0 0,140 pH10 KOH 711,0 27,3 642,8 0,085 pH11 KOH 578,5 18,2 475,6 0,007 pH7 мочевина 706,5 23,7 1355,7 0,235 pH8 мочевина 689,5 29,2 1744,0 0,168 pH9 мочевина 608,0 26,0 1053,6 0,182 pH7 NH₄OH 645,0 26,4 1897,3 0,081 pH8 NH₄OH 706,0 28,0 2378,3 0,129 pH9 NH₄OH 702,5 16,5 2666,2 0,109 pH10 NH₄OH 681,0 13,0 2487,5 0,068 pH11 NH₄OH 794,0 38,0 2336,6 0,020 pH7 CH₃NH₂ 665,0 24,7 3052,1 0,076 pH8 CH₃NH₂ 864,7 31,2 1885,8 0,084 pH9 CH₃NH₂ 718,0 27,0 2909,2 0,068 pH10 CH₃NH₂ 636,0 24,8 736,7 0,048 pH11 CH₃NH₂ 746,5 29,2 2209,1 0,054

Обобщение результатов, проанализированных по группам

Таблица № 2: Обобщение данных. Средние значения для обработок, выполненных при каждом pH±стандартное отклонение pH мкг белка/мг лиофилизата мкг Phl p 5/мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибир. Нативный 603,0 19,6 952 0,105 6 (без обработки) 584,0 21,6 1262 0,097 7 718,759,4 25,7±3,5 1805±759 0,118±0,060 8 758,2±61,8 31,5±5,2 1769±645 0,131±0,030 9 694,3±82,1 24,7±6,2 1698±858 0,131±0,038 10 706,5±49,6 23,2±5,9 1491±824 0,068±0,025 11 707,7±80,9 27,5±7,2 1617±784 0,047±0,036

Таблица № 3: Обобщение данных. Средние значения для обработок, выполненных с каждым основанием ± стандартное отклонение мкг белка/мг лиофилизата мкг Phl p 5/мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибир. Нативный 603,0 19,6 952 0,105 pH 6 (без обработки) 584,0 21,6 1262 0,097 NaOH 725,6±81,3 24,1±3,8 1401±593 0,115±0,018 LiOH 738,6±30,8 28,3±6,7 1708±553 0,091±0,045 KOH 722,9±86,9 29,1±6,7 984±503 0,100±0,059 Мочевина 668,0±52,7 26,3±2,8 1384±346 0,195±0,036 NH₄OH 705,7±55,0 24,4±9,9 2353±285 0,081±0,042 CH₃NH₂ 726,0±88,8 27,4±2,8 2159±930 0,066±0,015

Для нативных образцов и образцов без обработки не представлены величины стандартных отклонений, поскольку анализировали лишь по одному такому образцу.

SDS и вестерн-блот

Гель-электрофорез SDS и вестерн-блот проводили со всеми депигментированными образцами в сравнении с нативным экстрактом (Phleum).

Гель-электрофорез всех образцов проводили в невосстанавливающих условиях, в акриламидных гелях с 15% T. Все дорожки загружали одинаковым количеством мкг лиофилизированных образцов (по 25 мкг). Гели окрашивали красителем Coomassie R-250. Мембраны инкубировали с объединенным пулом сывороток пациентов, продемонстрировавших IgE к P. pratense (определяли с помощью теста ELISA), разбавленным 1/5. После этого мембраны инкубировали с α-IgE-PO и проявляли посредством хемилюминисценции. Результаты по гель-электрофорезу SDS показаны на Фигуре 9. Вестерн-блоты показаны на Фигуре 10.

Наиболее интенсивные полосы для нативного экстракта наблюдали при 11, 37 и 31 кДа (в порядке интенсивности). Наиболее важным отличием, наблюдавшимся в SDS-электрофореграммах депигментированных образцов, было уменьшение интенсивности высокомолекулярных полос по мере увеличения pH, хотя этот эффект приводил только к снижению интенсивности полос, но не к полному их исчезновению.

Примечание: Некоторые полосы секвенировали в IHRP-стандартах для P. pratense. Phl p 5 обнаруживали в полосе 37 кДа, Phl p 1 - в полосе 31 кДа и Phl p 2 (или 3) и 6 обнаруживали в полосе 12 кДа. Эти аллергены были описаны в IUIS, но с несколько другими молекулярными массами: Phl p 5 при 32 кДа, Phl p 1 при 27 кДа, Phl p 2 при 10-12 кДа и Phl p 6 при 11 кДа. Другими аллергенами, описанными в IUIS, являются Phl p 4 и 13 при 55 кДа, Phl p 7 (кальций-связующий белок) при 6 кДа, Phl p 11 (родственный Ole e 1) при 20 кДа и Phl p 12 (профилин) при 14 кДа.

Кроме того, были выполнены вестерн-блоты (Фигура 10). Наиболее интенсивные полосы в нативном экстракте соответствовали 37, 31, 59, 15 и 12 кДа (в порядке интенсивности), что может соответствовать Phl p 5, Phl p 1, Phl p 4, Phl p 12 и Phl p 2 и 6 (последние два попадали в одну и ту же полосу), соответственно. Никаких важных различий в интенсивности полос при изменениях pH не наблюдали.

Обобщение

В большинстве случаев обработки основаниями (в 26 из 28) содержание белка было выше, чем у нативного и необработанного образцов, что подтверждало факт влияния щелочной обработки на результат.

Что касается содержания основного аллергена, то уровни Phl p 5 были выше при щелочной обработке с pH 8.

По результатам исследования ELISA конкурентного типа (REINA) не было выявлено очевидной тенденции в зависимости от обработки pH или основаниями, хотя обработка гидроксидом аммония показала несколько более высокую биологическую активность обработанного экстракта.

По результатам ингибиторного теста ELISA (IgE), максимально высокие значения (количества мкг для 50% ингибирования) соответствовали pH 10 и 11.

На белковые профили и аллергенные профили ни обработки при различных pH, ни обработки различными основаниями никакого существенного влияния не оказывали.

Общие выводы

В целом, обработка основаниями дала более высокие результаты в отношении концентрации белков и содержания основного аллергена. На профили белков и основного аллергена в электрофореграммах SDS-PAGE обработка основаниями не влияла.

Пример 2: Olea europea

Депигментированный экстракт Olea europaea получали согласно приведенным выше стадиям A-C.

Содержание белка

Максимальное содержание белка получали после обработки метиламином при pH 9 (862 мкг белка на 1 мг лиофилизированного экстракта), а минимальное содержание белка соответствовало обработке гидроксидом натрия при pH 10 (441 мкг белка на 1 мг лиофилизированного экстракта). Среднее значение составило 696 мкг белка на 1 мг лиофилизированного экстракта (Таблица 4, Фигуры 11 и 12).

Исследование ELISA конкурентного типа (IgE) - Биологическая активность

Среднее значение составило 302 HEPL/мг лиофилизированного экстракта. Самое высокое значение соответствовало образцу, обработанному гидроксидом натрия при pH 8 (582 HEPL/мг), а самое низкое значение соответствовало обработке метиламином при pH 7 (128 HEPL/мг) (Таблица 4).

Самая высокая биологическая активность наблюдалась в случае обработки при pH 8 (347 HEPL/мг), а самая низкая - в случае обработки при pH 9 (236 HEPL/мг) (Таблица 5, Фигура 13).

Ингибиторное исследование ELISA (IgE)

Количества лиофилизированного экстракта, необходимые для достижения 50%-ного ингибирования, обратно пропорциональны биологической активности экстракта. Количество микрограмм лиофилизированного экстракта, необходимое для достижения 50% ингибирования, не показывает существенной корреляции с величинами HEPL/мг (согласно ранговой корреляции Спирмена). Самое низкое значение соответствовало обработке мочевиной при pH 9 (0,043 мкг), а самое высокое значение соответствовало обработке гидроксидом лития при pH 10 (0,132 мкг) (Таблица 4). Среднее значение по всем депигментированным образцам составило 0,088 мкг.

Величины, полученные при различных pH, были очень близкими друг другу (Таблица 5, Фигура 15). Более заметные различия получали при использовании различных оснований. Самое высокое значение было получено при обработке гидроксидом лития (средняя величина 0,108 мкг), а самое низкое - при обработке мочевиной (0,057 мкг) (Таблица 4, Фигура 16).

Таблица индивидуальных результатов

Таблица № 4: Индивидуальные данные Образцы мкг белка/мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибирования Нативный 603,0 294,6 0,079 Без обработки, pH6 750,0 380,1 0,059 pH7 NaOH 735,5 467,8 0,083 pH8 NaOH 644,5 582,0 0,105 pH9 NaOH 790,5 157,0 0,105 pH10 NaOH 440,5 219,3 0,112 pH11 NaOH 694,0 233,7 0,106 pH7 LiOH 687,5 208,8 0,120 pH8 LiOH 631,5 270,3 0,073 pH9 LiOH 522,5 245,0 0,117 pH10 LiOH 670,5 368,5 0,132 pH11 LiOH 660,0 529,1 0,101 pH7 KOH 722,5 206,1 0,084 pH8 KOH 701,5 248,6 0,074 pH9 KOH 747,5 182,1 0,072 pH10 KOH 681,5 206,7 0,072 pH11 KOH 648,5 322,0 0,079 pH7 мочевина 712,0 469,1 0,076 pH8 мочевина 617,0 461,0 0,052 pH9 мочевина 828,0 153,8 0,043 pH7 NH₄OH 706,0 168,2 0,083 pH8 NH₄OH 856,5 288,7 0,097 pH9 NH₄OH 814,5 439,7 0,077 pH10 NH₄OH 713,5 351,8 0,101 pH11 NH₄OH 552,0 211,3 0,066 pH7 CH₃NH₂ 750,0 127,9 0,096 pH8 CH₃NH₂ 540,0 233,3 0,095 pH9 CH₃NH₂ 862,0 238,1 0,091 pH10 CH₃NH₂ 795,0 430,1 0,066 pH11 CH₃NH₂ 774,5 429,1 0,092

Обобщение результатов, проанализированных по группам

Таблица № 5: Обобщение данных. Средние значения для обработок, выполненных при каждом pH ± стандартное отклонение pH мкг белка/мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибирования Нативный 603,0 294,6 0,079 6 (без обработки) 750,0 380,1 0,059 7 718,9±22,2 274,7±153,0 0,090±0,016 8 665,2±107,2 347,3±141,5 0,083±0,020 9 760,8±122,9 235,9±107,2 0,084±0,026 10 660,2±132,1 315,3±97,9 0,096±0,027 11 665,8±80,5 345,0±133,9 0,089±0,016

Таблица № 6: Обобщение данных. Средние значения для обработок, выполненных с каждым основанием ± стандартное отклонение мкг белка/мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибирования Нативный 603,0 294,6 0,079 pH 6 (без обработки) 750,0 380,1 0,059 NaOH 661,0±134,4 331,9±183,0 0,102±0,011 LiOH 634,4±65,8 324,3±128,9 0,108±0,023 KOH 700,3±37,9 233,1±55,1 0,076±0,005 Мочевина 719,0±105,7 361,3±179,7 0,057±0,017 NH₄OH 728,5±118,0 291,9±108,7 0,085±0,014 CH₃NH₂ 744,3±121,6 291,7±133,4 0,088±0,012

Для нативных образцов и образцов без обработки не представлены величины стандартных отклонений, поскольку анализировали лишь по одному такому образцу.

Иммуно-блот и гель-электрофорез SDS-PAGE

Гель-электрофорез SDS и вестерн-блот проводили со всеми депигментированными образцами в сравнении с нативным экстрактом.

Гель-электрофорез всех образцов проводили в невосстанавливающих условиях, в акриламидных гелях с 15% T. Все дорожки загружали одинаковым количеством мкг лиофилизированных образцов (по 25 мкг). Гели окрашивали красителем Coomassie R-250. Кроме того, мембраны для вестерн-блота инкубировали с объединенным пулом сывороток пациентов, продемонстрировавших IgE к O. europaea (определяли с помощью теста ELISA), разбавленным 1/5. После этого мембраны инкубировали с α-IgE-PO и проявляли посредством хемилюминисценции.

Наиболее интенсивные полосы на SDS электрофореграмме нативного экстракта наблюдали при 20 и 18 кДа (в порядке интенсивности, Фигура 22). Обе полосы были обнаружены по данным собственных стандартов (IHRP) как относящиеся к Ole e 1, основному аллергену Olea. Также наблюдали полосы при 10,5, 42, 48, 73 и 89 кДа. Другими аллергенами, описанными в IUIS, являются Ole e 2 (профилин, 15 кДа), Ole e 3 (полкальцин, 9 кДа), Ole e 4 (32 кДа), Ole e 5 (16 кДа), Ole e 6 (10 кДа), Ole e 7 (nsLTP, 9-10 кДа), Ole e 8 (21 кДа), Ole e 9 (46 кДа), Ole e 10 (11 кДа) и Ole e 11 (39,4 кДа).

Наиболее важным отличием, наблюдавшимся в SDS-электрофореграммах депигментированных образцов, было уменьшение интенсивности высокомолекулярных полос по мере того, как pH становился более щелочным, особенно при pH 11. Однако в случае обработок мочевиной это наблюдалось и при pH 9.

Кроме того, были выполнены вестерн-блоты (Фигура 18). Наиболее интенсивные полосы в нативном экстракте соответствовали 19 и 17 кДа (Ole e 1). Другие полосы наблюдали при 13, 34, 38, 48 и 74 кДа. В случае обработок основаниями никаких явных отличий не наблюдали. Однако полосы при 34 и 13 кДа терялись при высоких значениях pH (при pH 9 в случае с мочевиной, при pH 10 и 11 в случаях с другими основаниями).

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Тонкослойную хроматографию проводили на всех образцах, и результаты сравнивали с результатами нативного образца. Для технического контроля также использовали эталонные стандарты (растительного происхождения).

Полученные результаты показаны на Фигуре 19. В образцах Olea наблюдали до пяти различных флавоноидов. Интенсивность в случае нативного экстракта была выше, чем в депигментированных образцах.

Обобщение

Результаты по белковому содержанию и исследованию ELISA (REINA) конкурентного типа: никаких существенных различий между группами не наблюдали.

В отношении результатов ингибиторного исследования ELISA (IgE) никаких различий не наблюдали в случае обработки при различных значениях pH, однако в случае обработки различными основаниями такие различия наблюдались. Самая низкая биологическая активность (самое большее количество мкг, требуемое для достижений 50% ингибирования) соответствовала образцам, обработанным гидроксидом натрия и гидроксидом лития.

В представленных белковых профилях и аллергенных профилях в целом наблюдали ослабление высокомолекулярных полос по мере увеличения pH (при pH 9-10), особенно при обработке мочевиной.

Тонкослойная хроматография показала снижение количества пигментов в экстрактах при обработке основаниями.

Общие выводы

1. В целом, обработка экстрактов O. europeae основаниями обеспечивала более высокие результаты в смысле белкового содержания по сравнению с нативным экстрактом.

2. Наблюдали убыль белков (и аллергенов) с высокой молекулярной массой при обработке более высокими pH, что подразумевает обогащение экстрактов основными аллергенами (имеющими более низкую молекулярную массу).

Пример 3: D. pteronyssinus

Депигментированный экстракт D. pteronyssinus получали согласно приведенным выше стадиям A.

Содержание белка

Максимальное содержание белка получали после обработки гидроксидом аммония при pH 7 (710 мкг белка/мг лиофилизированного экстракта), а минимальная концентрация соответствовала обработке CH₃NH₂ при pH 8 (561,5 мкг белка/мг лиофилизированного экстракта) (Таблица 7). Средняя величина по всем депигментированным образцам составила 5985 мкг белка/мг лиофилизированного экстракта (Таблица 7).

При всех вариантах обработки содержание белка было выше, чем в нативном экстракте.

В отношении использования конкретных оснований, самое высокое содержание белка получали при обработке гидроксидом аммония, а самое низкое - при обработке гидроксидом натрия (NaOH) (Таблица 9, Фигура 21).

Содержание основного аллергена

Самый высокий уровень Der p 1 соответствовал нативному экстракту (20,3 мкг Der p 1/мг лиофилизированного экстракта), затем следовали образцы, обработанные при pH 7 и 9 (в среднем 17,6 и 17,1 мкг Der p 1/мг лиофилизированного экстракта, соответственно). Среднее значение по всем депигментированным образцам составило 16,1 мкг Der p 1/мг лиофилизированного экстракта (Фигура 22, Таблицы 7 и 8).

Что касается обработки различными основаниями, то самыми высокими были уровни Der p 1 у образцов, обработанных гидроксидом аммония и метиламином (в среднем 18,6 и 18,4 мкг Der p 1/мг лиофилизированного экстракта, соответственно) (Фигура 23, Таблица 9).

Исследование ELISA конкурентного типа (IgE)

Самая высокая биологическая активность соответствовала образцам, обработанным при pH 7 гидроксидом аммония (707 HEPL/мг лиофилизированного экстракта). Самое низкое значение соответствовало обработкам NaOH (185,5 и 168,3 HEPL/мг лиофилизированного экстракта при pH 10 и 11, соответственно) (Таблица 7). Среднее значение по всем депигментированным образцам составило 356 HEPL/мг лиофилизированного экстракта (Фигуры 29 и 30).

Ингибиторное исследование ELISA (IgE)

Количества микрограммов лиофилизированного экстракта, необходимые для достижения 50%-ного ингибирования, были обратно пропорциональны величинам HEPL/мг.

Самое низкое значение для 50%-ного ингибирования соответствовало обработке метиламмонием при pH 9, после чего следовал нативный экстракт (0,024 и 0,030 мкг, соответственно, Таблица 7).

Никаких очевидных различий между группами с обработкой различными pH не наблюдали (Фигура 26, Таблица 8). Что касается использованных оснований, то самые высокие значения для 50%-ного ингибирования соответствовали обработкам LiOH (в среднем 0,043 мкг). Самые низкие значения наблюдали для нативного экстракта, обработанного гидроксидом аммония, и образца с естественным уровнем pH 6 (не подвергнутого обработке) (0,030, 0,39 и в среднем 0,04, соответственно) (Фигура 27, Таблица 9).

Таблица индивидуальных результатов

Таблица № 7: Индивидуальные данные Образцы мкг белка/мг лиофилизата мкг Der p 1/мг лиофилизата мкг Der p 2/ мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибирования Нативный 400,5 20,3 14,6 223,9 0,030 Без обработки, pH6 610,0 16,6 24,7 489,4 0,038 pH7 NaOH 602,0 17,6 17,3 502,0 0,033 pH8 NaOH 581,0 12,5 16,2 412,4 0,033 pH9 NaOH 567,0 16,1 16,4 185,5 0,035 pH10 NaOH 587,5 14,0 15,9 168,3 0,048 pH11 NaOH 590,0 11,5 18,0 171,9 0,053 pH7 LiOH 610,5 16,2 19,0 332,0 0,040 pH8 LiOH 562,3 12,2 15,8 288,9 0,041 pH9 LiOH 608,3 15,7 16,6 321,5 0,043 pH10 LiOH 630,5 12,7 16,4 376,0 0,048 pH11 LiOH 661,5 8,9 17,9 375,3 0,043 pH7 KOH 655,0 16,1 19,6 404,2 0,031 pH8 KOH 574,5 18,5 18,9 394,5 0,039 pH9 KOH 611,5 14,7 19,4 360,6 0,046 pH10 KOH 585,5 14,2 15,9 441,8 0,048 pH11 KOH 581,0 11,0 20,0 331,0 0,047 pH7 NH₄OH 710,0 19,3 19,7 707,3 0,038 pH8 NH₄OH 612,5 19,5 16,6 468,9 0,037 pH9 NH₄OH 699,0 19,5 16,4 511,4 0,037 pH10 NH₄OH 701,0 19,2 16,4 671,1 0,034 pH11 NH₄OH 645,0 15,3 15,2 481,5 0,048 pH7 CH₃NH₂ 632,0 19,0 16,3 218,2 0,048 pH8 CH₃NH₂ 561,5 20,5 17,8 232,8 0,049 pH9 CH₃NH₂ 600,5 19,5 15,8 279,0 0,024 pH10 CH₃NH₂ 658,5 17,2 14,5 335,2 0,041 pH11 CH₃NH₂ 648,5 15,6 15,3 423,5 0,045

Обобщение результатов, проанализированных по группам

Таблица № 8: Обобщение данных. Средние значения для обработок, выполненных при каждом pH ± стандартное отклонение pH мкг белка/мг лиофилизата мкг Der p 1/мг лиофилизата мкг Der p 2/ мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибирования Нативный 400,5 20,26 14,63 223,9 0,030 6 (без обработки) 610,0 16,63 24,66 489,4 0,038 7 641,9±44,6 17,6±3,1 18,4±1,5 432,8±144,2 0,038±0,006 8 578,4±46,2 16,6±3,3 17,1±1,5 359,5±145,4 0,040±0,006 9 617,3±45,7 17,1±3,3 16,9±1,5 331,6±146,6 0,037±0,007 10 632,6±44,9 15,5±3,3 15,8±1,7 398,5±140,8 0,044±0,007 11 625,2±44,4 12,5±3,3 17,3±1,7 356,6±132,9 0,047±0,007

Таблица № 9: Обобщение данных. Средние значения для обработок, выполненных с каждым основанием ± стандартное отклонение мкг белка/мг лиофилизата мкг Der p 1/мг лиофилизата мкг Der p 2/ мг лиофилизата HEPL/мг мкг/50% ингибирования Нативный 400,5 20,26 14,63 223,9 0,030 6 (без обработки) 610,0 16,63 24,66 489,4 0,038 NaOH 585,5±12,8 14,35±2,52 16,77±0,85 288,0±157,8 0,040±0,009 LiOH 614,6±36,2 13,16±2,95 17,12±1,31 338,7±37,3 0,043±0,003 KOH 601,5±33,0 14,90±2,74 18,76±1,65 386,4±42,4 0,042±0,007 NH₄OH 673,5±42,6 18,55±1,83 16,84±1,67 568,1±112,4 0,039±0,005 CH₃NH₂ 620,2±39,5 18,35±1,92 15,93±1,22 297,7±83,9 0,041±0,010

Для нативных образцов и образцов без обработки не представлены величины стандартных отклонений, поскольку анализировали лишь по одному такому образцу.

Иммуно-блот и гель-электрофорез SDS-PAGE

Гель-электрофорез SDS и вестерн-блот проводили со всеми депигментированными образцами в сравнении с нативным экстрактом.

Гель-электрофорез всех образцов проводили в невосстанавливающих условиях, в акриламидных гелях с 15% T. Все дорожки загружали одинаковым количеством мкг лиофилизированных образцов (по 35 мкг). Гели окрашивали красителем Coomassie R-250.

Иммуноблоты выполняли путем перенесения белков на мембраны, которые затем инкубировали с объединенным пулом сывороток пациентов, продемонстрировавших IgE к D. pteronyssinus (определяли с помощью теста ELISA), разбавленным 1/10. После этого мембраны инкубировали с α-IgE-PO и проявляли посредством хемилюминисценции.

Наиболее интенсивные полосы на SDS электрофореграмме нативного экстракта наблюдали при 31, 28 и 15 кДа (Фигура 35). На SDS электрофореграммах депигментированных образцов никаких существенных различий в белковом профиле не наблюдали.

Примечание: Некоторые полосы секвенировали в IHRP-стандартах для D. pteronyssinus. Der p 1 и Der p 3 обнаруживали в полосе 31 кДа, а Der p 10 и Der p 8 обнаруживали в полосе 28 кДа. Der p 2 обнаруживали при 15 kDa с использованием моноклонального антитела α-Der p 2.

Кроме того, были выполнены вестерн-блоты (Фигура 29). Наиболее интенсивные полосы в нативном экстракте соответствовали 15, 28, 37, 46 и 60 кДа. Полоса 46 кДа в депигментированных экстрактах была слабее. В некоторых случаях полоса при 60 кДа исчезала (при щелочных обработках), тогда как полоса при 80 кДа выглядела более интенсивной по сравнению с нативным экстрактом.

Обобщение

Содержание белка не зависело от вариантов обработки (никаких существенных отличий между группами не наблюдали). Депигментированные образцы отличались более высоким содержанием белка по сравнению с нативным экстрактом. Однако эта разница не была значительной (исследовали только один нативный образец). Даже образец с естественным pH 6 (без обработки) продемонстрировал более высокое содержание белка, чем нативный экстракт, аналогичное величинам для обработанных образцов. Таким образом, увеличение белкового содержания в этих образцах по сравнению с нативным экстрактом скорее всего связано с более высокой степенью очистки этих образцов (их диализировали в 5 раз больше).

Что касается содержания основного аллергена, то на уровни Der p 1 и Der p 2 влияло использование мочевины, но не изменения в pH.

В отношении исследования ELISA конкурентного типа (REINA) и ингибиторного исследования ELISA худшие результаты (самые низкие значения HEPL/мг и самые высокие количества мкг для 50%-ного ингибирования) соответствовали образцам, обработанным мочевиной.

Белковые профили не показали значительных различий при различных вариантах депигментационной обработки, тогда как аллергенные профили такие различия показали. Единственное общее различие наблюдалось у обработок мочевиной, которые снижали интенсивность полос. Вестерн-блоты образцов, депигментированных щелочными уровнями pH, снижали четкость распознавания полос в области высоких молекулярных масс.

Общие выводы

1. Содержание белка выше в «депигментированных» экстрактах, чем в нативных.

2. Обработки с высокими уровнями pH снижали четкость распознавания белков с высокой молекулярной массой в иммуноблоте.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно, к способу получения депигментированного экстракта аллергена, к композиции, вакцине на его основе. Способ получения депигментированного экстракта аллергена, включающий: a) подщелачивание нативного экстракта аллергена до pH от 7 до 11 в течение от 1 минуты до 24 часов; затем b) подвергание указанного экстракта стадии удаления первой молекулярной фракции для удаления молекул размером менее 3,5 кДа; и c) доведение pH до нейтрального значения с получением депигментированного экстракта аллергена. Депигментированный экстракт аллергена для лечения аллергии. Депигментированный полимеризованный экстракт аллергена для лечения аллергии. Фармацевтическая композиция для лечения аллергии, содержащая экстракт аллергена. Вакцина для лечения аллергии, содержащая экстракт аллергена. Депигментированный экстракт аллергена, полученный вышеописанным способом, характеризуется повышенным содержанием аллергена и повышенной биологической активностью. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 29 ил., 9 табл., 3 пр.

1.Способ получения депигментированного экстракта аллергена, включающий:

a) подщелачивание нативного экстракта аллергена до pH от 7 до 11 в течение от 1 минуты до 24 часов; затем

b) подвергание указанного экстракта стадии удаления первой молекулярной фракции для удаления молекул размером менее 3,5 кДа; и

c) доведение pH до нейтрального значения с получением депигментированного экстракта аллергена.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий полимеризацию, при этом указанная полимеризация включает:

d) приведение депигментированного экстракта аллергена в контакт с альдегидом; затем

e) подвергание указанного экстракта стадии удаления второй молекулярной фракции для удаления молекул размером менее 100 кДа; затем

f) проведение стадии (e) при 3-15, предпочтительно при 3-5°C до тех пор, пока электропроводность экстракта аллергена, измеренная при комнатной температуре, не станет менее 210 мкСм/см, и/или до исчезновения альдегида, определенного сканированием в УФ или видимом диапазоне света, с получением депигментированного полимеризованного экстракта аллергена.

3. Способ по пп. 1 или 2, отличающийся тем, что нативный экстракт аллергена подщелачивают до pH по меньшей мере 7,5, 8,0, 8,5 или 9,0, при этом указанный нативный экстракт аллергена подщелачивают до pH не более 11, 10,5, 10,0, 9,5 или 9,0.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что стадию (a) проводят в течение от 5 до 30 минут.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что стадии удаления первой и второй низкомолекулярных фракций b) и e) независимо включают стадию ультрафильтрации, стадию диафильтрации, стадию диализа или фильтрование.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что на стадии c) pH доводят до значения в пределах от 7,0 до 7,5, например, от 7,3 до 7,4.

7. Депигментированный экстракт аллергена для лечения аллергии, полученный по способу по любому из пп. 1 и 3-5.

8. Депигментированный полимеризованный экстракт аллергена для лечения аллергии, полученный или получаемый по способу по любому из пп. 2-6.

9. Экстракт аллергена по п. 7 или 8, отличающийся тем, что указанный экстракт аллергена получен из исходного материала, выбранного из пищевых аллергенов, переносимых по воздуху аллергенов, эпителиальных аллергенов и аллергенов насекомых.

10. Экстракт аллергена по п. 7 или 8, отличающийся тем, что указанный экстракт аллергена получен из исходного материала, выбранного из пыльцы, пылевых клещей, грибов, плесени, шерсти животных и перхоти животных.

11. Экстракт по п. 7 или 8, отличающийся тем, что указанный экстракт аллергена получен из исходного материала, выбранного из Arachis hypogaea, Alnus glutinosa, Betula alba, Corylus avellana, Cupressus arizonica, Olea europaea, Platanus sp, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis, Ambrosia elatior, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali, Avena sativa, Hordeum vulgare, Secale cereale, Triticum aestivum, Zea mays, Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, Glycophagus domesticus, Chortoglyphus arcuatus, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, кошачьей шерсти и перхоти, собачьей шерсти и перхоти, лошадиной шерсти и перхоти, волос и перхоти человека, шерсти и перхоти кроликов, шерсти и перхоти крыс, шерсти и перхоти мышей, шерсти и перхоти морских свинок, а также перьев птиц, муравьев, блох, тараканов, яда ос и пчел и аллергенов членистоногих.

12. Экстракт аллергена по п. 7 или 8, исходный материал для которого выбран из пыльцы и клещей.

13. Экстракт аллергена по п. 7 или 8, исходный материал для которого выбран из Phleum pratense, Olea europaea, Betula alba (pendula) и Dermatophagoides pteronyssinus.

14. Экстракт аллергена по любому из пп. 7-13 для применения для лечения аллергии.

15. Экстракт аллергена по п. 14 для применения для лечения аллергии на пыльцу.

16. Фармацевтическая композиция для лечения аллергии, содержащая экстракт аллергена по любому из пп. 7-13.

17. Вакцина для лечения аллергии, содержащая экстракт аллергена по любому из пп. 7-13.