МАСКИРОВКА КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ДИОКСИДА КРЕМНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C01B33/18 A61K47/10 A61K9/14 

Настоящее изобретение относится к способу обработки кристаллического диоксида кремния и к полученным таким образом тонкодисперсным порошкам кристаллического диоксида кремния.

Силикоз, который представляет собой узелковый фиброз легких, может быть вызван длительным и интенсивным вдыханием альвеолярных респирабельных фракций кристаллического SiO₂, и при хроническом воздействии может привести к образованию опухолей легких. Следовательно, Международное агентство по изучению рака (МАИР, IARC) отнесло фракцию А кварца и кристобалита к канцерогену класса 1 для человека. Однако настоящая опасность, исходящая от конкретных видов SiO₂, по существу зависит от их происхождения и от их химической, термической и механической обработки, и соответствующей ситуации промышленного воздействия (IARC (1997), Silica, some silicates, coal dust and para-aramid fibrils. Lyon: IARC, стр. 41-240. ISBN 9 283 21268 1).

Имея один и тот же химический и минералогический состав матрицы SiO₂, материалы с модифицированной поверхностью могут обладать радикально разными потенциалами токсичности (Fubini (1998), Surface chemistry and quartz hazard. Ann Occup Hyg; 42(8): 521-30, и (1998a) Health effects of silica. В «The Surface Properties of Silica». New York: Wiley, стр. 415-464. ISBN 978 0 4719 5332 6).

Согласно технике безопасности на производстве и потребителей было бы желательно селективно модифицировать поверхности кристаллического диоксида кремния, чтобы в результате подавить описанную нежелательную биологическую активность поверхности, но сохранить технологически важные свойства, такие как хорошее смачивание водными растворами. Таким образом, применение тонкодисперсных порошков SiO₂ с модифицированной поверхностью может быть дополнительной мерой управления риском для защиты от силикоза в промышленных отраслях, в которых обрабатывают или производят кристаллический SiO₂, в дополнение к соблюдению пределов профессиональных воздействий, определенных органами власти.

Реакционноспособные силанольные группы на поверхности SiO₂ были описаны Шлипкотером (Schlipköter) и Брокгаузом (Brockhaus) (1961) как очень важный инициирующий фактор патологических эффектов. Таким образом, их дезактивация могла бы привести к снижению риска при обработке SiO₂.

JP 2005263566 описывает способ предотвращения затвердевания кварцевой пыли при обработке кварцевой пыли полиалкиленгликолем. Описанная кварцевая пыль представляет собой аморфный материал, имеющий особенно малый размер зерен.

Согласно литературе N-оксиды поливинилпиридина и соли алюминия, такие как лактат алюминия, неоднократно исследовали на модификацию поверхности кварца и таким образом на предотвращение силикоза. Однако на сегодняшний день не удалось продемонстрировать достаточную эффективность in vivo для таких нековалентно связанных веществ (Weller (1975) Long-term test on rhesus monkeys for the PVNO therapy of anthracosilicosis. Inhaled Part; 4(1): 379-87, 1975; Zhao et al. (1983) Long-term follow-up observations of the therapeutic effect of PVNO on human silicosis. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg B; 178(3): 259-62; Prügger et al. (1984) Polyvinylpyridine N-oxide (Bay 3504, P-204, PVNO) in the treatment of human silicosis. Wien Klin Wochenschr; 96(23): 848-53; Bégin et al. (1986) Aluminum lactate treatment alters the lung biological activity of quartz. Exp Lung Res; 10: 385-99; Goldstein and Rendall (1987) The prophylactic use of polyvinylpyridine-N-oxide (PVNO) in baboons exposed to quartz dust. Environ Res; 42(2): 469-81; Dubois et al. (1988) Aluminum inhalation reduces silicosis in a sheep model. Am Rev Respir Dis; 137(5): 1172-9; Dufresne et al. (1994) Influence of aluminum treatments on pulmonary retention of quartz in sheep silicosis. Exp Lung Res; 20(2): 157-68; Bégin et al. (1995) Further information on aluminum inhalation in silicosis. Occup Environ Med; 52(11): 778-80).

Таким образом, до сих пор существует потребность в более эффективных решениях для модификации тонкодисперсных порошков кристаллического SiO₂ в отношении более низкого потенциала тонкодисперсных порошков вызывать нежелательные биологические эффекты.

Задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы обеспечить такой способ.

Эта цель достигается способом обработки кристаллического диоксида кремния, включающим стадию измельчения кристаллического диоксида кремния вместе с веществом в количестве от 0,05 до 1,00% масс., выбранным из группы, состоящей из многоатомных спиртов, каолина, алкоголятов алюминия и их смесей.

Таким образом, согласно изобретению кристаллический диоксид кремния измельчают вместе с многоатомным спиртом, алкоголятом алюминия или каолином. Это служит для тщательного перемешивания и немедленной реакции многоатомного спирта, алкоголята алюминия и/или каолина с кристаллическим диоксидом кремния и его свежеразломанной/образовавшейся поверхностью.

На этом этапе фактическое изменение размера зерен кристаллического диоксида кремния на стадии измельчения маловажно, тогда как важно разрушение с образованием реакционноспособных поверхностей.

Подходящими размерами зерен тонкодисперсного порошка кристаллического диоксида кремния являются размеры зерен d50 в пределах диапазона от 0,2 до 90 мкм, более предпочтительно 0,3 до 10 мкм после измельчения.

d50 означает размер зерен, при котором 50% по объему больше, чем заданное значение D50, и 50% по объему меньше, чем значение D50. Такие значения можно получить с помощью лазерной дифрактометрии.

Обычно значение d90 таких материалов из измельченного диоксида кремния примерно в два - три раза больше значения d50, значение d95 примерно в пять раз выше. Если в документе 1 мкм описан как верхний предел размера зерен, то это означает значение d50 порядка самое большее 0,3 мкм, вероятно даже меньше. Типичные значения для таких материалов составляют:

- d50 = 0,5 мкм → d90 = 1 мкм;

- d50 = 2 мкм → d90 = 6 мкм;

- d50 = 3 мкм → d90 = 10 мкм.

Материалы с размером зерен d50 в пределах диапазона 0,5 мкм или менее не могут быть больше эффективно превращены в порошок механическими способами.

Предпочтительно, полученный по изобретению продукт имеет d90 1 мкм или более, предпочтительно 2 мкм или более. Например, значение d90 может находиться в диапазоне 1 до 30 мкм, предпочтительно 1 до 15 мкм после измельчения.

«Кристаллический диоксид кремния», как используется в настоящем изобретении, означает диоксид кремния, который имеет по меньшей мере 70% кристаллической массовой доли. Кристаллическую долю измеряют рентгенодифракционным методом. Предпочтительно, кристаллическая доля составляет по меньшей мере 75% масс.

Определение кристаллической доли диоксида кремния можно осуществить способом, описанным в экспериментальной части.

Особенно предпочтительные диоксиды кремния включают кварц, кристобалит или тридимит, особенно в форме тонкодисперсных порошков.

Глицерин и полиэтиленгликоли или полипропиленгликоли, в частности, подходят в качестве указанных многоатомных спиртов. Также можно использовать смеси этих веществ или сополимеры.

Предпочтительным является применение глицерина и полиэтиленгликолей.

Подходящие полиэтиленгликоли включают, в частности, ПЭГ200, ПЭГ300, ПЭГ500, ПЭГ1500, ПЭГ35000 и их смеси.

Предпочтительно, указанный многоатомный спирт имеет молярную массу в пределах диапазона от 92 до 50000 г/моль.

Каолин представляет собой белую породу, основным компонентом которой является каолинит, алюмосиликат пластинчатой формы, имеющий размер зерен (d50) менее 10 мкм. Предпочтительными являются каолины, имеющие d50 менее 2 мкм.

Триизопропилат алюминия (трис-изопропоксид алюминия), в частности, является подходящим алкоголятом алюминия.

Неожиданно было показано, что цитотоксический и провоспалительный потенциал тонкодисперсного порошка кристаллического диоксида кремния может быть снижен способом по изобретению.

Цитотоксический и провоспалительный потенциал можно измерить способами, описанными в экспериментальной части заявки. Этот способ осуществляли на образцах и стандартах из Института токсикологии и экспериментальной медицины им. Фраунгофера (Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin, ITEM) (Ганновер, Германия).

Также изобретение относится к составу кристаллического диоксида кремния, содержащему кристаллический диоксид кремния и от 0,05 до 1,00% масс. вещества, выбранного из группы, состоящей из многоатомных спиртов, алкоголятов алюминия, каолина и их смесей.

Такой состав по изобретению содержит по меньшей мере 97% масс. диоксида кремния, предпочтительно по меньшей мере 98% масс. диоксид кремния, или 99% масс. или более диоксида кремния, как измерено рентгенофлуоресцентным методом.

Степень кристалличности этого диоксида кремния составляет по меньшей мере 70% масс. или более, как измерено рентгенодифракционным методом.

Также состав кристаллического диоксида кремния по изобретению имеет предпочтительные размеры зерен d50 в пределах диапазона от 0,2 до 90 мкм, измеренные как d50, более предпочтительно в пределах диапазона от 0,3 до 10 мкм.

Дополнительно изобретение относится к применению многоатомных спиртов, алкоголята алюминия и/или каолина для снижения цитотоксического и провоспалительного потенциала кристаллического диоксида кремния, и к составу кристаллического диоксида кремния, получаемому способом по изобретению.

На фигуре 1 показано высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) для измерения индукции повреждения мембраны стандартными материалами.

На фигуре 2 показано высвобождение ЛДГ для измерения индукции повреждения мембраны разными образцами кварцевого тонкодисперсного порошка по сравнению со стандартами.

На фигуре 3 показана количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) Cxcl2 (метод Δ-CT) для измерения индукции экспрессии гена Cxcl2 разными образцами кварцевого тонкодисперсного порошка в первичных альвеолярных макрофагах крысы на основе гена Hprt1 в качестве референсного гена.

Материалы

Отрицательный контроль (образец: 1): среда для культивирования клеток D-MEM (минимальная эссенциальная среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко) плюс 10% фетальная бычья сыворотка (ФБС).

В качестве отрицательного контроля без частиц/контроля наполнителем использовали минимальную эссенциальную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко, (D-MEM) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), GlutaMaxTM и пируватом натрия (110 мг/л) от Life Technologies GmbH (Дармштадт, Германия) согласно публикации (Ziemann et al., 2017, и Ziemann C, Reamon-Buettner SM, Tillmann T et al. (2014b) The SILICOAT project: In vitro and in vivo toxicity screening of quartz varieties from traditional ceramics industry and approaches for an effective quartz surface coating. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol; 387 (Suppl 1): стр. 23).

Отрицательный контроль с частицами (образец: 2): оксид алюминия (Al₂O₃).

Чтобы иметь возможность разграничить общие эффекты частиц и вызванные кварцем эффекты, параллельно использовали оксид алюминия (Al₂O₃; «порошок оксида алюминия, <10 мм, 99,5% trace metal basis»; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен) в качестве отрицательного контроля с частицами. Исследования in vitro показали, что Al₂O₃ почти не обладает неблагоприятной биологической активностью на используемой модельной системе (Ziemann et al., 2009; Ziemann et al., 2014; Ziemann et al., 2017).

Положительный контроль (эффекты кварца; образец: 3): кварц DQ12 (DQ12).

В качестве положительного контроля для зависимых от кварца эффектов использовали кварц DQ12 от Dörentrup (87% α-кварц, 13% аморфного SiO₂; массовый средний геометрический диаметр: 2,99 ± 1,53 мкм; Bergbauforschung, Эссен, Германия), который представляет собой общепринятый положительный стандарт для экспериментальной токсикологии в Европе (Robock (1973), Standard quartz DQ12 < 5 μm for experimental pneumoconiosis research projects in the Federal Republic of Germany. Ann Occup Hyg; 16: 63-6; Clouter et al. (2001) Inflammatory effects of respirable quartz collected in workplaces versus standard DQ12 quartz: particle surface correlates. Toxicol Sci; 63: 90-8; Creutzenberg et al. (2008) Toxicity of a quartz with occluded surfaces in a 90-day intratracheal instillation study in rats. Inhal Toxicol; 20: 995-1008). DQ12 способен воспроизводимо вызывать повреждение ДНК и мембраны на используемой модельной системе (Monfort et al., 2008; Ziemann et al., 2009, 2014 и 2017) и провоцировать воспалительные реакции в легком крысы.

Подавление зависимых от кварца эффектов: лактат алюминия (ЛА).

Чтобы иметь возможность различить зависимые от кварца биологические эффекты и эффекты, не опосредованные кварцем, каждый образец кварцевого тонкодисперсного порошка исследовали с и без лактата алюминия (ЛА; 100 мкм; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен). Инактивирующее воздействие ЛА на зависимые от кварца биологические эффекты неоднократно смогли подтвердить в первичных альвеолярных макрофагах (AM) крысы (Monfort et al., 2008; Ziemann et al., 2009; Ziemann et al., 2014; Ziemann et al., 2017).

Положительный контроль (повреждение мембраны): Тритон X-100.

Клетки обрабатывали Тритоном X-100 в качестве положительного контроля (высокий контроль) и стандарта вычисления (100% цитотоксичность) для экспериментов, относящихся к высвобождению лактатдегидрогеназы (ЛДГ). При обработке клеток этим неионным поверхностно-активным веществом клеточная мембрана полностью повреждалась, и высвобождался обычно присутствующий внутриклеточно локализованный фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ).

Исследуемые вещества

Образец Измельчение Мелющая среда Концентрация на основе кварца [%] 37797 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) отсутствует - 37935 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) Полигликоль 35000 S
изготовлен Clariant
Материал № 107915 0,4 38132 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) Тетраэтилсиликат
CAS № 78-10-4
Wacker^® TES 28
Этилсиликат 0,4 38157 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) Золь кремниевой кислоты
Ludox^® TM-50
изготовлена Grace 0,4 38174 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) Глицерин
CAS № 56-81-5 0,4 38193 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) трис-Изопропоксид алюминия
CAS № 555-31-7 0,4 38272 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) Каолин KBE-1
изготовлен Amberger Kaolinwerke 0,4 38287 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) эпсилон-Капролактам
CAS № 105-60-2 0,4 38328 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) Ангидрид 3-(триэтоксисилил)пропил-янтарной кислоты
CAS № 93642-68-3
Geniosil^® GF 20
изготовлен Wacker 0,4 38423 Воздушно-струйная мельница, автогенное измельчение отсутствует - 38360 шаровая мельница
(Алюбитовые мелющие тела) Алкилсиликоновая смола с алкоксигруппами
Silres^® BS 1260
изготовлена Wacker 0,4 38361 приобретенный промышленный стандарт
Dörentrup DQ12 (предположительно отсутствует) -

У продуктов был единый средний размер частиц d50 2 мкм.

Исследование на стерильность и исследование на содержание эндотоксинов

Сначала кристаллические диоксиды кремния проверяли на стерильность и содержание эндотоксинов, поскольку соответствующее загрязнение может привести к неспецифическим эффектам при исследовании in vitro. В частности, на конечные точки исследования провоспалительного потенциала могут влиять искусственные объекты.

Для исследования на стерильность образцы инкубировали в тиогликолевом бульоне, который поддерживал рост широкого спектра бактерий и грибов, при 34-35°C в течение 14 дней. Культуры, которые инокулировали золотистым стафилококком (Staphylococcus aureus), служили в качестве положительно контроля. Оценку осуществляли через 14 дней при визуальном осмотре (мутность, морфологический рост грибов).

Кроме того, содержание эндотоксинов определяли с помощью «Кинетического хромогенного ЛАЛ-анализа», метод D (смотрите раздел 2.6.14 Европейской фармакопеи), в независимой лаборатории (Lonza, Вервье, Бельгия) на трех этапах разбавления, поскольку эндотоксины также могут вызывать иммунные ответы в качестве искусственных объектов при экспериментах in vitro.

Рабочие растворы

Предварительные культуры AM готовили согласно Ziemann et al., 2017, и исследуемые и стандартные материалы осторожно добавляли в виде дважды концентрированных суспензий частиц после деагломерации ультразвуком. Три разные концентрации (25, 50 и 75 мкг/см²) каждой из частиц добавляли, чтобы выявить оптимальный диапазон чувствительности высвобождения ЛДГ и экспрессии гена Cxcl2. После предварительных экспериментов указанный диапазон был определен как 75 мкм/см², чтобы обеспечить достаточные ответы для дифференциации разных образцов.

Все исследуемые и стандартные материалы проверяли в присутствии и отсутствии лактата алюминия (ЛА).

Клеточная система

Первичные альвеолярные макрофаги (AM) из легкого крысы использовали в качестве кварц-релевантной клеточной модели in vitro. Культивированные AM крысы представляют собой очень чувствительную модельную систему in vitro для проверки эффектов кварца и кристобалита, которые могут проявляться во многих случаях (например, Ziemann et al., 2009; Ziemann et al., 2014; Ziemann et al., 2017).

Извлечение и культивирование AM и добавление суспензий частиц, и дополнительное культивирование осуществляли согласно пояснениям в Ziemann et al., 2017.

Способы:

Определение кристаллической фракции рентгенодифракционным методом

Определение кристаллической фракции диоксида кремния осуществляли по аналогии со стандартной рабочей процедурой «SOP № A04 Röntgendiffraktometrische Quarzfeinstaubbestimmung gemäβ BGIA 8522 - Bestimmung von Cristobalit und Tridymit im A-Staub sowie Analyse kristalliner Kieselsäuren in Materialproben; Dr. M. Kirchner, IGF Analytik Dr. H.-H. Fricke, IGF Analytik T. Faak; IGF Analytik; 04/2014» и стандартом ИСО 24095 «Воздух на рабочем месте. Руководство по измерению содержания взвешенного кристаллического диоксида кремния» («ISO STANDARD 24095; First edition 2009-12-15; Workplace air - Guidance for the measurement of respirable crystalline silica»).

Выявление и количественное определение кристаллических фаз в минеральных наполнителях осуществляли в центральной лаборатории Quarzwerke GmbH посредством рентгеновского дифрактометра типа D4 Endeavor фирмы Bruker AXS с геометрией Брэгга-Брентано, используя медную рентгеновскую трубку.

Образцы измеряли в виде прессованных порошкообразных брикетов, которые либо вдавливали в стальное кольцо с автоматическим устройством подготовки образцов от фирмы Herzog, либо вручную наносили в держатель образца, используя предметное стекло.

Качественную оценку дифрактограмм осуществляли, используя программное обеспечение DIFFRAC.EVA версии 4 от фирмы Bruker AXS с использованием базы структурных данных PDF-2 Международного центра дифракционных данных (ICDD) (выпуск 1998).

Количественные анализы выполняли методом Ритвельда (TOPAS 5 от Bruker AXS), методом добавок (согласно DIN 32633), или посредством калибровочных кривых (DIFFRAC.DQUANT версии 1 от Bruker AXS).

Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Высвобождение ЛДГ

После инкубации первичных альвеолярных макрофагов крысы с исследуемыми и стандартными материалами активность ЛДГ в инкубационных надосадочных жидкостях определяли с помощью колориметрии.

Детектирование повышенной ферментативной активности в надосадочной жидкости клеточной культуры указывает на повреждение клеточной мембраны, которое может быть вызвано непосредственным взаимодействием кварц-клеточная мембрана с реакционноспособными кварцевыми тонкодисперсными порошками.

В дополнение к ее легкому определению и ее надежности эта конечная точка обладает тем преимуществом, что ее можно использовать в качестве конечной точки как in vitro, так и ранее in vivo при лаваже легкого, и таким образом осуществить корреляции между данными, полученными in vitro и in vivo.

«Набор для определения цитотоксичности (ЛДГ)» от фирмы Roche Applied Science (Мангейм, Германия) использовали для определения активности ЛДГ в соответствии с инструкциями изготовителя.

Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (СО) 3 независимых культур, каждую из которых анализировали в трех экземплярах.

В итоге клетки, которые были полностью лизированы при обработке Тритон X-100, служили в качестве положительного контроля для вычисления процента цитотоксичности. Все измеренные значения обработанных образцов в итоге основывались на значении для клеток, обработанных Тритоном X-100.

Экспрессия гена Cxcl2

ОТ-кПЦР Cxcl2 (метод Δ-CT)

Для оценки биологической активности образцов кварцевого тонкодисперсного порошка, имеющих разные модификации поверхности, определение экспрессии гена для провоспалительного гена «хемокиновый лиганд 2 с мотивом C-X-C» (Cxcl2) посредством ОТ-кПЦР выбрали в качестве дополнительной конечной точки.

Провоспалительный белок Cxcl2 продуцируется активированными макрофагами и оказывает притягивающее воздействие на полиморфноядерные нейтрофилы (ПМЯ). Количество и процентное содержание ПМЯ является важной конечной точкой in vivo. Например, в случае животных, подвергшихся воздействию кварца, степень неблагоприятной биологической активности кварца в легких можно оценить весьма показательным образом посредством подсчета ПМЯ в промывной жидкости легких. Это уже было показано в проекте Европейского союза (ЕС) (SILICOAT). Что касается зависимых от кварца ответов Cxcl2 (MIP-2), также смотрите Driscoll et al. (1996) Alpha-quartz-induced chemokine expression by rat lung epithelial cells: effects of in vivo and in vitro particle exposure. Am J Pathol. 149(5): 1627-37.

После начального периода роста в 24 часа AM инкубировали с исследуемыми и стандартными материалами в течение 4 часов. Затем экспрессию генов Cxcl2 и Hprt1 определяли и вычисляли посредством ОТ-кПЦР. Данные происходят от средних значений 3 технических повторов на условие. Оценку осуществляли в соответствии с методом сравнения CT (Schmittgen TD, Livak KJ. (2008) Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3:1101-1108), в котором также проверяли линейность и эффективность.

Информация, относящаяся к праймерам, приводится в следующей таблице:

Название гена NCBI RefSeq (база данных Национального центра биотехнологической информации) Фирма для заказа Уникальный идентификационный номер анализа Длина продукта Cxcl2 NM_053647 BioRad gRnoCED0003624 102 п.о. Название гена NCBI RefSeq Прямой праймер Обратный праймер Длина продукта Hprt NM_012583 CTGTCATGTCGACCCTCAGT TCGAGCAAGTCTTTCAGTCC 158 п.о.

Статистика

В случае высвобождения ЛДГ результаты представлены на графиках в виде средних значений ± соответствующее стандартное отклонение (СО) для трех культур, которые в свою очередь измеряли в трех экземплярах или в двух экземплярах.

Статистический анализ выполняли, используя программное обеспечение SigmaStat 3.1^® (Systat Software, Inc., Пойнт Ричмонд, США). Статистическую оценку результатов осуществляли посредством t-критерия Стьюдента. Двусторонний непарный t-критерий применяли как для определения статистически значимых различий для отрицательного контроля с частицами, так и для оценки значимых различий между культурами, обработанными ЛА и не обработанными ЛА, и между стандартным кварцем 37797 и образцами кварцевого тонкодисперсного порошка с модифицированной поверхностью. С вероятностью ошибки менее 5 % (p < 0,05) результаты считали как статистически значимые.

Результаты и обсуждение

Сначала все 12 доставленных образцов кварцевого тонкодисперсного порошка проверяли на стерильность и содержание в них эндотоксинов, поскольку соответствующее загрязнение кварцевых тонкодисперсных порошков может привести к искусственным биологическим эффектам при исследовании in vitro.

Исходя из проверки стерильности, осуществленной самостоятельно, и исследовании на эндотоксины, ни один из проверенных образцов кварцевого тонкодисперсного порошка не показал загрязнения бактериями, грибами или эндотоксином. Таким образом, почти исключены искусственные биологические эффекты на основе соответствующих загрязняющих примесей.

В пробном эксперименте биологическую активность стандартного кварца (37797; свежий, кварцевый тонкодисперсный порошок, размолотый без мелющей среды) описывали на модельной системе in vitro (AM) с одной стороны, и определяли оптимальную экспериментальную концентрацию для дополнительных измерений.

Стандартные кварцевые тонкодисперсные порошки 37797, 38361 (DQ12 QW) и DQ12 (Fraunhofer ITEM) включали в качестве положительного контроля, и Al₂O₃ (75 мкг/см²) включали в качестве отрицательного контроля с частицами.

Что касается образцов кварцевого тонкодисперсного порошка 37797 и 38361, стало ясно, что концентрация 75 мкг/см² должна быть искомой во всех экспериментах, поскольку только при этой концентрации возможно обнаружить значительное увеличение экспрессии гена Cxcl2 под воздействием 37797 (36,43 [2^-CT x 10^2]) по сравнению с отрицательным контролем с частицами (2,88 [2^-CT x 10^2]), которая в свою очередь может быть полностью ингибирована в присутствии ЛА (2,77 [2^-CT x 10^2]), что предполагает специфичность эффекта кварца.

При оптимизированных экспериментальных концентрациях осуществляли сравнительную проверку in vitro всех двенадцати по-разному размолотых/с модифицированной поверхностью кварцевых тонкодисперсных порошков на их цитотоксический и провоспалительный потенциал. Высвобождение ЛДГ и экспрессию гена Cxcl2 оценивали, чтобы иметь возможность сделать четкие утверждения, несмотря на определенные ограничения отдельных методов.

Кроме того, проводили проверку значимости по сравнению с отрицательным контролем с частицами Al₂O₃ и проверку на значимые различия между образцами кварцевого тонкодисперсного порошка, обработанными и не обработанными ЛА, чтобы получить информацию о фактической зависимости от кварца эффектов.

Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

После инкубации AM с 75 мкм/см² исследуемых и стандартных материалов в течение четырех часов конечная точка высвобождения ЛДГ дала очень четкую картину. В то время как отрицательный контроль (среда для культивирования клеток) и отрицательный контроль с частицами (Al₂O₃) имели низкие значения цитотоксичности 5,3 ± 0,10 и 4,6 ± 0,29 %, что указывает на хорошую жизнеспособность клеток, значительно более высокая активность ЛДГ могла быть обнаружена в инкубационной надосадочной жидкости для всех «активных» образцов (DQ12 33797, 38423 и 38361) по сравнению с отрицательным контролем с частицами (P ≤ 0,001; смотрите фигуру 2). С 61,6 ± 0,27 и 48,7 ± 2,95 % цитотоксичностью положительный контроль (DQ12) и образец 38361 (DQ12 QW - положительная холостая проба) вызывали самое тяжелое повреждение мембраны. Образец 38423 (кварц, свежемолотый автогенно на воздушно-струйной мельнице) также показал высокую цитотоксичность 30,1 ± 6,25 %, как и следовало ожидать. Стандартный кварцевый тонкодисперсный порошок 37797 (кварц, свежемолотый на шаровой мельнице) с 16,0 ± 0,42 % цитотоксичностью в основном измерении (фигура 2) был явно менее активен, чем в первых измерениях определения диапазонов активных концентраций (фигура 1) (39,4 ± 0,38 %), что может указывать на эффект старения. Однако интенсивность остаточного повреждающего мембрану эффекта позволила осуществить четкую дифференциацию образцов с модифицированной поверхностью. В ходе параллельной обработки клеток ЛА повреждающие мембрану эффекты «активных» образцов кварцевого тонкодисперсного порошка почти полностью могли быть подавлены.

Образец 37935 (модификатор: полигликоль 35000 S) не показал большую цитотоксичность, чем отрицательный контроль с частицами Al₂O₃ и отрицательный контроль (без частиц). 38174 (модификатор: глицерин) также не показал отрицательного эффекта, за ним следуют 38193 (модификатор: трис-изопропоксид Al) и 38272 (модификатор: каолин KBE-1).

Экспрессия гена Cxcl2

Экспрессию гена Cxcl2 культур, обработанных кварцевым тонкодисперсным порошком, определяли в качестве дополнительной конечной точки.

Если рассматривать чистые данные экспрессии гена Cxcl2, то все образцы кварцевого тонкодисперсного порошка, которые были «активными» по определению (DQ12, 37797, 38423 и 38361), показали четкую индукцию экспрессии гена Cxcl2 (фигура 3). В частности, стандартный кварц 37797 (кварц, свежемолотый на шаровой мельнице без модификатора) по сравнению с отрицательным контролем с частицами Al₂O₃ (2,88 [2^-CT x 10^2]) показал очень значительное увеличение экспрессии гена Cxcl2 до 36,43 [2^-CT x 10^2], которая может быть почти полностью ингибирована ЛА (2,77 [2^-CT x 10^2]). Отрицательный контроль без частиц показал экспрессию гена 3,43 [2^-CT x 10^2]. Явно более слабый результат экспрессии гена Cxcl2 образца 38361 по сравнению с DQ12 можно объяснить старением образца. Образец 38361 показал более низкие ответы по сравнению с DQ12 уже в обоих экспериментах по цитотоксичности (фигуры 1 и 2). В экспрессии гена Cxcl2 этот эффект виден еще в большей степени.

Таким образом, исходя из данных экспрессии гена Cxcl2, была очень хорошо возможна дифференциация кварцевых тонкодисперсных порошков с модифицированной поверхностью. В отличие от положительного контроля 37797 образцы 37935 (модификатор: полигликоль 35000 S) с 2,68 [2^-CT x 10^2], 38174 (модификатор: глицерин) с 3,65 [2^-CT x 10^2], 38193 (модификатор: трис-изопропоксид Al) с 2,22 [2^-CT x 10^2], 38272 (модификатор: каолин KBE-1) с 1,95 [2^-CT x 10^2]) и 38328 (модификатор: ангидрид 3-(триэтоксисилил)пропил-янтарной кислоты) с 2,54 [2^-CT x 10^2] показали очень низкую индукцию экспрессии гена Cxcl2 и таким образом низкий провоспалительный потенциал. Напротив, в образцах 38132 (модификатор: тетраэтилсиликат) с 26,39 [2^-CT x 10^2], 38157 (модификатор: золь кремниевой кислоты) с 18,02 [2^-CT x 10^2] и 38287 (эпсилон-капролактам) с 10,45 [2^-CT x 10^2] было очевидно значительное увеличение экспрессии гена Cxcl2, которую можно было значительно ингибировать ЛА во всех случаях, и таким образом, по-видимому, основано на зависимом от кварца механизме.

Заключение

Если рассматривать обе конечные точки in vitro (цитотоксичность ЛДГ как первичный эффект и экспрессию гена Cxcl2 как вторичный эффект), то обработка кристаллического SiO₂ полигликолем (образец 37935) или глицерином (образец 38174) показала одинаково хорошую активность подавления. Следовательно, отрицательные воздействия модифицированных таким образом частиц кристаллического SiO₂ на альвеолярные макрофаги крысы более не могли быть обнаружены in vitro. Таким образом, с эффектами одинакового порядка, что и отрицательные контроли (культуральная среда и Al₂O₃), упомянутые модификации поверхности опосредовали наивысшее снижение цитотоксического и провоспалительного потенциала кристаллического SiO₂. Также хороший «маскирующий потенциал» для тех участков поверхностей SiO₂, которые были активны в отрицательном смысле (то есть вызывающие биологически неблагоприятные эффекты), продемонстрировали соединения алюминия, трис-изопропоксид Al, (образец 38913) и каолин KBE-1 (образец 38272).

Изобретение относится к тонкодисперсным порошкам диоксида кремния. Предложен способ обработки кристаллического диоксида кремния, включающий стадию измельчения кристаллического диоксида кремния вместе с веществом в количестве от 0,05 до 1,00% масс., выбранным из группы, состоящей из многоатомных спиртов, каолина, алкоголятов алюминия и их смесей. Предложены также полученный заявленным способом состав кристаллического диоксида кремния со сниженным цитотоксическим и противовоспалительным потенциалом и применение многоатомных спиртов, каолина и алкоголята алюминия для снижения цитотоксического и противовоспалительного потенциала кристаллического диоксида кремния. Технический результат – предложенный способ позволяет получать кристаллический диоксид кремния со сниженным цитотоксическим и противовоспалительным потенциалом. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Способ обработки кристаллического диоксида кремния, включающий стадию измельчения кристаллического диоксида кремния вместе с веществом в количестве от 0,05 до 1,00% масс., выбранным из группы, состоящей из многоатомных спиртов, каолина, алкоголятов алюминия и их смесей.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный кристаллический диоксид кремния имеет размер зерен d50 от 0,2 до 90 мкм, более предпочтительно от 0,3 до 10 мкм после измельчения, и/или размер зерен d90 от 1 до 300 мкм, предпочтительно от 1 до 15 мкм после измельчения.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный многоатомный спирт выбран из группы, состоящей из глицерина, полиэтиленгликолей, полипропиленгликолей и их смесей и сополимеров.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанный многоатомный спирт имеет молярную массу от 90 до 50000 г/моль.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный кристаллический диоксид кремния имеет по меньшей мере 70% кристаллической доли.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный кристаллический диоксид кремния представляет собой кварц, кристобалит, тридимит.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанная обработка снижает цитотоксический и провоспалительный потенциал кристаллического диоксида кремния.

8. Состав кристаллического диоксида кремния со сниженным цитотоксическим и провоспалительным потенциалом, содержащий кристаллический диоксид кремния и от 0,05 до 1,00% масс. вещества, выбранного из группы, состоящей из многоатомных спиртов, алкоголятов алюминия, каолина и их смесей.

9. Состав кристаллического диоксида кремния по п. 8, содержащий по меньшей мере 97% масс. диоксида кремния.

10. Состав кристаллического диоксида кремния по п. 8 или 9, содержащий диоксид кремния с по меньшей мере 70% кристаллической доли.

11. Состав кристаллического диоксида кремния по пп. 8, 9 или 10, отличающийся тем, что указанный кристаллический диоксид кремния имеет размер зерен d50 от 0,2 до 90 мкм, более предпочтительно от 0,3 до 10 мкм.

12. Применение многоатомных спиртов для снижения цитотоксического и провоспалительного потенциала кристаллического диоксида кремния.

13. Применение каолина для снижения цитотоксического и провоспалительного потенциала кристаллического диоксида кремния.

14. Применение алкоголята алюминия для снижения цитотоксического и провоспалительного потенциала кристаллического диоксида кремния.

15. Состав кристаллического диоксида кремния со сниженным цитотоксическим и провоспалительным потенциалом, получаемый способом по любому из пп. 1-7.