Способ получения рыбного коллагенового гомогенизата Российский патент 2023 года по МПК C08H1/06 C09H1/04 A23J1/04 

Изобретение относится к переработке отходов рыбного производства (рыбных шкур), касается способа получения рыбного коллагена, преимущественно из шкур трески, который можно использовать для получения медицинских и косметических препаратов, а также некоторых продуктов питания.

Выделение коллагена из шкур промысловых рыб решает важную экологическую задачу переработки отходов производства. Отходы являются техническим сырьем. В отличие от шкур животных для шкур рыб неизвестен ни один вирус, который передавался бы от рыб к человеку, что исключает возможность заражения от них. Нарастание производства рыбопродукции и особенно обесшкуренного филе, и соответствующее нарастание его отходов привлекает к себе внимание, тем более что коллаген из рыбных шкур особенно перспективен для использования в пищевых, медицинских и косметических целях.

Одним из самых важных потребителей коллагена становится регенеративная медицина, связанная со стимулированием клеточной/тканевой регенерации [А. А. Иванов, О. П. Попова и др. Успехи современной биологии, 2019, том 139, № 2, с. 196-20523-34]. Активно развиваемый метод в этом направлении - это разработка композиций на основе многотоннажных синтетических полимеров и полимеров природного происхождения, таких как рыбный коллаген. Создание материалов нового поколения, обладающих требуемыми эксплуатационными характеристиками и отличающихся высокой надежностью неразрывно связано с использованием новых подходов. Приоритетными направлениями являются исследования, согласованные с принципами «зеленой химии» и в этом случае перспективны фотокаталитические комплексы на основе оксидов металлов, которые относятся к экологически чистой альтернативе химических источников активных частиц в превращениях реагентов. Прекурсоры для создания новых материалов для регенеративной медицины на основе коллагена получены как при использовании разных инициаторов, предпочтительно при невысоких температурах с использованием борсодержащих инициаторов [Yu. Kuznetsova , K. Gushchina et al. Polymers. 2022, 14, 3290.], так и фотокатализа в присутствии, например, сложного оксида RbTe1.5W0.5O6 при облучении видимым светом λ= 400-700 нм [Semenycheva, L.L., Chasova, V.O. et al. Polymer Science - Series D. 2022. 15(1), с. 110-117].

Добыча трески в мире составляет около 800 тыс. т в год [http://fish-seafood.ru/news/detail.php_ID=43850.html]. Очевидно, что получение коллагена из шкуры трески перспективно, но коллаген должен быть высокого качества.

Необходимо отметить, что с 2008 в России (https://ribikon.ru/vred-polifosfatov-v-ryibe/), а еще раньше в Европе (https://www.fishnet.ru/news/novosti_otrasli/obzor-praktiki-primeneniya-fosfatov-pri-proizvodstve-rybnoy-produkcii/) г. в процессе обработки рыбной продукции применяются пищевые добавки, включающие фосфаты кальция (ФК): полифосфаты и ортофосфат кальция. Их применение в России регламентируется санитарными правилами и нормами (СанПин 2.3.2.1293-03 от 26.05.2008). Эти пищевые добавки (Е 452,Е 341) - многофункциональные компоненты большинства продуктов и позволяют стабилизировать форму продукта, отрегулировать кислотность, придать продукту привлекательный цвет. Устойчивые к растворению в воде добавки позволяют увеличить объем продукта и придать ему красивую форму, так как свою естественную форму продукты теряют со временем. (https://mayonesguitars.ru/medicina-i-zdorove/vred-fosfatov-na-organizm-cheloveka.html. https://www.oum.ru/literature/zdorovje/pishchevaya-dobavka-e341/) Естественно, водонерастворимые фосфаты кальция присутствуют и в шкуре рыбы.

Тем не менее, существуют данные о том, что добавки фосфата кальция могут способствовать развитию онкозаболеваний (https://tasu.ru/ekonomika-i-finansy/potrebitelskiy-rynok/shkola-potrebiteley/spisok -opasnykh-i-bezopasnykh-e-kodov-produktov-pitaniya/; P.R. Angelova, A.Y. Baev, A. V. Berezhnov, A.Y. Abramov. Biochem Soc Trans (2016) 44 (1): 40-45), вызывают расстройство желудочно-кишечного тракта: (https://mecuchi.ru/blog/stati/perechen-i-svoystva-pishchevykh-e-dobavok/ Маскалик В.Л., Михалевич В.С. Сборник материалов V межвузовской научно-практической интернет-конференции студентов, магистрантов, аспирантов и молодых ученых. Гродно, 2021 Издательство: Гродненский государственный медицинский университет (Гродно) повышать уровень холестерина в крови (https://tasu.ru/ekonomika-i-finansy/potrebitelskiy-rynok/shkola-potrebiteley/spisok-opasnykh-i-bezopasnykh-e-kodov-produktov-pitaniya/, твердые соединения холестерина с ортофосфатами кальция приводят закупорке кровеносных сосудов и атеросклерозу (Dorozhkin, S.V. Morphologie. 2017. 101(334), с. 125-142). Кроме того, полифосфаты кальция нарушают баланс фосфора и кальция, таким образом увеличивая риск возникновения остеопороза. https://sredaobitaniyatv.ru/polifosfaty-v-rybe/

Таким образом, не вызывает сомнения опасность этих добавок. Тот факт, что фосфаты кальция содержатся в организме человека, вовсе не говорит о том, что этот же самый компонент, поступающий извне, является для нас безвредным. Кроме того, ФК, которые содержатся в организме, не участвуют в процессе пищеварения, а находятся в костях и зубах лишь в качестве строительного компонента. А добавки ФК активно включаются в процессы пищеварения, и какие у этого будут последствия в долгосрочной перспективе досконально не изучено. https://www.oum.ru/about/.

Краткая характеристика последствий присутствия ФК в некостных тканях человека показывает, что их присутствие в тресковом коллагене, особенно если речь идет о регенеративной медицине, крайне нежелательно, хотя они широко применяются в рыбоперерабатывающей промышленности https://www.vedomosti.ru/business/articles /2022/04/12/917822-defitsit-pischevih-fosfatov. В то же время при выделении коллагена из отдельно приобретенной шкуры трески разных производителей, а также из шкуры, отделенной в лаборатории от трески, приобретенной в коммерческой сети, содержание ФК составляет 8,2-8,5 %, и важной задачей является удаление остатков ФК до минимума.

Существует много способов выделения рыбного коллагена из природного сырья. Как правило, используют кислотный, щелочной, щелочно-солевой, электрохимический, ферментатитвный и другие методы (патенты РФ 3567171, РФ 2658766, РФ 2665587, РФ 25018182, РФ 2604504, SU 171502, SU 282588 и др. ). Недостатками методов являются чаще всего многостадийность, отсутствие качественных характеристик коллагена, а также в них не упоминается об анализе содержания ФК в исходном сырье и в конечном продукте, в то время как для получения качественных медицинских, косметических и пищевых препаратов из рыбного коллагена этот параметр имеет важное значение (http://perlealpha.ru/, http://formula-figuri-spa.prom.ua/).

Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению являются патенты (РФ 2567171, РФ 2658766, РФ 2665589), где предварительная обработка шкур рыб (очистка шкур, гомогенизация, промывка перед выделением коллагена, анализ исходного сырья и др.) проводится одинаково. Затем фактически в одну стадию выделяют коллаген: коллагеновый гомогенизат заливают водным раствором реагента в зависимости от конечной задачи: для выделения высокомолекулярного коллагена - раствором уксусной кислоты, гидролизата коллагена - раствором фермента либо раствором щелочи. Способ получения коллагена, защищенный патентом RU 2567171 принят за ближайший аналог (прототип).

В способе по прототипу, включающем очистку тресковых шкур, измельчение, троекратную промывку водопроводной водой, обработку коллагенового гомогенизата 3%-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 2-5, выдерживание в кислотном растворе при периодическом помешивании, гомогенизацию путем фильтрации через капроновую ткань. Выдерживание в кислотном растворе осуществляют в течение 15-18 часов. Способ получения уксусной дисперсии трескового коллагена обеспечивает получение высокомолекулярного рыбного коллагена с молекулярной массой 210-220 кДа.

Преимуществом и общим признаком с предлагаемым изобретением является сокращение длительности технологического цикла и расхода электроэнергии при получении трескового коллагена. Недостатком способа по прототипу является отсутствие проверки исходного сырья на содержание фосфатов кальция.

В задачу изобретения положено создание нового способа получения рыбного коллагена с низким содержанием фосфатов кальция.

Техническим результатом от использования предлагаемого изобретения является получение трескового коллагена с содержанием фосфатов кальция менее 2-3% на сухой остаток.

Это достигается тем, что в способе получения рыбного коллагена, включающем очистку тресковых шкур, измельчение, промывку водой, обработку коллагенового гомогенизата раствором реагента при гидромодуле 2-5, выдерживание в растворе реагента при периодическом помешивании и гомогенизацию путем фильтрации через капроновую ткань, после очистки рыбных шкур коллагеновый гомогенизат заливают 2-3%-ной минеральной кислотой НСl при гидромодуле 1-1,5, выдерживают в течение 30-40 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод и дистиллированной водой; осуществляют обработку коллагенового гомогенизата 2-3%-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 2-5 при комнатной температуре в течение 18-20 часов при периодическом помешивании для получения высокомолекулярного коллагена; осуществляют обработку коллагенового гомогенизата 3%-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 2-5 при 50°С в течение 5-6 часов при периодическом помешивании для получения желатина; осуществляют обработку коллагенового гомогенизата 1-3%-ным раствором протеолитического фермента или раствором гидроксида натрия при гидромодуле 2-5 дробно в течение 5-6 ч через каждые 30 мин. для получения гидролизата коллагена.

На фиг. 1 представлены рентгенограммы исходной золы и CaO, Ca₃(PO4)₂, Ca₃(PO4)₂ в программном обеспечении Match!

Предлагаемый способ получения коллагена осуществляют следующим образом.

Для осуществления способа используют отходы рыбного производства - шкуры трески. Очищают шкуры рыбы от чешуи, прирезей мышечной ткани и жира, измельчают, например, мясорубкой с диаметром пор 3,5 мм (электрическим диспергатором).

Приготовленную шкуру (очищенную и измельченную) анализируют на содержание фосфатов кальция.

Навеску высушенного сырья массой ~ 0.5 г сжигают в муфельной печи при температуре 650°С. Проводят расчет золы по формуле:

ω(золы) = (a-b) × 100/c, где:

а - масса гильзы с навеской до сжигания, г;

b - масса гильзы с навеской после сжигания, г;

с - масса навески, г.

Затем методом рентгеновского фазового анализа (РФА) определяют фазовый состав золы.

Порошковую дифракцию рентгеновских лучей выполняют на дифрактометре Shimadzu XRD-6100 с Ni-фильтром для Cu-Kα-излучения (λ=1,54056 Е) в диапазоне градусов 2θ 10-60? град. со скоростью 1 град./мин при комнатной температуре. Полученные рентгенограммы были обработаны с помощью программного обеспечения Match!

Из сравнения результатов РФА для исходного образца золы с рентгенограммами из открытой кристаллографической базы (COD) (фиг.1) устанавливают, что образец состоит из фаз состава Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇ и CaO (продукта термолиза солей кальция)).

Коллагеновый гомогенизат заливают минеральной 3%-ной кислотой НСl при гидромодуле 1-1,5, выдерживают в течение 30-40 мин (время, в течение которого растворяется основная часть фосфатов кальция и образуется растворимый в воде хлористый кальций и фосфорные кислоты).

Удаляют раствор кислоты, фильтруя через капроновую ткань, и промывают коллагеновый гомогенизат дистиллированной водой до нейтрального рН промывных вод.

Затем заливают коллагеновый гомогенизат раствором реагентов.

Для получения дисперсии высокомолекулярного коллагена раствором уксусной кислоты при жидкостном гидромодулиенте 2-5, выдерживают при комнатной температуре 18-20 ч, отделяют остатки коллагенового гомогенизата, фильтруя через капроновую ткань. В растворе остается высокомолекулярный коллаген. Для получения сухого порошка высокомолекулярного коллагена жидкие компоненты удаляют лиофильной или распылительной сушкой. Порошок коллагена анализируют на содержание ОК.

Для получения дисперсии желатина раствором уксусной кислоты при гидромолуле 2-5, выдерживают при температуре 50°С 5-6 ч, отделяют остатки коллагенового гомогенизата, фильтруя через капроновую ткань. В растворе остается желатин. Для получения сухого порошка желатина жидкие компоненты удаляют лиофильной или распылительной сушкой. Порошок коллагена анализируют на содержание ОК.

Для получения гидролизата рыбного коллагена путем ферментативного гидролиза, добавляют 1-3%-ный раствор протеолитического ферментного препарата при гидромодуле 2-5, выдерживают в течение 5-6 отделяют остатки коллагенового гомогенизата, фильтруя через капроновую ткань. В растворе остается гидролизат трескового коллагена. Для получения сухого порошка гидролизата жидкие компоненты удаляют лиофильной или распылительной сушкой. Порошок коллагена анализируют на содержание ОК.

Для получения гидролизата трескового коллагена путем щелочного гидролиза, добавляют 2-3% раствор гидроксида натрия при гидромодуле 2-5, выдерживают при комнатной температуре 20-24 ч, отделяют остатки коллагенового гомогенизата, фильтруя через капроновую ткань. В растворе остается гидролизат коллагена. Для получения сухого порошка коллагена жидкие компоненты удаляют лиофильной или распылительной сушкой. Порошок коллагена анализируют на содержание ФК.

Молекулярную массу (ММ) коллагена (желатина) определяют методом ГПХ на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы SHIMADZU СТО-20А/20АС (Япония) с применением колонки TosohBioscienceTSKgelG3000SWx1 с диаметром пор 5 мкм. В качестве детектора используют низкотемпературный светорассеивающий детектор ELSD-LTII. В качестве элюента используют 0.5 M раствор уксусной кислоты.

Для калибровки применяют стандарты декстрана с диапазоном молекулярных масс 1000-410000 Да. Фильтрование образцов коллагеновой субстанции осуществляют через насадочные мембраны MilliporeMillex-LCR (PTFE 0.45 μm).

Дисперсии коллагена можно хранить несколько месяцев в холодильнике при температуре 2-8°С. Срок хранения сухого порошка составляет 3 года.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ позволяет получить коллагеновую дисперсию и порошок, которые могут быть использованы для получения медицинских и косметических препаратов, продуктов питания, содержание золы (ФК) в которых не превышает 2,5 % в сухом остатке.

Ниже приведены примеры, подтверждающие реализацию способа получения уксуснокислой дисперсии высокомолекулярного рыбного коллагена.

Пример 1.

Коллагенсодержащее сырье (шкуру трески) очищают от чешуи, прирезей мышечной ткани и жира, измельчают мясорубкой, или электрическим диспергатором с диаметром пор 3,5 мм. Коллагеновый гомогенизат заливают 2%-ной НСl при гидромодуле 1, выдерживают в течение 30 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод, промывают дистиллированной водой, заливают 3%-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 5. Оставляют на 18 часов, периодически помешивая. Отфильтровывают через капроновую ткань. Полученная коллагеновая дисперсия содержит 3,3 % коллагена с молекулярной массой 220 кДа, сухой порошок содержит золы (ФК) 2,0 %.

Пример 2.

Коллагенсодержащее сырье (шкуру трески) очищают от чешуи, прирезей мышечной ткани и жира, измельчают мясорубкой, или электрическим диспергатором с диаметром пор 3,5 мм коллагеновый гомогенизат заливают 3%-ной НСl при гидромодуле 1,5, выдерживают в течение 30 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод, промывают дистиллированной водой, заливают 2 %-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 2. Оставляют на 20 часов, периодически помешивая. Отфильтровывают через капроновую ткань. Полученная коллагеновая дисперсия содержит 6,5 % коллагена с молекулярной массой 240, сухой порошок содержит золы (ФК) 2,5 %.

Пример 3.

Коллагенсодержащее сырье (шкуру трески) очищают от чешуи, прирезей мышечной ткани и жира, измельчают мясорубкой, или электрическим диспергатором с диаметром пор 3,5 мм коллагеновый гомогенизат заливают 2%-ной НСl при гидромодуле 1, выдерживают в течение 30 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод, промывают дистиллированной водой, заливают 3 %-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 3. Оставляют на 5 часов при 50°С, периодически помешивая. Отфильтровывают через капроновую ткань. Полученная дисперсия желатина содержит 4,5 % желатина с молекулярной массой 220, сухой порошок содержит золы (ФК) 2,0 %.

Пример 4.

Коллагенсодержащее сырье (шкуру трески) очищают от чешуи, прирезей мышечной ткани и жира, измельчают мясорубкой, или электрическим диспергатором с диаметром пор 3,5 мм коллагеновый гомогенизат заливают 3%-ной НСl при гидромодуле 1,5, выдерживают в течение 30 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод, промывают дистиллированной водой. коллагеновый гомогенизат заливают 2%-ным раствором протеолитического фермента панкреатина при гидромодуле 2. Обработку панкреатином проводят дробно в течение 5 ч через каждые 30 мин, разделив на порции пропорционально. Затем продукт фильтруют от примесей. Для получения жидкой субстанции раствор подкисляют раствором уксусной кислоты до 3%. Полученная дисперсия содержит 4,5% коллагена а с молекулярной массой ≤7 кДа, сухой порошок содержит золы (ФК) 2,1 %.

Пример 5.

Коллагенсодержащее сырье (шкуру трески) очищают от чешуи, прирезей мышечной ткани и жира, измельчают мясорубкой, или электрическим диспергатором с диаметром пор 3,5 мм коллагеновый гомогенизат заливают 3%-ной НСl гидромодуле 1,5, выдерживают в течение 40 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод, промывают дистиллированной водой и заливают 2%-ным раствором гидроксида натрия при гидромодуле 2. Обработку проводят в течение 20 ч. Для получения и хранения жидкой субстанции раствор нейтрализуют и подкисляют раствором уксусной кислоты до рН 5,5-6,5. Для анализа параметров коллагена из раствора испаряют воду лиофильно. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ ≤ 15кДа), ~80% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа. Затем продукт фильтруют от примесей. Для получения жидкой субстанции раствор подкисляют раствором уксусной кислоты до 3%. Полученная дисперсия содержит 4,5 % коллагена, сухой порошок содержит золы (ФК) 2,5%.

Настоящее изобретение относится к переработке отходов рыбного производства. Описан способ получения рыбного коллагенового гомогенизата, включающий очистку тресковых шкур, измельчение, промывку водой, после очистки рыбных шкур коллагеновый гомогенизат заливают 2-3%-ной минеральной кислотой НСl при гидромодуле 1-1,5, выдерживают в течение 30-40 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод и дистиллированной водой. Технический результат – получение продукта с содержанием фосфата кальция менее 2-3% на сухой остаток. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 пр.

1. Способ получения рыбного коллагенового гомогенизата, включающий очистку тресковых шкур, измельчение, промывку водой, после очистки рыбных шкур коллагеновый гомогенизат заливают 2-3%-ной минеральной кислотой НСl при гидромодуле 1-1,5, выдерживают в течение 30-40 мин, затем промывают водопроводной водой до нейтрального рН промывных вод и дистиллированной водой.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют обработку коллагенового гомогенизата 2-3%-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 2-5 при комнатной температуре в течение 18-20 часов при периодическом помешивании и гомогенизацию путем фильтрации через капроновую ткань для получения высокомолекулярного коллагена.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют обработку коллагенового гомогенизата 3%-ным раствором уксусной кислоты при гидромодуле 2-5 при 50°С в течение 5-6 часов при периодическом помешивании и гомогенизацию путем фильтрации через капроновую ткань для получения желатина.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют обработку коллагенового гомогенизата при гидромодуле 2-5 1-3%-ным раствором протеолитического фермента дробно в течение 5-6 часов или раствором гидроксида натрия в течение 20-24 часов, фильтрацию через капроновую ткань для получения гидролизата коллагена.