Способ снижения содержания кадмия в организме крыс Российский патент 2024 года по МПК A61K35/742 A61K31/28 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к отрасли биотехнологии и может быть использовано в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы по применению пробиотических препаратов в системе снижения уровня токсического влияния ксенобиотических элементов на организм животных.

Способ снижения содержания кадмия в теле цыплят-бройлеров, включающий дачу корма непрерывно, начиная с двухнедельного возраста, с содержанием наночастиц меди размером 103,0±2,0 нм в дозе 1,7 мг/кг комбикорма. [Патент на изобретение RU № 2468595 опубл. 10.02.2014].

Недостатком данного способа является то, что он является достаточно дорогостоящем, предусматривает использование тяжелого металла в виде наночастиц меди.

Технический результат изобретения - снижение уровня содержания кадмия в организме животных по средству введения суспензии биомассы транзиторных бактериальных клеток, входящих в состав пробиотических препаратов Споробактерин (Bacillus subtilis 534) и Бактисубтил (Bacillus cereus IP 5832), в концентрации 1×10⁹ КОЕ/мл. Суспензия вводилась per os индивидуально в дозе 1,0 мл на голову в течение 7 суток, после создания экспериментальной интоксикации, вызванной однократным введением водного раствора CdSO4 в дозе 5 мг/кг натощак.

Решение поставленной задачи обусловлено тем, что на фоне развития острой интоксикации вызванной однократным введением водного раствора CdSO4 в дозе 5 мг/кг животным достигшим физиологической зрелости, per os вводили суспензию биомассы бактериальных клеток (бактериальная взвесь в 0,7 % растворе NaCl) выделенных из препаратов Споробактерин (Bacillus subtilis 534) и Бактисубтил (Bacillus cereus IP 5832). Суспензию вводили в течение 7 дней однократно утром натощак в объеме 1 мл на голову (содержание изолированных клеток составляло 1×10⁹ КОЕ/мл), контроль дозы введения осуществляли с использованием стандартов мутности по МакФарланду и нефелометрическим методом. Первое введение осуществляли через 12 часов после интоксикации.

Пробиотические препараты на основе бактерий рода Bacillus обладают рядом преимуществ, в частности они являются самоэлиминирующими транзиторными прокариотическими формами с высоким уровнем антагонистических характеристик. Многочисленные литературные данные свидетельствуют об уникальных характеристиках сорбции катионов, как эссенциальных, так и ксенобиотических элементов из группы, тяжелых металлов, широко используемых в различных отраслях (растениеводство, металлургия, экология и т.д.) деятельности человека. В качестве источника изолированных транзиторных пробиотических клеток нами использовались пробиотические препараты:

- препарат «Споробактерин» («Sporobacterin» - содержит биомассу живых бактериальных клеток Bacillus subtilis 534 в концентрации не менее 1×10⁹ КОЕ/мл. Данный микроорганизм обладает широким спектром антагонистического действия в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, не оказывая негативного влияния на рост индигенной микрофлоры кишечника. Размножаясь в кишечнике, продуцируют различные биологически активные вещества (лизоцим, липазы, амилазы и другие протеолитические ферменты) активно участвующие в процессах пищеварения, на ряду с этим установлено выраженное иммуностимулирующее действие и умеренный антиаллергический эффект. Производитель препарата - ООО НП «Бакорен», г. Оренбург (Россия).

- препарат «Бактисубтил» (Bactisubtil) выпускается в виде твердых желатиновых капсул, содержащих аморфный порошок бело-серого или бело-желтого цвета, со специфическим запахом. Каждая капсула содержит 35 мг (10⁹ спор) лиофильно высушенных спор Bacillus cereus IP 5832. Производитель препарата - Marion Merrel, Франция.

Способ реализуется следующим образом:

Из 80 крыс линии Wistar, сформированы 4 группы аналогов (самцы весом 220,0 ± 10,0 г. находящихся в периоде половой зрелости) 2 контрольные и две опытные группы по 20 голов в каждой.

В качестве материала источника острой формы интоксикации использовали водный раствор CdSO4 вводимый индивидуально в дозе 5 мг/кг натощак в группах контроля интоксикации и опытных группах.

Группа интактных животных (К0) получала основной рацион и не подвергалась негативному воздействию. Группа контроля интоксикации кадмием (К1) подвергалась однократному индивидуальному токсическому воздействию (вводили водный раствор CdSO4 индивидуально в дозе 5 мг/кг натощак). Животным опытных групп аналогично группы контроля интоксикации вводили однократно водный раствор CdSO4 в дозе 5 мг/кг, с последующей терапией путем ежедневной однократного введения в течение 7 суток суспензии бактериальных клеток в группе О1 Bacillus subtilis 534 (1×10⁹ КОЕ/мл) и Bacillus cereus IP 5832 во второй группе (О2) в аналогичной дозировке.

Экспериментальные исследования на модели животных проводили в соответствии с инструкциями, рекомендуемыми Российским Регламентом, 1987 г. и «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1996)». Подопытные животные находились в одинаковых условиях содержания.

Взятие биологического материала проводилось с периодичностью в семь дней (фоновое исследование, седьмой, четырнадцатый и двадцать первый день). Проанализирована способность исследуемых транзиторных штаммов микроорганизмов в системе снижения концентрации кадмия (методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии биоматериалов: костная и мышечная ткани, кожный покров) в организме животных и снижении уровня патогенетического действия (морфофизиологическое и биохимическое исследование крови, гистологическое исследование селезенки и печени, определение КОЕ исследуемых микроорганизмов). Рецессия кадмия в теле подопытных животных представлена на фигуре 1 - динамические характеристики содержания кадмия в тканях экспериментальных животных.

Анализ исследуемых биосубстратов крыс осуществлялся в лаборатории АНО «Центр биотической медицины», г. Москва (аттестат аккредитации ГСЭН.RU.ЦОА.311, регистр. номер в гос. реестре РОСС RU.0001.513118 от 29 мая 2003) с использованием методов атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной аргоновой плазмой (приборы ICAP-9000 «Thermo Jarrell Ash, США, Perkin Elmer Optima 2000DV, США; МУК 4.1.1482-03, МУК 4.1.1483-03). Пробоподготовка осуществлялась в соответствии с рекомендациями 4.1.1482-03 и 4.1.1483-03, методом микроволнового разложения на приборе Multiwave 3000 (A. Paar).

Проведенные экспериментальные исследования направленные на оценку патогенетического действия кадмия на организм животных свидетельствуют о выраженном биологическом действии на системы детоксикации характеризующиеся высоким уровнем цитопатического действия на гепатоциты, о чем свидетельствуют данные гистологического исследования тканей печени с опосредованным действием на ткани селезенки и показатели биохимического исследования крови в частности установлено значительное увеличение ферментов аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, на фоне увеличения в сыворотке крови общего билирубина и уровня щелочной фосфатазы. Наряду с этим в группе контроля интоксикации регистрируется значительное повышение концентрации кадмия в биологических образцах к седьмому дню с максимальным уровнем кумуляции в костной ткани на 77,59 % по отношению к фоновым показателям, на 53,47 % в мышечной ткани и 32,81% в кожном покрове соответственно. Высокий уровень патогенетического действия на организм сохранялся на протяжении всего эксперимента на фоне незначительного снижения уровня кадмия к 21 дню эксперимента на 17,43 % в кожном покрове, 27,85 % в мышечной и 6,75 % костной тканях соответственно.

Использование в первой опытной группе суспензии бактериальных клеток Bacillus subtilis 534 (1×10⁹ КОЕ/мл 0,7 % раствора NaCl) в течение 7 дней после экспериментальной интоксикации кадмием позволило не только значительно снизить уровень поступления и накопления кадмия в тканях животных на 38,28 % в кожном покрове, 48,52 % в мышечной и 66,09 % костной тканях, соответственно, по отношению к группе контроля интоксикации. При этом регистрировалась стабилизация показателей накопления кадмия в тканях на протяжении всего эксперимента, с сохранением положительной динамики поддержания уровня кадмия в пределах близких к уровню контрольных (референтных) значений, с превышением интактных показателей на 21 день эксперимента на 32,81 % в мышечной и 35,48 % костной тканях, на фоне снижения уровня накопления в кожном покрове на 2,74 % по отношению к контрольной группе. По отношению к группе контроля интоксикации разница содержания кадмия в опытной группе составила 33,03 % в кожном покрове, 37,98 % мышечной и 61,96 % костной тканях, что суммарно выразилось в снижении концентрации кадмия в организме на 47,58 %. При этом следует отметить отсутствие выраженных патогенетических изменений в организме животных, о чем свидетельствовали биохимические показатели крови животных опытной группы, в которых регистрировалось незначительное превышение показателей АлАТ, АсАТ, общего билирубина и щелочной фосфатазы по отношению к показателям интактной группы, находящиеся в диапазоне верхней границы референтных значений. Гистологическое исследование не выявило выраженного цитопатического действия как ткани печени, так и селезенки.

Экспериментальные данные по оценке использования во второй опытной группе суспензии бактериальных клеток Bacillus cereus IP 5832 (1×10⁹ КОЕ/мл 0,7 % раствора NaCl) в качестве биогенного препарата детоксикации в течение 7 дней после интоксикации кадмием, свидетельствует о незначительном влиянии данного транзиторного штамма на показатели накопления кадмия на первоначальном этапе исследования, так как показатели аккумуляции кадмия в тканях животных данной группы незначительно отличались от показателей группы контроля интоксикации, разница содержания концентрации Cd составила 9,38 % в кожном покрове, 11,88 % мышечной и 11,49 % костной тканях. При этом биохимические показатели крови, характеризующие состояние гепатоцитов (АлАТ, АсАТ, общий билирубин и щелочная фосфатаза) также значительно превышали референтные значения и показатели интактной группы. Следует отметить, что на 21 день проведения экспериментальных исследований показатели содержания кадмия в биологических образцах имели близкие значения к показателям первой опытной и интактной групп и незначительно превышали показатели последней на 16,67 % в кожном покрове, 17,31 % мышечной и 33,33 % костной тканях соответственно. Суммарный процент снижения кадмия в данной группе в среднем составил 42,45 % по отношению к группе контроля интоксикации. Данный эффект на наш взгляд обусловлен низкими показателями колонизации кишечника на начальном этапе эксперимента по отношению к аналогичному показателю первой опытной группы.

Сравнительный анализ результатов двух опытных групп свидетельствует о выраженных сорбционных характеристиках обоих используемых штаммов вводимых в организм животных в идентичной дозировке 1 мл суспензии содержащей 1×10⁹ КОЕ/мл 0,7 % раствора NaCl, позволяет нам заключить, что применение транзиторного штамма Bacillus subtilis 534 в тестируемой дозировке позволяет на достаточном уровне колонизировать кишечник экспериментальных крыс, приводящий в конечном итоге не только к существенному суммарному снижению содержания кадмия в тканях животных на 47,58 %, но и предотвратить выраженное патологическое действие Cd на системы детоксикации (печень, селезенка).

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в лабораториях биологического и медицинского профиля для снижения уровня содержания кадмия у животных. Крысам индивидуально per os вводят суспензии Bacillus subtilis 534 1x10⁹ КОЕ/мл 0,7% раствора NaCl в дозе 1,0 мл на одну половозрелую особь. Препарат вводят натощак в течение 7 дней. Способ позволяет расширить список назначений пробиотических препаратов, а именно позволяет использовать данные препараты для снижения уровня токсического влияния кадмия на организм животных, а также предотвратить его выраженное патологическое действие на системы детоксикации. 1 ил., 1 пр.

Способ снижения содержания кадмия в организме крыс, включающий индивидуальное per os введение суспензии Bacillus subtilis 534 1x10⁹ КОЕ/мл 0,7% раствора NaCl в дозе 1,0 мл на одну половозрелую особь, натощак, в течение 7 дней.