Биореактор для тканевой инженерии с аэрозольным способом подачи культуральной питательной среды Российский патент 2024 года по МПК C12M3/00 C12N5/71 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Биореактор для тканевой инженерии с аэрозольным способом подачи культуральной питательной среды содержит емкость в виде диоптра с прозрачными боковыми стенками и герметично закрывающимися крышками. В пространстве емкости расположена вращающаяся рамка для крепления тканеинженерной конструкции, в крышке диоптра расположено отверстие для переходника ингаляционной камеры электронно-сетчатого ингалятора (меш-небулайзера), через который от сетчатой мембраны ингалятора факел распыления аэрозоля культуральной питательной среды поступает к тканеинженерной конструкции расположенной ниже уровня сетчатой мембраны, аэрозоль заполняет все внутреннее пространство емкости, диоптр имеет наклон в сторону крышки с отверстием для переходника ингаляционной камеры для сбора питательной среды из емкости биореактора, слив жидкости осуществляется через штуцер в нижней точке емкости. Изобретение обеспечивает снижение расхода культуральной питательной среды, более длительное удержание питательной среды на тканеинженерной конструкции за счет оптимизации потоков тонкораспыленной питательной среды при вращении конструкции, снижение шума и вибраций при работе, повышение эффективности выращивания биоискусственных органов и их частей сложной формы в условиях аэрозольного распыления культуральной среды, позволяет изучать физиологический ответ клеток в составе тканеинженерной конструкции под влиянием механических сил, действующих на живые клетки при ее вращении, включая возможность регистрации изменений организации их цитоскелета, клеточной формы и подвижности, а также определять присутствие и сочетание биохимических сигналов клеток в этих условиях, дать оценку их выраженности в кинетике наблюдения.

Изобретение относится к областям экспериментальной биологии и медицины, тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Известен биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций in vivo, который имеет специальное отверстие с элементом крепления в виде съемной манжеты на неподвижном резьбовом соединении для вхождения и удержания сегмента конечности или части хвоста живого индивида с закрепленной тканеинженерной конструкцией.

Пневмоакустические форсунки выполнены съемными с изменяющимся углом раскрытия факела, размещены на стенках емкости над и под сегментом конечности или части хвоста живого индивида (1).

Известно устройство - биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций. Биореактор представляет собой емкость округлой формы, в стенках которой над и под биоматрицей (тканеинженерной конструкцией) расположены пневмоакустические форсунки (не менее 3-х) выполненные с углом раскрытия факела, равным 180°создающие взвесь мелких капель культуральной питательной среды в стерильном воздухе с повышенным в нем до 5% содержанием углекислого газа (2).

Известное устройство требует повышенного расхода культуральной питательной среды из-за количества пневмоакустических форсунок, пневмоакустические форсунки из-за конструктивных особенностей в распыленной среде выдают капли разных размеров (20%), пневмоакустические форсунки требуют повышенного расхода газовой смеси и питательной среды, работают шумно, вызывают раскачивание и вибрацию биореактора, шаровидная форма биореактора требует большего количества распыляемой культуральной питательной среды для заполнения внутреннего объема емкости биореактора. Тканеинженерная конструкция при креплении неподвижно в биореакторе требует увеличения числа факелов распыления для равномерного покрытия питательной культуральной средой всех поверхностей биоматрицы, а также создаются быстрые нисходящие потоки этой среды, стекающей под действием гравитации, что уменьшает время взаимодействия поверхности клеток со средой и эффективность поглощения из нее питательных веществ клетками тканеинженерной конструкции.

Цель изобретения - снижение расхода культуральной питательной среды и стоимости изготовления устройства, более длительное удержание питательной среды на тканеинженерной конструкции за счет оптимизации потоков тонкораспыленной питательной среды при вращении конструкции, снижение шума и вибраций при распылении культуральной питательной среды, повышение эффективности выращивания биоискусственных органов и их частей сложной вытянутой формы в условиях аэрозольного распыления культуральной среды, обеспечить действия механических сил на живые клетки при вращении тканеинженерной конструкции с разными скоростями для исследования физиологического ответа, механотрансдукции в клетках, входящих в состав тканеинженерной конструкции, исследовать кинетику строения тканеинженерной конструкции при длительном вращении.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в обеспечении 3D культивирования клеток на скаффолде при разных режимах вращения тканеинженерной конструкции, возможности выращивания биоискусственных тканей под влиянием механических сил, возникающих при вращении конструкции, влияние такого механического стимула отражается на механотрансдукции в клетках и уровнях продукции клетками цитокинов, а также на строении тканеинженерной конструкции при длительном вращении (несколько суток). Снижение расхода культуральной питательной среды происходит за счет использования одного распылителя, более длительного удержания питательной среды на тканеинженерной конструкции за счет оптимизации потоков тонкораспыленной питательной среды по тканеинженерной конструкции при вращении. Снижение шума и вибраций при распылении культуральной питательной среды повышает эффективность выращивания биоискусственных органов или их частей, в том числе, сложной, вытянутой формы.

Технический результат достигается тем, что используются преимущественно готовые, выпускаемые серийно, комплектующие, в том числе трубный диоптр и недорогой меш-небулайзер - единственный распылитель в устройстве, работающий бесшумно и без вибраций, тканеинженерная конструкция крепится к вращаемой электродвигателем рамке, через сетчатую мембрану электронно-сетчатого ингалятора (меш-небулайзера) подается культуральная питательная среда в виде аэрозоля, факел распыления отклоняется под действием гравитации книзу, рамка расположена ниже отверстия для подачи аэрозоля в емкость тканеинженерного биореактора и ниже отверстия для переходника ингаляционной камеры меш-небулайзера в крышке диоптра биореактора, аэрозоль с жидкой дисперсной фазой в виде культуральной питательной среды при вращении рамки заполняет все внутреннее свободное пространство биоректора. Стерильная дыхательная смесь периодически подается в биореактор через штуцер для подачи газовой дыхательной смеси, образуя восходящий воздушный поток, поднимающий часть капель аэрозоля наверх. Тонкораспыленная культуральная питательная среда в диспергированном состоянии имеет большую суммарную удельную поверхность и обеспечивает глубокое проникновение в тканеинженерную конструкцию, а также быстрое действие на клетки веществ в составе жидкой дисперсной фазы аэрозоля. Ввиду малых размеров частиц (около 3 мкм) скорость седиментации аэрозоля культуральной питательной среды невелика, поэтому они долго могут находиться во взвешенном состоянии в газовой дыхательной смеси биореактора. Использование меш-технологии позволяет гораздо более экономно расходовать культуральную питательную среду, не происходит ее нагревания раствора, отсутствует непосредственное повреждающее воздействие ультразвука на молекулы питательной среды.

Сущность предлагаемого технического решения поясняется чертежом, на котором представлен биореактор для тканевой инженерии с аэрозольным способом подачи культуральной питательной среды (фиг. 1, фиг. 2).

Устройство состоит из трубчатого диоптра 1, образующего емкость биореактора, рамки для крепления тканеинженерной конструкции (биоматрицы) 2, крышки диоптра 3, меш-небулайзера 4, электродвигателя с приводом вращения рамки 5, второй крышки диоптра с отверстием для небулайзера 6, переходника ингаляционной камеры меш-небулайзера 7, штуцера для подачи газовой дыхательной смеси в емкость биореактора 8, отверстия для выхода аэрозоля и крепления переходника ингаляционной камеры меш-небулайзера к емкости тканеинженерного биореактора 9, сетчатой мембраны электронно-сетчатого ингалятора (меш-небулайзера) 10, штуцера для слива культуральной питательной среды 11, шпилек диоптра 12, фланцев диоптра 13, уплотнителей фланца 14.

Устройство работает следующим образом: в стерильных условиях ламинарного шкафа тканеинженерная конструкция крепится к рамке, с помощью шпилек трубчатый диоптр крепится к фланцам, в том числе к фланцу со второй крышкой диоптра и отверстием для небулайзера, уплотнители обеспечивают герметичность крепления, тканеинженерная конструкция оказывается внутри емкости, образованной трубчатым диоптром с крышками. Подключаются силиконовые трубки, одна - к штуцеру для слива культуральной питательной среды, другая - к штуцеру для подачи газовой дыхательной смеси в емкость биореактора. Включается меш-небулайзер и электродвигатель вращения рамки. От сетчатой мембраны электронно-сетчатого ингалятора (меш-небулайзера) через переходник ингаляционной камеры подается аэрозоль культуральной питательной среды, факел распыления менее 45 гр, переходник ингаляционной камеры находиться выше рамки с тканеинженерной конструкцией. Культуральная питательная среда в биореакторе рециркулирует. Камера меш-небулайзера вместе с сетчатой мембраной являются съемными, периодически заменяются на стерильные, при этом сменная сетчатая мембрана промывается стерильными моющими растворами. Все манипуляции с биоматрицей проводятся в стерильных условиях ламинарного шкафа. Тканеинженерная конструкция может строиться в биореакторе такого типа практически неограниченное время, а также созревать после биопечати или сборки вне биореактора.

Работоспособность предлагаемого устройства подтверждается следующим экспериментальным примером: коллагеновая мембрана (коллаген 1 типа), полученная методом электроспининга, с адгезированными к верхней поверхности клеточными сфероидами из клеток надкостницы кролика, крепится к рамке. Производится сборка и крепление диоптра с помощью шпилек, на штуцер подачи газовой смеси одевается силиконовая трубка, соединенная с газовым баллоном через систему редукторов и клапанов, штуцер для слива культуральной питательной среды подключается к системе рециркуляции питательной среды посредством силиконовой трубки. Включается электродвигатель привода вращения рамки, включается меш-небулайзер. С определенной периодичностью (2 раза в сутки) производиться замена переходника ингаляционной камеры электронно-сетчатого ингалятора (меш-небулайзера) и ингаляционной камеры меш-небулайзера вместе с сетчатой мембраной. Для этого отключается меш-небулайзер и электродвигатель. Меш-небулайзер отсоединяется от устройства, производиться замена камеры и мембраны, камера меш-небулайзера заполняется культуральной питательной средой, меш-небулайзер присоединяется к устройству, включается электродвигатель и сам меш-небулайзер. Биореактор позволяет поддерживать условия культуры ткани, питание и дыхание клеток в составе тканеинженерной конструкции практически неограниченное время.

Список литературы

1. Патент №2715313 С1, Российская Федерация, МПК С12М 3/00, C12N 5/0775. Биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций in vivo, №2018139446: заявл. 08.11.2018: опубл. 26.02.2020 / А.В. Ковалев.

2. Патент №2482180 С2, Российская Федерация, МПК C12N 5/00, С12М 3/00. Биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций, №2011129288/10: заявл. 14.07.2011: опубл. 20.05.2013 / А.В. Ковалев.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, тканевой инженерии и регенеративной медицине. Биореактор для тканевой инженерии с аэрозольным способом подачи культуральной питательной среды содержит емкость с прозрачными стенками и герметично закрывающейся крышкой, штуцер для слива питательной среды, распылитель питательной среды и элемент крепления тканеинженерной конструкции. Емкость выполнена из трубного диоптра и содержит две крышки, расположенные напротив друг друга. Для подачи культуральной питательной среды используется один факел распыления от меш-небулайзера. Отверстие для переходника ингаляционной камеры меш-небулайзера с открытой сетчатой мембраной расположено в крышке диоптра. В пространстве емкости биореактора расположена рамка, вращающаяся с помощью двигателя, к которой крепится тканеинженерная конструкция. Рамка расположена ниже сетчатой мембраны меш-небулайзера. Диоптр имеет наклон в сторону крышки диоптра с закрепленным меш-небулайзером. В нижней трети крышки, противоположной крышке диоптра с меш-небулайзером, находится штуцер для подачи внутрь устройства стерильной дыхательной газовой смеси. Изобретение обеспечивает снижение расхода культуральной питательной среды, более длительное удержание питательной среды на тканеинженерной конструкции, снижение шума и вибраций при работе биореактора. 2 ил.

Биореактор для тканевой инженерии с аэрозольным способом подачи культуральной питательной среды, включающий емкость с прозрачными стенками и герметично закрывающейся крышкой, штуцер для слива питательной среды, распылитель питательной среды, элемент крепления тканеинженерной конструкции, отличающийся тем, что емкость выполнена из трубного диоптра и содержит две крышки, расположенные напротив друг друга, для подачи культуральной питательной среды используется один факел распыления от меш-небулайзера, отверстие для переходника ингаляционной камеры меш-небулайзера с открытой сетчатой мембраной расположено в крышке диоптра, в пространстве емкости биореактора расположена рамка, вращающаяся с помощью двигателя, к которой крепится тканеинженерная конструкция, рамка расположена ниже сетчатой мембраны меш-небулайзера, диоптр имеет наклон в сторону крышки диоптра с закрепленным меш-небулайзером, в нижней трети крышки, противоположной крышке диоптра с меш-небулайзером, находится штуцер для подачи внутрь устройства стерильной дыхательной газовой смеси, слив жидкости осуществляется через штуцер в нижней точке емкости.