Способ производства биокомпозитных сфероидов для восстановления костной ткани Российский патент 2021 года по МПК C12N5/00 C12N5/77 A61L27/38 A61K38/39 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, пластической хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии.

Уровень техники

Найти эффективные пути восстановления структуры и анатомической целостности органов и тканей после повреждения (нарушения) или болезней, изменяющих их нормальную структуру - это серьезная проблема здравоохранения, требующая поиска и разработки более эффективных решений. Новая область медицины - регенеративная медицина - ставит одну из задач выявления регенерационной способности там, где она оставалась нераскрытой. Одно из важнейших положений учения о регенерации гласит, что если органотипическая регенерация не наблюдается в естественных условиях, то она может быть индуцирована и усилена искусственным путем.

Регенеративная медицина - восстановление нормальной структуры и функций поврежденных или стареющих органов, тканей и клеток человека, за счет появления и внедрения новых технологий: генной и клеточной терапии, стволовых клеток, тканевой инженерии, биомеханических протезов и т.д.

Областью исследований травматологии и ортопедии является экспериментальная и клиническая разработка новых методов лечения заболеваний и повреждений опорно-двигательной системы и внедрение их в клиническую практику. Трансплантация костной ткани или костнопластических материалов имеет высокую востребованность в современной медицине, стоит на втором месте по частоте пересадок донорских тканей реципиенту после переливания крови. Трансплантационная регенерация кости по костному аутологичному, аллогенному трансплантату или каркасу (костнопластическому материалу) является длительным, ограничивающим подвижность и мучительным для пациента методом лечения, растягивается на многие месяцы и годы, требующим стабилизации костных отломков, иногда иммобилизации конечности, далеко не всегда удается добиться полной реабилитации - костного сращения и избежать повторных хирургических операций и инвалидизации пациента.

Одним из направлений стимуляции репаративного остеогенеза является клеточная терапия. Однако, эффективность клеточных трансплантаций часто недостаточно высока. Это связано с рядом ограничений, требующих преодоления, проведения трансляционных исследований.

Можно выделить следующие ограничения клеточной терапии в травматологии и ортопедии.

1. Быстрая гибель клеток при трансплантации в виде суспензии.

2. Недостаточно длительное удержание на месте.

3. Потеря жизнеспособности из-за ограниченной передачи сигналов от клетки к клетке и клеточного матрикса.

4. Неконтролируемая микросреда реципиентной области.

5. Недостижение порога количества клеток, необходимого для остеогенеза.

6. Необходимость длительного взаимодействия с организованным субстратом.

Установлено, что максимум трехмиллиметровые кусочки тканей могут существовать в благоприятной среде без собственной сосудистой сети и нормального кровообращения. Одним из решений проблем клеточной терапии стали разработки клеточных или тканевых сфероидов, как строительных блоков для регенеративной медицины и тканевой инженерии в том числе опорно-двигательного аппарата. Тканевые сфероиды - это плотно упакованные клетки в агрегаты округлой формы, наиболее часто производят диаметром 25-500 микрометров.

Основные преимущества применения клеточных сфероидов в тканевой инженерии костей:

1. Увеличение жизнеспособности клеток.

2. Микросреда, приближенная к in vivo.

3. Высокая клеточная емкость для реконструкции.

4. Большая биосовместимость.

5. Способность к механотрансдукции.

6. Способность к биоинтеграции и клеточной дифференцировке.

Немецкая компания «Со.don" успешно использует тканевые сфероиды ("хондросферы") в клинике с 2008 года для лечения повреждений и хряща. Проведено более 15 тысяч трансплантаций хондросфер 75% из которых завершились успехом. Причем повторная биопсия через 2 года убедительно и объективно продемонстрировала полную регенерацию дефектов хряща хондросферами с образованием аутентичного гиалинового хряща. После завершения успешного клинических испытаний компания получила разрешение в 2018 году использовать данную технологию во всех странах Европейского союза.

Известен другой тип тканевых сфероидов - «остеосферы», сформированные из костных клеток для лечения болезней и повреждений кости. Компания "Osteosphere" расположенная в Техасе, США пытается коммерциализировать данную технологию.

Свойства сфероидов и их регенеративный потенциал зависят от способов их производства. Самый давно известный, широко распространенный, относительно дешевый и простой метод - метод «висячей капли» (hanging drop method), существует много модификаций этого метода. В одной, из которых, клеточную суспензию помещают на крышку чашки Петри в виде капли на несмачиваемой необработанной поверхности полимера, к которой клетки не могут адгезироваться, поэтому клетки спонтанно образуют между собой клеточные агрегаты на дне капли культуральной среды - сфероиды [Susan Breslin, Lorraine O'Driscoll. (2013). Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249]. Любое случайное резкое перемещение, встряхивание смешивает капли, производственный процесс нарушается. Достаточно сложно проводить смену культуральной питательной среды.

Один из известных способов производства сфероидов (компания Synthecon, США) основан на принципе клинотации, определяемая как аннулирование силы тяжести при медленном вращении вокруг одной или двух осей. Когда культуральный сосуд с питательной средой и клеточной культурой вращается, клетки или агрегаты клеток ускоряются до предельной (седиментационной) скорости, при которой сила гравитации уравновешены гидродинамическими силами сдвига, центробежной силой и силой Кориолиса. В этих условиях клетки взаимодействуют между собой и образуют клеточные агрегаты. Основной недостаток - плохо контролируемые размеры клеточных агрегатов - большой разброс размеров, соответственно многие агрегаты клеток осаждаются на стенки флаконов в роллерных системах The Rotary Cell Culture System (RCCS) этого производителя.

Известна технология 3D клеточных культур, которая максимизирует межклеточные взаимодействия. Клеточные агрегаты образуются в агарозных лунках, имеющих определенные размеры (Microtissues, США). Компания производит силиконовые прецизионные микроформы для литья агарозы 3D Petri Dishes ™, агарозные отпечатки, с которых помещаются в стандартные многолуночные планшеты, заполняемые культуральной питательной средой. В новом 3D Petri Dishes ™ в противоположности обычной чашке Петри, живые клетки не прилипают ко дну чашки, но они самостоятельно прилипают друг к другу и самостоятельно собираются в трехмерные микроткани. Форма лунки затрудняет циркуляцию питательной среды, диффузию кислорода и извлечение клеточных агрегатов. Агарозная лунка в микроформованном агарозном геле имеет 800 мкм - диаметр, глубину - 2000 мкм.

Одной из особенностей сфероидов, производимых по этому способу, является образование гипоксического ядра в центре клеточного агрегата, в этой центральной области сфероида формируется область апоптоза и гибели клеток.

В качестве прототипа настоящего изобретения может быть выбран способ получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных в виде сфероидов для стимуляции регенерации костной ткани, описанный в документе RU2675930. Однако данный способ характеризуется рядом ограничений, в частности получаемые сфероиды имеют мелкий размер 50-200 мкм.

Таким образом, несмотря на имеющиеся способы производства клеточных сфероидов, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных проблем.

Раскрытие изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового способа получение клеточных сфероидов для восстановления костной ткани.

Техническим результатом данного изобретения является разработка нового эффективного способа получения сфероидов, в частности на основе клеток надкостницы, для эффективного восстановления костей, обладающих выраженным регенеративным потенциалом.

Указанный технический результат достигается посредством осуществления способа получения сфероидов для восстановления костной ткани субъекта, включающий:

- получение адгезивных клеточных культур аутологичных клеток субъекта, представляющих собой 2D культуру клеток.

- 3D культивирование указанных аутологичных клеток субъекта в агарозных лунках, в качестве агарозной лунки используется усеченная пирамидообразная агарозная лунка в виде четырехугольной правильной пирамиды, подача питательной среды осуществляется с помощью электронно-сетчатого распылителя в виде тонкодисперсного аэрозоля с размером капель 1-3 мкм, факел распыления аэрозоля направлен под углом 20-85° к основанию лунки, а наклон агарозных лунок к горизонту составляет 3-5°, причем питательная среда содержит пеногаситель.

В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды представляют собой сфероиды на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде биокомпозитного ядра сфероида, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде биокомпозитного ядра сфероида. В более предпочтительных вариантах воплощения изобретения адгезивная клеточная культура аутологичных клеток субъекта представляет собой 2D культуру клеток внутреннего слоя надкостницы субъекта и обладающих остеогенными потенциями. В частных вариантах воплощения изобретения сфероид включает деминерализованный костный матрикс в виде ядра сфероида.

В частных вариантах воплощения изобретения питательная среда для культивирования в качестве пеногасителя включает симетикон в количестве 5 мг на 1 литр питательной среды на этапе 3D культивирования.

В частных вариантах воплощения изобретения питательная среда для культивирования включает тромболизат человека 5-10% и дексаметазон в концентрации 5 мкг на литр среды, без ксеногенной фетальной бычьей сыворотки.

В частных вариантах воплощения изобретения усеченная пирамидообразная агарозная лунка в виде четырехугольной правильной пирамиды характеризуется тем, что высота пирамиды 1200 мкм, в основании квадрат с размером стороны 600 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения агарозная лунка находиться в стерильной воздушной среде CO₂-инкубатора с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и при 100% влажности, при термостатировании газовой фазы 36,6°С.

В частных вариантах воплощения изобретения размер сфероида составляет 400-800 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения размер сфероида составляет 600 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения размер биомпозитного ядра сфероида составляет 300-500 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения размер биомпозитного ядра сфероида составляет 300 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения в лунку помещают перед началом 3D культивирования 10000-20000 клеток.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.

В частных вариантах воплощения изобретения 3D культивирование осуществляется в течение 7-21 дней.

Краткое описание чертежей.

Фигура 1. Схема строения агарозной лунки:

А) схема строения агарозной лунки 3D Petri Dishes ™ (Microtissues, США) (затруднена диффузия кислорода);

Б) схема строения агарозной лунки по изобретению (более активный рост сфероидов).

На фиг.1 цифрами обозначены следующие позиции:

10 - уровень питательной среды.

Фигура 2. Схема расположения панели с агарозными лунками в культуральном флаконе с подачей высокодисперстного аэрозоля из питательной среды. На фиг.2 цифрами обозначены следующие позиции:

1. Мэш-небулайзер с автоматической подачей питательной среды в резервуар не-булайзера;

2. Патрубок соединяющий Мэш-небулайзер с культуральным флаконом;

3. Культуральный флакон (матрас для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой с вентилируемой крышкой со встроенным фильтром (Techno Plastic Products AG);

4. Чашка с агарозой и лунками;

5. Агарозная лунка;

6. Вентиллируемая крышка со встроенным фильтром культурального флакона;

7. Боковая крышка культурального флакона, открывающаяся.

Определение и термины

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.

Используемый в данном документе термин «дефект» относится к хрящевой или костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект скелетных соединительных тканей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы.

Термин «адгезивная культура» в настоящем документе означает монослойную культуру клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу, при наличии определенных условий эти клетки будут прикрепляться к субстрату и в норме будут делиться и распространяться таким способом.

Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса. Сфероиды, согласно изобретению, характеризуются размером 400-800 мкм, в предпочтительных вариантах 600 мкм. Сфероиды согласно настоящему изобретению могут быть получены на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде ядра сфероида, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде ядра сфероида.

Клетки камбиального слоя надкостницы содержат скелетогенные клетки - остеобласты, преостеобласты и стволовые скелетогенные клетки.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга - гетерогенная популяция клеток стромы костного мозга, способная к дифференцировке в клетки, имеющие мезенхимальное происхождение: адипоциты, остеоциты, хондроциты, а также в особых условиях in vitro в клетки эктодермального и энтодермального фенотипа.

Используемый в данной заявке термин «трансплантат» относится к сфероидам, а термин «трансплантация» - это процесс пересадки указанного трансплантата на основе сфероидов в организм субъекта, как правило, для устранения дефекта скелетных соединительных тканей.

«Композиты» - это материалы-конструкции, они конструируются из двух, трех или более материалов, обладающих различными свойствами и достаточно надежно соединенных друг с другом, чтобы обеспечить работу полученной системы как единого целого. Биокомпозиты - это конструкции, созданные природой.

«Кость» - орган опорно-двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Кость с позиции материаловедения - это биокомпозит или полимерный композит. Исследованиями их свойств интенсивно занимаются специалисты в области композитов. Известно, что костная ткань содержит три основных компонента - минеральное вещество гидроксилапатит (~70%), органическое вещество на основе белка коллагена (~20%) и воду (~10%).

Частицы деминерализованной кости по изобретению (деминерализованный костный матрикс в виде ядра сфероида), в частности, представляют собой костнопластический материал Перфоост.

Подробное раскрытие изобретения

Клетки внутреннего слоя надкостницы являются камбием, содержащим остеоген-ные клетки, принимающим активное участие в костной регенерации.

Условия реализации костеобразовательных потенций надкостницы:

1. Надкостница и суставные хрящи оставляются на своих прежних местах.

2. На разрез надкостницы накладываются хирургические швы, для восстановления ее целостности и препятствия врастанию внутрь параоссальных тканей.

3. При регенерации первоначально формируется «грубая модель будущей кости», которая состоит в значительной мере из хряща. Хрящевая матрица замещается полноценной новообразованной костью-регенератом.

Агарозные лунки создаются в агарозе (силиконовая форма с выпячиваниями в форме лунок заливается агарозой - получается отливка) и они (слой агарозы с множественными лунками в ней) в чашке переносятся в культуральный флакон (фиг.2). Дно чашки расположено под углом к дну культурального флакона. И уже в этом флаконе переносятся в СО₂-инкубатор. Поднятый ободок в чашке по высоте соответствует уровню залитой агарозы. Он не мешает сливу питательной среды с поверхности агарозы. В культуральном флаконе делается специальное дополнительное отверстие для соединения небулайзера с емкостью флакона через патрубок, который герметично соединен с флаконом и небулайзером. Факел аэрозоля падает на поверхность агарозы и создает ток питательной среды по поверхности. Применяемая в данном изобретении технология получения аэрозоля - Меш-технология распыления (Vibrating Mesh Technology, технология основана на «просеивании» (проталкивании) питательной среды через сетку-мембрану с множеством микроскопических отверстий) позволяет выращивать сфероиды, сохраняя все свойства питательной среды, и получать очень мелкие капли 1-3 мкм (высокодисперсные аэрозоли) питательной среды. Толщина слоя текущей питательной среды около 2-3 мкм.

В эксперименте удается в указанных выше агарозных лунках формировать жизнеспособные сфероиды с выраженным регенераторным потенциалом заданных размеров.

Такой способ выращивания позволяет более эффективно обеспечить подачу растворенных питательных веществ и кислорода к сфероидам, а также повысить эффективность воздействия газотрансмиттеров (при их добавлении в газовую фазу культуральной среды) на 3D клеточные культуры, в том числе на клеточные агрегаты и сфероиды.

Пример реализации способа по изобретению.

Этапы выполнения способа.

1. Под общим наркозом у кролика в ходе небольшой хирургической операции в асептических условиях производиться забор надкостницы с передней поверхности большеберцовой кости размером 4 на 1 см. Рана ушивается.

2. Надкостница передается в клеточную лабораторию. С помощью скальпеля производиться выскабливание внутреннего росткового слоя надкостницы, с последующим помещением кусочков тканей в раствор коллагеназы для получения диспергированных клеток.

3. Клетки надкостницы переносятся в культуральные флаконы (обработанная поверхность дна флакона для адгезивных культур) с питательной средой и культивируются в системе 2D, как адгезивные клеточные культуры. В питательной среде отсутствует ксеногенная фетальная бычья сыворотка, вместо которой используется человеческий тромболизат. Лизаты тромбоцитов способствуют расширению мезенхимальных стволовых клеток и являются безопасным заменителем сыворотки животных в клеточной терапии (Doucet С, Ernou I, Zhang Y, Llense JR, Begot L, Holy X, et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 2005; 205(2):228-36), более того, соединительнотканного происхождения клетки размножающиеся в тромболизатах, растут быстрее по сравнению с клетками, размноженными в среде, обогащенной фетальной бычьей сывороткой. Питательная среда - среда ДМЕМ с L-глутамином (ПанЭко, РФ), 10% тромболизатом (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин-стрептомициновая смесь (пенициллин-стрептомицин, 100-кратный раствор, рабочая концентрация 10 мл/л (ПанЭко, РФ) с добавлением дексаметазона (0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США). Может быть использована среда бессывороточная, среда StemPro MSC SFM CTS (Thermo FS).

4. Суспензия клеточной культуры клеток надкостницы переносят в виде суспензии в агарозные лунки (форма лунки в виде усеченной пирамиды) в количестве 20000 клеток на 1 лунку, куда предварительно погружают частицу частично деминерализованной аллогенной кости, для последующего 3D культивирования и образования клеточных агрегатов, окружающих ядро из заготовленной костной ткани.

5. Агарозные лунки переносят в CO₂-инкубатор с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и при 100% влажности, при термостатировании газовой фазы 36,6°С внутри инкубатора.

6. Внутри CO₂-инкубатора находиться электронно-сетчатый распылитель питательной культуральной среды в виде тонкодисперсного аэрозоля с размером капель 1-3 мкм, факел распыления аэрозоля питательной среды направлен под углом 20-85 градусов к основанию лунки. Питательная среда - среда ДМЕМ с L-глутамином (ПанЭко, РФ), 10% тромболизатом (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин-стрептомициновая смесь (Пенициллин-стрептомицин, 100-кратный раствор, рабочая концентрация 10 мл/л (ПанЭко, РФ) с добавлением дексаметазона (0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США), с добавлением симетикона в количестве 5 мг на 1 литр питательной среды. Может быть использована среда бессывороточная StemPro MSC SFM CTS (Thermo FS) с добавлением дексаметазона (0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США), с добавлением пеногасителя симетикона в количестве 5 мг на 1 литр питательной среды.

7. Рост клеточных сфероидов из клеток надкостницы в 3D культуре может продолжаться до 14 суток.

8. Сфероиды извлекаются из агарозных лунок, отмываются от культуральной питательной среды в теплом растворе F12 и виде суспензии набираются в шприц для трансплантации субъекту, в частности в организм модельного животного как трансплантаты - источники костной регенерации, а также как субстрат для трансплантационной регенерации кости.

В известных агарозных лунках большая глубина, и цилиндрическая форма, поэтому извлечение сфероидов затруднено, часто необходимо центрифугировать агарозные формы с лунками, чтобы извлечь оттуда сфероиды. Диффузия питательных веществ и кислорода затруднено, так как стоит над сфероидом неподвижный более высокий столб питательной среды с узким входным отверстием (фиг.1, а).

В способе по изобретению над отверстием в лунку постоянный микроток питательной среды, более активная подача питательных веществ и более высокая смешиваемость питательной среды с агарозной лунке, эта питательная среда мелко распылена и активно орошает лунки, количество растворенного кислорода в ней выше, отверстие более широкое и расширяемое кверху, поэтому извлечение сфероидов сложностей не вызывает, при росте сфероида, он поднимается к выходному отверстию (фиг.1, б). Ток питательной среды над лункой в 2-4 мкм толщиной способствует низкоамплитудным движениям и неполному вращению сфероидов, что оказывает благоприятное влияние на их рост и препятствует миграции клеток наружу из лунки. В таком способе больше скорость наращивания биомассы сфероидов и выше клеточность самого сфероида (клетки более активно пролиферируют и плотность клеток в клеточном агрегате выше). Форма лунки в виде усеченной пирамиды легче изготавливать, меньше бракованных заливок.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, пластической хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии, и состоит в разработке способа получения сфероидов для восстановления костной ткани субъекта. Способ получения сфероидов для восстановления костной ткани субъекта включает получение адгезивных клеточных культур аутологичных клеток субъекта, представляющих собой 2D культуру клеток; 3D культивирование указанных аутологичных клеток субъекта в агарозных лунках. В качестве агарозной лунки используется усеченная пирамидообразная агарозная лунка в виде четырехугольной правильной пирамиды. Подача питательной среды осуществляется с помощью электронно-сетчатого распылителя в виде тонкодисперсного аэрозоля с размером капель 1-3 мкм. Факел распыления аэрозоля направлен под углом 20-85° к основанию лунки, а наклон агарозных лунок к горизонту составляет 3-5°. Питательная среда содержит пеногаситель. Технический результат – разработка нового эффективного способа получения сфероидов, в частности, на основе клеток надкостницы для эффективного восстановления костей, обладающих выраженным регенерационным потенциалом. 9 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 ил.

1. Способ получения сфероидов для восстановления костной ткани субъекта, включающий:

- получение адгезивных клеточных культур аутологичных клеток субъекта, представляющих собой 2D культуру клеток;

- 3D культивирование указанных аутологичных клеток субъекта в агарозных лунках, в качестве агарозной лунки используется усеченная пирамидообразная агарозная лунка в виде четырехугольной правильной пирамиды, подача питательной среды осуществляется с помощью электронно-сетчатого распылителя в виде тонкодисперсного аэрозоля с размером капель 1-3 мкм, факел распыления аэрозоля направлен под углом 20-85° к основанию лунки, а наклон агарозных лунок к горизонту составляет 3-5°, причем питательная среда содержит пеногаситель.

2. Способ по п. 1, в котором питательная среда для культивирования в качестве пеногасителя включает симетикон в количестве 5 мг на 1 литр питательной среды на этапе 3D культивирования.

3. Способ по п. 1, в котором питательная среда для культивирования включает тромболизат человека 5-10% и дексаметазон в концентрации 5 мкг на литр среды, без ксеногенной фетальной бычьей сыворотки.

4. Способ по п. 1, в котором усеченная пирамидообразная агарозная лунка в виде четырехугольной правильной пирамиды характеризуется тем, что высота пирамиды 1200 мкм, в основании квадрат с размером стороны 600 мкм.

5. Способ по п. 1, в котором агарозная лунка находится в стерильной воздушной среде СО₂-инкубатора с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и при 100% влажности, при термостатировании газовой фазы 36,6°С.

6. Способ по п. 1, в котором сфероиды представляют собой сфероиды на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде биокомпозитного ядра сфероида, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде биокомпозитного ядра сфероида.

7. Способ по п. 1, в котором размер сфероида составляет 400-800 мкм.

8. Способ по п. 6, в котором размер биокомпозитного ядра составляет 300-500 мкм.

9. Способ по п. 1, в котором в лунку помещают перед началом 3D культивирования 10000-20000 клеток.

10. Способ по п. 1, в котором 3D культивирование осуществляется в течение 7-21 дней.