Способ моделирования длительно незаживающих ран кожи в эксперименте на фоне формирования условной модели коморбидного больного Российский патент 2024 года по МПК A61K31/133 A61P9/04 A61K31/505 A61P5/16 G09B23/28 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть применимо для моделирования длительно незаживающей раны. Моделирование длительно незаживающей раны на мелких лабораторных животных может быть использовано для оценки действия лекарственных средств, предназначенных для стимуляции регенерации и/или репарации у коморбидных пациентов, например, при доклинических испытаниях новых лекарственных средств.

Современные модели экспериментального изучения регенеративных лекарственных средств или биомедицинского клеточного продукта включают в себя различные по способу нанесения и площади поражения у мелких и крупных лабораторных животных [1-3]. Наиболее часто используются грызуны (крысы, мыши, хомячки, морские свинки), однако экстраполирование полученных в ходе эксперимента данных ограничено по двум основным позициям:

- у норных грызунов происходит несвойственная высшим приматам контракция раны;

- значимая часть раненых и пострадавших имеют сопутствующие заболевания, при этом имеющаяся коморбидность также влияет на динамику заживления ран, особенности эпителизации и формирования рубцов.

Существующие модели экспериментальных длительно незаживающих ран не учитывают коморбидность и обеспечиваются особенностью нанесения повреждений с моделированием нарушений кровообращения по периферии [4, 5], максимального ограничения контракции [6], инфицирования ран [7-10] или модулирования иммуносупрессии [11]. С другой стороны, гормоны щитовидной железы являются уникальными регуляторами клеточной пролиферации и ангиогенеза, что делает их универсальными регуляторами регенерации и репарации [12]. С учетом высокого распространения сердечно-сосудистой патологии [13] и патологии эндокринной системы [14] экспериментальное моделирование данных заболеваний перед нанесением поражения кожи воспроизводит достаточно высокую степень приближения к клинической модели коморбидного пациента.

Целью изобретения является моделирование длительно незаживающей раны кожи в эксперименте путем формирования хронической сердечной недостаточности и индукции медикаментозного гипотиреоза средней степени тяжести на протяжении всего эксперимента с последующим нанесением термического повреждения кожи.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что при данном способе моделирования длительно незаживающих ран до нанесения экспериментальных повреждений кожных покровов:

- моделируют хроническую сердечную недостаточность путем ежедневного 5-минутного свободного плавания лабораторного животного в течение 20 дней на фоне внутрибрюшинного ведения 0,05 мл 0,1% раствора мезатона на каждые 100 г массы лабораторного животного;

- последующей индукцией лекарственного гипотиреоза тяжелой степени тяжести путем введения пропилтиоурацила в дозе 1,0±0,2 мг на 100 г массы лабораторного животного 1 раз в сутки за 4 дня до нанесения раны, при этом субстанции вводят внутрижелудочно через атравматичный зонд ежедневно;

- повреждение кожи осуществляют нанесением термического ожога крысам с помощью цилиндрического стального аппликатора с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм, нагрев которого до постоянной температуры перед воздействием на животное проводят путем полного погружения в кипящую воду на две минуты, продолжительность времени аппликации составляет 40 секунд.

Техническим результатом предлагаемого нами способа является решение задачи, заключающейся в моделировании длительно незаживающей раны, являющейся условной моделью коморбидного пациента.

Преимущества предлагаемого нами способа заключается в нанесении повреждении кожи на фоне системного нарушения гемодинамики с одновременным созданием тиреоид-зависимого нарушения клеточной пролиферации и ангиогенеза.

После регламентированного 14-дневного карантина белым беспородным крысам массой 200-250 г, содержащимся в стандартных условиях вивария, после взвешивания внутрибрюшинно вводят мезатон, объем которого рассчитывается по следующей пропорции: 0,05 мл 0,1% официнального раствора на каждые 100 г массы лабораторного животного. Далее через 3-5 минут после выполнения внутрибрюшинного введения мезатона лабораторное животное помещают на 5 минут в наполненную водой температурой 20-25°С бассейноподобную структуру с высокими краями, где крыса подвергается свободному плаванию. После чего животное вынимается, высушивается и помещается в клетку. Данная процедура выполняется 20 дней подряд и способствует дилатации камер сердца, что приводит к моделированию сердечной недостаточности с соответствующим нарушением гемодинамики и расстройством микроциркуляции.

Далее выполняется индукция лекарственного гипотиреоза тяжелой средней тяжести путем перорального введения пропилтиоурацила в дозе 1,0±0,2 мг на 100 г массы лабораторного животного 1 раз в сутки за 4 дня до нанесения раны, при этом субстанции вводят внутрижелудочно через атравматичный зонд ежедневно.

После моделирования условной коморбидности наносят термический ожог крысам с помощью цилиндрического стального аппликатора с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм, нагрев которого до постоянной температуры перед воздействием на животное проводили путем полного погружения в кипящую воду (температура 98-99°С) на две минуты. Продолжительность времени аппликации составляла 40 секунд, после чего аппликатор удаляли. Однако возможно нанесения механических повреждений кожи или химических ожогов по стандартной методике.

Основным критерием оценки является динамика эпителизации раны и длительность полной эпителизации раны. В качестве дополнительных критериев оценка может быть проведена по степени дегидратации рубцовой ткани, удельному весу (частоте) осложнений. Морфологическая и/или иммуногистохимическая оценка биоптатов, взятие которых было выполнено на различных временных интервалах, может выявить микроскопические особенности и/или экспрессию различных маркеров пролиферации, ангиогенеза и воспаления.

Пример осуществления предлагаемого способа.

Проведено несколько серий экспериментов на 112 беспородных крысах в возрасте 40±10 дней с начальной массой тела 200-250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. После окончания карантина лабораторные животные были рандоминизированно распределены на четыре равные группы [15], при этом экспериментальные и контрольная группа были сформированы следующим образом:

- на первой группе промодулирована хроническая сердечная недостаточность путем 20-дневного свободного плавания на фоне введения мезатона;

-- на второй группе воспроизведена модель пропилтиоурацилового гипотиреоза;

-- третья группа лабораторных животных сочетала экспериментальную хроническую сердечная недостаточность с медикаментозно-индуцированным гипотиреозом;

-- четвертая группа служила контролем.

Работа проведена в соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.) [16].

На четвертые сутки после моделирования лекарственного гипотиреоза во второй и третьей группах лабораторных животных и синхронно с ними наносили термический ожог всем лабораторным животным в области середины поверхности спины с обеих сторон тела. Манипуляции по подготовке места нанесения ожога и саму процедуру ожога кожи крысам выполняли под общей анестезией - внутрибрюшинное введение препарата Золетил (Valdepharm, Франция) в дозе 25 мг/кг в сочетании с клофелином (Дальхимфарм, РФ) в соотношении 1:1. У животных с левого бока в области средней трети туловища справа и слева выстригали шерсть и проводили депиляцию предназначенным для этого кремом в течение 20 минут, после чего крем с шерстью удаляли с поверхности кожи, кожу в данной области промывали теплой водой и давали обсохнуть. В качестве инструмента для нанесения термического ожога крысам использовали цилиндрический стальной аппликатор с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм. Нагрев аппликатора до постоянной температуры перед воздействием на животное проводили путем полного погружения в кипящую воду (температура 98-99°С) на две минуты. Продолжительность времени аппликации составляла 40 секунд, после чего аппликатор удаляли, а лабораторное животное помещали в клетку для содержания.

На третьи сутки после нанесения термического ожога иссекали струп, кожу вокруг раны прошивали хирургической нитью, по периметру раневого дефекта устанавливали напечатанную на 3D-принтере шину в форме кольца внутренним диаметром 22 мм, толщиной (размер между внутренним и наружным диаметром) 3 мм и шириной кольца 5 мм. Все лабораторные животные на область раны слева получали ежедневную аппликацию лекарственного средства «Левомеколь», рана с правой стороны служила объективным контролем. На девятые сутки после аппликации раневого покрытия у всех крыс под общей анестезией были удалены шинирующие кольца для обеспечения условия последующего естественного заживления раны.

Отбор тканей ран у крыс производили под общей анестезией на 7-е, 12-е и 18-е сутки эксперимента, а также после эвтаназии на 35-е сутки эксперимента. После иссечения образцов осуществляли проводку тканей, изготовление блоков и стеклопрепаратов по стандартной методике. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ гистологических препаратов проводили под световым микроскопом.

Качественные признаки представлены в виде абсолютных (количество) и относительных (удельный вес/частота, в %) данных, количественные - в виде среднего значения ± стандартное отклонение (нормальное распределение) или в виде медианы с границами 25 и 75-го перцентилей (отличное от ненормального распределения). Сравнение между группами проводили в зависимости от параметра распределения признака в группе (по W-критерию С.С. Шапиро и М. Уилка) с применением параметрических (t-критерий Стьюдента) и непараметрических методов. Критический уровень значимости принимали 0,05. Соотношение частот при расщеплении признаков в группах проводили с использованием критерия хи-квадрат К. Пирсона (χ²). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Таблица 1. Результаты заживления ран Название группы n Частота эпителизации на 27-е сутки, n (%) Средняя длительность полной эпителизация справа
(естественная эпителизация) слева
(аппликации Левомеколем) справа
(естественная эпителизация) слева
(аппликации Левомеколем) I 28 16 (57,1%) 19 (67,9%) 34 [29; 37] 33 ± 3,8 II 28 13 (46,4%) 14 (50%) 38 ± 3,2 35 [31; 39] III 28 0 10 (35,7%) 44 ± 4,6* 41 [38; 45] IV 28 20 (71,4%) 24 (82,7%) 32 ± 3,6 30 ± 3,9 * данные для 26 лабораторных животных, у 2-х крыс эпителизация не достигнута к 0 суткам наблюдения

Таким образом, использование предлагаемого способа моделирования длительно незаживающей раны имитацией, влияющей на регенеративные процессы коморбидности (хроническая сердечная недостаточность + гипотиреоз) с использованием стандартного противомикробного и ранозаживляющего препарата «Левомеколь» продемонстрировано пригодность данного способа моделирования длительно незаживающих ран для оценки регенеративных свойств лекарственных средств.

Список литературы:

1. Довнар Р. И. Нюансы выбора экспериментального животного для моделирования процесса заживления кожной раны // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2020. - Т. 18. - №. 4. - С. 429-435.

2. Довнар Р. И. Моделирование кожных ран в эксперименте //Новости хирургии. - 2021. - Т. 29. - №. 4. - С. 480-489.

3. Цибулевский А. Ю., Дубовая Т. К., Демьяненко И. А. Моделирование заживления ран кожи // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2020. - Т. 10. - №. 4. - С. 64-71.

4. Гатиатуллин И.З., Шевлюк Н.Н., Третьяков А.А., Фадеев С.Б., Мухаммедов, Х.Б.М. Способ лечения труднозаживающих ран в эксперименте. - 2020 - Патент RU 2715145 C1.

5. Воротеляк Е.А., Роговая О.С., Суханов Ю.В., Моргун Е.И., Риппа А.Л. Способ моделирования длительно незаживающих ран для оценки ранозаживляющего действия биомедицинских клеточных продуктов. 2019. - Патент RU 2702603 C1

6. Погодина, М. А., Шехтер, А. Б., & Руденко, Т. Г. Устройство для моделирования ран кожи. 2007. - Патент RU 72348 U1.

7. Галагудза М.М., Торопова Я.Г., Бельский, Ю. П., Бельская Н. В. Способ моделирования инфицированной раны на крысах SPF категории. 2020. - Патент RU 2746435 C1

8. Григорьев Г.Е., Лепехова С.А., Гольдберг О.А., Коваль Е.В., Зарицкая Л.В. Способ моделирования инфицированной кожной раны. 2011. - Патент RU 2431890 С1.

9. Зайцев А. Е., Асанов О. Н., Мясников Н. И. Способ моделирования трофических гнойных ран в эксперименте. 2021. - Патент RU 2753955 C1

10. Суховей Ю.Г., Цирятьева С.Б., Минин А.С., Самусев Р.С., Сыч А.С., Костоломова Е.Г. Способ моделирования инфицированной раны мягких тканей. 2008. - Патент RU2321898C1

11. Парийская E.H., Захарова Л.Б., Орлова О.Г., Рыбальченко О.В., Голованова Н.Э., Астратенкова И.В. Опыт моделирования гнойно-воспалительной раны на фоне иммуносупрессии // Лабораторные животные для научных исследований. - 2018. - №4. - С. 116-124.

12. Глушаков Р.И., Прошин С.Н, Тапильская Н.И. Роль тиреоидных гормонов в регуляции ангиогенеза, клеточной пролиферации и миграции // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011; 6 (1): 12 -18.

13. Каграманова С. Р., Чичерина Е. Н. Современное представление о распространенности хронической сердечной недостаточности // Дальневосточный медицинский журнал. - 2019. - №. 3. - С. 96-100.

14. Марковская Н. В., Скляр Х. А., Семенова Е. С. Распространенность заболеваний щитовидной железы // Вестник научных конференций. - ООО Консалтинговая компания Юком, 2019. - №. 11-3. - С. 49-50.

15. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, Гриф и К, Москва (2012), сс. 642-657.

16. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes, Strasbourg, 18.III.1986 (15.VI.2006), European Treaty Series, № 123 (1986, 2006).

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, комбустиологии, и может быть применимо для моделирования длительно незаживающей раны. У лабораторных животных моделируют нарушение гемодинамики формированием хронической сердечной недостаточности путем ежедневного 5-минутного свободного плавания лабораторного животного последовательно в течение 20 дней на фоне внутрибрюшинного ведения 0,05 мл 0,1% раствора мезатона на каждые 100 г массы лабораторного животного. Далее за 4 дня до нанесения экспериментального повреждения кожи индуцируют лекарственный гипотиреоз тяжелой степени тяжести путем перорального введения пропилтиоурацила в дозе 1,0±0,2 мг на 100 г массы лабораторного животного 1 раз в сутки. Препарат продолжают вводить в данном режиме на протяжении всего эксперимента. Повреждение кожи осуществляют нанесением термического ожога крысам с помощью цилиндрического стального аппликатора с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм. Его нагрев ведется до постоянной температуры перед воздействием на крысу с помощью погружения аппликатора в кипящую воду на две минуты. Продолжительность времени аппликации составляет 40 секунд. Способ позволяет получить модель длительно незаживающей раны, являющейся условной моделью коморбидного пациента, которую можно использовать для дальнейшей оценки регенеративных свойств лекарственных средств. 1 табл., 1 пр.

Способ моделирования длительно незаживающих ран кожи в эксперименте на фоне формирования условной модели коморбидного больного, отличающийся тем, что белым беспородным крысам массой 200-250 г моделируют хроническую сердечную недостаточность путем ежедневного 5-минутного свободного плавания лабораторного животного последовательно в течение 20 дней на фоне внутрибрюшинного введения 0,05 мл 0,1% раствора мезатона на каждые 100 г массы крысы; при этом за 4 дня до нанесения экспериментального повреждения кожи индуцируют лекарственный гипотиреоз тяжелой степени тяжести путем перорального введения пропилтиоурацила в дозе 1,0±0,2 мг на 100 г массы крысы 1 раз в сутки с продолжением введения препарата на протяжении всего эксперимента; повреждение кожи осуществляют нанесением термического ожога крысам с помощью цилиндрического стального аппликатора с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм, нагрев которого до постоянной температуры перед воздействием на крысу проводят путем погружения в кипящую воду на две минуты, продолжительность времени аппликации составляет 40 секунд.