НИОСОМАЛЬНЫЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ГЕЛЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТИЧЕСКИХ ЯЗВ, РАН, ОЖОГОВ, В ТОМ ЧИСЛЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ АНТИБИОТИКО-РЕЗИСТЕНТНЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ Российский патент 2022 года по МПК A61K38/00 A61P31/00 A61K9/127 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения трофических язв, ран и ожогов, инфицированных антибиотико-резистентными микроорганизмами у больных сахарным диабетом.

В настоящее время в науке и медицине большое внимание уделяется веществам, воздействующим на антибиотико-устойчивую микрофлору. Одной из групп таких веществ являются антимикробные пептиды - низкомолекулярные соединения, построенные из аминокислот и имеющие катионную или амфипатическую природу, которые синтезируются в организме большинства эукариот в ответ на внедрение чужеродных микроорганизмов. К ним относятся дефензины, которые имеют большие перспективы применения в качестве антимикробных препаратов, так как характеризуются высокой противомикробной активностью, безопасностью и отсутствием формирования с течением времени резистентности [1]. У больных сахарным диабетом 1 и 2 типа, без осложнений и с осложнениями (ретинопатия, синдром диабетической стопы и сердечно-сосудистые осложнения) содержание дефензинов в 2,5 раза выше, чем у здоровых [2]. Таким образом, дефензины возможно принимают участие в развертывании иммунологических реакций при сахарном диабете.

Однако известно, что антимикробные пептиды в силу своих химических свойств быстро разрушаются протеазами. Особенно ярко проблема антибиотикорезистентности проявляется при хроническом течении инфекционного процесса, например у пациентов с синдромом диабетической стопы. Это связано с тем, что инфицированные язвы плохо поддаются лечению системными противомикробными средствами ввиду низкой чувствительности к препаратам, а также иммунодефицита и нарушений микроциркуляции при сахарном диабете. Нарушения микроциркуляции у больных сахарным диабетом в свою очередь снижают эффективность системных антибактериальных препаратов. Тем не менее, попытки усилить эффективность системной антибактериальной терапии с помощью местных противомикробных средств не всегда результативны [3].

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является антимикробный гель для лечения инфицированных ран, ожогов и трофических язв [4]. Антимикробный гель содержит рекомбинантный альфа-дефензин-1 (HNP-1), ПЭГ 12 диметикон, гелеобразователь, триэтаноламин и воду очищенную. При этом HNP-1 инкапсулирован в ниосомы, сформированные с помощью ПЭГ 12 диметикона. Компоненты используются в заявленном количестве. Гель позволяет не только уничтожать патогенные бактерии в ране, но и ускорять скорость заживления ран. Использование кремнийорганических ниосом с пептидами, позволяет направленно доставлять их к патологическому очагу, пролонгировать снижение воспаления, улучшать микроциркуляцию и уничтожать микрорганизмы. Лечение антимикробным ниосомальным гелем с рекомбинантным альфа дефензином (Cloud-Clone Corp., США) осуществляют следующим образом. Гель в количестве 1-2 мл наносят на пораженный участок кожи. Показаниями к назначению препарата являются воспалительные, язвенно-некротические, инфекционные, ожоговые, трофические поражения кожи, в том числе при синдроме диабетической стопы, а также послеоперационные раны. Препарат быстро всасывается, а благодаря трансдермальной основе обеспечивает высокий процент доставки и длительную продолжительность действия альфа-дефензина-1. Гель наносят на пораженный участок 2 раза в сутки. Применение геля осуществляют до заживления поражения.

Однако в данном способе используют только рекомбинантные антимикробные пептиды, производимые за рубежом, стоимость которых очень высока. Это делает данный способ лечения дорогостоящим. Помимо очень высока. Это делает данный способ лечения дорогостоящим. Помимо этого, отсутствуют регенеративные пептиды плацентарного происхождения, содержащие факторы роста и эпителизации, что снижает эффективность полноценной регенерации.

Использование эндогенных антибиотиков-антимикробных пептидов, к которым не формируется устойчивость со стороны микроорганизмов, является очень перспективной идеей для решения этой проблемы. Инкапсулирование пептидов в кремнийорганические ниосомы позволит многократно уменьшить терапевтическую дозу и увеличить экономическую эффективность за счет пролонгируемого эффекта. Низкомолекулярные пептиды, выделенные из амниотической мембраны плаценты являются естественным резервуаром для соответствующих факторов роста и цитокинов. Амниотическая мембрана - это базальная мембрана с антиангиогенными и противовоспалительными свойствами. Способность ранозаживления диабетических язв, под воздействием инкапсулированнных в ниосомы регенераторных пептидов, основана на механизме восстановления метаболизма и как следствие, ускорения эпителизации диабетических язв.

Поставлена задача повышения эффективности регенерации, сокращения сроков лечения, снижения себестоимости лечения диабетических язв.

Поставленная задача достигается использованием ниосомального антимикробного геля, содержащего эндогенные антимикробные пептиды и плацентарных низкомолекулярные пептиды, инкапсулированные в кремнийорганические ниосомы.

Отличительными признаками заявляемого технического решения от известного изобретения является использование в качестве основного действующего вещества эндогенных антимикробных пептидов и низкомолекулярных регенераторных пептидов, выделенных из плацентарной ткани.

Получение ниосомального геля осуществляют следующим образом.

Выделяют эндогенные антимикробные пептиды ферментативным гидролизом лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, затем осветляют раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6%, выдерживают 15 минут при 66°С и осаждают балластные вещества центрифугируя при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Далее очищают фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Затем получают фракции пептидов при использовании разделительной колонки с Сефадексом G-25. Использование разделительной колонки позволяет получать фракцию с повышенным содержанием дефензинов. Так, содержание дефензина альфа 1 во фракции составляет 0.35±0,01 (мкг/мл). Для получения регенераторных пептидов, из экстракта плаценты животного происхождения, выделяют широкий спектр низкомолекулярных пептидов, обладающих высокими эпителизирующими свойствами. Полученные регенераторные пептиды объединяют с антимикробными эндогенными пептидами в равном объеме и инкапсулируют в кремнийорганические ниосомы. С этой целью полученную смесь помещают в сосуд для ультразвуковой обработки. Режим озвучивания: частота - 20 кГц, мощность - 200 Вт. Для экспозиции используют временные интервалы в 15, 30 и 45 минут. В результате повышается эффективность включения антимикробных пептидов в ниосомы. В заключение используют 50 мл гелеобразователя «Salcare SC80», который образует трехмерную объемную «сетку» при добавлении 20 мл триэтаноламина.

Разработанная таким способом наружная лекарственная форма на основе инкапсулированных пептидов представляет собой ниосомальный антимикробный гель.

Лечение полученным ниосомальным антимикробным гелем осуществляют следующим образом.

Гель, в количестве 1-2 мл, наносят на предварительно очищенную диабетическую язву. Ниосомы, содержащиеся в геле, обеспечивают пролонгированное продолжительное действие низкомолекулярных плацентарных и эндогенных антимикробных пептидов. Гель наносят на пораженный участок 2 раза в сутки. Применение геля осуществляют до эпителизации дефектов кожи.

Повышение эффективности лечения диабетических язв, ран и ожогов происходит при положительном эффекте синергии действия двух типов пептидов: эндогенных антимикробных и низкомолекулярных плацентарных.

Исследования были проведены на экспериментальных животных. Эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [5]. Полученные результаты применения геля в эксперименте на животных подтверждаются следующими примерами.

Пример №1

Лечение резаных ран. В опыте участвовало 2 группы животных: опытная и контрольная (плацебо) по 10 крыс каждая. Всем крысам, при физическом воздействии под эфирным наркозом, на хохолке удаляли шерсть и в этом месте наносили резаную рану стандартного размера (20 мм*10 мм). В контрольной группе, на резаную рану наносили «плацебо», что позволяло процессу заживления идти естественным путем. В исследуемой опытной группе, после нанесения физического повреждения, рану сразу же обрабатывали ниосомальным антимикробным гелем с пептидами. Для изучения скорости и характера регенераторного процесса у животных определяли площадь раны в момент нанесения повреждения, а затем, на 3-й, 5-е, 7-е, 15-е сутки после нанесения повреждения.

У крыс контрольной группы раневая поверхность в первые трое суток после повреждения была несколько увеличена по сравнению с опытной группой. По краям раны наблюдалась не яркая гиперемия и отек средней степени. По мере увеличения срока наблюдения на 5-е-7-е сутки краевая гиперемия уменьшалась вплоть до полного исчезновения. Рана имела пастозный оттенок. Наблюдалось уменьшение краевого отека. На 7-е сутки рана подсыхала, бледнела. Площадь раневой поверхности существенно уменьшалась. К 12-м 15-м суткам можно было наблюдать практически полное заживление раны.

У крыс опытной группы с первых суток рану обрабатывали ниосомальным антимикробным гелем с пептидами. Отек и краевая гиперемия были развиты значительно слабее. К 5 суткам площадь раны уменьшалась. Появление грануляционной ткани и краевой эпителизации отмечено на 2-е суток раньше, чем в контрольной группе. Рана подсыхала более интенсивно. У крыс опытной группы к 12 суткам наблюдалось практически полное заживление раны.

Использование заявляемого ниосомального антимикробного геля с пептидами ускорило процесс регенерации ран в эксперименте.

Пример 2

Лечение термического ожога кожи. Эксперимент моделировали на 20 крысах. Животные были разделены на 2 группы: контрольную и опытную по 10 крыс в каждой.

Под эфирным наркозом у животных создавали ожог прикладыванием к коже металлического паяльника, температурой 100°С, временем экспозиции 7 минут. Площадь поверхности воздействия составляла 1×5 мм. При данном режиме экспозиции достигалось повреждение всех слоев кожи.

В контрольной группе, крысам после ожога на рану наносили плацебо и заживление шло естественным путем. В опытной группе, крысам, после нанесения ожога, на рану наносили ниосомальный антимикробный гель с пептидами.

Наблюдение показало, что площадь раны у контрольной группы животных в первые 5 суток увеличивалась в размере, по сравнению с исходным. Рана имела белесый оттенок, мокла. Края ее были не ровными. После 7-х суток рана начинала подсыхать. На поверхности начинала образовываться плотная темная корочка.

В опытной группе, раны, обработанные ниосомальным антимикробным гелем с пептидами, увеличивались в размерах не столь значительно. Дальнейшее уменьшение ран в размерах шло более интенсивно по сравнению с контролем. Раны начинали подсыхать на 3-5 сутки, сохраняли нежно-розовый оттенок.

Разница в лечении ран контрольной и опытной группы была заметна уже в первые сутки после воздействия. К концу срока наблюдения, на 15 сутки, разница в заживлении ран между обеими группами была очевидна. Значительно отличалась величина и характер раневой поверхности у контрольной группы.

Таким образом, ниосомальный антимикробный гель с пептидами стимулирует процессы регенерации, однако его эффективность снижается, если раневая поверхность инфицирована антибиотико-устойчивыми микроорганизмами.

Пример №3

Лечение инфицированных ран кожи. В эксперименте моделировали инфицирование ран золотистым стафилококком на 30 крысах. Животные были разделены на 3 группы: первая группа контрольная (10 крыс), в которой на инфицированную рану 1 раз в сутки наносили плацебо - заживление шло естественным путем. Во второй опытной группе (10 крыс), сразу после инфицирования на раны 1 раз в сутки наносили гель «Левомеколь». В третьей опытной группе (10 крыс), на инфицированные раны также 1 раз в сутки наносили ниосомальный антимикробный гель с пептидами. В динамике проводили сравнительное изучение линейной скорости заживления ран и относительного снижения площади ран.

В контрольной группе, при вычислении линейной скорости заживления ран (v) с 5 по 9 день эксперимента, в первые пять дней лечения были получены следующие результаты: среднее значение v составило 0,0049±0,0154 мм²/сут. Расчет линейной скорости заживления ран с 9 по 16 день эксперимента показал схожие данные - 0,0053±0,0087 мм²/сут - статистически достоверные отличия v внутри группы отсутствовали (р=0,9516).

Во второй группе при лечении препаратом «Левомеколь», линейная скорость заживления ран с 5 по 9 день эксперимента составила 0,0099±0,0150 мм²/сут; с 9 по 16 день эксперимента v составила (р=0,1115) - 0,0253±0,0175 мм²/сут.

В третьей - опытной группе, при лечении ниосомальным гелем с антимикробными пептидами величина v с 5 по 9 день эксперимента в первые 5 дней лечения составила 0,0272±0,0094 мм²/сут, с 9 по 16 день эксперимента - линейная скорость заживления ран увеличилась - 0,0285±0,0127 мм²/сут (р=0,8127).

При вычислении величины относительного снижения площади ран были получены результаты сходные с данными при вычислении линейной скорости заживления ран: наиболее эффективным оказался ниосомальный гель с антимикробными пептидами. Вычисление величины процентной скорости заживления ран подтвердило результаты других вычислений (линейной скорости заживления ран и относительного снижения площади ран).

Ниосомальный антимикробный гель с пептидами ускорял регенерацию ран, инфицированных золотистым стафилококком (в промежутке с 5 по 16 день эксперимента).

Пример №4

Лечение моделированных диабетических язв инфицированных антибиотико-устойчивыми стафилококками.

В эксперименте моделировали диабетические язвы инфицированные антибиотико-устойчивыми стафилококками на 20 экспериментальных животных. Животные были разделены на 2 группы: в первой контрольной группе (10 крыс), сразу после появления язв, при моделировании алаксанового диабета и последующего инфицирования, на поверхность раны 2 раза в день наносили гель «Левомеколь» в течение 18 дней. Во второй группе (10 крыс), на инфицированные диабетические язвы наносили ниосомальный гель с инкапсулированными антимикробными и низкомолекулярными плацентарными пептидами.

После лечения проводили сравнительное изучение площади ран и гистопатологические исследования.

В результате проведенного исследования было установлено, что в контрольной группе, при применении препарата «Левомеколь», размер раны был значительным вплоть до 18 дня. В то же время, в опытной группе, применение разработанного ниосомального антимикробного геля привело к уменьшению в размере ран исследуемых крыс и к полному заживлению ран на 14 день эксперимента. Более высокая эффективность ниосомального антимикробного геля с пептидами в ранозаживлении диабетических язв, вызванных антибиотико-устойчивыми микроорганизмами, подтверждена также и гистопатологическими исследованиями. Так, у экспериментальных крыс в опытной группе отмечали полную эпителизацию, наличие волокон коллагена, замену кровеносных сосудов, наличие фибробластов и незначительное количество клеток воспаления.

Лечение ниосомальным антимикробным гелем инфицированных диабетических язв, в сравнении с применением стандартного препарата «Левомеколь», показало лучшие гистологические результаты. Полученные данные показали отсутствие необходимости дополнительного применения антибиотиков для лечения диабетических язв, ран и ожогов, что ведет к отсутствию риска селекции антибиотико-устойчивых штаммов возбудителей и генерализации процесса, а также предотвращает аллергизацию организма больного и возникновение дисбактериоза.

Использование разработанного ниосомального антимикробного геля способствует повышению эффективности лечения диабетических язв, ран и ожогов за счет положительного эффекта синергии действия двух типов пептидов: эндогенных антимикробных и низкомолекулярных плацентарных.

Ниосомальный антимикробный гель может быть использован для лечения как амбулаторно, так и в медицинских учреждениях.

Источники информации

1. Puri S., Edgerton М. How does it kill?: understanding the candidacidal mechanism of salivary histatin 5. Eukaryotic Cell. 2014; 13(8):958-964. doi:10.1128/ec.00095-14.

2. Norris A. Ligand promiscuity through the eyes of the aminoglycoside N3 acetyltransferase IIa/ A. Norris, E. Serpersu// Protein Sci. - 2013. - Vol. 22. - Is. 7. - P. 916-928.

3. Dumville J. Topical antimicrobial agents for treating foot ulcers in people with diabetes/ J. Dumville, B. Lipsky, С.Hoey, M. Cruciani// Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2017. - doi: 10.1002/14651858.CD011038.pub2.

4. Патент на изобретение RUS 2655522 «Антимикробный гель для лечения инфицированных ран, ожогов и трофических язв».

5. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes, Strasbourg, 18.III.1986.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики и представляет собой ниосомальный антимикробный гель для лечения диабетических язв, ран, ожогов, включающий использование инкапсулированных пептидов, отличающийся тем, что содержит инкапсулированные в кремнийорганические ниосомы дефензины, выделенные из лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови, и низкомолекулярные пептиды, выделенные из амниотической мембраны плаценты животного происхождения, а также гелеобразователь «Salcare SC80» и триэтаноламин. В частном случае указанные язвы, раны или ожоги являются инфицированными антибиотико-резистентными микроорганизмами. Изобретение обеспечивает решение задачи повышения эффективности регенерации и сокращения сроков лечения диабетических язв. 1 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Ниосомальный антимикробный гель для лечения диабетических язв, ран, ожогов, включающий использование инкапсулированных пептидов, отличающийся тем, что содержит инкапсулированные в кремнийорганические ниосомы дефензины, выделенные из лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови, и низкомолекулярные пептиды, выделенные из амниотической мембраны плаценты животного происхождения, а также гелеобразователь «Salcare SC80» и триэтаноламин.

2. Гель по п. 1, где указанные язвы, раны или ожоги являются инфицированными антибиотико-резистентными микроорганизмами.