ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЫШЬЯКА И ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K33/06 A61K33/242 A61K33/26 A61K33/30 A61K33/32 A61K33/34 A61K33/36 A61P25/28 A61P29/00 A61P35/00 A61P35/02 A61P37/06 

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области медицины и основано на неожиданном открытии, что терапевтические эффекты мышьяка могут быть усилены введением ионов двухвалентных металлов и, в частности, ионов Cu²⁺.

Уровень техники

Соединения мышьяка уже более двух тысяч лет широко применяются в качестве традиционной медицины во многих регионах мира для лечения различных заболеваний, таких как псориаз, сифилис или ревматический артрит. За долгую историю существования данных агентов было разработано и применено множество различных препаратов мышьяка. Например, Фаулеров раствор мышьяка, содержащий 1% арсенит калия (KAsO₂), в течение многих лет назначался как средство против лейкемии и даже в качестве тонизирующего лекарственного средства.

Некоторые соединения мышьяка являются особенно токсичными и канцерогенными, с такими побочными эффектами, как цирроз печени, идиопатическая портальная гипертензия, рак мочевого пузыря и рак кожи. Однако в последнее время несколько соединений мышьяка были вновь открыты и разработаны для лечения различных заболеваний, таких как рак.

В частности, триоксид мышьяка (As₂O₃, также упоминаемый как «АТО» в настоящем тексте) является одним из наиболее эффективных новых противоопухолевых («противораковых» или «цитотоксических») агентов. ATO был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения острого промиелоцитарного лейкоза, устойчивого к лекарственным средствам первого ряда, а именно к политрансретиноевой кислоте (ATRA). Было выявлено, что триоксид мышьяка вызывает апоптоз опухолевых клеток.

Триоксид мышьяка также известен или в настоящее время исследуется в качестве средства против других заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания.

Bobé et al. (Blood, 108, 13, стр. 3967-3975, 2006) исследовали эффекты триоксида мышьяка на мышиной модели системной красной волчанки. As₂O₃ значительно продлевал выживаемость MRL/lpr мышей, предотвращая развитие синдрома у молодых мышей и почти полностью обращал диагностированное заболевание у взрослых животных. Авторы предположили, что данное соединение может успешно применяться при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка.

В 8394422 США Chelbi-Alix и Bobé предложили применять триоксид мышьяка для лечения аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний.

Kavian et al. (J Immunol. 2012;188(10):5142-9) описали успешное применение ATO на мышиной модели РТПХ.

Совсем недавно Майер и другие (J Immunol. 2014 Январь 15; 192 (2): 763-70) обнаружили, что соединения мышьяка, включая одобренный FDA противораковый терапевтический триоксид мышьяка, являются мощными ингибиторами каспазы-1 и врожденного иммунного ответа (интерлейкина 1) и, таким образом, их потенциально можно применять для лечения воспалительных компонентов аутоиммунных заболеваний. Кроме того, Li et al. продемонстрировали, что триоксид мышьяка улучшает баланс Treg и T17 у пациентов с ревматоидным артритом, таким образом, являясь потенциально полезным иммуномодулятором (Int. Immunopharmacology, 2019, Arsenic trioxide improves Treg and Th17 balance by modulating STAT3 in treatment-naïve rheumatoid arthritis patients).

Как сообщалось ранее, клеточная дифференциация, вызванная As₂O_3, происходит в результате прямого связывания As₂O₃ с остатками цистеина цинковых пальцев в домене RING-finger и B-Box (RBCC) белка слияния PML-RARα, что приводит к усиленному сумоилированию/убиквитинированию, а затем деградации PML-RARα, способствуя тем самым клеточной дифференциации, приводящей к клинической ремиссии (Zhang et al., Science. 2010;328(5975):240-3; Chen et al., Blood. 2011 Jun 16;117(24):6425-37). Однако, хотя это и объясняет полезное действие мышьяка при данной редкой форме рака, это явно не было общим явлением, которое могло бы объяснить действие As при других раковых заболеваниях, при которых он был (и все еще остается) проверен на эффективность (более 100 клинических испытаний проводятся или были проведены с соединениями мышьяка к 2019 году, как сообщается в clinicaltrials.gov), ни при аутоиммунных заболеваниях, ни при РТПХ.

Чтобы объяснить недавние наблюдения положительного эффекта As на иммунную систему, был предложен новый механизм действия. Действительно, стало очевидно, что одним из основных последствий воздействия As на ряд типов клеток in vitro (клеточные линии или первичные культуры, нормальные или пораженные) и in vivo (животные модели аутоиммунных заболеваний) является индукция специфической гибели клеток, как правило, посредством стимуляции различных, хотя в целом гипотетических, проапоптотических программ, ожидаемо приводящих к изменениям в клеточных субпопуляциях с часто сниженным уровнем цитокинов и модифицированными межклеточными коммуникациями.

Одно из основных предположений состояло в том, что были активированы некоторые пути окислительного стресса за счет продукции АФК (ROS) (иногда интересно наблюдать, что она не ингибируется обычными антиоксидантами (такими как N-ацетил-L-цистеин, NAC)), которая приводит к потреблению GSH и другим процессам, вызывающим клеточный стресс, приводящим к гибели клеток, особенно в патологически иммунных активированных клетках (Bobé et al 2006, выше и Kavian et al., выше, предполагающие гибель плазматических дендритных клеток).

Чтобы лучше понять противоопухолевый механизм мышьяка, Zhang et al. (PNAS 2015; Том 112, № 49) применяли микрочип протеома человека, чтобы идентифицировать связывающие мышьяк белки. Они идентифицировали 360 белков и обнаружили, что белки гликолиза являются высокообогащенными. Они предполагают, что гликолиз в целом и ограничивающий скорость фермент гексокиназа-2 гликолитического пути в частности играют ключевую роль в опосредовании противоопухолевой активности мышьяка.

Более того, сообщалось, что мышьяк нацелен на Pin1, описанный как критический «драйвер» и уникальная лекарственная мишень при раке и других заболеваниях. Kozono et al. предполагают, что ATO и ATRA в клинически безопасных дозах совместно блокируют многочисленные пути, ведущие к раку, посредством прямого обратимого ингибирования Pin 1, таким образом, являясь перспективным подходом для борьбы с раком молочной железы и другими заболеваниями (Nat Commun. 2018 Август 9;9(1):3069).

Однако, подробный механизм(ы) действия As является далеко не полностью изученным.

Распространенные побочные эффекты мышьяка

As₂O₃ является фармакологически активным соединением, обладающим высокотоксичными свойствами при высоких концентрациях или длительном воздействии.

Интересно, что лечение острого промиелоцитарного лейкоза (с разрешения FDA и Европейской службы по надзору в сфере лекарственных средств (EMA)) и СКВ (Фаза 2a; прекращена) или РТПХ (Фаза 2, продолжается) приводит только к обратимым побочным эффектам при внутривенной (IV) дозе, вводимой обычно 0,15 мг/кг/сутки в течение 1-2 (и иногда до 5) месяцев внутривенного лечения.

Побочные эффекты являются потенциально серьезной угрозой для состояния здоровья пациентов, причем наиболее нежелательными являются временное уширение сердечного интервала QT, возможно вместе с изменением уровня электролитов в крови и повышенным высвобождением печеночных ферментов. Данные побочные эффекты тщательно контролируются, и по существу обратимы, но требуют временной приостановки лечения на несколько дней и возникают у значительной части пациентов. Как правило, даже у пациентов, соответствующим всем строгим правилам включения/исключения, примерно у одной трети из них проявляются побочные эффекты.

Таким образом, остается необходимость в уменьшении количества мышьяка, вводимого пациентам, получающим лечение триоксидом мышьяка или другими веществами, содержащими мышьяк, для уменьшения побочных эффектов активного фармацевтического ингредиента (АФИ; триоксид мышьяка или любое другое соединение мышьяка) при сохранении того же уровня благоприятной биологической активности.

Однако с одной стороны, положительные эффекты мышьяка зависят от дозы, и обычно принимаемые дозы уже рассчитаны таким образом, чтобы уменьшить связанные с ними побочные эффекты. С другой стороны, как объяснялось выше, механизм действия мышьяка определен лишь частично, и на данный момент лишь несколько наблюдаемых биохимических и физиологических эффектов имеют большое значение для оценки ожидаемой эффективности лечения. Наиболее важным в области онкологии и иммунных патологий является способность мышьяка активировать процессы клеточного стресса, приводящие к высвобождению цитокинов и специфической гибели клеток, а также позитивному вмешательству в иммунные механизмы, относящиеся к определенным заболеваниям.

Таким образом, в настоящее время существует необходимость в поиске лекарственных средств, которые бы усиливали положительные эффекты мышьяка, применяемого в качестве лекарственного средства, без проявления токсического воздействия мышьяка. Это позволило бы соответствующим образом уменьшить количество мышьяковой соли (солей), доставляемое для соответствующего лечения или повысить эффективность лечения без увеличения количества указанной вводимой мышьяковой соли (солей).

Продукция АФК и соответствующие регулирующие антиоксиданты

В этой связи изобретатели исследовали возможности усиления эффекта определенной дозы АФИ за счет параллельного применения лекарственных средств или молекул, способных усиливать клеточный стресс.

Клеточный стресс в основном достигается увеличением количества активных форм кислорода (АФК). Основной окислительный путь клеточного стресса является хорошо известным с его каскадом стадий, включая:

Получение супероксидного радикала: O₂+1 e^-→O₂^·-

Получение пероксида водорода: O₂^·-+O₂^·-+2H⁺→H₂O₂+O₂

Получение гидроксильного радикала: H₂O₂+Fe²⁺→^·OH+Fe³⁺+OH^-

Количество пероксида водорода регулируется пероксидазами гема, которые ускоряют его диспропорционирование, и глутатионпероксидазой (GPx), которая катализирует его восстановление глутатионом (GSH).

Существуют другие АФК, такие как пероксидные радикалы RO₂, гидропероксиды RO₂H и алкоксильные радикалы RO^·.

Реакция Фентона, разрушающая H₂O₂ (реакция (iii) выше) обычно катализируется свободными двухвалентными ионами железа и приводит к образованию^·OH. Реакция Фентона, как принято считать, локализована в эндоплазматическом ретикулуме или в околоядерных сайтах, но не в митохондриях или других клеточных компартментах (Liu Q, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:4302-7). Источниками H₂O₂ могут быть митохондрия (реакция супероксиддисмутазы), пероксисомы (ацил-CoA оксидахная реакция) и бета-амилоид сенильных бляшек (реакции, подобные супероксиддисмутазе). H₂O₂, который ускользает от клеточного антиоксидантного механизма, такого как глутатионпероксидаза и каталаза, может быть неферментативно превращен в перинуклеарной локализованной реакции Фентона и действовать как агент, повреждающий РНК или ДНК.

СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретатели исследовали возможность усиления эффекта соответствующей дозы соединения мышьяка с помощью параллельного применения лекарственных средств или молекул, способных усилить клеточный стресс за счет активации реакции Фентона. С этой целью они протестировали несколько элементов, которые, как известно, усиливают данную реакцию, начиная с хорошо известных солей железа, а также других, таких как Zn, Mn, Mg, Cu, Au и т.д.

Как описано в приведенной ниже экспериментальной части, они обнаружили, что совершенно неожиданным и необъяснимым образом с помощью только активации реакции Фентона, ионы Cu²⁺ особенно проявляют сильные синергические эффекты с мышьяком, включая все искомые свойства, т.е. продукцию клеток H₂O₂, увеличение индукции апоптоза и физиологические эффекты в основном и весьма значимом тесте на функционирование иммунной системы, реакции смешанных лимфоцитов, разработанной с клетками мыши различного генетического происхождения.

Таким образом, настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему соединение мышьяка и ион металла, выбранный из группы, состоящей из Cu²⁺, без исключения более классических агентов Фентона, таких как Au²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺ и их смесей.

Изобретение также относится к применению комбинации соли Cu²⁺ и соединения мышьяка при лечении различных заболеваний, включая опухолевые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания и нейродегенеративные заболевания, при этом соединение мышьяка и соли Cu²⁺ вводят пациенту одновременно или последовательно. При таком комплексном лечении ионы Cu²⁺ усиливают терапевтическое действие мышьяка.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Влияние As₂O₃ при возрастающих концентрациях на продукцию H₂O₂, продукцию GSH и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 2: Влияние FeSO₄ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 3: Влияние HAuCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 4: Влияние ZnSO₄ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 5: Влияние ZnCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 6: Влияние MnSO₄ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 7: Влияние MnCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 8: Влияние CuSO₄ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 9: Влияние CuCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 10: Влияние As₂O₃ (1 мкм) в сочетании с CuCl₂ (1 или 4 мкм) на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 11: Влияние As₂O₃ (1 мкм) в сочетании с возрастающими концентрациями CuCl₂ (0.5-4 мкм) на продукцию GSH и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 12: Влияние As₂O₃ на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов. Ось ординат: DO UptiBlue, который измеряет клеточную метаболическую активность (и рассматривается как прямой показатель роста).

Фигура 13: Влияние FeSO₄ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов.

Фигура 14: Влияние HAuCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов.

Фигура 15: Влияние ZnSO₄ и ZnCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов.

Фигура 16: Влияние MnSO₄ и MnCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов.

Фигура 17: Влияние CuSO₄ и CuCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов.

Фигура 18: Влияние CuCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с As₂O₃ при 1 мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток A20.

Фигура 19: Влияние As₂O₃ (1 мкм) в сочетании с возрастающими концентрациями CuCl₂ (0.5-4 мкм) на продукцию GSH и жизнеспособность клеток A20.

Фигура 20: Влияние AsI₃ при возрастающих концентрациях на продукцию H₂O₂, GSH и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 21: Влияние CuCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с AsI₃ при 1мкм на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Фигура 22: Влияние As₂O₃ и AsI₃ на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов.

Фигура 23: Влияние CuCl₂ при возрастающих концентрациях, отдельно или в комбинации с AsI₃ при 1 мкм на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов.

Фигура 24: Влияние лечения на возникновение кожных аномалий (алопеции) при хронической РТПХ. На рисунках отображено развитие алопеции в разных экспериментальных группах. A: Сингенный (8 мышей). B: Аллогенный (9 мышей - 7 с алопецией). C: Аллогенный+As₂O₃ 2,5 мкг/г (9 мышей - 3 с алопецией). D: Аллогенный+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 2,5 мкг/г (3 мыши - ни одна с алопецией). E: Аллогенный+CuCl₂ в реакции смешанных лимфоцитов мкг/г (2 мыши - 1 с алопецией). F: Аллогенный+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 10 мкг/г (2 мыши - ни одна с алопецией). G: Аллогенный+CuCl₂ 10 мкг/г (5 мышей - ни одна с алопецией). H: Аллогенный+As₂O₃ 5 мкг/г (5 мышей - 1 с алопецией).

Фигура 25: Влияние лечения на вес мышей во время развития РТПХ. A. Сингенные и аллогенные группы, обработанные или не обработанные As₂O₃ (2,5 мкг/г или 5 мкг/г, как указано). B. Сингенная группа и аллогенные группы, обработанные или не обработанные с As₂O₃ (2,5 мкг/г и CuCl₂ 2,5 мкг/г). C. Сингенная группа и аллогенные группы, обработанные или не обработанные (As₂O₃ 2,5 мкг/г и CuCl₂ 10 мкг/г).

Фигура 26: Влияние лечения на васкулит (клиническая оценка: толщина ушей) во время развития РТПХ. A. Толщина ушей мышей в сингенной и аллогенной группах, обработанных или не обработанных As₂O₃ при 2,5 мкг/г или 5 мкг/г. B. Толщина ушей мышей в сингенной и аллогенной группах, обработанных или не обработанных As₂O₃ при 2,5 мкг/г и CuCl₂ при 2,5 мкг/г. C. Толщина ушей мышей в сингенной и аллогенной группах, обработанных или не обработанных As₂O₃ при 2,5 мкг/г и CuCl₂ при 10 мкг/г.

Фигура 27: Влияние лечения на печень: концентрации трансаминаз в крови каждой мыши. A. ALAT в плазме мышей сингенной и алогенной групп в зависимости от лечения. B. ASAT в плазме мышей сингенной и алогенной групп в зависимости от лечения.

Фигура 28: Влияние лечения на вес мышей во время развития РТПХ. Мыши, обработанные медью при 0/0,2 мкг/г и 0,5 мкг/г.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Применяемые в настоящем тексте термины «лечить» и «лечение» означают любое уменьшение одного или нескольких симптомов заболевания, например, уменьшение частоты и/или тяжести симптомов при аутоиммунном заболевании и/или увеличение выживаемости, которое является результатом введения композиции в соответствии с изобретением пациентам с раковым заболеванием. Данные термины применяют, как правило, для обозначения получения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения от заболевания и/или негативного последствия, связанного с заболеванием. Термин «лечение», применяемый в настоящем тексте, применяется к любому лечению заболевания у млекопитающего и включает: предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но еще клинически не имеющий его; ингибирование заболевания, т.е. приостановление его развития; или облегчение заболевания, т.е. регресс заболевания. Терапевтическое средство может быть введено до, во время или после начала заболевания или травмы. Особый интерес представляет лечение продолжающегося заболевания, когда лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы пациента.

Применяемая в настоящем тексте фраза «уменьшение выраженности по меньшей мере одного симптома» относится к уменьшению одного или нескольких симптомов заболевания или состояния, от которого субъект проходит лечение. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние, подлежащее лечению, представляет собой гематологическое злокачественное новообразование, в котором один или несколько симптомов устраняется, в частности: слабость, усталость, одышка, легкие синяки и кровотечения, частые инфекции, увеличенные лимфатических узлов, вздутый или болезненный живот (из-за увеличенных органов брюшной полости), боль в костях или суставах, переломы, незапланированная потеря веса, плохой аппетит, ночная потливость, постоянная умеренная лихорадка и снижение мочеиспускания (из-за нарушения функции почек).

Применяемый в настоящем тексте термин «предотвращать» и похожие слова такие как «предупреждать», «препятствовать» и т.д. обозначают подход к предотвращению, подавлению или уменьшению вероятности возникновения или рецидива заболевания или состояния. Термин также означает отсрочку начала заболевания или состояния или рецидива, или отсрочку возникновения или рецидива симптомов. Термин «предупреждение» и аналогичные слова также означают уменьшение интенсивности, эффекта, симптомов и/или бремени заболевания или состояния до начала заболевания или состояния или рецидива.

Применяемый в настоящем изобретении термин «количество» относится к «эффективному количеству» или «количеству, эффективному» мышьяка+иона металла, достаточному для достижения полезного или желаемого профилактического или терапевтического результата, включая клинические результаты. В одном варианте осуществления, эффективное количество относится к количеству соединения, содержащего мышьяк и ион металла, достаточному для предотвращения, улучшения одного симптома или лечения заболевания, например, гематологической злокачественной опухоли или аутоиммунного заболевания, рассматриваемого в настоящем тексте.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству соединения, содержащего мышьяк+ион металла, эффективного для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу применяют на субъектах до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество является меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

«Терапевтически эффективное количество» соединения, содержащего мышьяк+ион металла, может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума, а также свойств агента (соединения мышьяка) и сопутствующего агента (иона металла), чтобы вызвать желаемую реакцию у индивидуума. «Терапевтически эффективное количество» также представляет собой количество, в котором терапевтически полезные эффекты превосходят любые токсичные или вредные эффекты агента. Термин «терапевтически эффективное количество» включает количество, которое эффективно для «лечения» субъекта (пациента).

Термины «включать» или «содержать» предназначены для обозначения того, что композиции и способы включают перечисленные элементы, но не исключают других. «Состоять в основном из» применяют для определения композиций и способов, исключающих другие элементы, имеющие какое-либо существенное значение для комбинации. Например, композиция, состоящая по существу из элементов, определенных здесь, не исключает другие элементы, которые существенно не влияют на основную и новую характеристику (характеристики) заявленного изобретения. «Состоит из» означает исключение более чем следовых количеств других ингредиентов и существенных описанных этапов способа. Варианты осуществления, определенные каждым из переходных терминов, находятся в рамках настоящего изобретения.

Термин «приблизительно», применяемый перед числовым значением, указывает, что значение может варьироваться в разумных пределах, таких как ±10%, ±5% и ±1%. Выражение «приблизительно x» включает значение «x».

Формы единственного числа включают формы множественного числа, если в контексте не указано другое. Таким образом, «ион металла» будет означать «ионы металла».

При необходимости другие определения будут указаны ниже.

В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к лекарственному средству, которое содержит соединение мышьяка и ион металла, выбранный из Cu²⁺, Au²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺ и их смесей.

Примеры соединений мышьяка (как правило, солей), которые можно применять в качестве активных ингредиентов в композиции согласно изобретению, включают As₂O₃, AsI₃, As₂O₅, As₄O₆, As₂S₂, As₂S₃, As₂S₅, As₄S₄ и их смесей.

Лекарственные средства согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат триоксид мышьяка или трийодид мышьяка вместе с ионом металла, перечисленным выше, таким как Cu²⁺, отдельно или в сочетании с любым другим ионом металла, выбранным среди Au²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺ Mn²⁺ и Mg²⁺.

В определенных вариантах осуществления, показанных в приведенных ниже примерах, ионы Cu²⁺ находятся в форме соли, такой как сульфат меди (CuSO₄) или хлорид меди (II) (CuCl₂).

Фактическая дозировка для АТО при лечении гематологических раковых заболеваний составляет 0,15 мг/кг/сутки. Результаты, представленные в экспериментальной части, демонстрируют, что при применении ATO в сочетании c Cu²⁺, его эффекты усиливаются. Следовательно, та же терапевтическая эффективность должна быть получена при более низкой дозе ATO в присутствии Cu²⁺, как и у применяемого в настоящее время препарата АТО. В зависимости от ситуации врач также может сочетать с ионами Cu²⁺ ту же концентрацию АТО, которая в настоящее время одобрена в комбинации для усиления терапевтического эффекта АТО.

В определенных вариантах осуществления, композиция в соответствии с настоящим изобретением составлена таким образом, что одна суточная доза содержит от 0,01 до 0,15 мг/кг/сутки триоксида мышьяка (что соответствует 0,1-1,6 мкмоль/кг атомов мышьяка).

В определенных вариантах осуществления, композиция в соответствии с настоящим изобретением составлена таким образом, что одна суточная доза содержит от 0,01 до 0,05 мг/кг/день триоксида мышьяка.

В определенных вариантах осуществления, композиция в соответствии с настоящим изобретением составлена таким образом, что одна суточная доза содержит от 0,05 до 0,10 мг/кг/сут триоксида мышьяка.

В определенных вариантах осуществления, композиция в соответствии с настоящим изобретением составлена таким образом, что одна суточная доза содержит от 0,10 до 0,15 мг/кг/день триоксида мышьяка.

Когда в рамках настоящего изобретения применяют соединение мышьяка, отличное от триоксида мышьяка, его дозировка может быть выбрана таким образом, чтобы количество атомов мышьяка, вводимых пациенту, было таким же, как и в дозировках, указанных выше для триоксида мышьяка.

В определенных вариантах осуществления, композиция в соответствии с настоящим изобретением составлена таким образом, что одна суточная доза содержит от 0,05 мкмоль/кг до 10 мкмоль/кг Cu²⁺, предпочтительно от 0,06 мкмоль/кг до 2 мкмоль/кг Cu²⁺, например от 0,3 мкмоль/кг до 1,1 мкмоль/кг Cu²⁺.

В определенных вариантах осуществления, композиция в соответствии с настоящим изобретением составлена таким образом, что одна суточная доза содержит около 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1.9, 2, 2.2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мкмоль/кг Cu²⁺.

Конечно, квалифицированный специалист может выбрать любую другую схему введения меди, например, один раз в два дня, один раз в три дня или даже один раз в неделю, чтобы достичь дозы, эквивалентной суточной дозе, описанной выше.

Любое заболевание, которое уже успешно лечилось АТО или любым другим соединением мышьяка, может выиграть от лечения вышеописанной композицией, т.к. комбинация мышьяка и ионов металла, таких как Cu²⁺ усиливает благотворное воздействие мышьяка. Кроме того, заболевания, имеющие общие патофизиологические механизмы с заболеваниями и нарушениями, при которых уже успешно применялось лечение мышьяком, можно лечить с помощью синергической комбинации мышьяка и иона металла, такого как Cu²⁺, до настоящего момента не получившей соответствующей реализации, т.к. потребовались бы более высокие дозы активного вещества, при которых трудно обеспечить необходимую безопасность.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению композиции, описанной выше, для лечения заболевания среди:

- опухолевых заболеваний,

- аутоимунных заболеваний и

- воспалительных заболеваний.

Настоящее изобретение также относится к применению комбинации соли Cu²⁺ (например, Cu₂SO₄ или CuCl₂) и соединения мышьяка (как описано выше) при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из опухолевого заболевания, аутоиммунного заболевания и воспалительного заболевания, в котором указанное соединение мышьяка и указанная соль Cu²⁺ вводятся пациенту одновременно или последовательно.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению композиции, содержащей соединение мышьяка, для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из опухолевого заболевания, аутоиммунного заболевания и воспалительного заболевания, в которой указанное соединение мышьяка вводят пациенту в сочетании с солью Cu²⁺ или любыми другими ионами металлов с аналогичными свойствами. В определенных вариантах осуществления, композицию, содержащую соединение мышьяка, вводят перед композицией, содержащей соль Cu²⁺. В определенных вариантах осуществления, композицию, содержащую соединение мышьяка, вводят после композиции, содержащей соль Cu²⁺ В обоих случаях соединение мышьяка, и соли Cu²⁺ вводят с временным интервалом, предпочтительно не превышающим 12 часов. В определенных вариантах осуществления, композицию, содержащую соединение мышьяка, и композицию, содержащую соль Cu²⁺, вводят одновременно. Независимо от последовательности введения, соединение мышьяка и соли Cu²⁺ вводятся либо одним и тем же способом, либо разными способами.

В соответствии с другими аспектами, настоящее изобретение относится к применению соли иона металла, например, соли Cu²⁺, для стимулирования/усиления терапевтических эффектов соединения мышьяка, как описано выше. Ионы Cu²⁺ или подобные можно, например, применять для усиления терапевтических эффектов АТО или любого другого соединения мышьяка, применяемого при лечении заболевания, такого как опухолевое заболевание, аутоиммунное заболевание или, в целом, воспалительное заболевание. Под «стимулированием» в настоящем изобретении подразумевается, что при применении того же количества соединения мышьяка (АТО) терапевтические эффекты мышьяка значительно усиливаются, когда пациент также получает ионы Cu²⁺, хотя введение одних ионов Cu²⁺ не дает какого-либо заметного эффекта. Стимулирование или совместное действие были продемонстрированы, по крайней мере, in vitro в примерах 1-9 ниже (что показывает значительное увеличение продукции клеток H₂O₂ и индукции апоптоза, а также физиологические эффекты в реакции смешанных лимфоцитов, что является очень важным анализом для функции иммунной системы). Результаты, показанные в примере 10, иллюстрируют это совместное действие in vivo на животной модели.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из опухолевого заболевания, аутоиммунного заболевания или, в целом, воспалительного заболевания у пациента, нуждающегося в этом, включающему стадию введения пациенту эффективной дозы соединения мышьяка (как определено выше) и иона металла, выбранного из Cu²⁺, Au²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺ и их смесей. В соответствии с определенным вариантом осуществления пациенту вводят соль Cu²⁺.

В зависимости от контекста (свойств соединения мышьяка, соответствующего заболевания, стадии данного заболевания и общих параметров пациента) врач подбирает дозировку и схему введения соединения мышьяка и соли Cu²⁺ и подобные.

В определенных вариантах осуществления, соединение мышьяка представляет собой триоксид мышьяка. В данном случае терапевтически эффективное количество АТО составляет не более 0,30 мг/кг/день, например, 0,30, 0,25, 0,20 или 0,15 мг/кг/день АТО, а профилактически эффективное количество АТО составляет не более 0,15 мг/кг/день, например, 0,15, 0,10 или 0,05 мг/кг/день, или даже меньше, вплоть до 0,01 мг/кг/день.

В определенных вариантах осуществления, пациенту вводят ежедневную дозу, которая составляет от 0,01 до 0,15 мг/кг/день триоксида мышьяка, в течение от 1 до 80 дней.

В определенных вариантах осуществления, пациенту вводят ежедневную дозу, которая составляет от 0,01 до 0,05 мг/кг/день триоксида мышьяка, в течение от 1 до 80 дней, с возможностью повторного лечения, если это необходимо для достижения удовлетворительного уровня клинической эффективности.

В определенных вариантах осуществления, пациенту вводят ежедневную дозу, которая составляет от 0,05 до 0,10 мг/кг/день триоксида мышьяка, в течение от 1 до 80 дней.

В определенных вариантах осуществления, пациенту вводят ежедневную дозу, которая составляет от 0,10 до 0,15 мг/кг/день триоксида мышьяка, в течение от 1 до 80 дней.

В определенных вариантах осуществления, пациенту вводят суточную дозу, которая составляет от 0,05 мкмоль/кг до 10 мкмоль/кг Cu2+, предпочтительно от 0,06 мкмоль/кг до 2 мкмоль/кг Cu²⁺, например от 0,3 мкмоль/кг до 1,1 мкмоль/кг Cu²⁺, до тех пор, пока он/она получает соединение мышьяка. В определенных вариантах осуществления, пациент получает около 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мкмоль/кг Cu²⁺, каждый день, пока он/она получает соединение мышьяка.

Ионы Cu²⁺ могут быть, например, в форме сульфата меди или хлорида меди (II).

Как уже упоминалось, соединение мышьяка и соль Cu²⁺ вводят пациенту одновременно или последовательно, одинаковыми или разными способами введения. Соль Cu²⁺ можно вводить пациенту каждый день, через день, два или три раза в неделю или даже еженедельно.

В определенных вариантах осуществления, соединение мышьяка вводят внутривенно.

В определенных вариантах осуществления, соединение мышьяка вводят перорально.

В определенных вариантах осуществления, соединение мышьяка вводят местно.

В определенных вариантах осуществления, соединение мышьяка вводят в виде аэрозоля.

В определенных вариантах осуществления, соединение мышьяка и соль Cu²⁺ находятся в одной фармацевтической композиции. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу введения фармацевтической композиции, содержащей соединение мышьяка и соль Cu²⁺, включающему стадии предоставления указанной фармацевтической композиции и введения указанной фармацевтической композиции субъекту. Данное изобретение также относится к способу лечения аутоиммунного заболевания и, в целом воспалительного заболевания или опухолевого заболевания, такого как рак или опухоль, у пациента, нуждающегося в этом, включающему стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение мышьяка и соль Cu²⁺.

Опухолевые заболевания

Термин «опухолевое заболевание» применяют для обозначения патологической клеточной пролиферации в тканях субъекта по сравнению с нормальной пролиферацией в том же типе ткани. Новообразования включают доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли (например, лейкемия, опухоли толстой кишки или рак предстательной железы), которые являются либо инвазивными, либо неинвазивными. Злокачественные новообразования отличаются от доброкачественных новообразований тем, что первые проявляют большую степень анаплазии или потери дифференцировки и ориентации клеток, и обладают свойствами инвазии и метастазирования.

Раковые заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают солидные и несолидные раковые заболевания. В определенных вариантах осуществления, рак представляет собой гематологическую злокачественную опухоль. Примеры гематологических злокачественных новообразований, которые можно лечить в соответствии с изобретением, включают острый миелоидный лейкоз; острый нелимфоцитарный лейкоз; миелобластный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз; хронический миеломоноцитарный лейкоз; моноцитарный лейкоз; эритролейкоз; острый нейтрофильный лейкоз; миелодиспластический синдром; острый промиелоцитарный лейкоз; хронический лимфоцитарный лейкоз; хронический миелоидный лейкоз; волосатоклеточный лейкоз; миелопролиферативные новообразования; лимфома Ходжкина; неходжкинская лимфома; миелома; гигантоклеточная миелома; вялотекущая миелома; локализованная миелома; множественная миелома; плазмоклеточная миелома; склерозирующая миелома; одиночная миелома; тлеющая множественная миелома; несекреторная миелома; остеосклеротическая миелома; плазмоклеточный лейкоз; одиночная плазмацитома; и экстрамедуллярная плазмацитома.

В определенных вариантах осуществления, указанной гематологической злокачественной опухолью является острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ). В определенных вариантах осуществления, ОПЛ является недавно диагностированным. В определенных вариантах осуществления ОПЛ представляет собой рецидивирующий или рефрактерный ОПЛ.

Другие виды рака, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают, не ограничиваясь, карциному (например, плоскоклеточный рак, аденокарциномы, гепатоцеллюлярный рак и почечно-клеточный рак), в частности, рак мочевого пузыря, кишечника, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, пищевода, головы, почек, печени, легких, шеи, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка; доброкачественные и злокачественные меланомы; миелопролиферативные заболевания; саркомы, в частности саркома Юинга, гемангиосаркома, саркома Капоши, липосаркома, миосаркомы, периферическая нейроэпителиома и синовиальная саркома; опухоли центральной нервной системы (например, глиомы, астроцитомы, олигодендроглиомы, эпендимомы, глиобастомы, нейробластомы, ганглионевромы, ганглиоглиомы, медуллобластомы, опухоли шишковидной железы, менингиомы, саркомы менингея, нейрофибромы и шванномы); опухоли зародышевой линии (например, рак кишечника, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак матки, рак легких, рак яичников, рак яичек, рак щитовидной железы, астроцитома, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак печени, рак толстой кишки и меланома); смешанные типы неоплазий, в частности карциносаркома и болезнь Ходжкина; и опухоли смешанного происхождения, такие как опухоль Вильмса и тератокарциномы.

Аутоиммунные и воспалительные заболевания

Аутоиммунные заболевания представляют собой заболевания иммунной системы, характеризующиеся выработкой антител (так называемых аутоантителами), которые взаимодействуют с антигенами (так называемыми аутоантигенами), происходящими из тканей пациента, или заболевания, которые характеризуются активацией иммунных клеток (например, цитотоксических клеток) с выработкой антител или без нее.

Воспалительные заболевания включают широкий спектр расстройств и состояний, которые характеризуются воспалительными процессами, как вторичными, так и первичными или даже уникальными (преобладающими над другими иммунными механизмами).

Аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания, которые можно лечить комбинацией соединения мышьяка и иона металла, такого как Cu²⁺ согласно изобретению, включают, но не ограничиваясь, системную красную волчанку (СКВ); острую рассеянную красную волчанку; болезнь Беше; ювенильный артрит; синдром Фиссингера-Лероя-Рейтера; подагру; остеоартроз; полимиозит; миокардит; аутоиммунный ревматоидный артрит; системный васкулит; инсулинозависимый сахарный диабет; диабет I типа, воспалительное заболевание кишечника; целиакию, аутоиммунное заболевание щитовидной железы; Синдром Шегрена, аутоиммунный гастрит, язвенный колит; болезнь Крона; аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз; первичный склерозирующий холангит; кожные аутоиммунные заболевания; аутоиммунную дилатационную кардиомиопатию, рассеянный склероз (и другие демиелинизирующие заболевания; миастению гравис; васкулит (например, артериит Такаясу и гранулематоз Вегенера); апластическую анемию, любое заболевание, связанное с нетуморальным лимфопролиферация; В-лимфоцитарную лимфому; синдром Симмондса; подострый тиреоидит и болезнь Хашимото; болезнь Аддисона; аутоиммунные заболевания мышц, аутоиммунные нервно-мышечные расстройства, такие как анкилозирующий спондилит, рассеянный склероз и его различные формы, включая детские синдромы и острый диссеминированный энцефалит; иммуноопосредованные невропатии; аутоиммунные заболевания яичек, аутоиммунное заболевание яичников, аутоиммунный увеит, болезнь Грейвса, псориаз, анкилозирующий спондилит, болезнь Аддисона, тиреоидит Хашимото, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпура, аутоиммунное заболевание легких, такое как болезнь Вегенера и синдром Черга-Стросса; иммунологические заболевания легких, такие как астма, инфильтративное заболевание легких, гиперчувствительное заболевание легких и саркоидоз; дерматомиозит, включая склеродермию и полимиозит; и витилиго.

Продукты настоящего изобретения также можно применять для лечения болезни "трансплантат против хозяина" (РТПХ) как в качестве профилактического, так и радикального лечения.

Множественный склероз

О благотворном воздействии соединений мышьяка, особенно триоксида мышьяка, уже говорилось при рассеянном склерозе (США 2018/325944). Таким образом, рассеянный склероз и связанные с ним синдромы можно лечить в соответствии с изобретением с помощью комбинации мышьяка и иона металла, такого как Cu²⁺.

Конкретными заболеваниями, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, являются заболевания человека или их животные аналоги, которые уже успешно лечатся с помощью АТО, такие как острый промиелоцитарный лейкоз, системная красная волчанка (СКВ), хроническая болезнь "трансплантат против хозяина" (РТПХ), рассеянный склероз (РС), синдром Шегрена, ревматоидный артрит, болезнь Крона, миелоцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, хронический лимфолейкоз, злокачественная глиома, миелодиспластический синдром, множественный миелома и рак печени. Как объяснялось выше, настоящее изобретение обеспечивает усиление действия мышьяка при лечении данных заболеваний, что позволяет применять более низкие суточные дозы АТО или получать лучшие терапевтические результаты с той же дозировкой, которая применяется в настоящее время.

Другие характеристики изобретения также станут очевидными в ходе последующего описания биологических анализов, которые были проведены в рамках изобретения и которые обеспечивают ему необходимую экспериментальную поддержку, не ограничивая сферу его применения.

ПРИМЕРЫ

При отсутствии каких-либо указаний на обратное, экспериментальные результаты, показанные в примерах 1-9, получали с применением следующих материалов и способов.

Клетки, животные и химические вещества

Культура клеток HL60: линия клеток HL-60 представляет собой клеточную линию промиелоцитарного лейкоза европейца (ATCC n°CCL-240). Эту линию поддерживали на протяжении всего эксперимента, сохраняя 2×10⁵ клеток на мл в колбе (Falcon 250 мл 75 см², ссылка: 353135) в RPMI 1640+GlutaMax культуральная среда Sigma-Aldrich (Сен-Кантен Фаллавье, Франция) содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Гибко, США), 1% пенициллин-стрептомицина (Гибко, США), 1% ципрофлоксацина и 1% фунгизона (Гибко, США).

Культура клеток A20 : линия клеток A20 представляет собой линию клеток мыши (ATCC n°TIB-208). Эту линию поддерживали на протяжении всего эксперимента, сохраняя 2×10⁵ клеток на мл в колбе (Falcon 250 мл 75 см², ссылка: 353135) в RPMI 1640+GlutaMax культуральная среда Sigma-Aldrich (Сен-Кантен Фаллавье, Франция) содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Гибко, США), 1% пенициллин-стрептомицина (Гибко, США), 1% ципрофлоксацина, 1% фунгизона (Гибко, США) и 1% 2-меркаптоэтанола (Гибко, США).

Животные : восьминедельные самки мышей линии BALB/c и самки мышей линии C57Bl6 приобретали в питомнике Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, Франция) и обеспечены едой и водой в неограниченном количестве. Их содержание соответствовало всем необходимым требованиям. Клетки селезенки мышей каждого типа применяли на смешанной культуре лимфоцитов(модель СКЛ).

Химические вещества:

- Первые пять протестированных двухвалентных катионов приобретали у компании Sigma-Aldrich (Сен-Кантен Фаллавье, Франция): CuSO₄, FeSO₄, MnSO₄, ZnSO₄ а также HAuCl₂ (лабораторной степени чистоты).

- Три других проверенных двухвалентных катиона приобретали у ChemCon (Фрайбург, Германия): CuCl₂, MnCl₂ и ZnCl₂ (GMP степень чистоты).

- Триоксид мышьяка (Arscimed, качественная клиническая партия, исходный раствор 1 мг/мл) поставляется компанией MEDSENIC (Страсбург, Франция).

Статистический анализ

Все количественные данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism 5 с применением одностороннего ANOVA и post-hoc (Tukey). P-значение <0,05 считается статистически значимым.

Эффекты As₂O₃ с двухвалентными катионами или без них на продукцию H₂O₂ и продукция GSH в культивируемых клетках HL-60

Условия культивирования и обработки

Клетки (5×10⁵ на лунку) высевали в 96-луночные круглые планшеты с круглым дном (Falcon, Corning, ссылка: 353077) и инкубировали в течение 48 часов в различных экспериментальных условиях в инкубаторе при 37°C 5% CO2. Параллельно подготавливали два планшета для измерения продукции H₂0₂ и жизнеспособности клеток HL-60 соответственно.

Измерение продукции H₂0₂

Через 48 часов надосадочную жидкость удаляли, и 50 мкл на лунку 50 мкг/мл монохлорбимана (Sigma-Aldrich Saint-Quentin Fallavier, Франция) в солевом растворе PBS добавляли на клетки в тех же условиях обработки (среда, или As₂O₃ с катионом или без него).

Продукцию H₂O₂ оценивали способом спектрофлуориметрии с применением фузионного спектрофлуориметра Packard. Интенсивность флуоресценции регистрировали немедленно (T0 часов) и после 6 часов инкубации (T6 часов). Максимумы возбуждения/испускания флуоресценции составляли для диацетата 2’,7’-дихлордигидрофлуоресцеина 485/530 нм.

Измерение продукции GSH

Продукцию GSH оценивали способом спектрофлуориметрии с применением фузионного спектрофлуориметра Packard. Интенсивность флуоресценции регистрировали немедленно (T0 часов) и после 6 часов инкубации (T6 часов). Максимумы возбуждения/испускания флуоресценции составляли для монохлорбимана 380/461 нм.

Жизнеспособность клеток HL-60

Среду удаляли и клетки окрашивали 0,5% красителем кристаллический фиолетовый и 30% этанолом в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. После двух промывок PBS, окрашенные клетки суспендировали в метаноле, и поглощение измеряли при 550 нм с помощью фузионного спектрофлуориметра Packard(как в Ngô et al., Reactive Oxygen Species Controls Endometriosis Progression; The American journal of pathology; 2009, 175(1):225-34).

Расчет H₂O₂ или GSH, полученных в течение 6 часов:

Продукцию H₂O₂ или GSH рассчитывали в каждом состоянии обработки следующим образом:

Интенсивность флуоресценции [произвольные единицы] при T6 часов-интенсивность флуоресценции [произвольные единицы] при T0 часов

DO, синтезированный жизнеспособными клетками с цельной мембраной

Условия обработки и связанные с этим эксперименты (2 теста)

- Продукция H₂O₂ или GSH и жизнеспособность клеток: диапазон As₂0₃: 0,5 ; 1 ; 5 и 10 мкм

- Продукция H₂O₂: сравнение 5 двухвалентных катионов в 4 концентрациях с или без AS₂O₃ (1 мкм):

Sigma :

CuSO₄: 0,5 ; 1 ; 2-4 мкм

FeSO₄: 0,5 ; 1 ; 2-4 мкм

ZnSO₄: 6 ; 12,5 ; 25-50 мкм

HAuCl₂: 0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм

MnSO₄: 0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм

Chemcon :

CuCl₂: 0,5 ; 1 ; 2-4 мкм

ZnCl₂ : 6 ; 12,5 ; 25-50 мкм

MnCl₂ : 125; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм

Дополнительные результаты

- Продукция H₂O₂ или GSH и жизнеспособность клеток: диапазон концентраций As₂0₃ при 0,5 ; 1 ; 5 и 10 мкм с CuCl₂ при 1 и 4 мкм (1 тест)

- Продукция GSH и жизнеспособность клеток: As₂0₃ (1 мкм) с CuCl₂ при 0,5, 1, 2-4 мкм (2 теста)

Эффекты As₂O₃ с двухвалентными катионами или без них на продукцию H₂O₂ и продукцию GSH в культивируемых клетках A20

Условия культивирования и лечения

Клетки (1×10⁵ на лунку) высевали в 96-луночные планшеты с круглым дном (Falcon, Corning, ссылка: 353077) и инкубировали в течение 48 часов в различных экспериментальных условиях в инкубаторе при 37°C 5% CO2. Параллельно получали два планшета для измерения продукции H₂0₂ и жизнеспособности клеток A20.

Продукция H₂0₂, GSH и жизнеспособность клеток определяли с применением тех же протоколов, что и вышеописанные для клеток H60.

Условия лечения и связанные с этим эксперименты: 1 тест H₂O₂-1 тест GSH

- Продукция H₂O₂ или GSH и жизнеспособность клеток: As₂0₃ (1 мкм) с CuCl₂ при 0,5 ; 1 ; 2 и 4 мкм.

Эффект As₂O₃ с двухвалентными катионами или без них на пролиферацию CD4-T-клеток C57Bl6 in vitro (пролиферация клеток в культурах смешанных лимфоцитов).

Модель основана на культуре смешанных лимфоцитов, полученных из суспензий клеток селезенки самки мыши C57Bl6 и самки мыши BALB/c, облученной 30 Гр. Клетки селезенки механически отделяли, эритроциты удаляли гипотоническим лизисом (ACK - NH₄Cl 0,15M+KHCO₃ 1мМ+Na₂EDTA 0,1мМ).

Для количественного измерения пролиферации клеток in vitro применяли краситель UptiBlue. Клетки C57Bl6 (отвечающие клетки) отбирали с облученными клетками BALB/c (стимулирующие клетки) при 6×10⁵ на лунку на линию в 96-луночных круглодонных планшетах (Falcon, Corning, ссылка: 353077). Культуру смешанных клеток инкубировали в течение 48 часов при различных экспериментальных условиях в инкубаторе при 37°C 5% CO₂.

Через 48 часов 10 мкл красителя UptiBlue для подсчета жизнеспособных клеток (Interchim, ссылка: UP669413) добавляли непосредственно в культуральную среду, и пролиферацию клеток C57 измеряли с помощью спектрофлуориметра (фузионный флуориметр для считывания микропланшетов, Packard) после 24 часов инкубации с красителем UptiBlue при 37°C с 5% CO₂.

Условия обработки: представлены 2 теста (за исключением ZnCl₂ и MnCl₂)

Sigma :

CuSO₄: 0,5 ; 1 ; 2 и 4 мкм

FeSO₄: 0,5 ; 1 ; 2 и 4 мкм

ZnSO₄: 6 ; 12,5 ; 25 и 50 мкм

HAuCl₂: 0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм

MnSO₄: 0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм

Chemcon :

CuCl₂: 0,5 ; 1 ; 2 и 4 мкм мкм

ZnCl₂ : 6 ; 12,5 ; 25 и 50 мкм

MnCl₂:125; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм

Пример 1: Эффекты As₂O₃ на продукцию H₂O₂ и GSH и жизнеспособность клеток HL60

Клеточная линия HL60 является клеточной линией лейкоза человека. Пациент, у которого диагностирована лейкемия, проходит химиотерапию для удаления лейкозных клеток, а затем проводят трансплантацию костного мозга от здорового пациента. В некоторых случаях трансплантация гемопоэтических стволовых клеток вызывает хроническое заболевание "трансплантат против хозяина" (РТПХ). Терапия первой линии хронической РТПХ основана на иммуносупрессивных препаратах (кортикостероиды с циклоспорином или без него), достигающих удовлетворительного отклика примерно у 30% пациентов. В настоящее время Medsenic проводит исследование II фазы для оценки эффективности добавления триоксида мышьяка к стандартной терапии в борьбе с хронической РТПХ и для сокращения продолжительности терапии кортикостероидами. В этом исследовании триоксид мышьяка вводят пациентам в дозе 0,15 мг/кг/сутки. Одним из аспектов данного исследования является выяснение того, способен ли триоксид азота воздействовать на возможно выжившие лейкозные клетки, устойчивые к химиотерапии, в дополнение к его влиянию на аутоиммунные особенности хронической РТПХ, посредством процесса, включающего индукцию клеточного стресса на клетки.

Клетки способны реагировать на клеточный стресс, индуцируя продукцию активных форм кислорода. В этом исследовании исследователи наблюдали влияние As соединений/As₂O₃-индуцированного клеточного стресса в присутствии двухвалентных катионов на продукцию перекиси водорода (H₂O₂), продукцию GSH и жизнеспособность клеток.

Чтобы вызвать клеточный стресс, клетки HL60 (5×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты (Falcon, Corning, ссылка: 353077) и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с или без триоксида мышьяка при нескольких концентрациях: 0,1; 0,5; 1; 5 и 10 мкм (As₂O₃) в инкубаторе при 37°C 5% CO₂.

Эффекты As₂O₃:

Фигура 1 показывает влияние As₂O₃ при возрастающих концентрациях на продукцию H₂O₂, GSH и жизнеспособность клеток (4 независимых теста).

Продукция H₂O₂ в присутствии As₂O₃ не является существенной, но увеличивается при 5 мкм (Фигура 1A).

Продукция GSH значительно увеличивается в присутствии As₂O₃ при 0.5, 1 и 5 мкм, и исчезает при 10 мкм (Фигура 1C).

Жизнеспособность клеток HL-60 значительно увеличивается в присутствии As₂O₃ при 1, 5 и 10 мкм (p<0,05, p<0,001 и P<0,001 соответственно; Фигуры 1B и 1D).

Гибель клеток при 5 и 10 мкм объясняет снижение продукции H₂O₂ и GSH при этих концентрациях As₂O₃.

Вывод

Дозу 1 мкм As₂O₃ выбирали для проверки эффекта комбинации As₂O₃ и ионов металла на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60.

При этой концентрации биологический эффект продукции H₂O₂ все еще компенсируется продукцией GSH, и жизнеспособность клеток сохраняется. Таким образом, эффект As₂O₃ может быть модулирован ионом металла.

Пример 2: Эффекты комбинаций As₂O₃ и ионов металла на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60

Чтобы вызвать клеточный стресс, клетки HL60 (5×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты (Falcon, Corning, ссылка: 353077) и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с или без триоксида мышьяка 1 мкм (As₂O₃) с различными катионами или без них, или только в культуральной среде в инкубаторе 37°C 5% CO₂. Представленные результаты получены в результате 2 независимых экспериментов (за исключением MnCl₂ и ZnCl₂), и катионы имеют разные степени качества: лабораторная степень чистоты CuSO₄ (0,5 ; 1 ; 2 и 4 мкм), FeSO₄ (0,5 ; 1 ; 2 и 4 мкм), ZnSO₄ (6 ; 12,5 ; 25 и 50 мкм), HAuCl₂ (0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм), MnSO₄ (0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм) и GMP степень чистоты (для производства) CuCl₂ (0,5 ; 1 ; 2 и 4 мкм), ZnCl₂ (6 ; 12,5 ; 25 и 50 мкм), MnCl₂ (125; 0,25 ; 0,5 ; 1 мкм).

Эффекты комбинаций As₂O₃ и ионов металла :

Результаты экспериментов на клетках HL60 для продукции H₂0₂ и жизнеспособности клеток с применением FeSO₄, HAuCl₂, ZnSO₄, ZnCl₂, MnSO₄, MnCl₂, CuSO₄ и CuCl₂ показаны на фигурах 2-9, соответственно.

Согласно статистике значимые различия отображены на фигурах следующим образом:

- контрольные клетки по сравнению с клетками, обработанными As₂O₃

- контрольные клетки по сравнению с клетками, обработанными только катионами

- клетки, обработанные As₂O_3, по сравнению с клетками, обработанными As₂O₃₊катионы.

FeSO₄ отдельно оказывает существенное влияние на продукцию H₂O₂ только при 4 мкм (тест 1) или с As₂O₃ (1 мкм) при 4 мкм (тест 1, p<0,001) и при 2 и 4 мкм (тест 2, p<0,01 и 0,001, соответственно (Фигура 2, графики сверху). FeSO₄ отдельно и с As₂O₃ (1 мкм) не оказывают существенного влияния на жизнеспособность клеток (Фигура 2, графики снизу).

HAuCl₂ отдельно не оказывает существенного влияния на продукцию H₂O₂; этот эффект ограничен при 1 мкм с As₂O₃ (p<0,01, тест 1) и при 0,5 мкм с As₂O₃ (p<0,01, тест 2; Фигура 3, графики сверху). HAuCl₂ отдельно и с As₂O₃ (1 мкм) не оказывают существенного влияния на жизнеспособность клеток HL60 (Фигура 3, графики снизу).

ZnSO₄ и ZnCl₂ отдельно не имеют воспроизводимого эффекта на продукцию H₂O₂ (Фигуры 4 и 5, графики сверху). С As₂O₃ (1 мкм), ZnSO₄ значительно увеличивает продукцию H₂O₂ при 12,5; 25 и 50 мкм (p<0,001, только в тесте 2; Фигура 4, верхний график справа). С As₂O₃, ZnSO₄ и ZnCl₂ не оказывают существенного и воспроизводимого эффекта на жизнеспособность клеток (Фигуры 4 и 5, графики снизу).

MnSO₄ оказывает существенное дозозависимое влияние на продукцию H₂O₂ при 0,25, 0,5 и 1 мкм (тесты 1 и 2, фигура 6, графики сверху) и дополнительный эффект с As₂O₃ при 0,5 и 1 мкм (p<0,001; тесты 1 и 2; фигура 6, графики сверху) и даже с As₂O, при 0,25 (p<0,001; тест 2; фигура 6, верхний график слева). MnSO_4, с или без As₂O₃ не оказывают реального влияния на жизнеспособность клеток (Фигура 6, нижние графики).

MnCl₂, с или без As₂O₃, оказывает дозозависимое влияние на продукцию H₂O₂, но увеличение является значительным только при 1 мкм (p<0,001, тест 1, фигура 7, график сверху). MnSO₄, с или без As₂O₃, не оказывает реального влияния на жизнеспособность клеток (Фигура 7, график снизу).

CuSO₄ и CuCl₂ отдельно не оказывают существенного влияния на продукцию H₂O₂ (фигуры 8 и 9, графики сверху). Очевидное влияние CuSO₄ на продукцию H₂O₂ в тесте 2 можно объяснить аномально низким контрольным значением. Оба CuSO₄ и CuCl₂ усиливают эффект As₂O₃ при всех испытанных концентрациях (p<0,001, фигуры 8 и 9, графики сверху). CuSO₄ и CuCl₂, с или без As₂O₃, по-видимому, не оказывают реального влияния на жизнеспособность клеток (фигуры 8 и 9, графики снизу).

Таблица 1 суммирует результаты, полученные для продукции H₂O₂ в клетках HL60.

Катионы Продукция H₂O₂:
катионы
относительно контроля Продукция H₂O₂ :
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ Жизнеспособность клеток:
катионы
относительно контроля Жизнеспо-собность клеток:
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ FeSO₄
2 теста 4 мкм (тест 1)
Не значительно (тест 2) 4 мкм (тест 1)
2 и 4 мкм (тест 2) Не значительно (теста 1 и 2) Не значительно (теста 1 и 2) HAuCl₂
2 теста Не значительно (теста 1 и 2) 1 мкм (тест 1)
0,5 мкм (тест 2) Не значительно (теста 1 и 2) Не значительно (тесты 1 и 2) ZnSO₄
2 теста Не значительно (тест1)
50 мкм (тест 2) Не значительно(тест1)
12,5, 25 и 50 мкм (тест 2) Не значительно (тест1)
25 и 50 мкм (тест2) Не значительно (тесты 1 и 2) ZnCl₂
1 тест 12,5 мкм Не значительно Не значительно Не значительно MnSO₄
2 теста 0,25, 0,5, 1 мкм (тесты 1 и 2) 0,25, 0,5 и 1 мкм (тест 1)
0,5 и 1 мкм (тест 2) 0,5 мкм (тест 1)
Не значительно (тест 2) Не значительно (теста 1 и 2) MnCl₂
1 тест 1 мкм 1 мкм Не значительно Не значительно CuSO₄
2 теста Не значительно (тест 1)
0,5, 1, 2 и 4 мкм (тест 2) 0,5, 1, 2 и 4 мкм
(теста 1 и 2) Не значительно (тест 1)
4 мкм (тест 2) Не значительно (тест 1)
0,5, 1, 2 и 4 мкм (тест 2) CuCl₂
2 теста Не значительно (теста 1 и 2) 0.5, 1, 2 и 4 мкм (тест1)
1, 2 и 4 мкм (тест2) Не значительно (теста 1 и 2) Не значительно (теста 1 и 2)

Таблица 1

Примечание: проводили несколько тестов для проверки эффекта последовательного осаждения As₂O₃, за которым следуют ионы металлов (или наоборот: ионы металлов+As₂O₃) или смеси двух активных ингредиентов. Между сериями тестов не обнаружили существенных различий (данные не показаны).

Вывод

Ионы меди не влияют на жизнеспособность клеток HL60 отдельно или в присутствии As₂O_3, но значительно усиливают влияние As₂O₃ на продукцию H₂0₂ дозозависимым образом. CuCl₂ выбирали для дальнейшего анализа, потому что он соответствует (и непосредственно доступен в промышленных количествах) «Правилам производства лекарственных средств» (GMP).

Пример 3: Эффект комбинации As₂O₃ и CuCl₂ на продукцию H₂O₂ и GSH и жизнеспособность клеток HL60.

Чтобы вызвать клеточный стресс, клетки HL60 (5×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с или без триоксида мышьяка при нескольких концентрациях (0,1; 0,5; 1; 5 и 10 мкм) и с и без CuCl₂ при 1 и 4 мкм в инкубаторе при 37°C 5% CO₂.

Эффект комбинации As₂O₃ и CuCl₂:

CuCl₂ при 1 и 4 мкм значительно увеличивает продукцию H₂O₂, вызванную As₂O₃ при всех концентрациях (Фигура 10, верхняя диаграмма слева).

CuCl₂ при 1 и 4 мкм уменьшает продукцию GSH, вызванную As₂O₃, в основном при 1 и 5 мкм As₂O₃ (Фигура 10, нижняя диаграмма слева).

CuCl₂ при 1 и 4 мкм не оказывает дополнительного или защитного влияния на жизнеспособность клеток HL60 в присутствии As₂O₃ (Фигура 10, диаграмма справа).

Вывод

CuCl₂, протестированный при 1 и 4 мкм с большим диапазоном концентраций As₂O₃, не оказывает дополнительного или защитного эффекта на жизнеспособность клеток HL60, но оказывает дополнительное влияние на продукцию H₂O₂ и негативное влияние на продукцию GSH.

Пример 4: Эффект комбинации As₂O₃ и CuCl₂ на продукцию GSH и жизнеспособность клеток HL60.

Чтобы вызвать клеточный стресс, клетки HL60 (5×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с или без триоксида мышьяка при 1 мкм и с и без CuCl₂ при 0,5, 1, 2 и 4 мкм в инкубаторе при 37°C 5% 37°C 5% CO₂.

Эффект комбинации As₂O₃ (1 мкм) и CuCl₂ (0,5, 1, 2 и 4 мкм)

As₂O₃ при 1 мкм значительно увеличивает продукцию GSH. В тесте 1, CuCl₂ уменьшает увеличение GSH, вызванное As₂O₃, но этот эффект наблюдался только при более высоких концентрациях (Фигура 11, графики сверху).

CuCl₂ отдельно в любой из 4 протестированных концентраций не оказывает существенного влияния на продукцию GSH (Фигура 11, графики сверху).

CuCl₂ отдельно в любой из 4 протестированных концентраций не оказывает существенного влияния на жизнеспособность клеток (Фигура 11, графики снизу).

В таблице 2 показаны существенные результаты по продукции GSH.

Продукция GSH:
катионы
относительно контроля Продукция GSH:
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ Жизнеспособность клеток:
катионы
относительно контроля Жизнеспособность клеток:
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ CuCl2:
(2 теста) Не значительно (тесты 1 и 2) 4 мкм (тест 1)
2 и 4 мкм (тест 2) Не значительно (тесты 1 и 2) Не значительно (тесты 1 и 2)

Таблица 2

Вывод

Данные результаты подтверждают сильное потенцирующее действие меди на вызванный As₂O₃ окислительный стресс в клетках HL60.

Пример 5: Эффект комбинации As₂O₃ и ионов металла на пролиферацию клеток селезенки мышей C57BL6 в реакции смешанных лимфоцитов

Реакция смешанных лимфоцитов представляет собой анализ клеточного иммунитета ex vivo, который проводится между двумя популяциями аллогенных лимфоцитов (одного и того же вида, но генетически различных). Две популяции лимфоцитов инкубируются вместе, возникающая реакция измеряется.

В настоящем изобретении реакцию смешанных лимфоцитов применяют в качестве модели аутоиммунной реакции, которая соответствует пролиферации клеток селезенки in vitro от мышей C57BL6, подвергнутых воздействию и стимулированных облученными клетками селезенки от мышей BalbC. Данный способ in vitro имитирует реакцию лимфоцитов, которая происходит in vivo при заболевании трансплантата против хозяина (РТПХ) после трансплантации аллогенных гемапоэтических стволовых клеток.

Анализ пролиферации клеток in vitro проводили на клетках селезенки мышей C57BL6, совместно культивированных с ранее облученными in vitro (30 Грей) клетками селезенки BALB/c.

Для анализа пролиферации клетки (6×10⁵ клеток/лунка/штамм) инокулировали в 96-луночные планшеты (Falcon, Corning, ссылка: 353077) и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с или без триоксида мышьяка при 1 мкм (As₂O₃), с или без различных катионов или только в культуральной среде в инкубаторе при 37°C 5% CO₂. Представленные результаты получены в результате 2 независимых экспериментов, и катионы имеют разные уровни качества, как описано выше в разделе, касающемся материалов и способов.

Результаты исследований клеток селезенки для контролей, FeSO₄, HAuCl₂, Zn²⁺ солей (ZnSO₄ и ZnCl₂), Mn²⁺ солей (MnSO₄ и MnCl₂) и Cu²⁺ солей (CuSO₄ и CuCl₂) показаны на фигурах 12-17, соответственно. Согласно статистике, значимые различия представлены на фигурах следующим образом:

- контрольные клетки по сравнению с клетками, обработанными As₂O₃

- контрольные клетки по сравнению с клетками, обработанными только катионами и

- клетки, обработанные As₂O₃, по сравнению с клетками, обработанными As₂O₃+катионы.

Проверка условий культивирования: на фигуре 12 показан контроль измерения пролиферации (4 независимых теста): клетки селезенки только от мышей C57BL6 и клетки селезенки только от мышей BALB/c не пролиферируют. Напротив, смешанные клетки демонстрируют реакцию лимфоцитов и пролиферацию, равную той, которая получена в присутствии митогена (CD3 5мкг/мл/CD28 2мкг/мл). Триоксид мышьяка (1 мкм) полностью подавляет пролиферацию клеток в присутствии митогена.

Примечание: проводили несколько тестов для проверки эффекта последовательного осаждения As₂O₃, за которым следуют ионы металла (или наоборот, ионы металла+As₂O₃) или раствор двух агентов. Между сериями тестов не обнаружили существенных различий (данные не показаны).

Эффект комбинаций As₂O₃ и ионов металла

FeSO₄ не оказывает существенного влияния на пролиферацию клеток, ни отдельно, ни с As₂O₃ (Фигура 13).

HAuCl₂ уменьшает пролиферацию клеток отдельно, но этот эффект ограничен при 1 мкм As₂O₃ и только в тесте 1 (p<0,001, Фигура 14).

ZnSO₄ и ZnCl₂ уменьшают пролиферацию клеток отдельно, но этот эффект ограничен при 50 мкм с As₂O₃ и только в тесте 1 (p<0,01 и p<0,001 соответственно, Фигура 15).

MnSO₄ и MnCl₂ значительно уменьшают пролиферацию клеток отдельно, но этот эффект ограничен при 1 мкм с As₂O₃ и только в тесте 1 (Фигура 16).

CuSO₄ и CuCl₂ значительно уменьшают пролиферацию клеток отдельно, но этот эффект ограничен при 4 мкм или 2 и 4 мкм с As₂O₃ (p<0,001, Фигура 17).

В таблице 3 показаны результаты по снижению пролиферации клеток.

Катионы Пролиферация клеток:
Катионы относительно контроля Пролиферация клеток:
As₂O₃+катионы относительно As₂O₃ FeSO₄ (2 теста) Не значительно (тест 1)
0.5 мкм (тест 2) Не значительно (теста 1 и 2) HauCl₂ (2 теста) 0.125, 0.50 и 1 мкм (тесты 1 и 2) 1 мкм (тест 1)
Не значительно (тест 2) ZnSO₄ (2 теста) 6, 25 и 50 мкм (тест 1)
6 & 50 мкм (тест 2) 50 мкм (тест 1)
Не значительно (тест 2) ZnCl₂ (2 теста) 6 и 50 мкм (тест 1)
6, 12,5, 25 и 50 мкм (тест 2) 50 мкм (тест 1)
Не значительно (тест 2) MnSO₄ (2 теста) 0,125, 0,25, 0,50, 1 мкм (теста 1 и 2) 1 мкм (тест 1)
Не значительно (тест 2) MnCl₂ (2 теста) Не значительно(тест 1)
0,125, 0,25, 0,50 и 1 мкм (тест 2) Не значительно(тесты 1 и 2) CuSO₄ (2 теста) 0,5, 1, 2 и 4 мкм (тесты 1 и 2) 2 и 4 мкм (тест 1)
Не значительно (тест 2) CuCl₂ (2 теста) 0,5, 1, 2 и 4 мкм (тесты 1 и 2) 4 мкм (тест 1)
2 и 4 мкм (тест 2)

Таблица 3

Вывод

Cu²⁺ является наиболее эффективным ионом металла для снижения реакции смешанных лимфоцитов; изменение состава соли (CuSO₄ или CuCl₂) или уровня качества не оказывает влияния на целевой эффект.

Пример 6: Эффект комбинации As₂O₃ и CuCl₂ на продукцию H₂O_2, GSH и жизнеспособность клеток A20.

Клетки A20 представляют собой клеточную линию лимфомы мыши, полученную в результате спонтанного новообразования клеток ретикулума мыши Balb/CANN. В этом исследовании мышьяк тестировали на мышиной клеточной линии раковых клеток, чтобы изучить его действие таким же образом, как и для клеток HL60. Действительно, перед тем как исследовать в будущем в модели in vivo на мышах, необходимо проверить влияние As₂O₃ на данные мышиные клетки in vitro.

Чтобы вызвать клеточный стресс, клетки A20 (1×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с или без триоксида мышьяка при 1 мкм и с и без CuCl2 в 4 концентрациях (0,5, 1, 2 и 4 мкм) в инкубаторе при 37°C 5% CO₂.

Статистически значимые различия представлены на фигурах следующим образом:

- контрольные клетки по сравнению с клетками, обработанными As₂O₃

- контрольные клетки по сравнению с клетками, обработанными только катионами

- клетки, обработанные As₂O₃ по сравнению с клетками, обработанными As₂O₃₊катионы.

Результаты комбинации As₂O₃ и CuCl₂

As₂O₃ при 1 мкм значительно увеличивал продукцию H₂O₂ и снижал жизнеспособность клеток A20 (p<0,001, тест 1, Фигура 18A), но в тесте 2 As₂O₃ только значительно снижал жизнеспособность клеток A20 (p<0,001, Фигура 18B),

CuCl₂ отдельно увеличивал продукцию H₂O₂ при любой из 4 проверенных концентраций 4 (тест 1 p<0,001) и при 3 более высоких концентрациях (тест 2, p<0,001). CuCl₂ отдельно, по-видимому, увеличивал жизнеспособность клеток A20 при 3 или 2 более высоких испытанных концентрациях (Фигура 18).

При любой из 4 проверенных концентраций CuCl₂ усиливал эффект, вызванный As₂O₃ на продукцию H₂O₂ (Тесты 1 и 2, Фигура 18, графики слева). В присутсвии As₂O₃, CuCl₂ немного, но значительно повышал жизнеспособность A20 при более высоких концентрациях (Тест 1 : 2 и 4 и Тест 2 : 4 мкм; Фигура 18, график справа ).

As₂O₃ при 1 мкм значительно увеличивал продукцию GSH и значительно снижал жизнеспособность клеток A20 (p<0,001, тест 1, Фигура 19).

CuCl₂ отдельно значительно снижал продукцию GSH и повышал жизнеспособность клеток A20 при 2 и 4 мкм (тест 1; Фигура 19). В присутствии As₂O₃, CuCl₂ значительно снижал вызванную мышьяком продукция GSH при более высоких концентрациях и повышал жизнеспособность клеток A20 только при 4 мкм (тест 1; Фигура 19).

Таблицы 4 и 5 отображают существенные результаты по продукции H₂O₂, GSH и жизнеспособности клеток A20.

Катионы Продукция H₂O₂:
катионы
относительно контроля Продукция H₂O₂:
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ Жизнеспособность клеток:
катионы
относительно контроля Жизнеспособность клеток:
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ CuCl₂
(2 теста) 0,5, 1, 2 и 4 мкм (тест1)
1, 2 и 4 мкм (тест 2) 0,5, 1, 2 и 4 мкм (теста 1 и 2) 1, 2 и 4 мкм (тест 1)
2 и 4 мкм (тест 2) 2 и 4 мкм (тест 1)
4 мкм (тест 2)

Таблица 4

Катионы Продукция GSH:
катионы
относительно контроля Продукция GSH:
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ Жизнеспособность клеток:
катионы
относительно контроля Жизнеспособность клеток:
As₂O₃+катионы
относительно As₂O₃ CuCl₂
(1 тест) 2 и 4 мкм 1, 2 и 4 мкм 2 и 4 мкм 4 мкм

Таблица 5

Вывод

В присутствии As₂O₃, CuCl₂ значительно увеличивал продукцию H₂O₂ и снижал продукцию GSH без какого-либо существенного влияния на жизнеспособность клеток A20.

Пример 7: Эффекты AsI₃ на продукцию H₂O₂, GSH и жизнеспособность клеток HL60

Чтобы вызвать клеточный стресс, клетки HL60 (5×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты (Falcon, Corning, ссылка: 353077) и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с AsI₃ и без AsI₃ при нескольких концентрациях: 0,1; 0,5; 1; 5 и 10 мкм в инкубаторе при 37°C 5% CO₂.

Эффект AsI₃ на клетки HL60:

На Фигурах 20-23 показано влияние AsI₃ при возрастающих концентрациях на продукцию H₂O₂ и GSH, и жизнеспособность клеток (1 тест).

AsI₃ значительно снижал продукцию H₂O₂ при всех испытанных концентрациях (p<0,001, Фигура 20A).

AsI₃ значительно увеличил продукцию GSH при 0,1, 1 и 5 мкм (p<0,01, p<0,001 и p<0,001 соответственно, Фигура 20B).

AsI₃ значительно снижал жизнеспособность клеток HL60 при 10 мкм (p<0,001, Фигура 20C).

Вывод

Дозу AsI₃ при 1 мкм выбирали для проверки влияния комбинаций с CuCl₂ на продукцию H₂0₂ и жизнеспособность клеток HL60.

Пример 8 : Эффект комбинации AsI₃ и CuCl₂ на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток HL60

Чтобы вызвать клеточный стресс, клетки HL60 (5×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с или без AsI₃ при 1 мкм и с и без CuCl₂ при 0.5, 1, 2 и 4 мкм в инкубаторе при 37°C 5% CO₂.

Эффект комбинации AsI₃ и CuCl₂:

AsI₃ при 1 мкм не влияет на продукцию H₂O₂ и жизнеспособность клеток(Фигура 21).

Независимо от испытанной концентрации, CuCl₂ значительно увеличивал влияние AsI₃ (при 1 мкм) на продукцию H₂0₂ (Фигура 21, график слева). CuCl₂ не влиял на жизнеспособность клеток в присутствии AsI₃ (Фигура 21, график справа).

Вывод:

В присутствии AsI₃ (1 мкм) наблюдается значительный эффект потенцирования CuCl₂ на продукцию H₂O₂, хотя, он, очевидно, ниже, чем в присутствии As₂O_3.

Пример 9: Эффект AsI₃ на пролиферативные свойства клеток селезенки C57Bl6 во время реакции смешанных лимфоцитов (MLR).

Анализ пролиферации клеток in vitro проводили на клетках селезенки мышей C57BL6 в совместной культуре с ранее облученными (30 Грей) так называемыми «стимулирующими» клетками селезенки мышей линии BALB/c.

Для тестов на пролиферацию клетки (6×10⁵ клеток/лунка/штамм) высевали в 96-луночные планшеты (Falcon, Corning, ссылка: 353077) и инкубировали в течение 48 часов в полной среде с добавлением или без добавления триоксида мышьяка (As₂O₃) при 1 мкм или трийодида мышьяка (AsI₃) при 1 мкм в присутствии митогена или меди при возрастающих концентрациях от 0,5 до 4 мкм CuCl₂.

Пролиферацию клеток определяли спектрофлуориметрическим способом после 24 часов инкубации клеток с 10% UptiBlue (20 мкл в 200 мкл среды).

Результаты воздействия триоксида мышьяка (As₂O₃) при 1 мкм или трийодида мышьяка (AsI₃) при 1 мкм на пролиферацию клеток в присутствии митогена показаны на Фигуре 22. AsI₃ значительно активен только в тесте 2 (Фигуры 22 и 23, графики справа).

Результаты этих экспериментов на клетках селезенки для CuCl₂ с большим или меньшим содержанием трийодида мышьяка (AsI₃) показаны на Фигуре 23.

В присутсвии AsI₃, CuCl₂ значительно снижал пролиферацию клеток селезенки C57BL6 при 1, 2 и 4 мкм (тест 1) и при 4 мкм (тест 2).

Вывод:

AsI₃ активен, но немного меньше, чем As₂O₃, и совместное действие с CuCl_2, по-видимому, снижается, что, вероятно, указывает на то, что важным элементов является концентрация ионов As.

Пример 10: Эффекты As₂O₃ и CuCl₂ в мышиной модели болезни трансплантата против хозяина (РТПХ)

Связь триоксида мышьяка (As₂O₃) с молекулами меди (CuCl₂) оценивали в хорошо зарекомендовавшей себя мышиной модели хронического склеродерматозного заболевания трансплантата против хозяина (Arsenic Trioxide Prevents Murine Sclerodermatous Graft-versus-Host Disease, Kavian et al., 2012). В данной модели мышам (самкам мышей линии BALB/c и самцам линии H-2d), ранее подвергнутым сублетальному облучению 7,5 Грей из Gammacel источника и введению костного мозга (1×10⁶ клеток) и спленоцитов (2×10⁶ клеток) от мышей с низкой иммунной совместимостью (самцы мышей линии B10.D2 H-2b).

Через 7 дней после трансплантации мыши получали внутрибрюшинные инъекции триоксида железа, отдельно или в комплексе с хлоридом меди («медь»), 5 раз в неделю в течение 5 недель. Контрольную группу облучения добавляли для проверки эффективности облучения, чтобы убедиться, что трансплантация прошла успешно у мышей-реципиентов. Сингенной группе прививали спленоциты и костный мозг от мышей того же генетического происхождения. У этой контрольной группы не должно возникнуть хронической РТПХ. Раз в неделю клиническая оценка таких признаков, как выпадение волос, потеря веса, диарея и васкулит, позволяла оценить прогрессирование заболевания.

Группы Реципиенты Донор Количество мышей Контрольная группа облучения BALB/c Ø 3 Сингенная BALB/c BALB/c 9 Аллогенная BALB/c B10.D2 10 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г BALB/c B10.D2 10 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 10 мкг/г BALB/c B10.D2 10 Аллогенная+CuCl₂ 10 мкг/г BALB/c B10.D2 7 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 2,5 мкг/г BALB/c B10.D2 10 Аллогенная+ CuCl₂ 2,5 мкг/г BALB/c B10.D2 7 Аллогенная+As₂O₃ 5 мкг/г BALB/c B10.D2 7

Таблица 6: Экспериментальные группы, со штаммами мышей-доноров и мышей-реципиентов и количеством мышей в группе

Первоначальный протокол: через 5 недель мышей следовало подвергнуть эвтаназии, чтобы оценить действие сочетания меди с триоксидом мышьяка на органы, пораженные хронической РТПХ (кожа, легкие, печень...).

Корректировка протокола: после значительной потери мышей в группах, получавших медь, инъекции пришлось прекратить в конце 4-го дня. Лечение было возобновлено на следующей неделе на 8-й день с другой скоростью до конца 5 недели лечения. Затем медь вводили только 2 раза в неделю вместо 5 раз мышам, получавшим медь, в то время как мыши, получавшие только мышьяк или мышьяк в сочетании с медью, все еще получали 5 инъекций АТО в неделю. В новых условиях лечения смертельных случаев среди мышей, обработанных медью, не наблюдали.

Поскольку количество мышей значительно сократилось, мы решили собрать только кровь мышей, чтобы провести анализы на трансаминазу, но органы не были собраны. Эти эксперименты показывают, что медь необходимо уменьшить, чтобы устранить ее токсическое воздействие на мышей, по крайней мере, когда ее вводят внутрибрюшинно.

Группы Количество мышей в начале Количество мышей в конце Контроль облучения 3 0 Сингенная 9 8 Аллогенная 10 9 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г 10 9 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 10 мкг/г 10 2 Аллогенная+CuCl₂ 10 мкг/г 7 5 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 2,5 мкг/г 10 3 Аллогенная+CuCl₂ 2,5 мкг/г 7 2 Аллогенная+As₂O₃ 5 мкг/г 7 5

Таблица 7: Количество живых мышей в конце эксперимента по сравнению с исходным количеством мышей

Результаты данного эксперимента показаны в таблице 8 ниже и на фигурах 24-27.

Группы Количество мышей Количество мышей с алопецией Процент мышей с алопецией Сингенная 8 0 0% Аллогенная 9 7 77% Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г 9 3 33% Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 2,5 мкг/г 3 0 0% Аллогенная+CuCl₂ 2,5 мкг/г 2 1 50% Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 10 мкг/г 2 0 0% Аллогенная+CuCl₂ 10 мкг/г 5 0 0% Аллогенная+As₂O₃ 5 мкг/г 5 1 20%

Таблица 8: Результаты эксперимента (алопеция)

Несмотря на то, что количество мышей в группе недостаточно для достоверной статистики, мы по-прежнему можем отметить, что ни у одной из мышей, получавших комплексное лечение As₂O₃ (2,5 мкг/г ) и CuCl₂ (2,5 или 10 мкг/г), не развилась алопеция, что лучше, чем у мышей, получавших только As₂O₃ 2,5 мкг/г (33% алопеции), и даже лучше, чем у мышей, получавших As₂O₃ 5 мкг/г (20% алопеции) (Фигура 24). Это подтверждает, что действие мышьяка усиливается в сочетании с медью.

Что касается веса мышей, в конце лечения не было очевидной разницы между группами, даже если мыши сингенной группы, по всей видимости, имели больший вес, чем мыши других групп (Фигура 25).

Мыши в аллогенной группе демонстрируют увеличение толщины ушей (васкулит) по сравнению с мышами в сингенной группе. Также мы наблюдаем, что в аллогенной группе+As₂O₃ 2,5 мкг/г васкулит сократился, а в аллогенной группе+5 мкг/г он сократился еще больше, пока не достиг тех же значений, что и в сингенной группе (Фигура 26).

Что касается печеночного баланса животных, результаты, полученные для сыворотки трансаминаз, не сходятся. Это может быть связано с переменным токсическим действием повторных внутрибрюшинных инъекций триоксида мышьяка и меди, при этом печень подвергается воздействию различных количеств в зависимости от локализации каждой инъекции и, следовательно, оказывает различное вредное воздействие (Фигура 27).

Пример 11: Эффекты As₂O₃ и CuCl₂ в мышиной модели болезни трансплантата против хозяина (РТПХ) с более низкой дозировкой CuCl₂

На основе этих результатов мы решили провести оценку цитотоксичности меди. С этой целью в течение 5 недель мы вводили более низкую дозу меди (0,2 мкг/г и 0,5 мкг/г) 5 раз в неделю новой серии мышей BALB/c. Мы наблюдали за мышами каждый день, следили за их весом и выживаемостью, чтобы оценить токсичность меди.

Через 5 недель смертельных случаев не выявлено, и средние веса были одинаковыми между контрольной группой, получавшей PBS, и группами, получавшими медь в дозах 0,2 мкг/г и 0,5 мкг/г. Таким образом, была выбрана дозировка 0,5 мкг/г для нового набора экспериментов с применением того же протокола, что и в примере 10, но с условиями, описанными в таблице 9 ниже.

Группы Реципиенты Донор Количество мышей Контроль облучения BALB/c Ø 3 Сингенная BALB/c BALB/c 7 Аллогенная BALB/c B10.D2 7 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г BALB/c B10.D2 10 Аллогенная+As₂O₃ 2,5 мкг/г+CuCl₂ 0.5 мкг/г BALB/c B10.D2 10 Аллогенная+CuCl₂ 0.5 мкг/г BALB/c B10.D2 10 Аллогенная+As₂O₃ 5 мкг/г BALB/c B10.D2 10

Таблица 9: Экспериментальные группы, со штаммами мышей-доноров и мышей-реципиентов и количество мышей в группе

К сожалению, данная серия экспериментов была прервана из-за COVID-19, по причине которого лаборатория была вынуждена приостановить работу 11 марта 2020 года. Эксперименты будут продолжены после возобновления работы лаборатории.

Группа изобретений относится к области медицины и основана на том, что терапевтические эффекты мышьяка могут быть усилены введением ионов двухвалентных металлов и в частности ионов Cu²⁺. Предлагается применение композиции, содержащей триоксид мышьяка и ионы Cu²⁺, для получения лекарственного средства для лечения болезни "трансплантат против хозяина" (РТПХ), а также применение комбинации соли Cu²⁺ и триоксида мышьяка для получения лекарственного средства для лечения болезни "трансплантат против хозяина" (РТПХ). Применение указанных выше композиции и комбинации обеспечивает значительное усиление терапевтического эффекта мышьяка, в то время как введение одних ионов Cu²⁺ не дает какого-либо заметного эффекта. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 28 ил., 9 табл., 11 пр.

1. Применение композиции, содержащей триоксид мышьяка и ионы Cu²⁺, для получения лекарственного средства для лечения болезни "трансплантат против хозяина" (РТПХ).

2. Применение по п. 1, где ионы Cu²⁺ находятся в виде соли, выбранной из группы, состоящей из сульфата меди и хлорида меди(II).

3. Применение по п. 1, где указанное лекарственное средство составлено так, что одна суточная доза содержит от 0,01 до 0,10 мг/кг/сутки триоксида мышьяка.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где указанное лекарственное средство составлено в таком формате, что одна суточная доза содержит от 0,05 мкмоль/кг до 10 мкмоль/кг Cu²⁺.

5. Применение по п. 4, где указанное лекарственное средство составлено в таком формате, что одна суточная доза содержит от 0,06 мкмоль/кг до 2 мкмоль/кг Cu²⁺.

6. Применение по п. 5, где указанное лекарственное средство составлено в таком формате, что одна суточная доза содержит от 0,3 мкмоль/кг до 1,1 мкмоль/кг Cu²⁺.

7. Применение по любому из пп. 1-3, где указанная РТПХ представляет собой хроническую болезнь трансплантата против хозяина (РТПХ).

8. Применение комбинации соли Cu²⁺ и триоксида мышьяка для получения лекарственного средства для лечения болезни "трансплантат против хозяина" (РТПХ).

9. Применение по п. 8, где соль Cu²⁺ представляет собой сульфат меди или хлорид меди (II).

10. Применение по п. 8 или 9, где указанное лекарственное средство составлено так, что одна суточная доза содержит от 0,01 до 0,10 мг/кг/сутки триоксида мышьяка.

11. Применение по любому из пп. 8-10, где указанное лекарственное средство составлено так, что одна суточная доза содержит от 0,05 мкмоль/кг до 10 мкмоль/кг Cu²⁺.

12. Применение по п. 11, где указанное лекарственное средство составлено в таком формате, что одна суточная доза содержит от 0,06 мкмоль/кг до 2 мкмоль/кг Cu²⁺.

13. Применение по п. 12, где указанное лекарственное средство составлено в таком формате, что одна суточная доза содержит от 0,3 мкмоль/кг до 1,1 мкмоль/кг Cu²⁺.

14. Применение по любому из пп. 8-13, где указанная РТПХ представляет собой хроническую болезнь трансплантата против хозяина (РТПХ).