СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РЕАКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА СТИМУЛЯЦИЕЙ АНТИИДИОТИПИЧЕСКОЙ СУПРЕССИИ ДОНОРСКИХ ЛИМФОЦИТОВ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/44 A61P37/06 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическим методам лечения реакции трансплантат против хозяина (РТПХ).

Принцип способа лечения - антиидиотипическое подавление синтеза аутоантител у больных заболеваниями с аутоиммунными проявлениями (патент 93032579) - лег в основу профилактики и лечения РТПХ.

Для лечения РТПХ в клинике используется цитостатическое лечение. В последние годы показана эффективность лечения моноклональными антителами.

Наряду с очевидными успехами лечения РТПХ можно отметить основные недостатки:
1. Отсутствие или недостаточность избирательности воздействия, что является причиной серьезных осложнений, таких как иммунодефицит, инфекционные осложнения.

2. Недостаточная эффективность в ряде случаев.

3. Необходимость постоянного лечения.

Для лечения болезни трансплантат против хозяина апробировано несколько способов иммунологического воздействия.

1. В экспериментальных работах было показано, что блокирование CD4 (5,9) и CD2 (1) антигенов Т-клеток способствует развитию трансплантационной толерантности и может вызвать ингибирование РТПХ.

2. Моноклональные антитела против Т-клеток предотвращали летальный исход при аллогенной трансплантации на модели РТПХ: BALB/c (донор) - (C57BL/6 • CBA/2)F₁ (реципиент). (6, 7)
3. Комбинирование моноклональных анти-CD4 и -CD8 антител оказывало терапевтическое действие на РТПХ. (8)
4. Показано, что анти-В7 антитела способны вылечивать Т- клеточно-опосредованные болезни иммунной системы и могут быть использованы для подавления активации Т-клеток, предотвращая отторжение трансплантата и развитие РТПХ (1,2)
В последние годы показана эффективность лечения в клинике моноклональными антителами ОКТ-3 к антигену CD3 (4), блокирующими Т-лимфоциты, болезней, вызываемых трансплантацией костного мозга или органов.

Основные недостатки иммунологических способов лечения, связанных с трансплантацией костного мозга и органов:
1. способ лечения с введением моноклональных антител не всегда эффективен и в ряде случаев дает временный эффект,
2. отсутствие специфичности при подавлении активированных Т-лимфоцитов приводит к нарушению иммунитета.

3. имеется необходимость лечения цитостатиками в продолжение всей послеоперационной жизни.

Предлагаемый способ лечения позволяет преодолеть проблемы, связанные с проведением пассивной иммунотерапии, поскольку способствует развитию специфического иммунитета. После однократного цикла иммунизации анти-BALB/c антителами (к антигенам клеток-мишеней РТПХ) вырабатывается толерантность к тренсплантату. Эффект терапии РТПХ обеспечивается технологией проведения иммунизации. Присоединение к альдегидцеллюлозе антител против поверхностных антигенов клеток мишеней РТПХ повышает их иммуногенность и способствует синтезу антиидиотипических антител, которые избирательно блокируют активированные лимфоциты донора при иммунизации реципиента. Иммунизация до или после аллотрансплантации позволяет значительно снизить тяжесть болезни, при этом иммунитет сохраняется весь последующий период жизни животных. Повторное введение тех же донорских клеток вызывало болезнь, а третье - смерть у большинства нелеченых животных, тогда как иммунизированные животные не проявляли клиники реакции трансплантат против хозяина.

Возможность лечения и профилактики РТПХ исследовали на модели необлученных гибридов F₁ мышей, инокулированных спленоцитами одной из родительских линий. В качестве контролей специфичности антиидиотипического эффекта использовали трансплантацию сингенных спленоцитов, аллотрансплантацию без лечения, аллотрансплантацию с иммунизацией восстановленной диальдегидцеллюлозой, аллотрансплантацию с иммунизацией антителами к клеткам донора (анти-C57ВL/6), аллотрансплантацию с иммунизацией фиксированными клетками донора (C57BL/6), аллотрансплантацию с иммунизацией фиксированными клетками второй родительской линии (BALB/c), аллотрансплантацию с пассивными инъекциями антиидиотипической сыворотки (1 мл в/в, еженедельно). Развитие РТПХ исследовали в динамике, оценивая ее тяжесть по количеству выраженных клинических симптомов: артрит, спленомегалия, кожные поражения, конъюнктивит и др. при еженедельном обследовании. Для каждой мыши вычисляли суммарный показатель тяжести заболевания (число симптомов). Различия средних значений в группах оценивались при помощи критерия Стъюдента.

Было показано, что одного цикла иммунизации до или после трансплантации достаточно для успешного лечения РТПХ, тогда как пассивная иммунизация - трансфузия антиидиотипических иммуноглобулинов - не была эффективна. В работе исследовали цитотоксичность сывороток при РТПХ в реакции цитотоксичности (ЦТР).

Сыворотки мышей, имеющих ярко выраженные симптомы РТПХ, содержали высокий титр цитотоксических анти-BALB/c или анти-DBA/2 аутоантител. Их максимум приходился на 40-50 дни, и на всем протяжении исследования у нелеченых мышей титр был значимо выше (p < 0,05), чем в группе леченых. Сравнение динамики средних показателей цитотоксического теста и клинических проявлений РТПХ показало, что снижение тяжести заболевания совпадало со снижением титра цитотоксических аутоантител в группе леченых мышей.

В тесте нейтрализации ЦТР исследовали уровень антиидиотипических антител в сыворотках мышей (BBF₁), иммунизированных прямыми (СВА/2)-анти-BALB/c антителами до или после аллотрансплантации.

В опытах с профилактикой РТПХ иммунизация гибридов BBF₁ проводилась прямыми (CBA/2)-анти-BALB/c антителами до трансплантации. Исследование пулов сывороток от 20 до 50 мышей в макротесте нейтрализации ЦТР показало наличие антиидиотипических (анти-анти-BALB/c) антител. Полученные антиидиотипические сыворотки (в разведениях 1:1-1:4) нейтрализовали (СВА/2-анти-BALB/c) сыворотки (в разведениях 1:10-1:20) на 62-75%. Таким образом, цикл иммунизации прямыми антителами, полученными через "промежуточного" хозяина и иммобилизованными на альдегидцеллюлозе, приводит к индукции синтеза антиидиотипических антител. Иммунизация реципиентов BBF₁ после трансплантации им родительских спленоцитов шла по той же схеме, из чего следует, что сыворотки таких мышей должны содержать антиидиотипические антитела. Однако в тесте нейтрализации цитотоксичности не обнаружено различий в уровне антиидиотипических антител у иммунизированных и неиммунизированных мышей. Вероятнее всего, антиидиотипические антитела не выявляются в этом тесте, так как находятся в комплексе с прямыми антителами и об их наличии свидетельствует различие в уровне прямых аутоантител: уровень цитотоксических анти-BALB/c значительно ниже (0-25% мертвых клеток) у иммунизированных мышей по сравнению с контрольной группой (30 - 80%).

Приведенные результаты свидетельствуют о возможности идиотипической супрессии активированных против аллоантигенов клеток-мишеней Т-лимфоцитов стимуляцией синтеза антиидиотипических анти-анти-(антигены клеток-мишеней) антител. Последние, являясь "образами" антигенов клеток-мишеней, блокируют рецепторы активированных Т-лимфоцитов и, таким образом, ингибируют развитие РТПХ. Эту болезнь на необлученных гибридах F₁ можно как лечить, так и предупреждать.

Данная модель РТПХ близка событиям, происходящим при аллогенной трансплантации в клинике, когда наряду с донорскими клетками у реципиента восстанавливается собственное кроветворение.

Так как РТПХ моделирует аутоиммунное заболевание, представляется перспективным лечение болезней с аутоиммунными проявлениями путем индукции синтеза антиидиотипических антител к аутоантителам, являющимся патогенетическими факторами.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Лечению больных предшествует:
1. приготовление антиген-сорбентов из поверхностных антигенов лимфоцитов больного, являющихся "мишенью" реакции трансплантат против хозяина,
2. получение антител иммунизацией животных теми же лимфоцитами больного,
3. выделение антител из иммунных сывороток на предварительно приготовленном антиген-сорбенте.

4. химическое связывание антител с диальдегидцеллюлозой
5. иммунизация реципиентов антителами к антигенам клеток-"мишеней" РТПХ, связанными с целлюлозой.

Для иммунизации и приготовления антиген-сорбентов используют лимфоциты из грудного протока больного, крови, оперативно удаленных лимфоузлов и селезенки. Материал делят на две части. Одна часть используется для получения антител к мембранным антигенам больного иммунизацией кроликов (или мини-свинок) живыми клетками этого больного. Другая часть - для приготовления соответствующего иммуносорбента. Путем обработки клеток детергентами получают солюбилизированные мембранные антигены клеток и конъюгируют их с сефарозой или окисленной диальдегидцеллюлозой. Приготовленная из антигенов клеток-"мишеней" колонка служит для афинного выделения из иммунных сывороток соответствующих антител. Выделенные антитела подвергают частичному протеолизу для удаления Fс-фрагмента иммуноглобулина животного, стерилизуют путем ультрафильтрации, и Fab фрагменты (или цельные иммуноглобулины) конъюгируют с диальдегидцеллюлозой.

После проверки на стерильность препарат иммобилизованных на целлюлозе антител (или Fab-фрагментов) используется для терапии больного. Иммунизацию начинают через неделю после трансплантации костного мозга и проводят в течение пяти недель с недельным интервалом в дозе 10-100 мкг белка (или 5-10 мкг Fab-фрагментов) на 1 кг веса на одну инъекцию. Если Fab фрагменты не выделяют, предусматривается обеспечение иммунологической безопасности.

Предлагаемый способ был апробирован в многочисленной серии опытов более чем на 800 мышах.

1. В экспериментах с терапией болезни трансплантат против хозяина иммунизацию начинали одновременно с аллотрансплантацией (реципиенты - BBF1 (BALB/c Х C57BL/6), доноры - C57BL/6).

2. Для профилактики - цикл иммунизации проводили до трансплантации, реципиенты - BBF1, доноры - C57BL/6.

Необлученным гибридам F1 в хвостовую вену вводили родительские спленоциты C57BL/6 (донор), вызывая развитие болезни трансплантат против хозяина. Начиная со следующего дня после трансплантации для стимуляции антиидиотипического ответа проводили иммунизацию антителами против второй родительской линии (анти-BALB/c), которая является мишенью трансплантационной атаки - терапевтическая иммунизация. Эффективность профилактической иммунизации проверяли на той же модели: необлученным гибридам F1, вводили спленоциты (C57BL/6) после иммунизации анти-BALB/c-антителами. В обоих случаях тяжесть заболевания уменьшалась в 5-7 раз и резистентность к развитию болезни трансплантат против хозяина (при повторных введениях донорских клеток) сохранялась в течение всей жизни животных. В опытах с профилактикой РТПХ иммунизация гибридов BBF₁ проводилась прямыми (CBA/2)-aHTH-BALB/c антителами до трансплантации. Исследование пулов сывороток от 20 до 50 мышей в макротесте нейтрализации ЦТР показало наличие антиидиотипических (анти-анти-BALB/c) антител. Полученные антиидиотипические сыворотки (в разведениях 1: 1-1: 4) нейтрализовали (CBA/2-анти-BALB/c) сыворотки (в разведениях 1:10-1: 20) на 62-75%. Таким образом, цикл иммунизации прямыми антителами, полученными через "промежуточного" хозяина и иммобилизованными на альдегидцеллюлозе, приводит к индукции синтеза антиидиотипических антител. Иммунизация реципиентов BBFi после трансплантации родительских спленоцитов шла по той же схеме, из чего следует, что сыворотки таких мышей должны содержать антиидиотипические антитела, но не выявляются, так как находятся в комплексе с цитотоксическими антителами.

Для каждой мыши вычислялся суммарный показатель тяжести заболевания (количество симптомов). Различия средних значений в группах оценивались при помощи критерия Стъюдента.

Пример 1.

Гибридам BBF₁ - (BALB/c • C57BL/6)F₁ трансплантировали спленоциты мышей C57BL/6. Для стимуляции антиидиотипического ответа проводили посттрансплантационную терапевтическую иммунизацию анти-BALB/c антителами. В качестве контроля специфичности получаемого терапевтического эффекта исследовали влияние на РТПХ синтеза прямых антител к клеткам обеих родительских линий. С этой целью реципиентов после аллотрансплантации иммунизировали фиксированными клетками каждой из родительских линий мышей.

На фиг. 1 показана динамика проявления клинических симптомов. Как видно из фигуры, у групп терапевтически иммунизированных мышей (кривые 3, 4), тяжесть заболевания РТПХ снижена в 5-7 раз (p < 0,05) по сравнению с контрольной нелеченой группой (кривая 2). Степень тяжести заболевания леченой группы (кривые 3,4) была на одном уровне с группой сингенно трансплантированных мышей BBF₁, у которых в слабой степени также развивалась РТПХ (кривая 1). Повторный цикл посттрансплантационной иммунизации дополнительно не снизил тяжесть заболевания (кривая 4). При иммунизации реципиентов фиксированными клетками какой-либо родительской линии донорские спленоциты снижали тяжесть РТПХ (кривая 6). При иммунизации клетками второй родительской линии РТПХ несколько усиливалась (кривая 5). У нелеченых мышей наиболее тяжело заболевание протекало в период с 20 по 80 дни, после чего наступало "выздоровление" (кривая 2). Через 4 месяца после трансплантации клинические симптомы РТПХ ни в одной из групп не обнаружены.

Пример 2.

В данном опыте исследовали влияние повторных аллотрансплантации на реципиентах спленоцитов C57BL/6, взятых из экспериментов, описанных выше. Половине каждой из предварительно леченных и нелеченных групп мышей (соответственно по 6 мышей) через четыре месяца после "выздоровления" от РТПХ (260 дней после первой трансплантации) была проведена повторная трансплантация спленоцитов либо тех же доноров (C57BL/6) либо от сингенных мышей - BBF₁ (в дозе первой трансплантации - 3 • 10⁷ кл/мышь). На фиг. 2 видно, что мыши из ранее леченных иммунизацией анти-BALB/c антителами групп (соответствующих кривым 3, 4 на фиг. 1) не заболели после повторной трансплантации (фиг. 2 группа II, кривая 2). У всех мышей из ранее неимунизированной группы (соответствующей кривой 2 на фиг. 1) появились симптомы тяжелой РТПХ (фиг. 2, группа 1, кривая 2).

После третьей аллотрансплантации тем же группам - через несколько месяцев после второй аллотрансплантации - все мыши из группы нелеченых мышей проявили симптомы тяжелой РТПХ, в результате которой 4 из 6 ранее не леченных мышей погибли, тогда как леченые (6 мышей) остались живы.

Содержание донорских клеток мышей через 270 дней после первой трансплантации колебалось от 2 до 15% независимо от группы исследования. Это свидетельствует, что эффект повторных трансплантаций связан с приживлением донорских клеток и, видимо, зависит от их иммунологической активности.

Пример 3. Возможность профилактики РТПХ.

Гибридам BBF₁ - (BALB/c • C57BL/6)F₁ трансплантировали родительские клетки селезенки C57BL/6. Иммунизацию анти-BALB/c антителами проводили до трансплантации (профилактическая иммунизация). Для сравнения эффективности профилактической иммунизации в этом эксперименте проводили терапевтическую иммунизацию либо после профилактической, либо отдельно. В качестве контролей использовали трансплантацию сингенных спленоцитов; аллотрансплантацию без иммунизации, с иммунизацией антителами к донорским антигенам (aHTH-C57BL/6).

Из фиг. 3 видно, что у нелеченой группы мышей (кривая 2) или у групп, иммунизированных антителами к донорским клеткам (кривая 6) или инертным носителем (кривая 7), тяжесть РТПХ была в несколько раз выше (p < 0,05), чем у профилактически или терапевтически иммунизированных групп (кривые 3,4,5). При этом эффективность терапии не зависела от сроков иммунизации: до или после трансплантации.

Увеличение дозы инокулированных клеток усиливало тяжесть РТПХ. "Выздоровление" мышей, инокулированных 6,5•10⁷ кл/мышь, было неполным. Эффект терапии снизился от 5-7-кратного при дозе 3•10⁷ кл/мышь до 2-3 - кратного при дозе 6,5•10⁷ кл/мышь.

Подписи к фигурам
Фиг. 1. Результаты иммунотерапии РТПХ.

7 групп по 12 мышей (6 самцов и 6 самок).

По оси абсцисс - дни после трансплантации.

По оси ординат - степень тяжести заболевания.

1. Сингенная трансплантация (контроль 1).

2-7 - Аллогенная трансплантация родительских спленоцитов C57BL/6. РТПХ:
2. без дополнительной иммунизации (контроль 2),
3. посттрансплантационная иммунизация анти-BALB/c антителами,
4. два цикла посттрансплантационной иммунизации анти-BALB/c антителами,
5, 6 - посттрансплантационная иммунизация фиксированными спленоцитами родительских линий мышей BBF₁:
5. клетками BALB/c (контроль 3),
6. клетками C57BL/6 (контроль 4).

Фиг. 2. Повторная аллотрансплантация "выздоровевшим" от РТПХ группам мышей, ранее не иммунизированным и иммунизированным анти-BALB/c антителами.

4 группы по 6 мышей.

Группа I. Степень тяжести заболевания мышей без иммунизации
Группа II. Степень тяжести заболевания мышей, ранее иммунизированных анти-BALB/c антителами
1. повторная трансплантация сингенных (BBF₁) спленоцитов (контроль),
2. повторная трансплантация родительских спленоцитов (C57BL/6).

Фиг 3. Результаты иммунопрофилактики РТПХ.

7 групп по 10 мышей (5 самцов и 5 самок).

По оси абсцисс - дни после трансплантации
По оси ординат - степень тяжести заболевания
1. Сингенная трансплантация (контроль 1).

2-7-Аллогенная трансплантация родительских спленоцитов C57BL/6. РТПХ:
2. без дополнительной иммунизации (контроль 2),
3. иммунизация анти-BALB/c антителами до трансплантации,
4. иммунизация анти-BALB/c антителами до трансплантации плюс цикл посттрансплантационной иммунизации анти-BALB/c антителами
5. посттрансплантационная иммунизация анти-BALB/c антителами,
6. посттрансплантационной иммунизации aHTH-C57BL/6. антителами (контроль 3),
7. цикл посттрансплантационной иммунизации инертным носителем (контроль 4).

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическим методам лечения реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Предлагаемый способ основан на стимуляции антиидиотипического ответа в организме необлученных мышей F1(BALB/c х C57BL/6) - реципиентов родительских спленоцитов (C57BL/6). Это достигается иммунизацией реципиента антителами против поверхностных антигенов лимфоцитов BALB/c - мишени РТПХ. Антитела получают иммунизацией промежуточного реципиента третьего гаплотила лимфоцитами BALB/c, выделяют на иммуносорбенте, приготовленном из тех лимфоцитов, и для повышения иммуногенности иммобилизуют на диальдегидцеллюлозе. Иммунизация реципиента конъюгатами антител против клеток-мишеней позволяет профилактировать и лечить РТПХ, снижая в 5-7 раз тяжесть заболевания. 3 ил.

Способ профилактики и лечения болезни трансплантат против хозяина (РТПХ) путем иммунотерапии, отличающийся тем, что реципиента иммунизируют гетероантителами против собственных поверхностных антигенов лимфоцитов-мишеней РТПХ, иммобилизованными на инертном носителе, для получения антиидиотипической супрессии активированных Т-лимфоцитов донора.