Способ повышения иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма чумного микроба Российский патент 2024 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской биохимии, патофизиологии и иммунологии и может быть использовано для повышения иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма чумного микроба.

Эффективность специфической профилактики инфекционных заболеваний, в том числе особо опасных, зависит от иммуногенности и безопасности вакцин. Практически все сертифицированные вакцины против особо опасных инфекций представляют собой аттенуированные штаммы патогенов, обладающие остаточной вирулентностью. Для специфической профилактики чумы в России используют живую вакцину (ЖЧВ) на основе аттенуированного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (Y. pestis EV). Многолетний опыт применения ЖЧВ показал ее эффективность и безопасность. Однако существующие препараты имеют и ряд недостатков. Так, к особенностям ЖЧВ можно отнести ее высокую реактоген-ность. Искусственные иммунобиологические препараты для специфической профилактики особо опасных инфекций по своей эффективности значительно уступают живым вакцинам. В связи с этим, появился интерес к поиску новых методов коррекции вакцинального процесса, вызванного живыми вакцинами, поскольку они обладают остаточной вирулентностью и реактогенностью. Для снижения негативных реакций на живую вакцину можно снизить ее иммунизирующую дозу, но в этом случае снизится иммуногенность вакцины и эффективность иммунизации. Поэтому разработка способов повышения иммуногенности живых вакцин, в том числе при снижении иммунизирующей дозы, с помощью неспецифических факторов остается актуальной задачей.

Известен способ повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV путем 20-кратного пассирования (продолжительность одного пассажа 24 ч) субкультуры Y. pestis EV на агаре Хоттингера (при 28°С, рН 7.2), через монослойную культуру перитонеальных макрофагов морских свинок. Макрофаги получали посредством промывания брюшной полости животных 199 средой, содержащей гепарин и сыворотку человека (20%) (Авторское свидетельство на изобретение SU №1249939, МПК C12Q 1/00, Опубликовано: 15.03.1987). Недостатком данного способа являются его трудоемкость, длительность и сложность в создании стандартных условий на каждом этапе.

Известен способ повышения иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба, который предусматривает выращивание лиофилизированной культуры вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ 1 генерации in vitro на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2 ± 0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония в конечной концентрации 60 мкг/мл при температуре 28°С в течение 48 часов. (Патент РФ на изобретение №2727258, МПК A61K 39/02, C12N 1/20, опубл. 21.07.2020, Бюл. №21). Данный способ позволяет получить вакцинный штамм чумного микроба с высокой иммуногенностью, но при этом реактогенность вакцины остается высокой. Вместе с тем, оптимальное течение вакцинального процесса зависит не только от иммуногенности живой вакцины, но и от реактогенности. Одним из ключевых факторов, ассоциированных с патологическими реакциями живых вакцин, является накопление активных форм кислорода (АФК). Повышение уровня АФК может привести к активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и развитию аллергических и воспалительных реакций. В случае осложнения вакцинального процесса, антиоксидантная система макроорганизма не справляется с накопившимися АФК и развивается интоксикация, которая может привести к формированию иммунодефицитных состояний (Афанасьева Г.А. Чеснокова Н.П. О патогенетической значимости активации процессов липопероксидации в механизмах нарушения реологических свойств крови при экспериментальной чумной интоксикации, индуцируемой фракцией FII вакцинного штамма EV Y. pestis II, Вестник Рос. акад. мед. наук. 2009; 2: 14-18). Привнесение в вакцинальный процесс неспецифических факторов, способных корригировать иммунный и метаболический статус, позволит уменьшить дозу живой вакцины, и, таким образом, снизить ее реактогенность.

Известен способ повышения иммуногенности живых вакцин из rs (sr) штаммов бруцелл, который заключается в том, что используют вакцины из штаммов 82 Brucella abortus и 75/79-АВ Brucella abortus, находящихся в RS-(SR) форме в сочетании с иммуномодулятором иммунофаном. При этом иммунофан вводят одновременно с вакциной в дозе 0,3-0,4 мл на морскую свинку. Способ повышает специфический бруцеллезный иммунитет у животных в 2 раза и через 6 месяцев сохраняет иммуногенность вакцинного препарата до 100% (Патент РФ №2391999, МПК A61K 38/00, A61K 39/10, опубл. 20.06.2010, №17).

Известен способ повышения иммуногенности живой чумной вакцины, включающий введение в краевую вену уха животного (морские свинки) живой чумной вакцины EV в дозе 10⁶ м.к. с одновременным внутривенным введением полиоксидония (0,2 мг/кг в 0.5 мл 0.85% растворе натрия хлорида) или введение животным (морские свинки) живой чумной вакцины EV (10⁶ м.к.) с одновременным в/в введением беталейкина (0,5 мкг). (Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Тугамбаев Т.И., Мельникова Н.Н., Адамбеков Д.А. Иммуномодуляция, как способ повышения иммуногенности живой чумной вакцины. Вестник КГМА имени И.К. Ахунбаева, 2015, №3. - С. 95-97). Однако данный способ недостаточно эффективен, т.к. иммунизация морских свинок живой чумной вакциной EV в дозе 10⁶ м.к. в сочетании с одновременным введением полиоксидония или беталейкина защищает 90,6% экспериментальных животных от заражения вирулентным штаммом Y. pestis 231. Кроме того, для иммунизации используется чумная вакцина Y. pestis EV в высокой дозе - 10⁶ м.к., а это повышает реактогенность вакцины.

Среди соединений, способных повышать антиоксидантный и противовоспалительный потенциал организма, особое место занимают селеноорганические соединения (Юрьева О.В., Дубровина В.И., Пятидесятникова А.Б. Перспективы использования синтетических селенорганических соединений для коррекции метаболического и иммунного статуса при вакцинальных процессах, вызванных живыми аттенуированными вакцинами против особо опасных инфекций. Acta Biomedica Scientifica. 2021;6(3): 60-69.). Антиоксидантная и противовоспалительная активность селена (Se) хорошо изучена. Вместе с тем, последние исследования показали, что некоторые селенорганические соединения обладают иммунотропными свойствами (Полубояринов П.А., Елистратов Д.Г., Швец В.И. Метаболизм и механизм токсичности селенсодержащих препаратов, используемых для коррекции дефицита микроэлемента селена. Тонкие химические технологии. 2019; 14(1): 5-24.). Препарат Se повышал выработку антител в организме при вакцинации против гриппа у пожилых людей (Avery JC, Hoffman PR. Selenium, Selenoproteins, and immunity. Nutrients. 2018; 10 (9): 1203. doi: 10.3390/nu10091203). Наночастицы Se (SeNPS) совместно с поверхностным антигеном гепатита В индуцировали устойчивое повышение уровня цитокинов Th1 и интерферона-γ (IFN-γ) у мышей. Совместное введение Se с противодифтерийной вакциной оказывало положительное влияние на образование титров антител против дифтерии, чем повышало эффективность самой вакцины (Farhoudi R, Shahverdi AR. Oral administration of synthetic selenium nanoparticles induced robust Th1 cytokine pattern after HBs antigen vaccination in mouse model. J Infect Public Health. 2017; 10 (1): 102-109).

Однако многие из селенсодержащих соединений обладают узким диапазоном между терапевтической и токсичной дозами. Поэтому продолжается поиск соединений, которые, обладая высокой иммунотропной активностью, наименее токсичны, и определение их дозы для применения.

В лаборатории халькогенорганических соединений Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН впервые синтезирован 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромид (соединение 974zh, препарата 974zh).

Синтез 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромида (974zh): раствор пиридина (2 г., 25 ммоль) в 5 мл ацетонитрила прикапывали к раствору 2,6-дибром-9-селенобицикло[3.3.1]нонана (3.48 г., 10 ммоль) в 25 мл ацетонитрила. Реакционная смесь перемешивалась в течение 6 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли на роторном испарителе, остаток промывали хлороформом (3×5 мл), сушили в вакууме до постоянной массы. Продукт 2,6-дипиридиноний-9-селенобицикло[3.3.1]нонана дибромид (соединение 974zh), бесцветные кристаллы, чистота более 98%.

¹Н (400.1 MHz), ¹³С (100.6 MHz) 1-10% раствор в D₂O.

¹Н NMR (400 MHz, D₂O) δ 2.34 - 2.41 (м, 2Н, SeCHCH₂), 2.54-2.59 (м, 4Н, BrCHCH), 3.07-3.17 (м, 2Н, BrCHCH), 3.41-3.44 (м, 2Н, SeCH), 5.83-5.89 (м, 2Н, BrCH), 8.09 (т, 4Н, m-H_pyr), 8.54 (т, 2Н,р-H_pyr), 9.02 (д, 4Н, o-H_pyr). ¹³С NMR (100 MHz, D₂O) δ 25.57, 28.19, 29.37, 74.60, 128.68, 143.15, 146.46. Найдено: С, 42.84; Н, 4.41; Br, 31.72; N, 5.54; Se, 15.49. Вычислено: C₁₈H₂₂Br₂N₂Se: С, 42.80; Н, 4.39; Br, 31.64; N, 5.55; Se 15.63.

Было установлено, что соединение 974zh не проявляет токсичность в дозе 40 мг/1 кг живой массы белых лабораторных мышей (Юрьева О.В., Дубровина В.И., Потапов В.А., Мусалов М.В., Старовойтова Т.П., Иванова Т.А., Громова А.В., Шкаруба Т.Т., Балахонов СВ. Влияние синтетического селеноорганического препарата на степень патоморфологических изменений органов белых мышей, иммунизированных туляремийной и бруцеллезной вакцинами. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019; 168(7): 76-79). Низкая токсичность препарата 974zh, очевидно обусловлена низкой биодоступностью Se в его составе.

Известен способ повышения иммуногенных свойств вакцинного штамма Y. pestis EV, включающий иммунизацию животного (белая мышь) подкожно в область бедра Y. pestis EV в количестве 10³ микробных клеток (м.к.) и двукратное введение синтетического селеноорганического соединения 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромида на 1-ые и 14-е сутки в дозе 2.5 мг/кг. Через 21 сут. после иммунизации, животных инфицировали штаммом Y. pestis 3560 (LD50 4 м.к.). Наблюдение проводили на протяжении 21 суток. По окончании эксперимента рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ, сут.) инфицированных животных и процент выживших животных. (Юрьева О.В., Дубровина В.И., Потапов В.А., Мусалов М.В., Старовойтова Т.П., Иванова Т.А., Шкаруба Т.Т., Якимов В.А., Балахонов С.В. Результаты исследования иммунотропных свойств экспериментального синтетического селенорганического соединения. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020; 169(1): 45-48). Продолжительность жизни после заражения вирулентным штаммом в группе животных, иммунизированных Y. pestis EV в дозе 10³ м.к. совместно с соединением 974zh (2,5 мг/кг веса животного), введенным двукратно (в 1-е сутки, одновременно с Y. pestis EV, и на 14-е сутки) составила 15 суток. Таким образом, следует, что данный способ недостаточно повышает иммуногенную и протективную активность вакцинного штамма Y. pestis EV. Кроме того, используется достаточно высокая доза селен содержащего соединения 974zh.

Технический результат предлагаемого изобретения - повышение иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма Y. pestis EV при уменьшении дозы синтетического селенорганического соединения 974zh.

Указанный технический результат достигается тем, что осуществляют иммунизацию животного (белая мышь) подкожно в область бедра Y. pestis EV в количестве 10³ микробных клеток (м.к.) однократно и двукратное введение синтетического селенорганического соединения 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромида (соединение 974zh). Первое введение соединения 974zh осуществляют в дозе 2.0 мг/кг одновременно с введением вакцинного штамма Y. pestis EV подкожно в другое бедро, а на 5-ые сутки после введения вакцинного штамма Y. pestis EV повторяют введение соединения 974zh в дозе 2.0 мг/кг.

Предлагаемый способ повышения иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма Y. pestis EV можно использовать при проведении экспериментальных исследований по изучению пато- и иммуногенеза чумы, в том числе при изучении иммуномодуляции на протективную активность живой чумной вакцины в модельных опытах на экспериментальных животных, разработке способов повышения эффективности противочумной вакцинации на модели экспериментальных животных. Предлагаемый способ также может быть использован как основа для разработки способов метаболической и иммунной коррекции вакцинального процесса, вызванного вакцинным штаммом чумного микроба Yersinia pestis EV НИИЭГ.

Способ осуществляется следующим образом: белым лабораторным мышам, иммунизированным вакцинным штаммом чумного микроба Yersinia pestis EV (вакцина чумная живая на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ) в дозе 10³ микробных клеток, вводят дважды (в 1-ые сутки, одновременно с введением Yersinia pestis EV, и на 5-ые сутки после введения Yersinia pestis EV) синтетическое селенорганическое соединение 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромид (соединение 974zh). Животных иммунизировали подкожно в область правого бедра, а соединение 974zh вводили подкожно в область левого бедра из расчета 2 мг соединения 974zh на кг веса животного.

В работе использовали сертифицированных белых мышей. Работа с животными проводилась в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях и «Правил надлежащей лабораторной практики», утвержденных приказом Министерства здравоохранения №199н от 01.04.2016 года.

Дозу соединения 974zh для введения рассчитывали согласно весу животного, взятого в эксперимент. Для введения соединения 974zh готовили его раствор в ЗФР в концентрации 5 мг/50 мл. Животному вводили объем раствора, содержащий эквивалент выбранной дозы.

Эффективность предлагаемого способа оценивали следующим образом: через 21 сутки после иммунизации, животных заражали вирулентным референтным штаммом Y. pestis 3560 (дозой LD₅₀ - 100 м.к.). Наблюдение проводили на протяжении 21 суток. По окончании эксперимента рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ) и/или показатель протективности (ПВЖ - процент выживших животных после их заражения вирулентным штаммом Y. pestis 3560).

Пример 1. Лабораторных животных (белых мышей) разделили на 7 групп: I - контрольная (12 мышей)) - мышам вводили в бедро 0,9% NaCl (физиологический раствор); II (10 мышей) - мышам вводили Y. pestis EV в дозе 10⁴ м.к.; III (10 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ м.к.; IV (10 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ м.к. + 974zh в расчете 1,0 мг/кг веса животного (в 1-ые и на 5-ые сутки); V (10 мышей) - вводили Y pestis EV 10³ + 974zh 1,5 мг/кг (в 1-е и на 5-е сутки); VI(12 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ + 974zh 2,0 мг/кг (в 1-ые и на 5-е сутки); VII (12 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ + 974zh 2,5 мг/кг (в 1-ые и на 5-ые сутки). Через 21 сутки после иммунизации животных заражали вирулентным референтным штаммом Y. pestis 3560 (дозой LD₅₀ - 100 м.к.). Наблюдение проводили на протяжении 21 суток. По окончании эксперимента рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ) (Таблица 1) и показатель протективности (ПВЖ - процент выживших животных после их заражения вирулентным штаммом Y. pestis 3560) (Таблица 2).

Как видно из таблицы 1, после заражения вирулентным штаммом средняя продолжительность жизни в группе II (лабораторных мышей иммунизировали Y. pestis EV в дозе 10³ м.к) составила 9,5±0,8 суток. СПЖ в этой группе превышала контрольное значение (I группа) - 4,2±0,7 суток. СПЖ животных, иммунизированных Y. pestis EV в стандартной дозе 10⁴ м.к. (II группа) составила 18,2±0,6 суток. Очевидно, что десятикратное уменьшение иммунизирующей дозы Y. pestis EV привело к снижению протективной активности вакцинного штамма чумного микроба.

Минимальная доза соединения 974zh (1,0 мг/кг) практически не влияла на протективную активность вакцинного штамма Y. pestis EV (в дозе 10³ м.к.), поскольку СПЖ составила 9,8±0,4 суток по сравнению с эталонной (18,2±0,6 суток). В дозе 1,5 мг/кг, соединение 974zh, введенное совместно с Y. pestis EV 10³ м.к., повышало СПЖ до 13,5±0,4 суток. Введение 2,0 мг/кг соединения 974 zh повышало СПЖ иммунизированных Y. pestis EV (доза 10³ м.к.) животных до 18,8±0,5 суток. Повышение дозы соединения 974zh до 2,5 мг/кг практически не влияло на дальнейшее повышение протективной активности Y. pestis EV 10³ м.к. Таким образом, двукратное введение соединения 974 zh в дозе 2,0 мг/кг является оптимальным для повышения СПЖ зараженного животного, а также, повышения протективной активности вакцинного штамма чумного микроба.

Показатель протективности после заражения вирулентным штаммом Y. pestis 3560 белых лабораторных мышей, иммунизированных Y. pestis EV 10³ м.к. совместно с синтетическим селеноорганическим препаратом 974zh, представлен в таблице 2.

Как видно из данных таблицы 2, после заражения вирулентным штаммом протективность в III группе (животные иммунизированы Y. pestis EV в дозе 10³ м.к) составила 60%, т.е. снизилась в 1,7 раза по сравнению с показателем протективности у животных II группы, иммунизированных Y. pestis EV в стандартной дозе 10⁴ м.к. Очевидно, что десятикратное уменьшение иммунизирующей дозы Y. pestis EV привело к снижению протективной активности живой противочумной вакцины. Минимальная доза соединения 974zh (1,0 мг/кг) практически не влияла на протективную активность вакцинного штамма Y. pestis EV 10³ м.к.(ПП составил 60%). В дозе 1,5 мг/кг, введенный совместно с Y. pestis EV 10³ м.к., повышал ПП до 70%. Введение 2,0 мг/кг соединения 974 zh повышало ПП иммунизированных Y. pestis EV 10³ м.к. животных до 100%.

Таким образом, синтетическое селенорганическое соединение 974zh повышает иммуногенную и протективную активность живой противочумной вакцины Y. pestis EV при уменьшении вводимой дозы до 10³ м.к. Из исследованного диапазона выявлена оптимальная доза для введения соединения 974zh - 2,0 мг/кг (двукратно, в 1-ые и 5-ые сутки).

Пример 2. Для определения оптимальных сроков введения соединения 974zh мышам были проведены следующие исследования: лабораторных животных разделили на 7 основных групп: I группа - контрольная (12 мышей) - мышам вводили в правое бедро 0,9% NaCl (физиологический раствор); II группа (10 мышей) - мышам вводили Y. pestis EV в дозе 10⁴ м.к.; III группа (10 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ м.к.; IV группа (10 мышей) - вводили Y. pestis EV 10₃ м.к. + 974zh в расчете 1,0 мг/кг веса животного (в 1 и на 5 сутки); V группа (10 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ + 974zh 1,5 мг/кг (в 1 и на 5 сутки); VI группа (48 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ + 974zh 2,0 мг/кг в разные сроки. Группа разделена на подгруппы по сроки введения соединения 974zh: 1, 3 сутки (12 мышей); 1, 5 сутки (12 мышей); 1, 7 сутки (12 мышей); 1, 14 сутки (12 мышей); VII группа(48 мышей) - вводили Y. pestis EV 10³ + 974zh 2,5 мг/кг в разные сроки. Группа разделена на подгруппы по сроки введения соединения 974zh: 1, 3 сутки (12 мышей); 1, 5 сутки (12 мышей); 1, 7 сутки (12 мышей); 1, 14 сутки (12 мышей). Через 21 сутки после иммунизации животных заражали вирулентным референтным штаммом Y. pestis 3560 (дозой LD₅₀ - 100 м.к.). Наблюдение проводили на протяжении 21 суток. По окончании эксперимента рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ) и/или показатель протективности (ПВЖ - процент выживших животных после их заражения вирулентным штаммом Y. pestis 3560).

В таблице 3 представлены результаты определения оптимального режима введения соединения 974zh.

Из данных таблицы 3 следует, что наиболее оптимальным сроком для повторной инокуляции соединения 974zh в дозе 2,0 мг/кг являются 5-ые сутки.

В таблице 4 представлен показатель протективности после заражения вирулентным штаммом Y. pestis 3560 белых лабораторных мышей, иммунизированных Y. pestis EV 10³ м.к. совместно с синтетическим селеноорганическим соединением 974zh в зависимости от сроков введения соединения 974zh.

Как видно из данных таблицы 4, минимальная доза соединения 974zh (1,0 мг/кг) практически не влияла на протективную активность вакцинного штамма Y. pestis EV 10³ м.к. (ПП составил 70%). В дозе 1,5 мг/кг соединение 974zh, введенное совместно с Y. pestis EV 10³ м.к., повышает ПП до 80%. Введение 2,0 мг/кг 974 zh повышает ПП иммунизированных Y. pestis EV 10³ м.к. животных до 91,7% при повторном введении 974 zh на 3 сутки и до 100% при повторном введении этого препарата на 5 сутки. Повышение дозы препарата до 2,5 мг/кг не влияло на дальнейшее повышение протективной активности Y. pestis EV 10³ м.к. Следовательно, сочетанное применение живой чумной вакцины EV в дозе 10³ м.к. с соединением 974zh повышает ее иммуногенные (протективные) свойства в модельных опытах по заражению белых мышей. Введение соединения 974zh в 1-ые сутки (одновременно с введением Y. pestis EV) и повторное введение соединения 974zh на 5 сутки после иммунизации существенно повышает защитный эффект живой чумной вакцины EV при заражении экспериментальных животных вирулентным штаммом Y. pestis 3560 (протективность составляет 100%).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить иммуногенную и протективную активность вакцинного штамма Y. pestis EV. Предлагаемые режимы способа (использование синтетического селенорганического соединения 974zh, дозы, режимы его введения) позволяют повысить иммуногенную и протективную активность живой противочумной вакцины на основе аттенуированного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, при этом уменьшить ее дозу и тем самым снизить реактогенность.

Изобретение относится к медицинской биохимии, патофизиологии и иммунологии и может быть использовано для повышения иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV. Предложен способ повышения иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма чумного микроба. Белым лабораторным мышам, иммунизированным Y. pestis EV в дозе 10³ микробных клеток, вводят двукратно в 1-е сутки, одновременно с введением вакцины, и на 5-е сутки синтетическое селенорганическое соединение 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромид подкожно в область бедра из расчета 2 мг /кг веса животного. Изобретение позволяет снизить дозу чумной живой вакцины Y. pestis EV НИИЭГ и компенсировать ее реактогенность. 4 табл., 2 пр.

Способ повышения иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма чумного микроба, включающий иммунизацию белых лабораторных мышей Y. pestis EV в дозе 10³ микробных клеток и двукратное введение синтетического селеноорганического соединения 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромида, отличающийся тем, что 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромид первый раз вводят одновременно с введением Y. pestis EV, а затем повторяют введение на 5 сутки после введения Y. pestis EV, причем 2,6-дипиридиний-9-селенабицикло[3.3.1]нонан дибромид вводят из расчета 2 мг/кг веса животного.