ШТАММ БАКТЕРИЙ FRANCISELLA TULARENSIS ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ Советский патент 2006 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии, и может быть использовано для профилактики туляремийной инфекции.

Известен вакцинный штамм возбудителя туляремии голарктического подвида, который используется в качестве живой вакцины 15 НИИЭГ (1). Этот вакцинный штамм Francisella tularensis был получен путем длительных пересевов исходного родительского вирулентного штамма на искусственной питательной среде.

Однако известный вакцинный штамм 15 НИИЭГ, несмотря на высокую иммуногенность в отношении штаммов голарктического подвида, обладает рядом недостатков. Он характеризуется нестабильностью при хранении на искусственных питательных средах, так как теряет остаточную вирулентность (для белых мышей) и иммуногенность (диссоциация в R-форму). Недостатком является проблематичность повторного выделения такого штамма при утрате иммуногенности исходной родительской культурой и отсутствие маркеров при его идентификации. Также важным недостатком штамма 15 является невозможность создания полноценного иммунитета к заражению возбудителем туляремии неарктического подвида (2).

Целью изобретения является получение аттенуированного штамма Francisella tularensis неарктического подвида, обладающего высокой иммуногенностью.

Поставленная цель достигнута путем селекции стрептомицинрезистентных мутантов туляремийного микроба.

Предлагаемый штамм В 399 A-CoLe Str^r 2500/к получен отбором стрептомицинрезистентных мутантов туляремийного микроба штамма В 399 A-CoLe неарктического подвида с последующим выделением из них стрептомицинзависимого (условно) мутанта рассевом последнего на среде без стрептомицина и отбором по морфологии колониеобразующих единиц "крупного" типа.

Пример 1

Исходный штамм В 399 A-CoLe Fr. Tularensis subsp. tularensis высоковирулентный для белых мышей, морских свинок и домашних кроликов (минимальная летальная доза - единичные микробные клетки при подкожном введении) высевают на чашки с цистеинсодержащим сердечным агаром (СНА, Дифко) с добавлением гемоглобина (Дифко), рН от 6,8 до 7,0, содержащим 200 мкг/мл стрептомицина. Концентрация исходной культуры - 3·10¹⁰ микробных клеток (мк). (Здесь и далее концентрация микробных клеток (м.к.) в 0,85%-ном растворе NaCl рассчитывается по оптическому стандарту мутности (10 единиц) ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Выросшие мутанты рассевают дважды на селективной среде с антибиотиком. Полученные стрептомицинрезистентные мутанты (уровень устойчивости к стрептомицину - 2500 мкг/мл) высевают на среду без антибиотика и отбирают мутанты - "условно" зависимые от стрептомицина. Последние характеризуются более поздним сроком роста (4 суток), чем стрептомицинрезистентные (2 суток) при посевной дозе 10⁴-10⁶ мк/мл на среде без антибиотиков; имеют голубовато-серый цвет культуры (обычные Str^r-мутанты имеют беловатый цвет). "Условно" зависимые от стрептомицина мутанты пересевают на среду без антибиотика и отбирают колониеобразующие единицы "крупного" типа.

Полученный штамм Fr. tularensis В 399 A-CoLe Str^r 2500/к, предлагаемый для приготовления живой вакцины против туляремии, хранится в музее культур лаборатории туляремии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (коллекционный номер 97).

Штамм Fr. Tularensis В 399 А-CoLe Str^r 2500/к, полученный способом, описанным в примере 1, характеризуется следующими свойствами.

Морфологические и тинкториальные признаки

Бактерии штамма - грамотрицательные, неподвижные, не образующие спор, очень мелкие коккобактерии. В мазках из культуры с плотной среды обнаруживается обильная слизь, которая окрашивается фуксином (по Граму), как и бактерии, в розовый цвет.

Культуральные признаки

На свернутой желточной среде Мак-Коя рост появляется через 1 сутки (при посеве петлей), имеет вид бесцветного нежного налета слегка слизистой консистенции. На кровяном агаре Емельяновой и на среде СНА с гемоглобином (Дифко) приживаются единичные бактерии, посеянные в виде взвеси в 0,85%-ном растворе NaCl. Колониеобразующие единицы становятся заметными на чашках через 3-4 суток при посевной дозе 10² и 10³ мк/мл, имеют голубовато-беловатый цвет, круглые, с ровными краями, выпуклые, гладкие, размером 1-1,5 мм в диаметре.

Физико-биохимические признаки

Оптимальный рост при температуре 37°С и рН от 6,8 до 7,2 факультативный анаэроб. Ферментирует глицерин и цитруллин. Высокочувствителен к эритромицину.

Агглютинабельность

Обладает способностью агглютинироваться специфической туляремийной лошадиной сывороткой до титра 1:2560-1:5120 по типу стойкой V₁-агглютинации.

Штамм В 399 A-CoLe Str^r 2500/к проверен на остаточную вирулентность, иммуногенность, безвредность и стабильность основных биологических свойств.

Пример 2.

Остаточная вирулентность для белых мышей

Белых мышей подкожно заражают штаммом В 399 А-CoLe Str^r 2500/к в дозах 1, 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ и 10⁶ мк. LD₅₀ штамма для белых мышей (рассчитанная по методу Кербера в модификации Ашмарина) с величиной средней ошибки = 355±4 мк (таблица).

Иммуногенность для белых мышей

35 белых мышей подкожно иммунизируют 7 дозами вакцинного штамма от 1 до 10⁶ мк (по 5 животных на дозу) и через 28 суток заражают (подкожно) 10³ ДсL вирулентного штамма В 399 A-CoLe оставшихся в живых животных. Штамм создает иммунитет у белых мышей (таблица) - выжило 93% животных от заражения вирулентной культурой.

Для сравнения иммуногенности полученного штамма с используемым в настоящее время 15 НИИЭГ вакцинным штаммом проведены опыты на двух группах белых мышей. Каждую группу иммунизируют 10 м.к. штаммов В 399 А-CoLe Str^r 2500/к и 15 НИИЭГ (соответственно 36 и 30 белых мышей). Оставшихся в живых (соответственно 21 и 26) иммунизированных белых мышей заражают подкожно (на 21-е сутки) летальными дозами вирулентного штамма В 399 A-CoLe: 10³, 2,5·10³, 5·10³, 7,5·10³ и 10⁴ м.к. Процент защиты белых мышей для штамма В 399 A-CoLe Str^r 2500/к составляет 95 (82÷100), а для штамма 15 НИИЭГ-69 (59÷85), что свидетельствует о высокой иммуногенности полученного штамма против заражения вирулентным штаммом туляремийного микроба неарктического подвида. Различия между иммуногенностью вакцинного штамма В 399 A-CoLe Str^r 2500/к и 15 НИИЭГ в опытах на белых мышах статически достоверны (Р=0,95).

Стабильность основных биологических свойств

Проверена тремя пассажами штамма через организм белых мышей с последующим испытанием биологических свойств.

Штамм обладает стабильной иммуногенностью - после трех пассажей через организм белых мышей выживает 100% иммунизированных белых мышей (таблица). LD₅₀ пассированного штамма составляет 112 м.к. с величиной средней ошибки ±3,5 мк (таблица).

Иммунизация 43 белых мышей 10 м.к. штамма В 399 А-CoLe Str^r 2500/к защищает 97 (90÷100)% животных от 10 ДсL вирулентного штамма В 399 A-CoLe, а иммунизация 30 белых мышей штаммов 15 НИИЭГ, взятого в качестве контрольного, - 57 (39÷74)%. Разница в полученных результатах (проценты выживших животных) статистически достоверна (Р=0,95). Эти данные также свидетельствуют о стабильной иммуногенности вакцинного штамма В 399 A-CoLe Str^r 2500/к.

После анимализации штамм сохраняет резистентность к стрептомицину (2500 мкг/мл).

Иммуногенность для домашних кроликов

10 домашних кроликов иммунизируют дозой 2·10⁸ мк вакцинного штамма В 399 A-CoLe Str^r 2500/к. Через 28 суток после иммунизации кроликов заражают подкожно 10⁴ ДсL вирулентного штамма В 399 A-CoLe. Срок наблюдения - 26 суток.

В качестве контроля используют вакцинный штамм 15 НИИЭГ. 10 кроликов иммунизируют дозой 2·10⁸ м.к. и заражают подкожно такой же дозой вирулентного штамма В 399 A-CoLe в те же сроки.

Иммунизация вакцинным штаммом В 399 A-CoLe Str^r 2500/к защищает 100%, а вакцинным штаммом 15 НИИЭГ - 80% животных.

Дополнительно у иммунизированных животных изучают уровень антител в сыворотке крови (в реакции агглютинации) с туляремийным диагностикумом до заражения вирулентным штаммом (26-е сутки после иммунизации). Средние титры антител у кроликов, иммунизированных В 399 A-CoLe Str^r 2500/к и 15 НИИЭГ (контроль) составили 1:640 и 1:320 (соответственно). Различия в титрах статически достоверны при Р=0,95.

Безвредность

Штамм авирулентен при подкожном заражении дозой 2·10⁸ м.к. 14 домашних кроликов (с массой тела 3-3,5 кг): все подопытные животные выживают при указанной дозе.

Таблица
Остаточная вирулентность и иммуногенность вакцинного штамма В 399 A-CoLe Str^r 2500/к в опытах на белых мышахВакцинный штаммДоза заражения в м.к.Остаточная вирулентность пало/всего*)Иммуногенность выжило/всего **)1234 
 
В 399
A-CoLe
Str^r 2500/к
 10⁶4/51/110⁵3/4***)1/110⁴3/52/210³2/53/3l0²4/51/1102/53/311/53/4

Продолжение табл.1234 
В 399
A-Cole
Str^r 2500/к
(анимализи-
рованный)10⁶5/5-10⁵5/5-10⁴4/51/110³1/43/310²4/51/1101/54/412/53/3Примечание: *) в числителе - число животных, павших от туляремии; в знаменателе - общее количество животных в опыте;
**) исключены животные, павшие от посторонних причин;
***) в числителе количество выживших; в знаменателе - общее количество животных в опыте.

Подкожное введение 6 морским свинкам (с массой тела около 500 г) 10⁹ м.к. штамма не вызывает гибели подопытных животных.

Вакцинный штамм В 399 A-CoLe Str^r 2500/к, предлагаемый для приготовления живой вакцины против туляремийных вирулентных штаммов неарктического подвода, соответствует требованиям, предъявляемым в настоящее время к вакцинным штаммам (бюлл. ВОЗ, 1980): аттенуирован, обладает антигенной активностью, остаточной вирулентностью для белых мышей, иммуногенностью для белых мышей и домашних кроликов, безопасен (безвреден), стабилен по основным биологическим признакам, генетически охарактеризован, что дает возможность повторного получения вакцинного штамма, маркирован. Последнее позволяет дифференцировать его от штаммов естественного происхождения. Предлагаемый вакцинный штамм имеет высокую иммуногенность против заражения вирулентным штаммом неарктического подвида.

Литература

1. Гайский Н.А. - Ирк. противочум. ин-т, 1944, изд.1.

2. Олсуфьев Н.Г. и Емельянова О.О., Ж. гиг. эпид., микр., иммун., 1963, УП, с.41-49.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству вакцинных препаратов. Согласно изобретению получен аттенуированный штамм Fr. tularensis неарктического подвида, обладающего высокой иммуногенностью. Штамм получен отбором стрептомицинрезистентных мутантов туляремийного микроба штамма В 399 A-CoLe неарктического подвида. Полученный штамм Fr. tularensis В 399 A-CoLe Str^r 2500/K депонирован в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи под №97. Использование штамма для приготовления живой вакцины против туляремийных вирулентных штаммов неарктического подвида обеспечивает хороший защитный эффект благодаря его высокой иммуногенности. 1 табл.

Штамм бактерий Francisella tularensis НИИЭМ им. Гамалеи В 399 A-Cole Str^r 2500/к для приготовления живой вакцины против туляремийной инфекции.