Штамм бактерий Corynebacterium pseudotuberculosis, предназначенный для получения моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/05 C12R1/20 

Область техники

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, иммунологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве и контроле инактивированных иммунобиологических средств в виде моно- или поливалентных препаратов, предназначенных для профилактики инфекции мелкого рогатого скота, вызванной Corynebacterium pseudotuberculosis.

Уровень техники

Казеозный лимфаденит или псевдотуберкулез (CLA) – хроническое, высококонтагиозное, зооантропонозное заболевание бактериальной этиологии. Характеризуется образованием абсцессов во внутренних органах и лимфатических узлах, как поверхностных, так и внутренних [Paule, B.J.A., Meyer, R., Mouracosta, L.F., Bahia, R.C., Carminati, R., Regis, L.F., Vale, V.L.C., Freire, S.M., Nascimento, L., Schaer, R., Azevedo, V., 2004. Three phase partitioning as an efficient method for extraction concentration of immunoreactive excreted secreted proteins of Corynebacterium pseudotuberculosis. Protein Expr. Purif. 34, 311–316]. При инфицировании животные теряют живую массу, снижается плодовитость и продуктивность, что приносит значительный экономический ущерб [Al-Gaabary M. H., Osman S. A., Oreiby A. F. Caseous lymphadenitis in sheep and goats: Clinical, epidemiological and preventive studies //Small Ruminant Research. – 2009. – Т. 87. – №. 1-3. – С. 116-121].

Заболевание поражает млекопитающих, в большей степени овец и коз. Также в уровне техники описаны случаи возникновения болезни у крупного рогатого скота, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, лам, альпак. Кроме того, известно, что заболеванию также подвержены люди [Bartolomé J, Roca MJ, Marcote E, Moreno R. Adenitis por Corynebacterium pseudotuberculosis en un pastor [Corynebacterium pseudotuberculosis adenitis in a shepherd]. Med Clin (Barc). 1995 May 13;104(18):699-701. Spanish. PMID: 7769881].

Возбудителем казеозного лимфаденита является Corynebacterium pseudotuberculosis. Это грамположительная плеоморфная палочка, форма которой варьируется от коккоподобной до нитевидной. Размер клеток небольшой – 0,5-0,6 х 1,0-3,0 мкм. Спор и капсул не образует, является факультативным анаэробом.

Существует два биовара: биовар Ovis ассоциирован главным образом с овцами и козами, и биовар Equi, который чаще всего поражает лошадей, вызывая язвенный лимфангит дистальных отделов конечностей, вентральные абсцессы грудной клетки и брюшной полости [Biberstein EL, Knight HD, Jang S. [1971] Two biotypes of Corynebacterium pseudotuberculosis. Vet Rec 89: 691–692; Connor KM., Quire M, Baird G et al. [2000] Characterization of United Kingdom isolates of Corynebacterium pseudotuberculosis using pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 38: 2633–2637].

Для лечения единичных случаев возможно дренирование или удаление пораженного лимфатического узла, при этом, животное должно находиться на карантине на время лечения. Однако процедура может оказаться неэффективной, поскольку есть вероятность инфицирования внутренних органов или лимфоузлов, к которым доступ будет ограничен. Несмотря на высокую чувствительность возбудителя к антимикробным препаратам, использование антибактериальной терапии также имеет низкую эффективность, что связано с внутриклеточным расположением бактерий в организме. В дополнении к низкой эффективности, применение антибиотиков окажется экономически неоправданным, учитывая характерное для CLA массовое поражение животных в стаде [Baird, G.J., Fontaine, M.C., 2007. Corynebacterium pseudotuberculosis and its role in ovine caseous lymphadenitis. J. Comp. Pathol. 137, 179–210]. Более того, указанные выше подходы не могут принципиально предотвратить и устранить заражение возбудителем.

Ключевым моментом в борьбе с инфекцией является вакцинопрофилактика. Для этого можно использовать различные виды вакцин, которые различаются своей эффективностью. По ряду исследований, живые вакцины, созданные на основе аттенуированных штаммов, оказались малоэффективны при применении их овцам из-за неспособности стимулировать специфические лимфоциты, секретирующие IFN-γ, и слабой индукции IgG [Hodgson AL, Tachedjian M, Corner LA, et al. Protection of sheep against caseous lymphadenitis by use of a single oral dose of live recombinant Corynebacterium pseudotuberculosis. Infect Immun 1994; 62:5275–80; Piontkowski MD, Shivvers DW. Evaluation of a commercially available vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis for use in sheep. J Am Vet Med Assoc 1998; 212:1765–8; Fontaine MC, Baird G, Connor KM, et al. Vaccination confers significant protection of sheep against infection with a virulent United Kingdom strain of Corynebacterium pseudotuberculosis. Vaccine 2006; 24:5986–96]. Таким образом, живые вакцины не имели особого успеха и широкого распространения.

Более значительные результаты имели инактивированные бактериальные вакцины. Исследование, проведенное P.L. Menzies et al. в полевых условиях, показало высокую эффективность от применения цельноклеточной вакцины – у коз и овец наблюдалась значительная защита от развития абсцессов легких, уровень заболеваемости в опытной группе был достоверно ниже, а уровень специфических антител – выше. Хотя вакцина и не может обеспечить абсолютную защиту от заражения, она способствует значительному снижению смертности инфицированных животных [Menzies PI, Muckle CA, Brogden KA, et al. A field trial to evaluate a whole cell vaccine for the prevention of caseous lymphadenitis in sheep and goat flocks. Can J Vet Res 1991; 55:362–6; Eggleton DW, Middleton HD, Doidge CV, et al. Immunisation against ovine caseous lymphadenitis: comparison of Corynebacterium pseudotuberculosis vaccines with and without bacterial cells. Aust Vet J 1991; 68:317–9].

Ввиду развития и распространения резистентности бактерий к антибиотикам и дезинфицирующим средствам, а также отсутствия доступных иммунобиологических средств, борьба с псевдотуберкулезом мелкого рогатого скота часто малоэффективна. Хороший эффект возможно получить при использовании средств специфической профилактики инфекций. На решение этой задачи направленно данное изобретение.

В настоящее время известен ряд штаммов Corynebacterium pseudotuberculosis, предназначенных для получения иммуногенных композиций и профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота.

Штаммы C. pseudotuberculosis ВГНКИ N 74 R – ДЕП, ВГНКИ N 146S ДЕП, ВГНКИ N 70 R – ДЕП, ВГНКИ N 209R-ДЕП предложены в качестве референтных и для изготовления диагностических препаратов при казеозном лимфадените овец. Аллерген, приготовленный из представленных штаммов, способен при введении больному животному вызывать воспаление в месте инъекции. У здоровых животных реакция не возникает, таким образом, при использовании заявленных штаммов в составе диагностикумов существует возможность выявлять инфицированных особей в стаде [RU2051964; RU2051965; RU2051966; RU2053295].

Представленные штаммы были заявлены как антигены, входящие в состав диагностикумов, в виду чего их нельзя использовать при создании иммуногенных композиций.

Предложен штамм C. pseudotuberculosis 231 с удаленным геном, кодирующим фосфолипазу (PLD), являющуюся одним из факторов патогенности. В результате блокировки этого гена, вирулентность бактерий заметно снизилась, что позволяет рассматривать его как потенциальный компонент живых вакцин и эффективное транспортное средство для интеграции рекомбинантных антигенов. Созданный таким образом штамм демонстрирует способность активировать иммунный ответ, в то время как клинические проявления заболевания остаются невыраженными. Важно отметить, что удаление гена PLD ограничивает бактериям их потенциал для долгосрочного пребывания в организме, что в свою очередь подтверждает роль фосфолипазы в вирулентности и реакции иммунной системы. Штамм C. pseudotuberculosis 231 представляет интерес как потенциальный источник для разработки новых живых вакцин. Важно отметить, что, хотя иммунный ответ активируется в ответ на бактериальную клетку, он не обнаруживается в ответ на токсины, являющиеся продуктом деятельности гена PLD [Hodgson A. L. et al. Rational attenuation of Corynebacterium pseudotuberculosis: potential cheesy gland vaccine and live delivery vehicle //Infection and immunity. – 1992. – Т. 60. – №. 7. – С. 2900-2905.].

Таким образом, сохраняется необходимость в разработке и создании новых иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является получение нового штамма бактерии Corynebacterium pseudotuberculosis, отвечающего требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т. д. свойствам) и пригодного для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота.

Поставленная задача решается путем получения штамма Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422, депонированного во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук - ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) под номером B-1422 и предназначенного для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота.

Кроме того, настоящее изобретение включает применение штамма Corynebacterium pseudotuberculosis, депонированного во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером B-1422, для получения иммунобиологического средства, в частности моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота.

Предметом настоящего изобретения также является иммуногенная композиция для профилактики казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота, включающая профилактически эффективное количество инактивированного протективного антигена штамма по изобретению, адъювант и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В частных вариантах воплощения изобретения вспомогательное вещество представляет собой растворитель, наполнитель. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворитель выбирается независимо и представляет собой стерильный физиологический раствор, стерильную воду для инъекций, стерильный фосфатно-буферный раствор и т.д. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения вспомогательное вещество представляет собой щелочь, мертиолят натрия.

В частных вариантах воплощения изобретения адъювант выбирается независимо и представляет собой гидроксид алюминия, ПЭГ-6000, карбапол, масляный адъювант. Более конкретно масляный адъювант представляет собой адъювант марки MONTANIDE ISA 206. В некоторых частных вариантах карбапол представляет собой карбапол марки Carbopol 971Р.

Кроме того, предметом настоящего изобретения также является способ профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) у субъекта, включающий введение композиции по изобретению субъекту.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой мелкий рогатый скот. Более конкретно мелкий рогатый скот представляет собой овец, коз.

Настоящее изобретение также включает способ получения иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота, который осуществляют посредством штамма по изобретению.

Настоящее изобретение также включает применение штамма по изобретению для оценки эффективности иммуногенных композиций для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- получен новый штамм Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером B-1422 и предназначенный для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота;

- штамм по изобретению отвечает требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т. д. свойствам) и пригоден для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота;

- использование штамма по изобретению при производстве иммунобиологических средств позволит повысить уровень эпизоотического благополучия по казеозному лимфадениту (псевдотуберкулезу) мелкого рогатого скота;

- получена эффективная иммуногенная композиция на основе штамма по изобретению, которая предназначена для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота;

- разработан эффективный способ профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) у субъекта, включающий введение композиции по изобретению субъекту.

Изобретение также служит средством расширения арсенала моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней мелкого рогатого скота, обладает стабильностью, а также высокой антигенной, иммуногенной и протективной активностью.

Подробное раскрытие изобретения

Определение и термины

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «антиген» обозначает любое вещество, которое организм субъекта рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого организм может индуцировать (запускать) иммунный ответ. Это могут быть компоненты инфекционного агента, такие как, например, фрагменты белков бактерии, а также инфекционные агенты, сохранившие, хотя бы частично, присущую им структуру.

Под штаммом Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422 понимается как штамм Corynebacterium pseudotuberculosis, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером B-1422, так и полученный с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала (например, мутант, вариант), и сохраняющий все свойства исходного штамма, т.е. обладающий всеми определяющими штамм Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422 (идентифицирующими) характеристиками. В том, числе, по меньшей мере, пригодный для получения моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота.

Используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к штамму Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422 означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и химических веществ (составов), известных специалистам в данной отрасли или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.

Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у субъекта, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Субъекты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у субъектов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика — это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.

Под «профилактически эффективным количеством» подразумевается такое количество антигена штамма, вводимого или доставляемого субъекту, при котором у субъекта с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на профилактику. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида субъекта, способа введения препарата и т.п.

Термин «инактивированный протективный антиген штамма» в данном документе означает «нежизнеспособные» антигены микроорганизма, при введении которых лабораторным или целевым видам животных, способствуют образованию напряженного иммунного ответа, достаточного для обеспечения профилактического эффекта.

Термин «субъект» охватывает все виды мелкого рогатого скота, предпочтительно овец и коз, которые используют штамм и композицию по изобретению путем введения субъекту другим лицом для профилактики заболевания или медицинского состояния.

Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств бактерий и являются приемлемыми для использования в ветеринарии (безопасность для применения в ветеринарии). Частные варианты вспомогательных веществ включают носители или разбавители (растворители), например, воду.

Термин «LD₅₀» - средняя доза вещества, вызывающая гибель половины членов испытуемой группы.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример № 1. Штамм микроорганизма Corynebacterium pseudotuberculosis – B-1422.

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1422.

2. Дата депонирования: 13.06.2023 г.

3. Вид микроорганизма: Corynebacterium pseudotuberculosis.

4. Основание для депонирования: для производства и контроля иммунологических лекарственных средств для ветеринарного применения.

5. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов – санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактерия вида Corynebacterium pseudotuberculosis не относится ни к одной из четырех групп патогенности.

6. Дата, источник и место выделения: из абсцесса лимфатического узла овцы в 2022 году. Республика Башкортостан.

7. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

8. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных токсигенных свойств, а также с помощью масспектрального анализа; молекулярно-генетических свойств на наличие гена tox дифтерийного токсина.

9. Морфологические признаки: в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживаются неподвижные неспорообразующие грамположительные мелкие палочки неправильной формы 0,5-0,6 на 1,0-3,0 мкм, неравномерно окрашенные, с булавовидными формами и метахроматическими гранулами.

10. Культуральные особенности: на мясопептонном агаре (МПА), кровяном агаре микроорганизм формирует колонии белые, непрозрачные, выпуклые, с матовой поверхностью размером 1,0 мм с узкой зоной гемолиза вокруг колонии спустя 24-48 часов культивирования при температуре +37 °С; на кровяном теллуритовом агаре – формирует серо-черные, непрозрачные, выпуклые, блестящие колонии с шероховатой поверхностью и ровными краями размером 1,0-2,0 мм через 48 часов культивирования при температуре +37 °С. Аэробы.

11. Биохимические свойства: каталаза +, хитиназа +, цистиназа –, уреаза +, фруктоза +, галактоза +, глюкоза +, гликоген +, мальтоза +, манноза +, казеин –, эскулин –, гиппурат –, индол –, оксидаза –, лактоза –, маннит –, рафиноза –, рамноза –, редукция нитратов –, салицин –, сахароза –, крахмал –, трегалоза –, ксилоза –.

12. Серологические свойства: не определялись.

13. Продукция токсинов: токсины не продуцируют; в реакции преципитации в агаре с дифтерийным антитоксином (проба на токсигенность) продукции дифтерийного токсина нет.

14. Продукция антигенов, ферментов: не определялась.

15. Патогенность для лабораторных животных: при заражении мышей массой 18-20 грамм внутрибрюшинным способом в дозе 1 мл³/гол. с концентрацией 3 млрд м.кл. смерть животных наступает в течение 3 дней.

16. Устойчивость к антибактериальным препаратам: азитромицин – 0 мм (15 мкг), азтреонам - 0 мм (30 мкг), амоксиклав - 28 мм (30 мкг), амоксициллин - 26 (25 мкг), ампициллин – 16 мм (10 мкг), бацитрацин - 30 (10 U), бензилпенициллин – 10 мм (10 U), ванкомицин – 0 мм (30 мкг), гентамицин – 13 мм (10 мкг), дорипенем – 0 мм (10мкг), канамицин – 0 мм (30 мкг), карбенициллин – 36 мм (100 мкг), кларитромицин – 30 мм (15 мкг), клиндамицин – 24 мм (2 мкг), левофлоксацин – 24 мм (5 мкг), линкомицин – 23 мм (10 мкг), норфлоксацин – 0 мм (10 мкг), окситетрациклин – 16 мм (30 мкг), олеандомицин - 14 мм (15 мкг), офлоксацин – 26 мм (5 мкг), пефлоксацин – 16 мм (5 мкг), пиперациллин - 0 мм (100 мкг), полимиксин–В – 14 мм (50 U), пристиномицин – 22 мм (15 мкг), рифампицин – 18 мм (15 мкг), спектиномицин – 14 мм (100 мкг), спирамицин - 22 мм (30 мкг), стрептомицин – 14 мм (25 мкг), сульфадиазин – 13 мм (100 мкг), сульфафуразол - 16 мм (300 мкг), тетрациклин – 18 мм (30 мкг), тилозин – 20 мм (15 мкг), фосфомицин – 0 мм (50 мкг), фузидиевая кислота – 20 мм (30 мкг), хлортетрациклин - 20 мм (30 мкг), цефалотин - 0 мм (30 мкг), цефазолин - 0 мм (30 мкг), цефаклор – 22 мм (30 мкг), цефалексин – 26 мм (30 мкг), цефепим – 18 мм (30 мкг), цефотаксим – 0 мм (30 мкг), цефоперазон – 20 мм (75 мкг), цефпиром – 20 мм (30 мкг), цефиксим – 0 мм (5 мкг), цефтриаксон – 28 мм (30 мкг), ципрофлоксацин – 30 мм (30 мкг), энрофлоксацин – 30 мм (10 мкг), эритромицин – 14 мм (15 мкг).

17. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось.

18. Генетические характеристики: не выявлен фрагмент гена tox методом ПЦР со специфическими праймерами.

19. Условия культивирования: Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422 растет на мясопептонном бульоне (МПБ), сердечно-мозговом бульоне, триптон-соевом бульоне, а также на агаризированных питательных средах: кровяном, кровяном теллуритовом агаре или сывороточно теллуритовом агаре. Оптимум рН 7,0-7,4, температуры 37 °С.

20. Условия хранения: штамм хранят в лиофилизированном виде в ампулах. Объём лиофилизата составляет 1 см³. Температура хранения +4…+8 °С. Срок хранения 5 лет; в 50 % глицерине при температуре хранения - 30-34 °С срок хранения 5 лет.

Пример № 2. Получение бульонной культуры Corynebacterium pseudotuberculosis

Производственные штаммы бактерий, используемые для изготовления иммунобиологических и диагностических средств, чаще всего поддерживаются в лиофилизированном виде, что позволяет гарантировать сохранность и стабильность свойств данных культур. Такой подход позволяет стандартизировать качество производимой продукции, а также гарантирует возможность длительного хранения штаммов без пассажа. Кроме того, лиофилизация используется для гарантийного хранения не только производственных штаммов, но и эпизоотических и коллекционных культур.

Для лиофилизации штамма Corynebacterium pseudotuberculosis предварительно получали свежую бульонную культуру. С этой целью с поверхности агара в чашке Петри, на которых поддерживалась живая нативная культура C. pseudotuberculosis, проводился отсев отдельных колоний в пробирки с сердечно-мозговым бульоном (возможно использование триптон-соевого бульона, Эугоник бульона, бульона Хоттингера и т.д.). Засеянные пробирки с бульоном культивировались при 37–38 °С в течение 24-48 часов. По окончании культивирования, проводился контроль бульонной культуры на типичность роста, морфологические и тинкториальные свойства клеток бактерии, а также отсутствие роста посторонней микрофлоры. Спустя 48-72 часов бульонного культивирования концентрация бактериальных клеток штамма достигает 0,5-0,8 млрд. м.к./см³.

Пример № 3. Приготовление стабилизатора (защитной среды) для лиофилизации штамма Corynebacterium pseudotuberculosis

В качестве защитной среды для штамма могут быть использованы любые стабилизирующие среды и добавки, например, обезжиренное молоко (обрат), стерильная сыворотка крови животных, сахаро-желатиновая среда, декстрановая среда и т.д. по любой известной технологии, в частности:

Приготовление защитной декстрановой среды высушивания.

Состав: гидролизат казеина – 2,0%, декстран – 5,0%, сорбит – 5,0%, сахароза – 3,0%, желатин – 3,0%, К₂НРО₄ – 0,125%, КН₂РО₄ – 0,051%, вода бидистиллированная - до 100%.

К 2/3 конечного объема бидистиллированной воды добавляют компоненты в следующем порядке: К₂НРО₄, КН₂РО₄, желатин, декстран, сорбит, сахароза, гидролизат казеина. Каждый следующий компонент добавляют только после полного растворения предыдущего.

После растворения всех компонентов доводят объем до необходимого значения бидистиллированной водой, перемешивают, доводят рН до 7,3 при помощи 2Н КОН. Готовый раствор переливают в контейнеры для автоклавирования, автоклавируют среду в течение 30 мин при 121-125 °С. Хранят готовую защитную среду при температуре 4-8 °С.

Пример № 4. Смешивание штамма Corynebacterium pseudotuberculosis со стабилизирующей средой перед лиофилизацией

Для лиофилизации штамма Corynebacterium pseudotuberculosis в бульонную культуру вносят стабилизатор (например, декстриновый стабилизатор) до 30 % от объема, после чего полученную суспензию тщательно перемешивают в течение 3 минут. Готовую суспензию фасуют в ампулы и/или флаконы с соблюдением условий асептики и подвергают замораживанию для последующей лиофилизации.

Пример №5. Лиофилизация и контроль производственного штамма Corynebacterium pseudotuberculosis

Лиофилизацию, а также выходной контроль (контроль внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей; определение наличия вакуума; определение растворимости; определение массовой доли влаги; определение контаминации) проводят любыми известными способами, например описанном в RU2787392 штамм бактерий Gallibacterium anatis, предназначенный для получения моно- и поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику галлибактериоза сельскохозяйственных птиц].

Пример №6. Определение культуральных и морфологических свойств, а также типичности роста C. pseudotuberculosis на питательных средах

Для подтверждения культуральных и морфологических свойств штамма после лиофилизации, проводят отбор ампул от каждой расплодки. Для этого в ампулу вносят 1 мл стерильного физиологического раствора для восстановления первичного объема, после чего полученную суспензию переносят в 9 мл стерильного физиологического раствора. Затем проводят посев методом Дригальского на кровяной агар (основа колумбийский, триптон-соевый агар, сердечно-мозговой агар). Культивирование посевов проводится в течение 24-48 часов при 37 °С. На 24 час культивирования на кровяном агаре штамм C. pseudotuberculosis формирует белые, непрозрачные, выпуклые колонии с матовой поверхностью размером 1,0 мм с узкой зоной гемолиза вокруг. В мазках, окрашенных по Граму, выявляются неподвижные неспорообразующие грамположительные мелкие палочки неправильной формы, неравномерно окрашенные, с булавовидными формами и метахроматическими гранулами.

Оценка типичности роста коринебактерии на бульонных средах проводится путем пересева отдельных суточных колоний с кровяного агара в пробирки с сердечно-мозговым или триптон-соевым бульоном. Культивирование посевов проводится в течение 48 часов при 37 °С. В результате культивирования в пробирках образовалась равномерная взвесь бактериальных клеток. Средняя концентрация суспензии микробных клеток штамма C. pseudotuberculosis B-1422 составляет 0,5-0,8*10⁹ м.к./ см³.

Результаты исследования, отраженные в примере №1, пунктах 9 и 10.

Пример №7. Определение биохимических свойств штамма Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422

Для изучения биохимических свойств культуры Corynebacterium pseudotuberculosis используются коммерческие тест системы с сопутствующими расходными материалами и электронной базой для интерпретации полученного результата. Помимо коммерческих биохимических тест-систем могут быть использованы углеводы в дисках для определения сахаролитических свойств. Испытание проводится согласно инструкции производителя диагностикума.

В результате исследования были установлены свойства штамма, отраженные в примере №1, пункте 11.

Пример №8. Определение антибиотикограммы

Определение антибиотикочувствительности штамма проводили диско-диффузным методом (ДДМ) в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

В работе были использованы диски со следующими антибиотиками: азитромицин (15 мкг), азтреонам (30 мкг), амоксиклав (30 мкг), амоксициллин (25 мкг), ампициллин (10 мкг), бацитрацин (10 U), бензилпенициллин (10 U), ванкомицин (30 мкг), гентамицин (10 мкг), дорипенем (10мкг), канамицин (30 мкг), карбенициллин (100 мкг), кларитромицин мм (15 мкг), клиндамицин (2 мкг), левофлоксацин (5 мкг), линкомицин (10 мкг), норфлоксацин (10 мкг), окситетрациклин (30 мкг), олеандомицин (15 мкг), офлоксацин (5 мкг), пефлоксацин (5 мкг), пиперациллин (100 мкг), полимиксин–В (50 U), пристиномицин (15 мкг), рифампицин (15 мкг), спектиномицин (100 мкг), спирамицин (30 мкг), стрептомицин (25 мкг), сульфадиазин (100 мкг), сульфафуразол (300 мкг), тетрациклин (30 мкг), тилозин (15 мкг), фосфомицин (50 мкг), фузидиевая кислота (30 мкг), хлортетрациклин (30 мкг), цефалотин (30 мкг), цефазолин (30 мкг), цефаклор (30 мкг), цефалексин (30 мкг), цефепим (30 мкг), цефотаксим (30 мкг), цефоперазон (75 мкг), цефпиром (30 мкг), цефиксим (5 мкг), цефтриаксон (30 мкг), ципрофлоксацин (30 мкг), энрофлоксацин (10 мкг), эритромицин (15 мкг) («Himedia», Индия). Учёт результатов проводился спустя 18-24 часа термостатирования по диаметру зон задержки роста бактерий.

Результаты определения антибиотикограммы представлены в примере №1 пункт №16.

Пример №9. Определение биовара

Штаммы Corynebacterium pseudotuberculosis классифицируются по видовой предрасположенности к хозяину и способностью утилизировать нитраты на два биовара: ovis (серотип I, нитрат-отрицательный) вызывает лимфаденит у мелких жвачных животных, в основном овец и коз; equi (серотип II, нитрат-положительный) приводит к язвенному лимфангиту у лошадей [Bernardes JS, Eberle RJ, Vieira FRJ, Coronado MA. A comparative pan-genomic analysis of 53 C. pseudotuberculosis strains based on functional domains. J Biomol Struct Dyn. 2021 Nov;39(18):6974-6986. doi: 10.1080/07391102.2020.1805017. Epub 2020 Aug 11. PMID: 32779519.] и отечной кожной болезни (OSD) у буйволов [Barakat AA, Selim SA, Atef A, Saber MS, Nafie EK, El-Edeeby AA. Two serotypes of Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from different animal species. Rev Sci Tech. 1984 Mar;3(1):151-163. doi: 10.20506/rst.3.1.147. PMID: 32987978; Moussa IM, Ali MS, Hessain AM, Kabli SA, Hemeg HA, Selim SA. Vaccination against Corynebacterium pseudotuberculosis infections controlling caseous lymphadenitis (CLA) and oedematousskin disease. Saudi J Biol Sci. 2016 Nov;23(6):718-723. doi: 10.1016/j.sjbs.2016.06.005. Epub 2016 Jun 17. PMID: 27872567; PMCID: PMC5109496].

Ввиду того, что штамм выделен от овец, а также не утилизирует нитраты (установлено в ходе изучения биохимических свойств), то штамм относится к биовару ovis (серотип I).

Пример №10. Определение патогенности штамма Corynebacterium pseudotuberculosis

Определение патогенности штамма проводили с использованием лабораторных мышей массой 18-20 гр. При проведении исследования лабораторные животные подбирались по принципу аналогов (стандартные параметры массы тела, возраст, состояние здоровья). Животных содержали в помещениях вивария. Параметры микроклимата соответствовали требованиям [СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)"]. Кормление осуществлялось специальными концентрированными комбикормами. Животные индивидуально маркировались. На карточке клетки указывались номер исследования, руководитель исследования, номер протокола биоэтической комиссии, номер клетки, номера животных и номер группы.

Лабораторные животные содержались в комнате содержания животных барьерного типа с автоматической сменой дневного и ночного периода (08:00-20:00 – «день», 20:00-08:00 – «ночь») и как минимум 12-кратной сменой воздушного объема комнаты в час.

За стандарты содержания животных приняты стандарты, определенные Директивой 2010/63/EU по защите животных, используемых в научных целях. В качестве приемлемых границ параметров микроклимата в комнатах содержания животных приняты границы, определенные руководством The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington D.C., 2011).

Мыши, используемые в опыте, содержались в специализированных клетках М6 - Т4/1 (ООО «Профлаб», Россия). В качестве подстила для содержания мышей был использован коммерческий подстил, представляющий собой древесную стружку мягких нехвойных пород древесины (ООО «Лабораторкорм», Россия).

Пищевой рацион мышей состоял из гранулированного корма, а именно полноценный комбикорм для лабораторных животных (содержание мышей, крыс, хомяков) ПК 120-2_720. Изготовитель: АО «Гатчинский ККЗ» 188302, Ленинградская область. Гатчинский район, д. Малые Колпаны, ул. Западная д. 31.

Животные получали профильтрованную водопроводную воду в стандартных автоклавированных поилках (ООО «Профлаб», Россия).

Для проведения исследования животных (n=5) заражали внутрибрюшинным способом в дозе 1 мл³/гол. с концентрацией 3 млрд м.кл. В результате чего было установлено, что штамм вызывает гибель всех животных в течение 3 суток с момента инфицирования.

Пример №11. Определение вирулентности штамма Corynebacterium pseudotuberculosis

При определении вирулентности культуры коринебактерии, выраженной в значении показателя LD₅₀, использовали белых мышей массой 16–18 гр. в количестве 24 голов. Для исследования готовили ряд десятикратных разведений бактериальной суспензии штамма Corynebacterium pseudotuberculosis на основе физиологического раствора, а именно ~1х10⁹ м.к., ~1х10⁸ м.к., ~1х10⁷ м.к., ~1х10⁶ м.к. Мышей заражали внутрибрюшинно по 1 см³, срок наблюдения составлял 10 суток. Параллельно, для точного определения дозы (концентрации живых клеток) возбудителя в материале, проводили раститровку и высев на чашки Петри с ростообеспечивающими средами (чашечный метод Коха). Статистическую обработку результатов осуществляли в программах BioStat 2009 («AnalystSoft, Inc.», США) и Microsoft Exсel. Расчет LD₅₀ проводили посредством пробит-анализа. Результаты испытаний приведены в таблице №1.

Таблица №1. Результаты определения LD₅₀ производственного штамма Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422

Штамм Инфицирующая доза, м.к. Количество зараженных животных, гол. n=24 Погибло, гол. LD₅₀ м. к. B-1422 1,4*10⁹ 6 6 3,07*10⁶ 1,4*10⁸ 6 6 1,4*10⁷ 6 5 1,4*10⁶ 6 2 1,4*10⁵ 6 0

Согласно полученным данным, LD₅₀ штамма составляет 3,07*10⁶ м.к.

Сразу после гибели животных, проводили патологоанатомическое вскрытие трупов с последующим бактериологическим исследованием образцов внутренних органов. В ходе исследования из всех проб были выделены культуры заражающего штамма C. pseudotuberculosis. Полученные результаты свидетельствуют, что предлагаемый производственный штамм B-1422 является вирулентным и способен вызывать гибель лабораторных животных, что в дальнейшем будет использовано для контроля иммуногенной активности средств специфической профилактики казеозного лимфаденита.

Пример №12. Изготовление экспериментальной серии инактивированной вакцины против казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота

Экспериментальная серия инактивированной вакцины против казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота изготовлена на базе ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, при условиях глубинного культивирования с использованием лабораторного ферментера Biostat®A (Sartorius Group, Германия). Для культивирования штамма коринебактерии использовали сердечно-мозговой бульон и колумбийский агар («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия) с добавлением 10% дефибринированной крови барана. Культивирование проводилось в течение 48 часов при температуре 37 °С. Полученную культуру проверяли по показателям: типичности культуральных, морфологических и тинкториальных свойств штамма, отсутствие посторонней микрофлоры, концентрация микробных клеток. Концентрация бактериальных клеток возбудителя 1,3 млрд. м.к./см³. Инактивировали культуру путём добавления 0,3 % формалина к общему объёму бактериальной суспензии. Продолжительность инактивации бактериальных антигенов составляла 3 суток при температуре 21±1 °С. Ввиду того, что бактериальная масса культуры C. pseudotuberculosis содержит плотные включения колоний, то бактериальную массу подвергали ультразвуковой гомогенизации с целью повышения однородности и стабильности бактериальной суспензии. Обработка антигена ультразвуком проводится при температуре 0-2 °С (во льду) в течение 15 минут при следующих условиях: амплитуда 100%, рабочая частота 20 кГц, мощность 70 Вт, пульсация 20%.

После инактивации и гомогенизации бактериальной суспензии были произведены несколько вариантов экспериментального препарата с использованием различных адъювантов и различных концентраций бактериальных клеток (таблица №2).

Таблица №2. Варианты вакцин с использованием протективных антигенов производственного штамма Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422.

Конц-ция (м.к./см³) Адъювант ГОА ПЭГ-6000 Carbopol 971Р Montanide ISA 206 1,5*10⁹ Вариант 1.1. Вариант 2.1. Вариант 3.1. Вариант 4.1. 3,0*10⁹ Вариант 1.2. Вариант 2.2. Вариант 3.2. Вариант 4.2. 4,5*10⁹ Вариант 1.3. Вариант 2.3. Вариант 3.3. Вариант 4.3.

Варианты 1.1., 1.2., 1.3. были получены с использованием гидроксида алюминия (ГОА) (ФКП «Щелковская биофабрика», Россия). Поскольку данный адъювант является хорошим осадителем, то предварительно полученная бактериальная культура не концентрировалась с использованием лабораторно/промышленного оборудования (центрифуги и/или сепаратора). Осаждение бактериальной массы проводили путем добавления к бактериальной культуре, полученной в ферментере, 3%-ного раствора ГОА в объеме 10%. После осаждения бактериальной массы и ГОА проводили декантирование надосадочной жидкости. Таким образом удается проводить 10-кратное концентрирование. Для доведения концентрации бактериальных клеток в 1 см³, могут быть использованы любые разбавители (стерильный физиологический раствор, стерильная вода для инъекций, стерильный фосфатно-буферный раствор и т.д.). Концентрацию водородных ионов полученных препаратов регулировали с использованием раствора щелочи до значения 7,2-7,6 ед. В качестве консерванта использовался мертиолят натрия (из расчета 1:10000 v/v).

Варианты 2.1., 2.2., 2.3. были получены с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000, ООО «Норкем», Россия) — 10 % к объему вакцины. Поскольку ПЭГ не является хорошим осадителем, то ранее полученную в реакторе бактериальную суспензию концентрировали путем центрифугирования на установке MPW-380R в течение 1 ч при 3 тыс. оборотах при относительном центробежном ускорении RCF – 1861. Таким образом удаляли балластные вещества (остатки питательной среды), а протективный антиген использовали далее для составления серий вакцины. Для доведения концентрации бактериальных клеток в 1 см³, могут быть использованы любые разбавители (стерильный физиологический раствор, стерильная вода для инъекций, стерильный фосфатно-буферный раствор и т.д.). Концентрацию водородных ионов полученных препаратов регулировали с использованием раствора щелочи до значения 7,2-7,6 ед. В качестве консерванта использовался мертиолят натрия (из расчета 1:10000 v/v).

Варианты 3.1., 3.2., 3.3. были получены идентичным выше представленному способом, но вместо ПЭГ-6000 использовали стерильный 2 % гель карбомера (карбопола 971р) (Corel Pharma-Chem, Канада), приготовленный на фосфатно-солевом буфере в объеме 10%.

Варианты 4.1., 4.2., 4.3. были получены на масляном адъюванте Montanide ISA 206 (Seppic, Франция).

В подготовленный реактор-эмульгатор наливается расчетное количество масляного адъюванта марки MONTANIDE ISA 206 (50-70% к объему препарата), проводят процесс стерилизации при давлении 1,0 кг/см², температуре 120 °С в течение 40 мин. Адъювант охлаждает до 37 °С, из реактора отбираются пробы для контроля стерильности в пробирки с питательными средами мясопептонный агар, мясопептонный бульон, мясопептонный печеночный бульон, агар Сабуро. Эмульгирование с антигеном проводят перемешиванием смеси адъюванта и антигена якорной мешалкой в течение 30 мин, после остановки мешалки включают насос-эмульгатор. Длительность перемешивания зависит от объема серии вакцины от 15 до 30 мин, при постоянно работающей мешалке. При получении эмульсии, проводят процедуру стабилизации, путем подачи захоложенной воды в рубашку реактора и охлаждают от +15 до +10 °С. Время стабилизации эмульсии 12-18 ч, подать вакцину на розлив во флаконы.

Пример № 13. Контроль иммуногенной активности экспериментальных серий вакцины против казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота

Исследование иммуногенной активности экспериментальных вакцин (полученных согласно примеру №12) проводили в условиях вивария ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН с использованием белых мышей. Было сформировано 12 опытных групп животных (n=10), и 1 контрольная группа (n=10). Мышей опытной группы иммунизировали внутримышечно двукратно в объеме 0,5 мл с интервалом 14 дней, соответствующим вариантом вакцины. Животным контрольных групп внутримышечно вводился стерильный физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Спустя 14 дней после второй вакцинации, животные опытной и контрольной групп были подвергнуты инфицированию штаммом B-1422 в дозе 5Ld₅₀ (1,53*10⁷). Срок наблюдения за животными составлял 10 дней. В результате эксперимента были получены результаты представленные в таблице 3.

Таблица №3. Результаты оценки иммуногенной активности различных вариантов вакцин против казеозного лимфаденита

Результаты оценки иммуногенности вакцин в опытных группах по выживаемости (было/пало, процент смертности) Вариант 1.1. Вариант 2.1. Вариант 3.1. Вариант 4.1. (10/0, 0%) (10/0, 0%) (10/0, 0%) (10/0, 0%) Вариант 1.2. Вариант 2.2. Вариант 3.2. Вариант 4.2. (10/0, 0%) (10/0, 0%) (10/0, 0%) (10/0, 0%) Вариант 1.3. Вариант 2.3. Вариант 3.3. Вариант 4.3. (10/0, 0%) (10/0, 0%) (10/0, 0%) (10/0, 0%) Результаты оценки заражения животных в контрольной группе (было/пало, процент смертности) (10/10, 100%)

Согласно полученным данным, иммуногенная активность всех вариантов вакцин показала 100% защиту от 5-ти кратной летальной дозы при заражении, в то время как смертность животных в контрольной группе составила 100%. Таким образом сделано заключение, что предложенный штамм обладает необходимой иммуногенной активностью на лабораторных животных, при использовании в составе препарата 1,5*10⁹ м.к. протективного антигена.

Пример № 14. Оценка протективной активности иммуногенной композиции (вакцины) по изобретению

Оценку протективной эффективности иммунологических средств (вакцин), изготовленных из штамма Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422 по изобретению проводили в условиях неблагополучного по казеозному лимфадениту козоводческому предприятию. На предприятии животные имели типичные для заболевания клинико-морфологические проявления казеозного лимфаденита. Окончательный диагноз был поставлен путем проведения бактериологического исследования секционного (патологического материала) из данного предприятия, в ходе которого были выделены изоляты Corynebacterium pseudotuberculosis из различных органов и паренхиматозных тканей (лимфатических узлов, легких, сердца, селезенки). На основании данных вскрытия павших и вынужденно убитых животных было сделано заключение, что CLA протекает в висцеральной форме. Как раз она характеризуется образованием абсцессов на внутренних органах, таких как легкие, печень, почки, матка, селезенка, внутренние лимфоузлы. Кроме того, в редких случаях могут поражаться суставы, молочная железа, головной и спинной мозг, сердце, а также возможно возникновение орхита, мастита или целлюлита. Висцеральную форму часто сопровождает синдром «худой овцы» - возникает потеря веса, слабость, нарушение дыхания.

До момента начала эксперимента не менее 63,6% взрослого поголовья имело типичные для псевдотуберкулеза клинико-морфологические проявления. На молодняке заболевание не фиксировалось, что в свою очередь объясняется хроническим течением инфекции, которая развивается в более взрослом возрасте. Несмотря на это, при вскрытии павшего и выбракованного молодняка, из паренхиматозных органов и тканей животных также были выделены изоляты Corynebacterium pseudotuberculosis, что в свою очередь позволяло утверждать, что животные уже инфицированы.

В ходе проведения исследования использовался вариант иммуногенной композиции по изобретению (вакцины), включающий 1,5 млрд м.к. протективного антигена штамма по изобретению и гидроксид алюминия.

Для оценки протективной эффективности вакцины, было сформировано две группы животных:

- группа №1 – 38 козлят в возрасте 11-14 дней жизни. Козлят, вакцинировали, начиная с 14-21 дневного возраста. Вакцину вводили внутримышечно в бедренную группу мышц двукратно с интервалом 21-24 дня в дозе 1 мл, дополнительную ревакцинацию проводили в возрасте 3 месяцев однократно в дозе 2 мл. В случае пропуска очередного введения использовали двукратную схему вакцинации в указанной дозе. Вакцинацию проводили с соблюдением общепринятых правил асептики, для инъекции использовали только стерильные материалы и инструменты. Для каждого животного использовали отдельную иглу. Перед применением флаконы с вакциной тщательно взбалтывали.

- группа №2 – 43 козленка в возрасте 11-14 дней жизни. Данная группа иммунизации не подвергалась.

По результатам эксперимента оценивали инцидентность выявления у опытных и контрольных групп животных типичных для псевдотуберкулеза, клинико-морфологических проявлений заболеваний. Поскольку заболевание имеет хроническое течение, то учет проводился на период достижения животными полуторагодовалого возраста (пик заболеваемости, установленный на предприятии).

В результате проведенного исследования установлено, что среди не вакцинированной группы №2 инцидентность клинико-морфологического проявления казеозного лимфаденита составила 72,09%, в то время как среди вакцинированных животных 18,42%. Таким образом, применение иммунологического препарата по изобретению позволило на 53,57% уменьшить количество больных животных.

Стоит отметить, что создание эпизоотологического благополучия предприятия, требует длительного применение эффективных лечебно-профилактических и санитарно-гигиенических мероприятий. Так, создание однородного иммунного статуса среди поголовья, позволяет проводить оздоровительные мероприятия с максимальным эффектом.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, иммунологии и биотехнологии, в частности к штамму бактерий Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422, депонированному во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1422 и предназначенному для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота. Также раскрыта иммуногенная композиция для профилактики казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота и способ профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) у субъекта. Изобретение обеспечивает производство высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций для профилактики казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) мелкого рогатого скота. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 табл., 14 пр.

1. Штамм бактерий Corynebacterium pseudotuberculosis B-1422, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1422 и предназначенный для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота.

2. Применение штамма по п.1 для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота.

3. Иммуногенная композиция для профилактики казеозного лимфаденита мелкого рогатого скота, включающая профилактически эффективное количество инактивированного протективного антигена штамма по п.1, адъювант и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

4. Композиция по п.3, в которой вспомогательное вещество представляет собой растворитель, наполнитель.

5. Композиция по п.3, в которой адъювант выбирается независимо и представляет собой гидроксид алюминия, ПЭГ-6000, карбапол, масляный адъювант.

6. Композиция по п.5, в которой масляный адъювант представляет собой адъювант марки MONTANIDE ISA 206.

7. Композиция по п.5, в которой карбапол представляет собой карбапол марки Carbopol 971Р.

8. Способ профилактики казеозного лимфаденита у субъекта, включающий введение композиции по п.3 субъекту.

9. Способ по п.8, в котором субъект представляет собой мелкий рогатый скот.

10. Способ по п.9, в котором мелкий рогатый скот представляет собой овец, коз.