Контрольно-производственный штамм Actinobacillus rossii, предназначенный для производства и контроля иммунобиологических лекарственных средств ветеринарного применения Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/00 

Область техники

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, иммунологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве и контроле инактивированных иммунобиологических средств в виде моно- и поливалентных препаратов, предназначенных для профилактики инфекции свиней, вызванной Actinobacillus rossii.

Уровень техники

Аборты на свинофермах происходят эпизодически, но редко исследуются если случаи не превышают допустимые показатели, в среднем это примерно 2%. Для полного исследования причин абортов необходимо тщательное обследование репродуктивной системы с соответствующим микробиологическим скринингом.

Большинство абортов несут неинфекционный характер и представляют репродуктивные сбои, связанные с нарушениями гормонального фона и физиологическим состоянием или влиянием окружающее среды, питания и стрессом, а также нужно учитывать иммунодефицитные или иммунологические нарушения, однако существует большое количество возбудителей вирусной и бактериальной природы, вызывающих системное или местное инфицирование репродуктивных органов. Одним из примеров возбудителей может выступать бактерия рода Actinobacillus, это небольшие грамотрицательные плеоморфные палочки, которые могут быть комменсалами и входить в состав нормофлоры животных, так и обладать патогенностью. Один из представителей рода это Actinobacillus rossii – возбудитель, чаще всего вызывающий аборты у свиней на разных сроках беременности.

Actinobacillus rossii принадлежит к типу Proteobacteria, классу Gammaproteobacteria, отряду Pasterellales, семейству Pasteurellaceae, роду Actinobacillus. Он представляет собой грамотрицательные клетки овальной формы размером 2 мкм. Расположены одиночно или цепочками. Культуры хорошо растет на кровяном агаре в виде круглых полупрозрачных выпуклых колоний с серым оттенком 2 мм в диаметре в аэробных и анаэробных условиях. Иногда вызывают слабый гемолиз эритроцитов.

Actinobacillus rossii содержит ген, отвечающий за синтез токсина семейства RTX – Apx, который в свою очередь подразделяется на четыре типа: от ApxI до ApxIV, но содержит лишь токсины apxII или apxIII, либо сразу оба. Этот экзотоксин обладает порообразующим свойством, тем самым в организме хозяине он лизирует эритроциты, нейтрофилы, макрофаги, также альвеолярные эпителиальные и эндотелиальные клетки.

Возбудитель локализуется преимущественно в мочеполовых путях самки и поражает плаценту, затем он поражает плод, это может говорить о том, что у данного возбудителя присутствуют механизмы, способные обойти гематоплацентарный барьер. Так как происходит лизис клеток, то нарушается целостность органа репродукции, который становится не способен поддерживать развитие плода и тот погибает, не получая необходимых ресурсов для развития.

Из-за отсутствия или слабой реакции организма происходит накопление патогена и соответственно увеличение концентрации токсина, что ведет к токсикемии и смерти.

Таким образом, сохраняется необходимость в разработке и создании новых иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику инфекционных абортов свиней.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является получение нового штамма бактерии Actinobacillus rossii, отвечающего требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т. д. свойствам) и пригодного для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно- и поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику инфекционных абортов свиней вызванных одноименным патогеном.

Поставленная задача решается путем получения штамма Actinobacillus rossii B-1427, депонированного во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук - ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) под номером B-1427 и предназначенного для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики инфекционных абортов свиней вызванных одноименным патогеном.

Кроме того, настоящее изобретение включает применение Actinobacillus rossii B-1427, депонированного во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук - ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) под номером B-1427, для получения иммунобиологического средства, в частности моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики инфекционных абортов свиней вызванных одноименным патогеном.

Предметом настоящего изобретения также является иммуногенная композиция для профилактики инфекционного аборта свиньи, вызванного Actinobacillus rossii, включающая профилактически эффективное количество инактивированного протективного антигена штамма по изобретению, адъювант и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В частных вариантах воплощения изобретения вспомогательное вещество представляет собой растворитель, наполнитель. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворитель выбирается независимо и представляет собой стерильный физиологический раствор, стерильную воду для инъекций, стерильный фосфатно-буферный раствор и т.д. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения вспомогательное вещество представляет собой щелочь, мертиолят натрия.

В частных вариантах воплощения изобретения адъювант выбирается независимо и представляет собой гидроксид алюминия, ПЭГ-6000, карбапол, масляный адъювант. Более конкретно масляный адъювант представляет собой адъювант марки MONTANIDE ISA 206. В некоторых частных вариантах карбапол представляет собой карбапол марки Carbopol 971Р.

Кроме того, предметом настоящего изобретения также является способ профилактики инфекционного аборта у субъекта, вызванного Actinobacillus rossii, включающий введение композиции по изобретению субъекту.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой свиней.

Настоящее изобретение также включает способ получения иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций для профилактики инфекционного аборта у свиней, который осуществляют посредством штамма по изобретению.

Настоящее изобретение также включает применение штамма по изобретению для оценки эффективности иммуногенных композиций для профилактики инфекционных абортов свиней вызванных Actinobacillus rossii.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- получен новый штамм Actinobacillus rossii B-1427, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером B-1427 и предназначенный для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики инфекционных абортов свиней вызванных одноименным патогеном;

- штамм по изобретению отвечает требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т. д. свойствам) и пригоден для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций для профилактики инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii;

- использование штамма по изобретению при производстве иммунобиологических средств позволит повысить уровень эпизоотического благополучия по инфекционным абортам свиней вызванных Actinobacillus rossii;

- получена эффективная иммуногенная композиция на основе штамма по изобретению, которая предназначена для профилактики инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii;

- разработан эффективный способ профилактики инфекционных абортов, вызванных Actinobacillus rossii, у субъекта, включающий введение композиции по изобретению субъекту.

Изобретение также служит средством расширения арсенала моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii, которые обладают стабильностью, а также высокой антигенной, иммуногенной и протективной активностью.

Подробное раскрытие изобретения

Определение и термины

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «антиген» обозначает любое вещество, которое организм субъекта рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого организм может индуцировать (запускать) иммунный ответ. Это могут быть компоненты инфекционного агента, такие как, например, фрагменты белков бактерии, а также инфекционные агенты, сохранившие, хотя бы частично, присущую им структуру.

Под штаммом Actinobacillus rossii B-1427 понимается как штамм Actinobacillus rossii B-1427, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук - ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) под номером B-1427, так и полученный с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала (например, мутант, вариант), и сохраняющий все свойства исходного штамма, т.е. обладающий всеми определяющими штамм Actinobacillus rossii B-1427 (идентифицирующими) характеристиками. В том, числе, по меньшей мере, пригодный для получения моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику инфекционных абортов свиней, вызванных одноименным патогеном.

Используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к штамму Actinobacillus rossii B-1427 означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и химических веществ (составов), известных специалистам в данной отрасли или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.

Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у субъекта, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Субъекты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у субъектов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика — это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.

Под «профилактически эффективным количеством» подразумевается такое количество антигена штамма, вводимого или доставляемого субъекту, при котором у субъекта с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на профилактику. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида субъекта, способа введения препарата и т.п.

Термин «инактивированный протективный антиген штамма» в данном документе означает «нежизнеспособные» антигены микроорганизма, при введении которых лабораторным или целевым видам животных, способствуют образованию напряженного иммунного ответа, достаточного для обеспечения профилактического эффекта.

Термин «субъект» охватывает свиней, которые используют штамм и композицию по изобретению путем введения субъекту другим лицом для профилактики заболевания или медицинского состояния.

Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств бактерий и являются приемлемыми для использования в ветеринарии (безопасность для применения в ветеринарии). Частные варианты вспомогательных веществ включают носители или разбавители (растворители), например, воду.

Термин «LD₅₀» - средняя доза вещества, вызывающая гибель половины членов испытуемой группы.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример № 1. Штамм микроорганизма Actinobacillus rossii – B-1427.

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1427

2. Дата депонирования: 13.06.2023

3. Вид микроорганизма: Actinobacillus rossii

4. Основание для депонирования: для производства и контроля иммунологических лекарственных, а также диагностических средств против инфекций свиней, вызванных Actinobacillus rossii.

5. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней" бактерия вида Actinobacillus rossii не относится ни к одной из четырёх групп патогенности.

6. Дата, источник и место выделения: Выделен из абортированного плода свиноматки. Белгородская область 2021 год.

7. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

8. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных, токсигенных свойств, а также с помощью масспектрального анализа; молекулярно-генетических свойств (16s rRNA).

9. Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные короткие не спорообразующие палочки и/или коккобациллы, расположенные одиночно, реже парами, неподвижные.

10. Культуральные особенности: колонии штамма полупрозрачные или серовато-белые, с гладкой поверхностью на кровяном агаре. Размер колоний в среднем 2 мм на 48 час культивирования. На кровяном агаре проявляется зона бета-гемолиза. На бульонных средах (триптон-соевый бульон, сердечно-мозговой бульон и т.д.) рост скудный.

11. Биохимические свойства: типичные для микроорганизма Actinobacillus rossii. Штамм восстанавливает нитраты, оксидаза и каталаза - положителен, уреаза и щелочная фосфатаза положительна. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, L-арабинозу, глицерин, ксилозу, инозитол, маннит, сорбит, фруктозу, фукозу, галактозу. Не ферментирует D-арабинозу, маннозу, рамнозу, лактозу, мальтозу, раффинозу и декстрин.

12. Серологические свойства: не определялось.

13. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

14. Вирулентность для лабораторных животных: при внутрибрюшинном введении 3 млрд м.к. 7-недельным морским свинкам, гибель животных наступает в течение 2-4 дней.

15. Устойчивость к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к амоксиклаву, амоксициллину, ципрофлоксацину, клиндамицину, цефепиму, тилмикозину, рифампицину, цефазолину, энрофлоксацину, цефтриаксону. Штамм резистентен к гентамицину, левофлоксацину, пефлоксацину, спирамицину, стрептомицину, сульфадиазину, тиамулину, тилозину, хлортетрациклину.

16. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось.

17. Генетические характеристики:

Нуклеотидная последовательность гена 16S rRNA SEQ ID NO:1:

gactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgctgaggaaggcagttactttaatagagtagttgattgacgttagtcacagaagaagtaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcrgaataactgggcgtaaagggcacgcaggcggtgayttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcatactgggtcgatagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaatgtactgacgctcatgtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgctgtcgatttggggattgagctttaagcttggtgcccgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagacccttacctactcttgacatccatagaatcctgtagagatacgggagtgccttagggagctatgagacaggtgcatcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgatacggtcgggaactcaaaggagattgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgc.

18. Условия культивирования: штамм требователен к питательным средам. Растет при pH-7.8 и температуре 37 ^оС в течение 24-48 ч в сердечно-мозговом бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне и агаре Хоттингера с добавлением V и X факторов роста. Образует мелкие до 1 мм прозрачные колонии. В мясопептонном бульоне (МПБ) рост слабый с едва заметным помутнением и опалесценцией при наличии факторов роста.

19. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах при температуре от 2 до 8 ^оС. Объем лиофилизата составляет 1 см³.Среда высушивания (для лиофилизированных): декстрановый стабилизатор. Периодичность обновления расплодки: один раз в пять лет.

Пример №2. Определение культуральных и морфологических свойств, а также типичности роста штамма Actinobacillus rossii B-1427 на питательных средах.

При подтверждении культуральных и морфологических свойств штамма установлено, что колонии штамма полупрозрачные или серовато-белые, с гладкой поверхностью на кровяном агаре. Размер колоний в среднем 2 мм на 48 час культивирования. На кровяном агаре проявляется зона бета-гемолиза. На бульонных средах (триптон-соевый бульон, сердечно-мозговой бульон и т.д.) рост скудный.

Пример №3. Определение биохимических свойств штамма Actinobacillus rossii B-1427.

Для изучения биохимических свойств культуры Actinobacillus rossii используются коммерческие тест-системы с сопутствующими расходными материалами и электронной базой для интерпретации полученного результата. Помимо коммерческих биохимических тест-систем могут быть использованы углеводы в дисках для определения сахаролитических свойств. Испытание проводится согласно инструкции производителя диагностикума.

Установлено, что штамм восстанавливает нитраты, оксидаза и каталаза - положителен, уреаза и щелочная фосфатаза положительна. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, L-арабинозу, глицерин, ксилозу, инозитол, маннит, сорбит, фруктозу, фукозу, галактозу. Не ферментирует D-арабинозу, маннозу, рамнозу, лактозу, мальтозу, раффинозу и декстрин.

Пример №4. Определение патогенности штамма Actinobacillus rossii B-1427.

Определение патогенности штамма проводили с использованием морских свинок в возрасте 6-7 недель жизни. При проведении исследования лабораторные животные подбирались по принципу аналогов (стандартные параметры массы тела, возраст, состояние здоровья). Животных содержали в помещениях вивария. Параметры микроклимата соответствовали требованиям [СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)"]. Кормление осуществлялось специальными концентрированными комбикормами. Животные индивидуально маркировались. На карточке клетки указывались номер исследования, руководитель исследования, номер протокола биоэтической комиссии, номер клетки, номера животных и номер группы.

Лабораторные животные содержались в комнате содержания животных барьерного типа с автоматической сменой дневного и ночного периода (08:00-20:00 – «день», 20:00-08:00 – «ночь») и как минимум 12-кратной сменой воздушного объема комнаты в час.

За стандарты содержания животных приняты стандарты, определенные Директивой 2010/63/EU по защите животных, используемых в научных целях. В качестве приемлемых границ параметров микроклимата в комнатах содержания животных приняты границы, определенные руководством The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington D.C., 2011).

Морские свинки, используемые в опыте, содержались в специализированных клетках М6 - Т4/1 (ООО «Профлаб», Россия). В качестве подстила для содержания морских свинок был использован коммерческий подстил, представляющий собой древесную стружку мягких нехвойных пород древесины (ООО «Лабораторкорм», Россия).

Пищевой рацион морских свинок состоял из гранулированного корма, сена, а также свежих овощей (обусловлено видовой потребностью).

Животные получали профильтрованную водопроводную воду в стандартных автоклавированных поилках (ООО «Профлаб», Россия).

Для проведения исследования животных (n=5) заражали внутрибрюшинным способом в дозе 1 мл³/гол. с концентрацией 3 млрд м.кл. В результате чего было установлено, что штамм вызывает гибель всех животных в течение 2-4 суток с момента инфицирования.

Пример №5. Определение антибиотикочувствительности штамма Actinobacillus rossii B-1427.

Определение антибиотикочувствительности штамма проводили диско-диффузным методом (ДДМ) в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

В ходе проведения данной работы установлено, что: штамм чувствителен к амоксиклаву, амоксициллину, ципрофлоксацину, клиндамицину, цефепиму, тилмикозину, рифампицину, цефазолину, энрофлоксацину, цефтриаксону. Штамм резистентен к гентамицину, левофлоксацину, пефлоксацину, спирамицину, стрептомицину, сульфадиазину, тиамулину, тилозину, хлортетрациклину.

Пример №6. Секвенирование гена 16S rRNA штамма Actinobacillus rossii – B-1427.

Для определения видовой идентификации дополнительно проводили секвенирование фрагмента генома штамма с использованием дополнительной пары праймеров, комплементарных фрагменту гена 16S rRNA Actinobacillus rossii. Секвенирование ПЦР-фрагментов осуществляли с использованием набора Big Dye® Terminator v1.1. Cycle Sequencing Kit на амплификаторе GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystem, США) и автоматическом секвенатоpe ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Thermo Fisher, Франция).

В результате проведенной работы была установлена нуклеотидная последовательность участка гена 16S rRNA SEQ ID NO:1:

gactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgctgaggaaggcagttactttaatagagtagttgattgacgttagtcacagaagaagtaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcrgaataactgggcgtaaagggcacgcaggcggtgayttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcatactgggtcgatagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaatgtactgacgctcatgtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgctgtcgatttggggattgagctttaagcttggtgcccgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagacccttacctactcttgacatccatagaatcctgtagagatacgggagtgccttagggagctatgagacaggtgcatcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgatacggtcgggaactcaaaggagattgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgc.

Пример №7. Изготовление экспериментальной серии инактивированной вакцины против инфекционных абортов свиней вызванных Actinobacillus rossii.

Экспериментальная серия инактивированной вакцины против инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii, изготовлена на базе ФКП «Армавирская биофабрика», при условиях глубинного культивирования. Для культивирования штамма по изобретению использовали сердечно-мозговой бульон («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия) с добавлением никотинамид-β-аденин динуклеотида (NAD) (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Китай) и/или дрожжевого экстракта («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия).

Культивирование проводилось в течение 12 часов при температуре 37 ºС. Полученную культуру проверяли по показателям: типичности культуральных, морфологических и тинкториальных свойств штамма, отсутствие посторонней микрофлоры, концентрация микробных клеток. Концентрация бактериальных клеток возбудителя 2,3 млрд. м.к./см³. Инактивировали культуру путём добавления 0,3 % формалина к общему объёму бактериальной суспензии. Продолжительность инактивации бактериальных антигенов составляла 3 суток при температуре 21±1 °С.

Для оценки иммуногенных свойств предложенного штамма была скомпонована серия вакцины с использованием гидроксида алюминия (далее - ГОА) (ФКП «Щелковская биофабрика», Россия). Поскольку данный адъювант является хорошим осадителем, то предварительно полученная бактериальная культура не концентрировалась с использованием лабораторно/промышленного оборудования (центрифуги и/или сепаратора). Осаждение бактериальной массы проводили путем добавления к бактериальной культуре, полученной в ферментере, 3%-ного раствора ГОА в объеме 10%. После осаждения бактериальной массы и ГОА проводили декантирование надосадочной жидкости. Таким образом удается проводить 10-кратное концентрирование. Для доведения концентрации бактериальных клеток в 1 см³, могут быть использованы любые разбавители (стерильный физиологический раствор, стерильная вода для инъекций, стерильный фосфатно-буферный раствор и т.д.). Концентрацию протективного антигена в вакцине доводили до 3 млрд. м.к. см³. Концентрацию водородных ионов полученных препаратов регулировали с использованием раствора щелочи до значения 7,2-7,6 ед. В качестве консерванта использовался мертиолят натрия (из расчета 1:10000 v/v).

Пример № 8. Контроль иммуногенной активности экспериментальных серий вакцины против инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii.

Цель настоящего исследования заключалась в подтверждение того, что сформированный уровень антительного ответа в результате иммунизации композицией по изобретению способен защитить животных от прямого заражения летальной дозой патогена. Исследование иммуногенной активности экспериментальных вакцин (полученных согласно примеру №7) проводили в условиях вивария ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН с использованием морских свинок. Было сформировано 2 группы животных: опытная группа (n=10), и контрольная группа (n=10). Морских свинок опытной группы иммунизировали внутримышечно двукратно в объеме 0,5 мл с интервалом 14 дней. Животным контрольных групп внутримышечно вводился стерильный физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Спустя 14 дней после второй вакцинации, животные опытной и контрольной групп были подвергнуты инфицированию штаммом B-1427 в дозе 4 млрд м.к. внутрибрюшинно. Срок наблюдения за животными составлял 10 дней. В результате эксперимента была установлена 80 % гибель животных в контрольной группе и 100% сохранность животных в опытной группе. Таким образом, полученные результаты показали, что на фоне вакцинации сформировался титр антител, который обеспечивает защиту животных от острого инфицирования, что в свою очередь коррелирует с тем, что поскольку животные выживают в данном остром тесте, то и инфекция как таковая не развивается, соответственно аборты как таковые отсутствуют.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, иммунологии и биотехнологии. Предложены штамм бактерий Actinobacillus rossii B-1427, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных; применение штамма для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii; иммуногенная композиция для профилактики инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii, и способ профилактики инфекционных абортов у субъекта, включающий введение композиции субъекту. Изобретение позволяет конструировать и производить высокоэффективные иммунобиологические средства, в частности моно- и поливалентные иммуногенные композиции, направленные на специфическую профилактику инфекционных абортов свиней, вызванных одноименным патогеном. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 пр.

1. Штамм бактерий Actinobacillus rossii B-1427, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1427 и предназначенный для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii.

2. Применение штамма по п.1 для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii.

3. Иммуногенная композиция для профилактики инфекционных абортов свиней, вызванных Actinobacillus rossii, включающая профилактически эффективное количество инактивированного протективного антигена штамма по п.1, адъювант и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

4. Композиция по п.3, в которой вспомогательное вещество представляет собой растворитель, наполнитель.

5. Композиция по п.3, в которой адъювант выбирается независимо и представляет собой гидроксид алюминия, ПЭГ-6000, карбапол, масляный адъювант.

6. Композиция по п.5, в которой масляный адъювант представляет собой адъювант марки MONTANIDE ISA 206.

7. Композиция по п.5, в которой карбапол представляет собой карбапол марки Carbopol 971Р.

8. Способ профилактики инфекционных абортов у субъекта, включающий введение композиции по п.3 субъекту.

9. Способ по п.8, в котором субъект представляет собой свинью.