Область техники
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, иммунологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве и контроле инактивированных иммунобиологических средств в виде моно- и поливалентных препаратов, предназначенных для профилактики инфекции свиней, вызванной Actinobacillus pleuropneumoniae.
Уровень техники
Актинобациллезная плевропневмония (АПП) - тяжелое, контагиозное респираторное заболевание свиней, преимущественно поросят в возрасте до 6 месяцев, а также среди ремонтного и родительского поголовья. По мнению отдельных исследователей развитие и распространение патологии зависит от наличия предрасполагающих триггеров. Есть и другое мнение, согласно которому АПП является самостоятельным заболеванием, на которое наслаиваются вторичные патогены. По мнению авторов настоящего изобретения, оба предположения верны, ввиду существования низко и высокопатогенных серотипов актинобацилл.
АПП характеризуется внезапной вспышкой, острым течением, высокой заболеваемостью и смертностью. При данном заболевании отмечается токсемия, гнойное/геморрагическое воспаление легких, воспаление наружной оболочки сердца и плевры, артриты [Получение анатоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae и изучение их свойств. Лебедев Никита Викторович, автореферат, 2013].
В настоящее время возбудитель АПП (Actinobacillus pleuropneumoniae) классифицируют следующим образом: семейство Pasteurellaceae, род Actinobacillus, который в свою очередь включает 18 видов: anseriformium, arthritidis, capsulatus, delphinicola, equuli, hominis, indolicus, lignieresii, minor, pleuropneumoniae, porcinus, rossii, scotiae, seminist, succinogenes, suis, ureae, vicugnae.
В настоящее время выделяют 19 серотипов A. pleuropneumoniae. По данным F. Haesebrouck и других авторов, вирулентность может зависеть от биотипа и/или серотипа возбудителя [Actinobacillus pleuropneumoniae infections in pigs: the role of virulence factors in pathogenesis and protection F. Haesebrouck, K. Chiers, I. Van Overbeke, R. Ducatelle/ Veterinary Microbiology.V. 58, Is. 2-4, 1997, P. 239-249].
Источником возбудителя являются больные животные, а также бактерионосители. Пути передачи: контактно, аэрогенно. Возбудитель АПП обладает выраженной тропностью к тканям воздухоносных путей, может передаваться как от зараженных животных здоровым, так и от свиноматки поросятам [Actinobacillus pleuropneumoniae surface polysaccharides: their role in diagnosis and immunogenicity / J.D. Dubreuil, M. Jacques, K.R. Mittal, M. Gottschalk // Anim. Health Res. - 2000. - Vol.2. - P.73-93].
К возбудителю восприимчивы свиньи всех возрастов и разных пород. На фермах могут одновременно циркулировать несколько серотипов. При внутрибрюшинном и интраназальном заражении чувствительны белые мыши и морские свинки.
Эффективная профилактика и борьба с актинобациллезной плевропневмонией включает: соблюдение ветеринарных мероприятий (иммунизация, применение антибактериальных средств, витаминов), зоотехнических и технологических мер.
Вакцины против АПП разделяют на субъединичные (токсоидные) и цельноклеточные (корпускулярные). Токсоидные препараты уменьшают заболеваемость и проявление симптомов болезни, бактерин-токсоидные, и на основе бактерина защищают от гомологичного серовара. Некоторые субъединичные вакцины содержат токсины Apx в сочетании с капсульным антигеном или белком наружной мембраны. Компания Novartis разработала бесклеточную пятивалентную субъединичную вакцину «Pleurostar», которая показала ограниченную защиту от тяжелого заражения АПП серотипа 9. Вакцина была получена с использованием рекомбинантных антигенов АПП и содержала в своем составе трансферринсвязывающий белок В. Что касается живых аттенуированных вакцин, то важно чтобы штамм обладал высокоиммуногенным свойством и был авирулентным либо слабовирулентным, вызывал переболевание в легкой степени, потеряв способность к горизонтальной передаче.
Из уровня техники известен иммуногенный и негемолитический штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под регистрационным номером СЕСТ 5994, для приготовления живой аттенуированной вакцины против свиной плевропневмонии [RU2351360]. Штамм характеризуется тем, что он имеет делецию последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxI, которая кодирует вторую трансмембрану экзотоксина Apxl и, кроме того, делецию последовательности нуклеотидов 886-945 гена apxIIA, которая кодирует вторую трансмембрану экзотоксина ApxII.
Из уровня техники известен штамм Actinobacillus pleuropneumoniae серотипа 2 KVCC-BA1200398 (KACC 91766P), депонированный в Корейской коллекции сельскохозяйственных культур Института сельскохозяйственной биотехнологии, который может быть использован для получения вакцинной композиции для профилактики плевропневмонии свиней [KR101491803B1]. Также известен другой штамм Actinobacillus pleuropneumoniae серотипа 2 CCTCC NO:M2011410, предназначенный для создания вакцинного препарата против плевропневмонии свиней [CN102391975B].
Из уровня техники известен штамм Actinobacillus pleuropneumoniae серотипа 1 KVCC-BA1200396 (KACC 91772P), депонированный в Корейской коллекции сельскохозяйственных культур Института сельскохозяйственной биотехнологии, пригодного для диагностики и вакцинации плевральной пневмонии, вызванной домашними свиньями [KR101491795B1].
Из уровня техники известен штамм Actinobacillus pleuropneumoniae серотипа 12 KVCC-BA1200404 (KACC 91770P), депонированный в Корейской коллекции сельскохозяйственных культур Института сельскохозяйственной биотехнологии, пригодного для диагностики и вакцинации плевральной пневмонии, вызванной домашними свиньями [KR101491793B1]. Также известен другой штамм Actinobacillus pleuropneumoniae серотипа 12 SDHG-1 CCTCC NO: M2021204, депонированный в Китайском центре коллекции типовых культур в Уханьском университете, город Ухань, Хубэй, Китай [CN113186120A].
Из уровня техники известен штамм Actinobacillus pleuropneumoniae серотипа 5 KVCC-BA1200401 (KACC 91768P), депонированный в Корейской коллекции сельскохозяйственных культур Института сельскохозяйственной биотехнологии, пригодного для диагностики и вакцинации плевральной пневмонии, вызванной домашними свиньями [KR101491792B1].
АПП является одним из наиболее важных бактериальных заболеваний респираторного тракта свиней. Поскольку микроорганизм и болезнь, которую указанный микроорганизм вызывает, были изучены широко и подробно, то имеющиеся знания были использованы для разработки новых вакцин и диагностических методов и для предложения относительно высокоэффективных программ ликвидации заболевания. Тем не менее, лучшие и наиболее экономичные методы борьбы с этим заболеванием все еще остаются предметом обсуждения. Таким образом, сохраняется необходимость в разработке и создании новых средств и подходов, направленных на профилактику АПП у свиней.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является получение нового штамма бактерии Actinobacillus pleuropneumoniae, отвечающего требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т. д. свойствам) и пригодного для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно- и поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику актинобациллезной плевропневмонии свиней.
Поставленная задача решается путем получения штамма Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423, депонированного во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук - ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) под номером B-1423 и предназначенного для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней.
Кроме того, настоящее изобретение включает применение Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423, депонированного во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук - ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) под номером B-1423, для получения иммунобиологического средства, в частности моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней.
Предметом настоящего изобретения также является иммуногенная композиция для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней, включающая профилактически эффективное количество инактивированного протективного штамма по изобретению, адъювант и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В частных вариантах воплощения изобретения вспомогательное вещество представляет собой растворитель, наполнитель. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворитель выбирается независимо и представляет собой стерильный физиологический раствор, стерильную воду для инъекций, стерильный фосфатно-буферный раствор и т.д. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения вспомогательное вещество представляет собой щелочь, мертиолят натрия.
В частных вариантах воплощения изобретения адъювант выбирается независимо и представляет собой гидроксид алюминия, ПЭГ-6000, карбапол, масляный адъювант. Более конкретно масляный адъювант представляет собой адъювант марки MONTANIDE ISA 206. В некоторых частных вариантах карбапол представляет собой карбапол марки Carbopol 971Р.
Кроме того, предметом настоящего изобретения также является способ профилактики актинобациллезной плевропневмонии у субъекта, включающий введение композиции по изобретению субъекту.
В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой свиней.
Настоящее изобретение также включает способ получения иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней, который осуществляют посредством штамма по изобретению.
Настоящее изобретение также включает применение штамма по изобретению для оценки эффективности иммуногенных композиций для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней.
В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:
- получен новый штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером B-1423 и предназначенный для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней;
- штамм по изобретению отвечает требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т. д. свойствам) и пригоден для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно- или поливалентных иммуногенных композиций для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней;
- использование штамма по изобретению при производстве иммунобиологических средств позволит повысить уровень эпизоотического благополучия по актинобациллезной плевропневмонии свиней;
- получена эффективная иммуногенная композиция на основе штамма по изобретению, которая предназначена для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней;
- разработан эффективный способ профилактики актинобациллезной плевропневмонии у субъекта, включающий введение композиции по изобретению субъекту.
Изобретение также служит средством расширения арсенала моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику актинобациллезной плевропневмонии свиней, обладает стабильностью, а также высокой антигенной, иммуногенной и протективной активностью.
Подробное раскрытие изобретения
Определение и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.
Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.
Термин «антиген» обозначает любое вещество, которое организм субъекта рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого организм может индуцировать (запускать) иммунный ответ. Это могут быть компоненты инфекционного агента, такие как, например, фрагменты белков бактерии, а также инфекционные агенты, сохранившие, хотя бы частично, присущую им структуру.
Под штаммом Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423 понимается как штамм Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных (Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук - ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) под номером B-1423, так и полученный с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала (например, мутант, вариант), и сохраняющий все свойства исходного штамма, т.е. обладающий всеми определяющими штамм Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423 (идентифицирующими) характеристиками. В том, числе, по меньшей мере, пригодный для получения моно- или поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику актинобациллезной плевропневмонии свиней.
Используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к штамму Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423 означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и химических веществ (составов), известных специалистам в данной отрасли или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.
Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у субъекта, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Субъекты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у субъектов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.
Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.
Под «профилактически эффективным количеством» подразумевается такое количество антигена штамма, вводимого или доставляемого субъекту, при котором у субъекта с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на профилактику. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида субъекта, способа введения препарата и т.п.
Термин «инактивированный протективный антиген штамма» в данном документе означает «нежизнеспособные» антигены микроорганизма, при введении которых лабораторным или целевым видам животных, способствуют образованию напряженного иммунного ответа, достаточного для обеспечения профилактического эффекта.
Термин «субъект» охватывает свиней, которые используют штамм и композицию по изобретению путем введения субъекту другим лицом для профилактики заболевания или медицинского состояния.
Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств бактерий и являются приемлемыми для использования в ветеринарии (безопасность для применения в ветеринарии). Частные варианты вспомогательных веществ включают носители или разбавители (растворители), например, воду.
Термин «LD50» - средняя доза вещества, вызывающая гибель половины членов испытуемой группы.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Осуществление изобретения
Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Пример № 1. Штамм микроорганизма Actinobacillus pleuropneumoniae - B-1423.
1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1423
2. Дата депонирования: 13.06.2023
3. Вид микроорганизма: Actinobacillus pleuropneumoniae
4. Основание для депонирования: для производства и контроля иммунологических лекарственных, а также диагностических средств против актинобациллезной плевропневмонии свиней.
5. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней" бактерия вида Actinobacillus pleuropneumoniae не относится ни к одной из четырёх групп патогенности.
6. Дата, источник и место выделения: Выделен из легких свиноматки, Белгородская область 2020 год.
7. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
8. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных, токсигенных свойств, а также с помощью масспектрального анализа; молекулярно-генетических свойств на наличие гена Apx IV (общего маркера).
9. Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные короткие не спорообразующие палочки, расположенные одиночно, реже парами, неподвижные. Образует капсулу.
10. Культуральные особенности: колонии штамма серовато-белые, с гладкой поверхностью на шоколадном агаре. На 28 час культивирования колонии достигают 1-2 мм. На кровяном агаре проявляется зона бета-гемолиза. На бульонных средах (триптон-соевый бульон, сердечно-мозговой бульон и т.д.) рост очень скудный с едва заметным помутнением и опалесценцией при наличии факторов роста.
11. Биохимические свойства: типичные для микроорганизма Actinobacillus pleuropneumoniae. При идентификации штамма в биохимическом наборе Api NH для идентификации бактерий родов Neisseria и Haemophilus (BioMerieux SA), штамм ферментирует D-глюкозу, D-фруктозу, D-мальтозу, D-сахарозу, уреазу, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу. Не продуцирует пенициллиназу, орнитиндекарбоксилазу, липазу, пролин ариламидазу, гамма-глутамилтрансфераза и индол.
12. Серологические свойства: относится к 8 серотипу.
13. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: штамм продуцирует токсин Apx III.
14. Вирулентность для лабораторных животных: при внутрибрюшинном введении 4 млрд м.к. 7-недельным морским свинкам, гибель животных наступает в течение 2-5 дней.
15. Устойчивость к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к амоксиклаву, ампициллину, бензилпенициллину, кларитромицину, рифампицину, сульфадиазину, сульфафуразолу, фосфомицину, хлортетрациклину, цефазолину, цефалексину, цефотаксиму, цефпирому, цефтриаксону, энрофлоксацину. Штамм резистентен к бацитрацину, гентамицину, левофлоксацину, линкомицину, норфлоксацину, олеандомицину, спирамицину.
16. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось.
17. Генетические характеристики: штамм имеет ген токсина (общий маркер) Apx IV.
Нуклеотидная последовательность гена 16S rRNA SEQ ID NO:1:
agactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtagcgaggaaggtatcaaatttaatagatttggtaattgacgttaactacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcacgcaggcggttgattaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcatactggtcaactagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcacccccttgggaatgtactgacgctcatgtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaagtctggtgcccgaagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagcaccttacctactcttgacatccatggaatcttatagagatacgagagtaccttcgggaaccatgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattaggtcgggaactcaaaggagactgcgggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggc
1. Условия культивирования: штамм требователен к питательным средам. Растет при pH-7,8 и температуре 37°С в течение 24-48 ч в сердечно-мозговом бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне и агаре Хоттингера с добавлением V и X факторов роста. Образует мелкие до 1 мм прозрачные колонии. В МПБ рост слабый с едва заметным помутнением и опалесценцией при наличии факторов роста.
2. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах при температуре от 2 до 8°С. Объем лиофилизата составляет 1 см3.Среда высушивания (для лиофилизированных): декстрановый стабилизатор. Периодичность обновления расплодки: один раз в пять лет.
Пример №2. Определение культуральных и морфологических свойств, а также типичности роста штамма Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423 на питательных средах.
При подтверждении культуральных и морфологических свойств штамма установлено, что колонии культуры серовато-белые, с гладкой поверхностью на шоколадном агаре. На 28 час культивирования колонии достигают 1-2 мм. На кровяном агаре проявляется зона бета-гемолиза. На бульонных средах (триптон-соевый бульон, сердечно-мозговой бульон и т.д.) рост очень скудный с едва заметным помутнением и опалесценцией при наличии факторов роста. При микроскопировании установлено, что клетки культуры представляют собой мелкие грамотрицательные короткие не спорообразующие палочки, расположенные одиночно, реже парами, неподвижные. Образует капсулу.
Пример №3. Определение биохимических свойств штамма Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423.
Для изучения биохимических свойств культуры Actinobacillus pleuropneumoniae используются коммерческие тест системы с сопутствующими расходными материалами и электронной базой для интерпретации полученного результата. Помимо коммерческих биохимических тест-систем могут быть использованы углеводы в дисках для определения сахаролитических свойств. Испытание проводится согласно инструкции производителя диагностикума.
В частности, при использовании коммерческого набора API® NH (System for the identification of Neisseria and Haemophilus) (BioMérieux SA, Франция) были получены следующие результаты идентификации:
Штамм ферментирует D-глюкозу, D-фруктозу, D-мальтозу, D-сахарозу, уреазу, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу. Не продуцирует пенициллиназу, орнитиндекарбоксилазу, липазу, пролин ариламидазу, гамма-глутамилтрансфераза и индол.
Пример №4. Определение серотипа штамма Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423.
Определение серотиповой принадлежности предлагаемого штамма проводили методом Real-Time PCR с использованием набора Kylt® Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) (SAN Group Biotech Germany GmbH, Германия) согласно инструкции производителя (https://www.kylt.eu/templates/images/products/395_1_pdf/Kylt_APP_Direction%20For%20Use_Kit_Rev004.pdf?v=1697542885; https://www.kylt.eu/templates/images/products/504_1_pdf/Kylt_APP%20Serotpye%2012,13,18_Direction%20For%20Use_Rev001_.pdf?v=1697542885; https://www.kylt.eu/templates/images/products/498_1_pdf/Kylt_APP%20Serotpye%202%205%209-11_Direction%20For%20Use_Rev001.pdf?v=1697542885; https://www.kylt.eu/templates/images/products/518_1_pdf/Kylt_APP%20Serotype%206,%207,%208_Direction%20For%20Use_Rev001.pdf?v=1697542885).
В ходе проведенного исследования было установлено, что штамм относится к 8 серотипу Actinobacillus pleuropneumoniae.
Пример №5. Определение патогенности штамма Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423.
Определение патогенности штамма проводили с использованием морских свинок в возрасте 6-7 недель жизни. При проведении исследования лабораторные животные подбирались по принципу аналогов (стандартные параметры массы тела, возраст, состояние здоровья). Животных содержали в помещениях вивария. Параметры микроклимата соответствовали требованиям [СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)"]. Кормление осуществлялось специальными концентрированными комбикормами. Животные индивидуально маркировались. На карточке клетки указывались номер исследования, руководитель исследования, номер протокола биоэтической комиссии, номер клетки, номера животных и номер группы.
Лабораторные животные содержались в комнате содержания животных барьерного типа с автоматической сменой дневного и ночного периода (08:00-20:00 - «день», 20:00-08:00 - «ночь») и как минимум 12-кратной сменой воздушного объема комнаты в час.
За стандарты содержания животных приняты стандарты, определенные Директивой 2010/63/EU по защите животных, используемых в научных целях. В качестве приемлемых границ параметров микроклимата в комнатах содержания животных приняты границы, определенные руководством The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington D.C., 2011).
Морские свинки, используемые в опыте, содержались в специализированных клетках М6 - Т4/1 (ООО «Профлаб», Россия). В качестве подстила для содержания морских свинок был использован коммерческий подстил, представляющий собой древесную стружку мягких нехвойных пород древесины (ООО «Лабораторкорм», Россия).
Пищевой рацион морских свинок состоял из гранулированного корма, сена, а также свежих овощей (обусловлено видовой потребностью).
Животные получали профильтрованную водопроводную воду в стандартных автоклавированных поилках (ООО «Профлаб», Россия).
Для проведения исследования животных (n=5) заражали внутрибрюшинным способом в дозе 1 мл3/гол. с концентрацией 4 млрд м.кл. В результате чего было установлено, что штамм вызывает гибель всех животных в течение 2-5 суток с момента инфицирования.
Пример №6. Определение антибиотикочувствительности штамма Actinobacillus pleuropneumoniae
Определение антибиотикочувствительности штамма проводили диско-диффузным методом (ДДМ) в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».
В работе были использованы диски со следующими антибиотиками: амоксиклав (30 мкг), ампициллин (10 мкг), бацитрацин (10 U), бензилпенициллин (10 U), гентамицин (10 мкг), кларитромицин мм (15 мкг), левофлоксацин (5 мкг), линкомицин (10 мкг), норфлоксацин (10 мкг), олеандомицин (15 мкг), рифампицин (15 мкг), спирамицин (30 мкг), сульфадиазин (100 мкг), сульфафуразол (300 мкг), фосфомицин (50 мкг), хлортетрациклин (30 мкг), цефазолин (30 мкг), цефалексин (30 мкг), цефотаксим (30 мкг), цефпиром (30 мкг), цефтриаксон (30 мкг), энрофлоксацин (10 мкг), («Himedia», Индия). Учёт результатов проводился спустя 24 и 48 часа термостатирования по диаметру зон задержки роста бактерий.
В ходе проведения данной работы установлено, что: штамм чувствителен к амоксиклаву, ампициллину, бензилпенициллину, кларитромицину, рифампицину, сульфадиазину, сульфафуразолу, фосфомицину, хлортетрациклину, цефазолину, цефалексину, цефотаксиму, цефпирому, цефтриаксону, энрофлоксацину. Штамм резистентен к бацитрацину, гентамицину, левофлоксацину, линкомицину, норфлоксацину, олеандомицину, спирамицину.
Пример №7. Определение генов токсинов штамма Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423.
Определение генов токсинов штамма проводили с использованием набора Actinobacillus pleuropneumoniae Multiplex DNA test kit, Biochek (Biochek UK Ltd, Великобритания) согласно инструкции производителя (https://www.biochek.com/swine-pcr/actinobacillus-pleuropneumoniae-multiplex-dna-test-kit/).
В ходе проведенного исследования было установлено, что штамм имеет ген токсина Apx IV, что является общим маркером для данного возбудителя. Кроме того, данным способом обнаружен токсин Apx III, который типичен для 2, 3, 4, 6, 8 и 15 серотипов.
Пример №8. Секвенирование гена 16S rRNA штамма Actinobacillus pleuropneumoniae - B-1423.
Для определения видовой идентификации дополнительно проводили секвенирование фрагмента генома штамма с использованием дополнительной пары праймеров, комплементарных фрагменту гена 16S rRNA Actinobacillus pleuropneumoniae. Секвенирование ПЦР-фрагментов осуществляли с использованием набора Big Dye® Terminator v1.1. Cycle Sequencing Kit на амплификаторе GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystem, США) и автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Thermo Fisher, Франция).
В результате проведенной работы была установлена нуклеотидная последовательность участка гена 16S rRNA SEQ ID NO:1:
Agactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtagcgaggaaggtatcaaatttaatagatttggtaattgacgttaactacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcacgcaggcggttgattaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcatactggtcaactagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcacccccttgggaatgtactgacgctcatgtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaagtctggtgcccgaagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagcaccttacctactcttgacatccatggaatcttatagagatacgagagtaccttcgggaaccatgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattaggtcgggaactcaaaggagactgcgggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggc.
Пример №9. Изготовление экспериментальной серии инактивированной вакцины против актинобациллезной плевропневмонии свиней
Экспериментальная серия инактивированной вакцины против актинобациллезной плевропневмонии свиней изготовлена на базе ФКП «Армавирская биофабрика», при условиях глубинного культивирования. Для культивирования штамма по изобретению использовали сердечно-мозговой бульон («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия) с добавлением Никотинамид-β-аденин динуклеотида (NAD) (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Китай) и/или дрожжевого экстракта («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия).
Культивирование проводилось в течение 12 часов при температуре 37°С. Полученную культуру проверяли по показателям: типичности культуральных, морфологических и тинкториальных свойств штамма, отсутствие посторонней микрофлоры, концентрация микробных клеток. Концентрация бактериальных клеток возбудителя 1,6 млрд. м.к./см3. Инактивировали культуру путём добавления 0,3 % формалина к общему объёму бактериальной суспензии. Продолжительность инактивации бактериальных антигенов составляла 3 суток при температуре 21±1°С.
Для оценки иммуногенных свойств предложенного штамма была скомпонована серия вакцины с использованием гидроксида алюминия (далее - ГОА) (ФКП «Щелковская биофабрика», Россия). Поскольку данный адъювант является хорошим осадителем, то предварительно полученная бактериальная культура не концентрировалась с использованием лабораторно/промышленного оборудования (центрифуги и/или сепаратора). Осаждение бактериальной массы проводили путем добавления к бактериальной культуре, полученной в ферментере, 3%-ного раствора ГОА в объеме 10%. После осаждения бактериальной массы и ГОА проводили декантирование надосадочной жидкости. Таким образом удается проводить 10-кратное концентрирование. Для доведения концентрации бактериальных клеток в 1 см3, могут быть использованы любые разбавители (стерильный физиологический раствор, стерильная вода для инъекций, стерильный фосфатно-буферный раствор и т.д.). Концентрацию протективного антигена в вакцине доводили до 3 млрд. м.к. см3. Концентрацию водородных ионов полученных препаратов регулировали с использованием раствора щелочи до значения 7,2-7,6 ед. В качестве консерванта использовался мертиолят натрия (из расчета 1:10000 v/v).
Пример № 10. Контроль иммуногенной активности экспериментальных серий вакцины против актинобациллезной плевропневмонии свиней
Исследование иммуногенной активности экспериментальных вакцин (полученных согласно примеру №9) проводили в условиях вивария ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН с использованием морских свинок. Было сформировано 2 группы животных: опытная группа (n=10), и контрольная группа (n=10). Морских свинок опытной группы иммунизировали внутримышечно двукратно в объеме 0,5 мл с интервалом 14 дней. Животным контрольных групп внутримышечно вводился стерильный физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Спустя 14 дней после второй вакцинации, животные опытной и контрольной групп были подвергнуты инфицированию штаммом B-1423 в дозе 4 млрд м.к. внутрибрюшинно. Срок наблюдения за животными составлял 10 дней. В результате эксперимента была установлено 100 % гибель животных в контрольной группе и 90% сохранность животных в опытной группе.
Данный результат был достигнут за счет использования адъюванта, в частности, при использовании ГОА в качестве адъюванта, токсоидный компонент выпал в осадок с бактериальной массой, что и позволило получить эффективный вариант бактерин-токсодного иммунобиологического препарата. Здесь же отмечается, что вместо ГОА возможно использование любых других эффективных адъювантов, с данным штаммов. Ввиду чего, целесообразно использование методов тангенциальной фильтрации и концентрирования токсинов, продуцируемых предлагаемым штаммом.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="4104060_перечень
последовательностей.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-12-13">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference> 4104060</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной
ответственностью «Центр биотехнологической обработки продуктов
питания при институте микроэкологии» </ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Obschestvo s ogranichennoi otvetstvennostiu
"Centr biotekhnologicheskoi obrabotki produktov pitaniya pri
institute mikroehkologii"</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Штаммы бактерий Actinobacillus
pleuropneumoniae 8 серотипа, предназначенный для получения моно- и
поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую
профилактику актинобациллезной плевропневмонии
свиней</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>894</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..894</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Actinobacillus
pleuropneumoniae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggg
gaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaa
agttctttcggtagcgaggaaggtatcaaatttaatagatttggtaattgacgttaactacagaagaagc
accggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgt
aaagggcacgcaggcggttgattaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcat
actggtcaactagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtgg
aggaataccgaaggcgaaggcacccccttgggaatgtactgacgctcatgtgcgaaagcgtggggagcaa
acaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaagtctggt
gcccgaagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaatgaattga
cgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagcaccttacctactcttg
acatccatggaatcttatagagatacgagagtaccttcgggaaccatgagacaggtgctgcatggctgtc
gtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcg
attaggtcgggaactcaaaggagactgcgggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatc
atggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретения относятся к области ветеринарной микробиологии, иммунологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, предназначенный для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней. Также предложены иммуногенная композиция на основе указанного штамма и способ профилактики актинобациллезной плевропневмонии у свиней с ее использованием. Изобретения могут быть использованы при производстве и контроле инактивированных иммунобиологических средств в виде моно- или поливалентных препаратов, предназначенных для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней, вызванной Actinobacillus pleuropneumoniae. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 10 пр.
1. Штамм бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae B-1423, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1423 и предназначенный для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней.
2. Применение штамма по п.1 для получения моно- или поливалентной иммуногенной композиции для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней.
3. Иммуногенная композиция для профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней, включающая профилактически эффективное количество инактивированной бактериальной массы штамма по п.1, адъювант и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
4. Композиция по п.3, в которой вспомогательное вещество представляет собой растворитель, наполнитель.
5. Композиция по п.3, в которой адъювант выбирается независимо и представляет собой гидроксид алюминия, ПЭГ-6000, карбапол, масляный адъювант.
6. Композиция по п.5, в которой масляный адъювант представляет собой адъювант марки MONTANIDE ISA 206.
7. Композиция по п.5, в которой карбапол представляет собой карбапол марки Carbopol 971Р.
8. Способ профилактики актинобациллезной плевропневмонии у свиней, включающий введение композиции по п.3 свинье.
