СПОСОБ СОЗДАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЯИЧНИКОВ НА КРЫСАХ ЛИНИИ WISTAR Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно способу создания моделей заболеваний, и может быть использовано для создания клеточной модели преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ). ПНЯ характеризуется ускоренной потерей фолликулов в фертильном периоде и преждевременным прекращением функции яичников. Согласно Руководству Европейского общества по репродукции человека и эмбриологии (англ. European Society of Human Reproduction and Embryology, ESHRE), диагноз ПНЯ основывается на наличии олигоменореи или аменореи в течение не менее 4 месяцев в сочетании с повышением уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ)>25 МЕ/л, подтвержденным дважды (не во время овуляции), с интервалом более 4 недель (Webber L. et al., ESHRE guideline. Management of women with premature ovarian insufficiency. Hum Reprod. 2016; 31(5):926-37. https://doi.org/10.1093/humrep/dew027. Reed D. Primary ovarian insufficiency: a primary care overview. Proc UCLA Heal, 2019. 23). Данный синдром характеризуется неблагоприятными долгосрочными последствиями для здоровья женщины, включая повышенный риск ишемической болезни сердца, остеопороза, деменции, дислипидемии и многих других хронических заболеваний (Dhanushi Fernando W. et al. Premature ovarian insufficiency and infertility. Aust J Gen Pract. 2023; 52(l-2):32-38. doi:10.31128/AJGP-08-22-6531). Кроме того, существуют психологические последствия потери фертильности, которые могут провоцировать развитие депрессий и быть причиной достоверного снижения качества жизни.

В недавнем масштабном метаанализе, в который вошли данные 31 исследования, распространенность ПНЯ составила 3,7%. При этом в возрасте 20 лет ПНЯ встречается у 1 женщины из 10 тыс., а в 30 лет - у 1 женщины из 1000 (Golezar S. et al. The global prevalence of primary ovarian insufficiency and early menopause: a meta-analysis. Climacteric. 2019; 22(4):403-11. https://doi.org/10.1080/13697137.2019.1574738).

ПНЯ - полиэтиологическое заболевание, причем у значительного количества женщин причина остается неизвестной. Единственным методом терапии ПНЯ признана заместительная гормональная терапия, которую продолжают до среднего возраста наступления естественной менопаузы. Реализация репродуктивной функции возможна с применением методов вспомогательных репродуктивных технологий (ооцитов донора).

В настоящее время не существует единого подхода и универсального метода лечения ПНЯ, учитывая крайне полиморфную клиническую картину. Следовательно, необходимо дальнейшее изучение патогенеза ПНЯ с разработкой альтернативных методов патогенетически обоснованной терапии. Перспективным является изучение эффективности применения различных лекарственных препаратов на течение заболевания в рамках доклинических испытаний с использованием клеточных моделей.

В литературе описан ряд экспериментальных моделей ПНЯ на лабораторных животных, однако в доступных литературных источниках мы не встретили сообщений о способах моделирования ПНЯ на клеточной линии.

Техническим результатом изобретения является создание клеточной модели ПНЯ, обеспечение 100% эффективности моделирования, создание модели в короткие сроки, высокая технологичность и экологическая безопасность моделирования патологического состояния, возможность проводить с помощью созданной модели тестирование лекарственной эффективности химических веществ с целью их дальнейшего использования в медицине.

Клеточные культуры для моделирования различной патологии привлекают внимание исследователей как перспективные потенциальные системы для исследования механизма нарушения, а также возможности тестирования различных фармакологических препаратов. При этом немаловажным преимуществом является более целесообразное использование опытных животных (исключается необходимость использования множества групп животных), продолжительность эксперимента (значительно короче, так как не требуется длительная экспозиция после введения лабораторному животному).

Дополнительным преимуществом данного изобретения является то, что клеточные линии являются более технологичным и экологически безопасным методом моделирования патологического состояния, а масштабы культивирования обеспечивают производство клеточных линий в количествах, достаточных для клинических испытаний и терапевтического использования.

Указанный технический результат достигается в способе создания клеточной модели ПНЯ, в котором культуру гранулезных клеток яичника крысы линии Wistar после пяти этапов субкультивирования обрабатывают препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов.

Способ иллюстрируется фиг. 1, 2, где:

На фиг. 1 - графическое подтверждение возникающего изменения сигнала в ответ на введение фоликулостимулирующего гормона (FSH), свидетельствующее о том, что исследуемые клетки являются гранулезными клетками яичников.

На фиг. 2 - графическое подтверждение возникающей дисфункции комплекса I электронтранспортной цепи, ассоциированной с действием циклофосфамида.

Заявляемый способ основан на экспериментальных исследованиях с включением 9 самкок крыс линии Wistar.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

У половозрелой крысы линии Wistar осуществляют забор яичника посредством лапаротомии, полученный фрагмент промывают трижды стерильным изотоническим раствором NaCl, механически измельчают ткань, промывают раствором Версена с последующей трипсинизацией. Далее раствор трипсина удаляют, а фрагменты трижды отмывают раствором DMEM и добавляют коллагеназу (0,2%-ный раствор коллагеназы; 10 мл раствора на 1 г ткани), после чего коллагеназу нейтрализуют добавлением фетальной бычьей сыворотки, измельчают ткань до получения однородной суспензии. Полученную суспензию трижды отмывают раствором DMEM и суспензируют в полной ростовой среде. Проводят 5 этапов субкультивирования культуры гранулезных клеток крыс линии Wistar, пересевают в простерилизованные круглые покровные стекла и обрабатывают препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов, обрабатывают препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов. Оценивают величину и механизм поддержания митохондриального мембранного потенциала.

Известно, что препарат циклофосфамид вызывает индукцию хромосомных аберраций, обмен сестринскими хроматидами, одноцепочечные разрывы и образование двойных поперечных связей ДНК, что в последующем приводит к усиленному апоптозу клеток (Kalich-Philosoph L. et al. (2013) Cyclophosphamide triggers follicle activation and burnout; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med 5: 185ra62). Полученные нами результаты продемонстрировали снижение интенсивности флуоресценции TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester), что свидетельствует о резком падении величины митохондриального мембранного потенциала (фиг. 2) При этом в отличие от контроля в модельных клетках практически отсутствовала деполяризация митохондрий в ответ на введение ротенона, что говорит о возникающей дисфункции комплекса I (NADH-дегидрогеназный комплекс) электронтранспортной цепи, ассоциированной с действием циклофосфамида.

Заявляемый способ может быть легко воспроизведен в условиях экспериментальных лабораторий. Все эксперименты и приготовления проводились в стерильных условиях.

Пример осуществления способа.

В качестве клеточной линии была использована культура гранулезных клеток крыс линии Wistar. У половозрелой крысы линии Wistar (возраст - 4 месяца, карантин - 2 недели) весом 258 г в условиях изофлурановой анестезии осуществляли забор правого яичника: проводили лапаротомию, выделение правого рога матки, визуализацию правого яичника, перевязку и пересечение сосудисто-нервного пучка. Полученный фрагмент трижды промывали стерильным изотоническим раствором NaCl. Затем яичник механически измельчали и промывали раствором Версена с последующей трипсинизацией (0,25%-ный раствор трипсина; 10 мл раствора на 1 г ткани) при температуре 37°C в течение 45 минут. Затем раствор трипсина удаляли, фрагменты ткани трижды отмывали средой DMEM и подвергали воздействию коллагеназы (0,2%-ный раствор коллагеназы; 10 мл раствора на 1 г ткани) при температуре 37°C в течение 45 минут. Действие фермента останавливали добавлением 2 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС), после чего фрагменты ткани измельчали пипетированием до получения однородной суспензии. Клетки трижды отмывали средой DMEM с последующим суспендированием в полной ростовой среде (DMEM с содержанием глюкозы 1 г/л, 10% ФБС, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-аланил-L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). Культивирование клеток осуществляли в CO2-инкубаторе при температуре 37°С и содержании CO2 5% до достижения конфлюэнтности монослоя адгезионной культуры не менее 70%. Для моделирования преждевременной недостаточности яичников использовали клетки, полученные после пяти этапов субкультивирования. Для выполнения пересева культуру дважды промывали раствором Версена (0,1 мл на 1 см² поверхности культурального флакона) с последующей обработкой раствором трипсина (0,25%, 0,1 мл на 1 см² поверхности культурального флакона) и выдерживанием при температуре 37°С при периодическом покачивании. После полного открепления монослоя фермент инактивировали внесением полной ростовой среды (0,1 мл на 1 см² поверхности культурального флакона), отделяли центрифугированием с последующей декантацией надосадочной жидкости, а клетки дважды промывали полной ростовой средой. Контроль численности жизнеспособнных клеток в полученной суспензии осуществляли путем окрашивания трипановым синим (рабочая концентрация 0,2%) и подсчета в камере Горяева. Начальная концентрация в культуральном флаконе при пересеве составляла 104 клеток на 1 см².

Для проведения исследований клетки снимали с культурального флакона описанным методом с использованием трипсина, после чего высевали на предварительно простерилизованные круглые покровные стекла и культивировали до достижения конфлюэнтности не менее 70%. В целях идентификации культуры проводили функциональный анализ клеток, основанный на активации кальциевой сигнализации в гранулезных клетках яичников с помощью ФСГ. Для этого клетки на покровных стеклах трижды отмывали от ростовой среды с помощью сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) с последующим инкубированием в 5 мкМ растворе ратиометрического кальций-чувствительного зонда Fura-2 AM в течение 45 минут при температуре 37°С с добавлением 0,005% Pluronic F127 с последующей трехкратной отмывкой HBSS. Флуоресцентные исследования проводили на широкопольном флуоресцентном микроскопе с иммерсионным флюоритовым объективом (×20) с применением двух длин волн возбуждения - 380 нм и 340 нм для свободной и связанной с кальцием форм зонда Fura-2. В качестве аналитического сигнала использовали соотношение интенсивности флуоресценции при возбуждении длинами волн 340 нм и 380 нм (соотношение 340/380). Протокол измерения включал регистрацию базового уровня аналитического сигнала с последующим введением препарата фолликулостимулирующего гормона (фиг. 1).

Изменение характера сигнала в ответ на введение ФСГ свидетельствует о том, что исследуемые клетки являются гранулезными клетками яичников.

Для моделирования ПНЯ клетки на покровных стеклах обрабатывали препаратом циклофосфамида с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов и оценкой величины и механизма поддержания митохондриального мембранного потенциала. Для этого клетки на покровных стеклах трижды отмывали от ростовой среды с помощью сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) с последующим инкубированием в 25 нМ растворе митохондриально направленного флуоресцентного зонда тетраметилродамин (TMRM) в течение 45 минут при температуре 37°С. Флуоресцентные исследования проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе с использованием длины волны возбуждения 561 нм и регистрацией интенсивности флуоресценции в интервале 565-650 нм. Протокол измерения включал регистрацию базового уровня сигнала, сигнала после внесения ингибитора F1-F0-АТФ-синтазы олигомицина А (2 мкг/мл), ингибитора комплекса I ротенона (2 мкМ) и митохондриального разобщителя FCCP (2 мкМ). Величину митохондриального мембранного потенциала оценивали по амплитуде изменения интенсивности флуоресценции между базовым уровнем и уровнем после добавления FCCP. Оценку механизма поддержания митохондриального мембранного потенциала проводили по характеру изменению сигнала после добавок. В качестве контроля выступали гранулезные клетки яичников, которые не были обработаны препаратом циклофосфамида.

В сравнении с контролем обработанные препаратом клетки характеризуются почти 3-кратным снижением интенсивности флуоресценции TMRM, что говорит о резком падении величины митохондриального мембранного потенциала. При этом в отличие от контроля в модельных клетках практически отсутствует деполяризация митохондрий в ответ на введение ротенона (фиг. 2), что говорит о возникающей дисфункции комплекса I электронтранспортной цепи, ассоциированной с действием циклофосфамида.

Заявляемый способ обеспечивает 100% эффективность моделирования, создание модели в короткие сроки, высокую технологичность и экологическую безопасность моделирования патологического состояния, позволяет изучить в дальнейшем эффективность различных химических веществ в качестве лекарственного препарата для лечения данного синдрома, улучшить персонификацию лечения заболевания, применять данную клеточную модель в фундаментальных и прикладных научных исследованиях.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к способу создания моделей заболеваний, и может быть использовано для создания клеточной модели преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ). Культуру гранулезных клеток яичника крысы линии Wistar после пяти этапов субкультивирования обрабатывают препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов. Способ обеспечивает 100% эффективность моделирования, создание модели в короткие сроки, высокую технологичность и экологическую безопасность моделирования ПНЯ, позволяет на его основе изучить эффективность различных веществ в качестве лекарственного препарата для лечения ПНЯ, улучшить персонификацию лечения. 2 ил., 1 пр.

Способ создания клеточной модели преждевременной недостаточности яичников, заключающийся в том, что культуру гранулезных клеток яичника крысы линии Wistar после пяти этапов субкультивирования обрабатывают препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов.