СПОСОБ СОЗДАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ МЕДИКАМЕНТОЗНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ПАТОГЕНЕЗ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЯИЧНИКОВ У КРЫС Российский патент 2025 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии и фармакологии, и предназначено для медикаментозного лечения преждевременной недостаточности яичников на основании клеточной модели.

Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) - синдром, характеризующийся гипергонадотропной недостаточностью яичников, снижением их функции у пациенток в возрасте до 40 лет и приводящий к нарушению репродуктивной функции, метаболическим изменениям, снижению качества жизни женщин (Webber L., Davies М., Anderson R. et al. ESHRE Guideline: management of women with premature ovarian insufficiency. Hum Reprod. 2016;31(5):926-37).

ПНЯ характеризуется ускоренной потерей фолликулов в фертильном периоде и преждевременным прекращением функции яичников. Распространенность ПНЯ может иметь этнические и региональные различия и со временем меняться из-за образа жизни и факторов окружающей среды, которые все еще нуждаются в дальнейшем изучении.

По данным исследования Luborsky J.L. et al. в 2003 году заболеваемость ПНЯ составила 1,1%. В исследовании также отмечалось, что распространенность ПНЯ была выше у афроамериканских и испаноязычных женщин, чем у европеоидных женщин, и ниже у азиатско-американских женщин (Luborsky JL, Meyer Р, Sowers MF, Gold ЕВ, Santoro N. Premature menopause in a multi-ethnic population study of the menopause transition. Hum Reprod (2003) 18:199-206. 10.1093/humrep/deg005).

Согласно данным национального реестра в Швеции, заболеваемость ПНЯ в 2018 году уже составила 1,8% (Lagergeren K, Hammar М, Nedstrand Е, Bladh M, Sydsiö G. The prevalence of primary ovarian insufficiency in Sweden; a national register study. BMC Womens Health (2018) 18:175-179).

По данным систематического обзора и метаанализа 2023 года, общая распространенность ПНЯ в мире достигла 3,5%; ятрогенные причины составляли 11,2%, аутоиммунные заболевания - 10,5%). Распространенность ПНЯ составила 5,3% в развивающихся странах и 3,1% в развитых, при этом отмечается тенденция к росту распространенности ПНЯ за последние 20 лет.(Li М, Zhu Y, Wei J, Chen L, Chen S, Lai D. The global prevalence of premature ovarian insufficiency: a systematic review and meta-analysis. Climacteric. 2023 Apr;26(2):95-102. doi: 10.1080/13697137.2022.2153033. Epub 2022 Dec 15. PMID: 36519275).

Данное патологическое состояние характеризуется неблагоприятными долгосрочными последствиями для здоровья женщины, включая повышенный риск ишемической болезни сердца, остеопороза, деменции, сахарного диабета, дислипидемии и многих других хронических заболеваний. (Dhanushi Fernando W, Vincent A, Magraith K. Premature ovarian insufficiency and infertility. Aust J Gen Pract. 2023 Jan-Feb;52(1-2):32-38. doi: 10.31128/AJGP-08-22-6531. PMID: 36796766).

ПНЯ - крайне гетерогенное заболевание, обусловленное мутациями в более чем 75 генах. Условно генетические причины преждевременного истощения яичников можно разделить на несколько групп: гены, влияющие на развитие яичников (NR5A1, FOXL2, BMPR1B); деление и репарацию ДНК (STAG3, POF1B, PSMC3IP, HFM1, NUP107, ATM, NBN, FANCA, RECQL4, МСМ8, МСМ9, NANOS3, BCL2); на развитие фолликулов и гормональные сигналы (FSHR, GDF9, BMP 15, FIGLA и NOB ОХ); метаболизм (POLG, C10orf2, LARS2, HARS2, AARS2, LARS2, HARS2, HSD17B4, GALT,PMM2, CDG1); иммунологическую регуляцию (AIRE, APS2), гены без уточненного механизма действия (POF1B, FMR1, BRCA1); хромосомные причины. (Денисова В.М., Ярмолинская М.И., Закураева К.А. Преждевременная недостаточность яичников: генетические причины и тактика веденияпациенток (обзор литературы) // Журнал акушерства и женских болезней. - 2021. - Т. 70. - №3. - С. 75-91).

Единственным методом эффективного лечения ПНЯ признана заместительная гормональная терапия, которая не оказывает влияние на восстановление функции яичников, но направлена на устранение эстрогенного дефицита и связанных с ним патологических проявлений, что сопровождается значительным улучшением качества жизни пациенток и обладает важным профилактическим действием в отношении развития поздних обменных нарушений.

Таким образом, в настоящее время не существует патогенетически обоснованной терапии ПНЯ, которая обеспечивает реализацию репродуктивной функции.

В литературе описан ряд методов лечения ПНЯ, которые можно условно разделить на 3 группы: лечение на основании животной модели, медикаментозная терапия на клеточной модели, стимуляция работы яичников у женщин.

Главным недостатком способов на основании животной модели является высокая стоимость используемых компонентов и сложность выполнения эксперимента. Кроме того, использование животной модели не способно в полном объеме отражать патогенез заболевания на молекулярном и/или клеточном уровнях.

Недостатком известных хирургических способов, направленных на стимуляцию сниженной овариальной функции у женщин, является то, что неоднократные оперативные вмешательства сами по себе могут вызывать развитие спаечного процесса, еще больше снизить овариальный резерв и, соответственно, оказывать непосредственное негативное влияние на возможность реализации репродуктивной функции в будущем.

Среди способов лечения ПНЯ на клеточном уровне известен способ активации in vitro овариальных фолликулов и ооцитов, включающий в себя инкубацию фолликулов и/или ооцитов в физиологически приемлемой среде, содержащей один или более ингибиторов PTEN, в котором у четырех новорожденных самок мышей в асептических условиях удалили яичники и культивировали в специальной среде с добавлением ингибиторов PTEN. Ингибитор PTEN увеличивал выживаемость фолликулов в культивируемых яичниках, стимулировал пролиферацию и дифференциацию сплющенных прегранулезных клеток в кубовидные гранулезные клетки, что является стадией активации примордиальных фолликулов (Патент RU №2492866).

Недостатком указанного способа является использование искусственно синтезированного ингибитора PTEN, онкогенный потенциал которого при его применении у человека до настоящего времени не изучен.

Техническим результатом изобретения является медикаментозное воздействие с учетом патогенеза заболевания, увеличение содержания восстановленного глутатиона, уменьшение содержания АФК и восстановление митохондриальной функции гранулезных клеток, возможность избежать применения гормональных препаратов, хирургического вмешательства, следовательно, и недостатков их применения.

Указанный технический результат достигается в способе медикаментозного лечения преждевременной недостаточности яичников на основании клеточной модели у крыс, полученной путем культивирования гранулезных клеток яичника крысы линии Wistar, в котором в клеточную культуру клеточной модели добавляют 2 мкл/мл омавелоксолона (RTA 408) и инкубируют в течение 1 часа.

Недавние исследования с использованием секвенирования РНК подтвердили, что окислительное повреждение в клетках яичников является основным механизмом истощения его функции. (Titus et Wang S Zheng Y Li J Yu Y Zhang WLiu Z Min Z Ни H Jing YHe XSingle-Cell Transcriptomic Atlas of Primate Ovarian Aging Cell. 2020; 180: 585-600.e519).

Нарушение митохондриальной биоэнергетики, увеличения содержания активных форм кислорода, повреждение ДНК, апоптоз и нестабильность веретена деления во время хромосомной сегрегации влияют на качество ооцитов и формирование преждевременной недостаточности яичников. (Franasiak JM Forman EJ Hong KH Werner MD Upham KM Treff NR Scott Jr, RT The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil. Steril. 2014; 101: 656-663. e651). Фактор транскрипции NRF2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) регулирует транскрипцию антиоксидантных ферментов и ферментов, участвующих в детоксикации клетки, которые представляют собой мощную защитную систему клетки у млекопитающих. (Zhang Н, Davies KJ, Forman HJ. Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging. Free Radic Biol Med. 2015; 88:314-36. 10.1016/j.freeradbiomed.2015.05.036).

Сигнальная система NRF2 обладает способностью защиты от окислительного стресса и токсичных веществ и считается важной для выживания клетки. (Di Emidio G, Falone S, Vitti M, D'Alessandro AM, Vento M, Di Pietro C, Amicarelli F, Tatone C. SIRT1 signalling protects mouse oocytes against oxidative stress and is deregulated during aging. Hum Reprod. 2014; 29:2006-17). Нарушение сигнализации NRF2 связано с восприимчивостью к окислительному повреждению у людей и животных. (Pan Д Guan D, Liu X, Li J, Wang L, Wu J, Zhou J, Zhang W, Ren R, Zhang W, Li Y, Yang J, Hao Y, et al. SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivatingNRF2. Cell Res. 2016; 26:190-205. 10.1038/cr.2016.4). В физиологических условиях NRF2 в основном локализован в цитоплазме с относительно низким ядерным зарядом. Окислительный стресс высвобождает NRF2 из комплекса NRF2-KEAP1-CUL3, позволяя NRF2 накапливать и перемещаться в ядро, образуя комплекс NRF2-MAF-ARE, который индуцирует экспрессию генов защитных антиоксидантных ферментов, включая глутатион (GSH), супероксиддисмутазу (SOD) и каталазу (CAT). (Li G. Н, Li Y. R., Jiao P., Zhao Y, Ни H X, Lou H. X, et al. (2018). Therapeutic Potential of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma against Human Diseases Based on Activation of Nrf2-Mediated Antioxidant Defense System: Bioactive Constituents and Mechanism of Action. Oxid Med. Cell Longev. 2018, 7309073. Akino N., Wada-Hiraike O., Isono W., Terao H, Honjo H, Miyamoto Y, et al. (2019). Activation of Nrf2/Keap1 Pathway by Oral Dimethylfumarate Administration Alleviates Oxidative Stress and Age-Associated Infertility Might Be Delayed in the Mouse Ovary. Reprod. Biol. Endocrinol. 17 (1), 23. 10.1186/s12958-019-0466-y).

Активация NRF2 противодействует химическим канцерогенам, повышая уровень антиоксидантов и ферментов конъюгации, образует с НО-1 сигнальный путь NRF2/HO-1, вызывая экспрессию последующих защитных ферментов фазы II. НО-1, в свою очередь, блокирует активацию CD4+T-клеток, ингибируя активность NF-κВ и, тем самым, уменьшает воспаление. Результаты многочисленных исследований доказали, что путь NRF2/HO-1/SIRT1 играет ключевую роль в развитии аутоиммунных заболеваний. (Slocum SL, Kensler TW. Nrf2: control of sensitivity to carcinogens. Arch Toxicol 2011. April;85(4):273-84. 10.1007fs00204-011-0675-4. Chen Д Song L, Xu X, Han Z, Peng F, Zhang Q, Liu C, Liang X. The effect of icariin on autoimmune premature ovarian insufficiency via modulation of Nrf2/HO-1/Sirt1 pathway in mice. Reprod Biol. 2022 Jun;22(2): 100638. doi: 10.1016/j.repbio.2022.100638. Epub 2022 Mar 28. PMID: 35344846).

Полусинтетические тритерпеноиды - это антиоксидантные соединения модулятора воспаления (AIM), которые ингибируют рост и метастазы опухолевых клеток. Соединения класса AIM связываются с Keapl и активируют деградацию NRF2. В ядре NRF2 увеличивает экспрессию антиоксидантных генов и уменьшает провоспалительную экспрессию генов. Увеличивая активность NRF2, AIMs уменьшают содержание реактивного кислорода и воспаление в тканях, подавляют уровни оксида азота и провоспалительных цитокинов в интерферон-γ-стимулированных макрофагах.

Новое соединение в классе AIM, RTA 408, в настоящее время находится на стадии исследования фазы 1 у пациентов с метастатическим немелкоклеточным раком легких или меланомой (clinicaltrials.gov ID: NCT02029729). Противовоспалительная активность RTA 408 также была недавно продемонстрирована в модели радиационно-индуцированного дерматита. (Reisman SA, Lee CY, Meyer CJ, Proksch JW, Ward KW. Topical application of the synthetic triterpenoid RTA 408 activates Nrf2 and induces cytoprotective genes in rat skin. Arch Dermatol Res 2014. July;306(5):447-54. 10.1007/s00403-013-1433-7;Reisman SA, Lee CY, Meyer CJ, Proksch JW, Sonis ST, Ward KW. Topical application of the synthetic triterpenoid RTA 408 protects mice from radiation-induced dermatitis. Radiat Res 2014. May; 181 (5):512-20. 10.1667/RR13578.1).

NRF2/HO-1 является ключевым сигнальным путем, важным регулятором внутриклеточного гомеостаза. Разработанная ранее клеточная модель преждевременной недостаточности яичников показала, что циклофосфамид может вызвать окислительное повреждение, приводящее в последствии к истощению яичников (патент RU 2815539, опубл. 18.03.2024).

Таким образом, как мощный активатор NRF2, RTA 408 имеет потенциал для лечения преждевременной недостаточности яичников, уменьшая как окислительный стресс, так и воспаление в яичниковой ткани.

Заявляемый способ основан на экспериментальных исследованиях на 4 крысах-самках линии Wistar.

Все лабораторные животные были выведены в ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день/ночь»). Уход за животными и проведение экспериментов осуществлялись согласно основным морально-этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» (Good Laboratory Practice), утвержденные приказом Министерства здравоохранения и социального развития от 23.08.2010 №708н, и «Международные рекомендации по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятые Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г.

На первом этапе эксперимента было проведено формирование клеточной модели заболевания согласно существующей методике («Способ создания клеточной модели преждевременной недостаточности яичников на крысах линии Wistar (патент RU 2815539, опубл. 18.03.2024). В 100% случаев моделировалась ПНЯ.

После пяти этапов субкультивирования и обработки препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов, исследуемые клетки на покровных стеклах были разделены на 3 группы (по 3 покровных стекла): 1 группа - сравнения (пять этапов субкультивирования и обработки препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов); 2 группа - основная (добавление 2 мкл/мл RTA 408 и инкубация в течение 1 часа после пять этапов субкультивирования и обработки препаратом циклофосфамид с обеспечением рабочей концентрации в ростовой среде 0,1 мг/мл с последующим инкубированием в течение 6 часов); 3 группа - контрольная (пять этапов субкультивирования).

Оценку скорости продукции АФК проводили при помощи флуоресцентного зонда HEt (5 мкМ), продукты окисления которого в результате интеркаляции в ДНК флуоресцируют при возбуждении излучением на длине волны возбуждения 500 нм и эмиссии - 590 нм.

Эксперимент проводили без предварительной инкубации клеток, чтобы избежать токсического эффекта продуктов окисления. Измерения осуществляли с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа с флюоритовым иммерсионным объективом ×20 с использованием возбуждающего излучения с длинами волн 360 нм (для восстановленной формы) и 530 нм (для окисленной формы зонда) ксеноновой дуговой лампы. Регистрацию флуоресценции для восстановленной и окисленной форм осуществляли в интервалах длин волн 430-480 нм и 575-630 нм соответственно. Выделение флуоресцентного излучения проводили с использованием 4-полосного фильтра с интервалами пропускания 430-480 нм, 505-550 нм, 575-630 нм, 670-750 нм и автоматизированного колеса фильтров, обеспечивающего пропускание излучения в интервалах длин волн 430-480 нм (для восстановленной формы) и 575-635 нм (для окисленной формы зонда). Контроль скорости окисления зонда проводили по изменению величины соотношения интенсивности флуоресценции окисленной и восстановленной форм зонда (530/360 ratio).

Оценку скорости продукции АФК проводили с использованием значения тангенса угла наклона кривой, построенной по значениям отношения окисленной формы HEt к восстановленной и отражающей изменения этого соотношения с течением времени.

Для оценки активации антиоксидантной системы проводилось определение уровня глутатиона (GSH) в клетке. Оценку внутриклеточного содержания восстановленного глутатиона (GSH) проводили путем инкубирования клеток в течение 30 минут в 50 мкМ растворе монохлорбимана (МСВ), способного к образованию флуоресцирующих конъюгатов с низкомолекулярными соединениями, содержащими SH-группу. После этого клетки отмывали от зонда с помощью раствора Хэнкса и исследовали с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 900 в режиме Z-stack, получая не менее 10 оптических срезов. В качестве меры количественного содержания GSH в клетках использовали величину максимальной интенсивности флуоресценции. Анализ результатов проводили с учетом прямо пропорциональной зависимости между интенсивностью флуоресценции и содержанием GSH в образце. Все результаты экспериментальных исследований ортонормированы на данные контрольной группы, взятые за 100%.

Мы обнаружили, что циклофосфамид значительно увеличивает скорость базальной продукции АФК в гранулезных клетках, а также что RTA 408 статистически значимо снижает уровень АФК по сравнению как с контрольной группой, так и с группой сравнения (скорость окисления HEt в основной группе - 67,7±10,8%, в группе сравнения - 170±21,4% р<0,05) (фиг. 1). RTA 408 также статистически значимо увеличивал содержание восстановленного глутатиона.

Содержание GSH в клетках, обработанных RTA 408 было более чем в 2 раза выше по сравнению с клетками группы сравнения и контрольной группой (основная группа- 2730,94±452,11, группа сравнения 1230,64±354,2170,7±12,8% р<0,05) (фиг. 2., фиг. 3).

Способ иллюстрируется фиг. 1-3.

На фиг. 1 - уровень АФК в исследуемых группах: контрольной, сравнения и основной;

На фиг. 2 - уровень МСВ в исследуемых группах, подтверждающий эффективность RTA 408;

На фиг. 3 - интенсивность окрашивания, отражающая уровень содержания восстановленного глутатиона в клетке.

Таким образом, RTA 408 увеличивает содержание восстановленного глутатиона, уменьшает АФК, тем самым оказывает антиоксидантный и противовоспалительный эффекты.

Заявляемый способ расширяет арсенал средств лечения ПНЯ, оказывает медикаментозное воздействие с учетом патогенеза заболевания, сопровождающееся увеличением содержания восстановленного глутатиона, уменьшением содержания АФК и восстановлением митохондриальной функции гранулезных клеток, позволяет избежать применения гормональных препаратов, хирургических вмешательств, следовательно, и недостатков их применения.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу создания клеточной модели медикаментозного воздействия на патогенез преждевременной недостаточности яичников у крыс. Указанный способ характеризуется тем, что в клеточную культуру клеточной модели, полученную путем культивирования гранулезных клеток яичника крысы линии Wistar, добавляют 2 мкл/мл омавелоксолона (RTA 408) и инкубируют в течение 1 ч. Настоящее изобретение обеспечивает клеточную модель медикаментозного воздействия омавелоксолона на патогенез преждевременной недостаточности яичников. 3 ил.

Способ создания клеточной модели медикаментозного воздействия на патогенез преждевременной недостаточности яичников у крыс, характеризующийся тем, что в клеточную культуру клеточной модели, полученную путем культивирования гранулезных клеток яичника крысы линии Wistar, добавляют 2 мкл/мл омавелоксолона (RTA 408) и инкубируют в течение 1 часа.