ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США с серийным номером 61/799262, поданной 15 марта 2013 года, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Данное изобретение, в целом, относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, который транспортирует гибридный белок в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. Данное изобретение также относится к рекомбинантным представителям семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют такие гибридные белки, и препаратам, содержащим рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующие гибридные белки. Дополнительно, изобретение относится к способам стимуляции роста растений, защиты растений от патогенов, а также повышения устойчивости к стрессу в растениях путем применения рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus или препаратов к растениям или средам для роста растений. Данное изобретение также относится к способам иммобилизации спор рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридный белок, на растениях или на растительных веществах.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] В области, окружающей корни растения, присутствует область, которая называется ризосферой. В ризосфере бактерии, грибы и другие организмы конкурируют за питательные вещества и за связывание с корневыми структурами растения. В ризосфере могут присутствовать как вредные, так и полезные бактерии и грибы. Все, включая бактерии, грибы и корневую систему растения, могут подвергаться влиянию активности пептидов, ферментов и других белков в ризосфере. Внесение в почву или обработка растений теми или иными из этих пептидов, ферментов или других белков оказывали бы положительные эффекты на целые популяции полезных почвенных бактерий и грибов, создали бы более здоровую общую почвенную среду для роста растений, улучшили бы рост растений, и обеспечили бы защиту растений от определенных бактериальных и грибковых патогенов. Однако предыдущие попытки внесения пептидов, ферментов и других белков в почву с целью вызвать такие положительные эффекты у растений были затруднены низкой выживаемостью ферментов, белков и пептидов в почве. Кроме того, широкое распространение протеаз, естественно присутствующих в почве, вызывает деградацию белков в почве. Среда вокруг корней растения (ризосфера) представляет собой уникальную смесь бактерий, грибов, питательных веществ, и корней, свойства которых отличаются от свойств чистой почвы. Симбиотические взаимоотношения между этими организмами представляют собой уникальные и могут быть улучшены с помощью экзогенных белков. Высокая концентрация грибов и бактерий в ризосфере вызывает еще большую деградацию белков в связи с аномально высоким уровнем протеаз и других элементов, вредных для белков, в почве. Кроме того, ферменты и другие белки, внесенные в почву, могут быстро рассеиваться от корней растения.
[0004] Таким образом, существует необходимость в данной области техники в способе эффективной доставки пептидов, ферментов и других белков в растения (например, в корневые системы растений) и продления периода времени, в течение которого такие молекулы остаются активными. Кроме того, существует необходимость в данной области техники в способе селективной транспортировки таких пептидов, ферментов и белков в ризосферу и в листья растений, и в особенности корни растений.
Сущность изобретения
[0005] Данное изобретение относится к гибридным белкам, содержащим по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения, по меньшей мере один белок или пептид, который повышает устойчивость к стрессу в растении, или по меньшей мере одно растение, связывающее белок или пептид. Белок или пептид, стимулирующий рост растения, включает пептидный гормон, пептид, не являющийся гормоном или фермент, участвующий в образовании или активации соединения, стимулирующего рост растения. гибридный белок также содержит сигнальную последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой: (а) сигнальную последовательность, включающую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 43% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 54%; (б) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 1; (в) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 из SEQ ID №: 1; (г) сигнальную последовательность, включающую SEQ ID №: 1; (д) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 2; (е) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 из SEQ ID №: 3; (ж) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 из SEQ ID №: 3; (з) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 3; (и) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 4; (к) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 из SEQ ID №: 5; (л) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 из SEQ ID №: 5; (м) сигнальную последовательность, включающую SEQ ID №: 5; (н) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 6; (о) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 из SEQ ID №: 7; (п) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 из SEQ ID №: 7; (р) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 7; (с) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 8; (т) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 9; (у) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 9; (ф) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 9; (х) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 10; (ц) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 11; (ч) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 11; (ш) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 11; (щ) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 12; (э) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 13; (ю) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 13; (я) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 13; (аа) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 14; (аб) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 из SEQ ID №: 15; (ав) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 из SEQ ID №: 15; (аг) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 15; (ад) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 16; (ае) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 из SEQ ID №: 17; (аж) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 из SEQ ID №: 17; (аз) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 17; (аи) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 18; (ак) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 19; (ал) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 19; (ам) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 19; (ан) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 20; (ао) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 21; (ап) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 21; (ар) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 21; (ас) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 22; (ат) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 23; (ау) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 23; (аф) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 23; (ах) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 24; (ац) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 25; (ач) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 25; (аш) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 25; (ащ) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 26; (аэ) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 из SEQ ID №: 27; (аю) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 из SEQ ID №: 27; (ая) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 27; (ба) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 28; (бб) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 29; (бв) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 29; (бг) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 29; (бд) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 30; (бе) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 31; (бж) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 31; (бз) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 31; (би) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 32; (бк) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 из SEQ ID №: 33; (бл) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 33; (бм) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 34; (бн) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 из SEQ ID №: 35; (бо) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 35; (бп) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 36; (бр) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 из SEQ ID №: 43; (бс) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 из SEQ ID №: 43; (бт) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 43; (бу) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 44; (бф) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 45; (бх) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 из SEQ ID №: 45; (бц) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 45; (бч) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 46; (бш) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 из SEQ ID №: 47; (бщ) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 из SEQ ID №: 47; (бэ) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 47; (бю) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 48; (бя) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 из SEQ ID №: 49; (ва) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 из SEQ ID №: 49; (вб) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 49; (вв) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 50; (вг) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 51; (вд) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 51; (ве) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 51; (вж) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 52; (вз) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 53; (ви) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 53; (вк) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 53; (вл) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 54; (вм) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 из SEQ ID №: 55; (вн) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 из SEQ ID №: 55; (во) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 55; (вп) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 56; (вр) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 из SEQ ID №: 57; (вс) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 из SEQ ID №: 57; (вт) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 57; (ву) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 58; (вф) фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 59; (вх) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 60; (вц) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 61; (вч) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 62; (вш) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 63; (вщ) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 64; (вэ) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 65; (вю) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 66; (вя) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 67; (га) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 68; (гб) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 69; (гв) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 70; (гг) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 71; (гд) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 72; (ге) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 73; (гж) в белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 74; (гз) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 75; (ги) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 76; (гк) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 77; (гл) в белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 78; (гм) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 79; (гн) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 80; (го) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 81; (гп) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 82; (гр) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 83; (гс) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 84; (гт) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 из SEQ ID №: 1; (гу) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 из SEQ ID №: 1; (гф) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 из SEQ ID №: 1; (гх) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 из SEQ ID №: 3; (гц) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 из SEQ ID №: 3; или (гч) сигнальную последовательность, включающую аминокислоты 12-23 из SEQ ID №: 3.
[0006] Данное изобретение также относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой: (а) сигнальную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющую по меньшей мере около 43% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 54%; (б) сигнальную последовательность, состоящую из аминокислот 1-35 из SEQ ID №: 1; (в) сигнальную последовательность, состоящую из аминокислот 20-35 в SEQ ID №: 1; (г) сигнальную последовательность, состоящую из SEQ ID №: 1; (д) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 60; (е) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 из SEQ ID №: 3; (ж) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 из SEQ ID №: 3; (з) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 3; (и) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 4; (к) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 из SEQ ID №: 5; (л) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 из SEQ ID №: 5; (м) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 5; (н) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 6; (о) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 из SEQ ID №: 7; (п) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 из SEQ ID №: 7; (р) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 7; (с) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 8; (т) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 9; (у) в сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 9; (ф) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 9; (х) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 10; (ц) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 11; (ч) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 11; (ш) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 11; (щ) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 12; (э) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 13; (ю) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 13; (я) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 13; (аа) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 14; (аб) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 из SEQ ID №: 15; (ав) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 из SEQ ID №: 15; (аг) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 15; (ад) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 16; (ае) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 из SEQ ID №: 17; (аж) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 из SEQ ID №: 17; (аз) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 17; (аи) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 18; (ак) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 19; (ал) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 19; (ам) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 19; (ан) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 20; (ао) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 21; (ап) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 21; (ар) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 21; (ас) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 22; (ат) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 23; (ау) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 23; (аф) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 23; (ах) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 24; (ац) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 25; (ач) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 25; (аш) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 25; (ащ) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 26; (аэ) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 из SEQ ID №: 27; (аю) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 из SEQ ID №: 27; (ая) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 27; (ба) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 28; (бб) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 29; (бв) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 29; (бг) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 29; (бд) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 30; (бе) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 31; (бж) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 31; (бз) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 31; (би) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 32; (бк) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 из SEQ ID №: 33; (бл) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 33; (бм) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 34; (бн) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 из SEQ ID №: 35; (бо) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 35; (бп) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 36; (бр) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 из SEQ ID №: 43; (бс) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 из SEQ ID №: 43; (бт) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 43; (бу) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 44; (бф) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 45; (бх) к мишени последовательности, содержащей аминокислоты 20-35 из SEQ ID №: 45; (бц) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 45; (бч) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 46; (бш) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 из SEQ ID №: 47; (бщ) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 из SEQ ID №: 47; (бэ) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 47; (бю) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 48; (бя) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 из SEQ ID №: 49; (ва) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 из SEQ ID №: 49; (вб) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 49; (вв) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 50; (вг) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 51; (вд) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 51; (ве) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 51; (вж) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 52; (вз) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID №: 53; (ви) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 53; (вк) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 53; (вл) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 54; (вм) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 из SEQ ID №: 55; (вн) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 из SEQ ID №: 55; (во) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 55; (вп) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 56; (вр) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 из SEQ ID №: 57; (вс) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 из SEQ ID №: 57; (вт) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 57; (ву) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 58; (вф) фрагмент белка экзоспория, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 59; (вх) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 61; (вц) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 62; (вч) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 63; (вш) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 64; (вщ) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 65; (вэ) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 66; (вю) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 67; (вя) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 68; (га) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 69; (гб) сигнальную последовательность, содержащую SEQ ID №: 70; (гв) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 71; (ге) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 72; (гж) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 73; (гз) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 74; (ги) в белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 75; (гк) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 76; (гл) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 77; (гм) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 78; (гн) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 79; (го) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 80; (гп) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 81; (гр) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 82; (гс) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 83; (гт) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 84; (гу) сигнальную последовательность, состоящую из аминокислот 22-31 в SEQ ID №: 1; (гф) сигнальную последовательность, состоящую из аминокислот 22-33 в SEQ ID №: 1; (гх) сигнальную последовательность, состоящую из аминокислот 20-31 в SEQ ID №: 1; (гц) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 из SEQ ID №: 3; (гч) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 из SEQ ID №: 3; или (гш) сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 из SEQ ID №: 3.
[0007] Данное изобретение дополнительно относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена. Белок или пептид, защищающий растение от патогена, может включать гарпин, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин, пептид флагеллина, бактериоцин, лизоцим, пептид лизоцима, сидерофор, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина или TasA. В альтернативном варианте белок или пептид, защищающий растение от патогена, обладает инсектицидной активностью, антигельминтной активностью, подавляет хищничество насекомых или червей, или их комбинацию. В альтернативном варианте белок, защищающий растение от патогена, включает фермент. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любую из сигнальных последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, перечисленных ранее в параграфе [0005].
[0008] Данное изобретение также относится к гибридным белкам, содержащим по меньшей мере один целевой белок или пептид и белок экзоспория. Белок экзоспория может представлять собой белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с любой из SEQ ID №: 71, 75, 80, 81, 82, 83 и 84.
[0009] Данное изобретение дополнительно относится к рекомбинантному представителю семейства Bacillus cereus, который экспрессирует любой из гибридных белков.
[0010] Данное изобретение также относится к препаратам, включающим любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus и сельскохозяйственно приемлемый носитель.
[0011] Данное изобретение также относится к способу стимуляции роста растений. Данный способ включает введение в среду для роста растений любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения, или любого препарата, содержащего рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения. В альтернативном варианте данный способ включает применение к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растения, любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения, или любого препарата, содержащего рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения. Белок или пептид, стимулирующий рост растения, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus.
[0012] Данное изобретение также относится к способу стимуляции роста растений. Этот способ включает введение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего гибридный белок, в среду для роста растений или применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего гибридный белок, к растению, семени растений или области, окружающей растение или семя растения. Гибридный белок содержит по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения, сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любой из перечисленных ранее в параграфе [0005]. Белок или пептид, стимулирующий рост растения, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus.
[0013] Данное изобретение дополнительно относится к способу защиты растений от патогена или усиления устойчивости к стрессу в растении. Данный способ включает введение в среду для роста растений любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена, или по меньшей мере один белок или пептид, усиливающий устойчивость к стрессу в растении, или любой из препаратов, содержащих любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена, или по меньшей мере один белок или пептид, усиливающий устойчивость к стрессу в растении. В альтернативном варианте данный способ включает применение к растению, семени растения или области, окружающей растение, любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена, или по меньшей мере один белок или пептид, который повышает устойчивость к стрессу в растении, или любого препарата, содержащего любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена, или по меньшей мере один белок или пептид повышающий устойчивость к стрессам в растении. Белок или пептид, защищающий растения из патогена, или белок или пептид, усиливающий устойчивость к стрессу в растении, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[0014] Данное изобретение также относится к способу иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении. Данный способ включает введение в среду для роста растений любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих по меньшей мере один белок или пептид, связывающийся с растением, или любого препарата, содержащего любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих по меньшей мере один белок или пептид, связывающийся с растением. В альтернативном варианте данный способ включает применение к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растений, любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих по меньшей мере один белок или пептид, связывающийся с растением, или любого из препаратов, содержащих любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих по меньшей мере один белок или пептид, связывающийся с растением. Белок или пептид, связывающийся с растением, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[0015] Другие объекты и признаки будут отчасти очевидны и отчасти указаны в дальнейшем.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0016] ФИГ. 1 иллюстрирует выравнивание аминокислотной последовательности амино-концевого участка штамма BclA Bacillus anthracis Sterne с соответствующей областью различных белков экзоспория представителей семейства Bacillus cereus.
[0017] ФИГ. 2 иллюстрирует типичные результаты флуоресцентной микроскопии экспрессии гибридных белков, содержащих различные белки экзоспория, связанные с репортером mCherry, на экзоспории.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0018] В данном документе единственное число, «один», «данный» и «указанный» означает «по меньшей мере один» или «один или более», если не указано иное.
[0019] Термины «содержащий», «включающий» и «имеющий» подразумевают включение и означают, что могут быть дополнительные элементы, отличающиеся от перечисленных.
[0020] Термин «биологически активный пептид» означает любой пептид, который проявляет биологическую активность. «Биологически активные пептиды» могут быть получены, например, с помощью расщепления белка, пептида, пробелка или препробелка протеазой или пептидазой.
[0021] «Фермент, участвующий в образовании или активации соединения, стимулирующего рост растения» включает любой фермент, который катализирует любой этап пути биосинтеза соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, или любой фермент, который катализирует переход неактивного или менее активного производного соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, в активную или более активную форму соединения. Такие соединения, например, включают, но не ограничиваются ими, низкомолекулярные растительные гормоны, такие как ауксины и цитокинины, биологически активные пептиды и низкомолекулярные стимуляторы роста растения, которые синтезируются бактериями или грибами в ризосфере (например, 2,3-бутандиол).
[0022] В данном документе термин «гибридный белок» означает белок, имеющей полипептидную последовательность, которая содержит последовательности, полученные из двух или более отдельных белков. Гибридный белок может быть получен путем соединения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует весь первый полипептид, или его часть, с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует весь второй полипептид, или его часть, с целью создать последовательность нуклеиновой кислоты, при экспрессии которой образуется один полипептид, имеющий функциональные свойства, полученные от каждого из исходных белков.
[0023] Термин «иммобилизация споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении» означает связывание споры представителя семейства Bacillus cereus с растением, например, с корнем растения или с надземной частью растения, такой как лист, стебель, цветок или плод, таким образом, что спора остается на корневой структуре растения или на его надземной части и не проникает в среду роста растения или в среду, окружающую надземные части растения.
[0024] «Среда для роста растений» включает любой материал, который способен поддерживать рост растения.
[0025] В данном документе «белок или пептид, усиливающий иммунную систему растения» включает любой белок или пептид, который оказывает благоприятное воздействие на иммунную систему растения.
[0026] В данном документе термин «белок или пептид, стимулирующий рост растения», включает любой белок или пептид, который увеличивает рост растения, подверженного воздействию этого белка или пептида.
[0027] В данном документе термин «белок или пептид, защищающий растение от патогена», включает любой белок или пептид, который делает растение, подверженное действию этого белка или пептида, менее восприимчивым к инфицированию патогеном.
[0028] В данном документе термин «белок или пептид, который повышает устойчивость к стрессу в растении», включает любой белок или пептид, который делает растение, подверженное действию этого белка или пептида, более устойчивым к стрессу.
[0029] Термин «белок или пептид, связывающийся с растением» означает любой пептид или белок, способный специфически или неспецифически связываться с любой частью растения (например, с корнем или с надземными частями растения, такими как листья, стебли, цветки или плоды) или с растительным материалом.
[0030] В данном документе термин «сигнальная последовательность» означает полипептидную последовательность, которая, являясь частью более длинного полипептида или белка, приводит к локализации более длинного полипептида или белка в определенном месте внутри клетки. Сигнальные последовательности, описанные в данном документе, приводят к расположению белков в эксзоспории представителя семейства Bacillus cereus.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0031] Данное изобретение относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, который транспортирует гибридный белок в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus и: (а) по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения; (б) по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена; (в) по меньшей мере один белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессу; или (г) по меньшей мере один белок или пептид, связывающийся с растением. При экспрессии в бактериях - представителях семейства Bacillus cereus, эти гибридные белки транспортируются в слой экзоспория в споре и физически ориентируются таким образом, что данный белок или пептид выводится на внешнюю сторону споры.
[0032] Эта система выведения на экзоспорий Bacillus (ВЭВ) может быть использована для внесения пептидов, ферментов и других белков в растения (например, в листья, фрукты, цветки, стебли или корни, или в среду для роста растений, такую как почва. Пептиды, ферменты, белки и внесенные таким способом в почву или другую среду для роста растений, сохраняют и проявляют активность в почве в течение длительных периодов времени. Внесение в почву или ризосферу растения бактерий - рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридные белки, описанные в данном документе, приводит к повышению полезного роста растения во многих различных почвенных условиях. Использование ВЭВ с целью создания этих ферментов позволяет им продолжать проявление положительных результатов на растение и ризосферу в течение первых месяцев жизни растения.
Сигнальные последовательности, белки экзоспория и фрагменты белков экзоспория
[0033] Для простоты ссылки SEQ ID №№ для пептидных и белковых последовательностей, указанных в данном документе, приведены ниже в таблице 1.
Таблица 1. Пептидные и белковые последовательности
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 1) *
(SEQ ID №: 2) *
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 3)
(SEQ ID №: 4)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 5)
(SEQ ID №: 6)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 7)
(SEQ ID №: 8)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 9)
(SEQ ID №: 10)
(B. weihenstephensis
KBAB4)
(SEQ ID №: 11)
(SEQ ID №: 12)
(B. weihenstephensis
KBAB4)
(SEQ ID №: 13)
(SEQ ID №: 14)
(B. cereus VD200)
(SEQ ID №: 15)
(SEQ ID №: 16)
(B. cereus VD166)
(SEQ ID №: 17)
(SEQ ID №: 18)
(B. cereus VD200)
(SEQ ID №: 19)
(SEQ ID №: 20)
(B. weihenstephensis
KBAB4)
(SEQ ID №: 21)
(SEQ ID №: 22)
(B. weihenstephensis KBAB4)
(SEQ ID №: 23)
гипотетический белок bcerkbab4_2363 KBAB4
(SEQ ID №: 24)
(B. weihenstephensis KBAB4)
(SEQ ID №: 25)
(SEQ ID №: 26)
(B. weihenstephensis KBAB4)
(SEQ ID №: 27)
(SEQ ID №: 28)
(B. mycoides 2048)
(SEQ ID №: 29)
(SEQ ID №: 30)
(B. mycoides 2048)
(SEQ ID №: 31)
(SEQ ID №: 32)
(B. mycoides 2048)
(SEQ ID №: 33)
(SEQ ID №: 34)
(B. thuringiensis 35646)
(SEQ ID №: 35)
(SEQ ID №: 36)
(SEQ ID №: 43)
(SEQ ID №: 44)
(B. cereus)
(SEQ ID №: 45)
(SEQ ID №: 46)
(B. cereus)
(SEQ ID №: 47)
(SEQ ID №: 48)
(B. cereus)
(SEQ ID №: 49)
(SEQ ID №: 50)
(B. cereus)
(SEQ ID №: 51)
(SEQ ID №: 52)
(B. cereus)
(SEQ ID №: 53)
(B. thuringiensis)
(SEQ ID №: 55)
(SEQ ID №: 56)
(B. mycoides)
(SEQ ID №: 57) **
(SEQ ID №: 58) **
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 59)*
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 60)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 61)
(B. weihenstephensis
KBAB4)
(SEQ ID №: 62)
(B. weihenstephensis
KBAB4)
(SEQ ID №: 63)
(B. cereus VD166)
(SEQ ID №: 64)
(B. weihenstephensis
KBAB4)
(SEQ ID №: 65)
(B. weihenstephensis KBAB4)
(SEQ ID №: 66)
(B. weihenstephensis KBAB4)
(SEQ ID №: 67)
(B. mycoides 2048)
(SEQ ID №: 68)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 69)
(B. cereus)
(SEQ ID №: 70)
(B. mycoides)
(SEQ ID №: 71)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 72)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 73)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 74)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 75)
(B. anthracis H9401)
(SEQ ID №: 76)
(B. thuringiensis HD74)
(SEQ ID №: 77)
(B. cereus ATCC 10876)
(SEQ ID №: 78)
(B. cereus)
(SEQ ID №: 79)
(B. anthracis Ames)
(SEQ ID №: 80)
(B. anthracis)
(SEQ ID №: 81)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 82)
(Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 97-27)
(SEQ ID №: 83)
(B. thuringiensis HD74)
(SEQ ID №: 84)
AК=аминокислоты
* Штамм BclA B. anthracis Sterne имеет 100%-ную идентичность последовательности с В. thuringiensis BclA. Таким образом, SEQ ID №№: 1, 2 и 59 также представляют аминокислоты 1-41 из B. thuringiensis BclA, полноразмерного B. thuringiensis BclA, и аминокислоты 1-196 из B. thuringiensis BclA, соответственно. Аналогично, SEQ ID №: 60, также представляет метиониновый остаток плюс аминокислоты 20-35 из B. thuringiensis BclA.
** Гипотетический белок TIGR03720 из B. mycoides имеет 100%-ную идентичность последовательности с гипотетическим белком WP003189234 из B. mycoides. Таким образом, SEQ ID №№: 57 и 58 также представляют аминокислоты 1-136 гипотетического белка WP003189234 из B. mycoides и полноразмерный гипотетический белок WP003189234 из B. mycoides, соответственно.
[0034] Bacillus представляет собой род палочковидных бактерий. Семейство бактерий Bacillus cereus включает виды Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis и Bacillus weihenstephensis. В стрессовых условиях окружающей среды бактерии семейства Bacillus cereus претерпевают споруляцию и образуют овальные эндоспоры, которые могут оставаться в состоянии покоя в течение длительных периодов времени. Наружный слой эндоспор известен как экзоспорий и содержит базальный слой, покрытый внешним ворсом из волоскоподобных выростов. Нити этого волоскоподобного ворса образованы преимущественно коллагеноподобным гликопротеином BclA, в то время как базальный слой состоит из нескольких различных белков. В экзоспории также присутствует другой коллагеноподобный белок, BclB, который располагается на эндоспорах представителей семейства Bacillus cereus. Было показано, что BclA, основной компонент поверхностного ворса, прикреплен к экзоспорию с помощью амино-конца (N-конца), расположенного в базальном слое, и углеродного конца (С-конца), выходящего из споры наружу.
[0035] Ранее было обнаружено, что некоторые последовательности из N-концевых участков BclA и BclB могут быть использованы для транспортировки пептида или белка в экзоспорий эндоспор Bacillus cereus (см заявки на патент США №№ 2010/0233124 и 2011/0281316, и Thompson et al., Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore surface, Molecular Microbiology 70(2):421-34 (2008), каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки). Было также установлено, что белок BetA/BAS3290 Bacillus anthracis локализируется в экзоспории.
[0036] В частности, было обнаружено, что аминокислот 20-35 BclA из штамма Bacillus anthracis Sterne достаточно для транспортировки в экзоспорий. На Фигуре 1 проиллюстрировано выравнивание последовательности аминокислот 1-41 из BclA (SEQ ID №: 1) с соответствующими N-концевыми участками нескольких других белков экзоспория из семейства Bacillus cereus и белков из семейства Bacillus cereus, имеющих сходные последовательности. Как видно из Фигуры 1, есть область высокой гомологии между всеми белками в области, соответствующей аминокислотам 20-41 из BclA. Тем не менее, в этих последовательностях аминокислоты, соответствующие аминокислотам 36-41 из BclA, содержит вторичную структуру и не представляют собой необходимыми для транспортировки гибридного белка в экзоспорий. Область консервативной сигнальной последовательности в BclA (аминокислоты 20-35 из SEQ ID №: 1) выделена жирным на Фигуре 1 и соответствует минимальной сигнальной последовательности, необходимой для транспортировки в экзоспорий. Более высоко консервативная область, охватывающая аминокислоты 25-35 из BclA в пределах сигнальной последовательности, подчеркнута в последовательностях на Фигуре 1 и представляет собой последовательность распознавания для ExsFA/BxpB/ExsFB и гомологов, которые направляют и прикрепляют описанные белки на поверхности экзоспория. Аминокислотные последовательности SEQ ID №№. 3, 5 и 7 на Фигуре 1 представляют собой аминокислоты 1-33 из штамма BetA/BAS3290 Bacillus anthracis Sterne, за метионином следуют аминокислоты 2-43 из штамма BAS4623 Bacillus anthracis Sterne, и аминокислоты 1-34 из штамма BclB Bacillus anthracis Sterne, соответственно. (Для BAS4623 было обнаружено, что замена присутствующего валина в положении 1 в нативном белке на метионин приводит к лучшей экспрессии.) Как можно увидеть из Фигуры 1, каждая из этих последовательностей содержит консервативную область, соответствующую аминокислотам 20-35 из BclA (SEQ ID №: 1; выделена жирным) и более высоко консервативную область, соответствующую аминокислотам 20-35 из BclA (подчеркнуто).
[0037] Дополнительные белки из представителей семейства Bacillus cereus также содержат консервативную сигнальную область. В частности, на Фигуре 1 SEQ ID №: 9 представляет собой аминокислоты 1-30 штамма BAS1882 Bacillus anthracis Sterne, SEQ ID №: 11 представляет собой аминокислоты 1-39 генетического продукта 2280 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID №: 13 представляет собой аминокислоты 1-39 из генетического продукта 3572 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID №: 15 представляет собой аминокислоты 1-49 из лидерного пептида экзоспория Bacillus cereus VD200, SEQ ID №: 17 представляет собой аминокислоты 1-33 из лидерного пептида экзоспория Bacillus cereus VD166, SEQ ID №: 19 представляет собой аминокислоты 1-39 из гипотетического белка IKG 04663 Bacillus cereus VD200, SEQ ID №: 21 представляет собой аминокислоты 1-39 из β-пропеллерного белка Bacillus weihenstephensis KBAB4 YVTN, SEQ ID №: 23 представляет собой аминокислоты 1-30 из гипотетического белка bcerkbab4_2363 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID №: 25 представляет собой аминокислоты 1-30 из гипотетического белка bcerkbab4_2131 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID №: 27 представляет собой аминокислоты 1-36 из тройной коллагеновой спирали Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID №: 29 представляет собой аминокислоты 1-39 из гипотетического белка bmyco0001_21660 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID №: 31 представляет собой аминокислоты 1-30 из гипотетического белка bmyc0001_22540 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID №: 33 представляет собой аминокислоты 1-21 из гипотетического белка bmyc0001_21510 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID №: 35 представляет собой аминокислоты 1-22 из белка тройной коллагеновой спирали Bacillus Thuringiensis 35646, SEQ ID №: 43 представляет собой аминокислоты 1-35 из гипотетического белка WP_69652 Bacillus cereus, SEQ ID №: 45 представляет собой аминокислоты 1-41 из лидера экзоспория WP016117717 Bacillus cereus, SEQ ID №: 47 представляет собой аминокислоты 1-49 из пептида WP002105192 экзоспория Bacillus cereus, SEQ ID №: 49 представляет собой аминокислоты 1-38 из гипотетического белка WP87353 Bacillus cereus, SEQ ID №: 51 представляет собой аминокислоты 1-39 из пептида 02112369 экзоспория Bacillus cereus, SEQ ID №: 53 представляет собой аминокислоты 1-39 из белка WP016099770 экзоспория Bacillus cereus, SEQ ID №: 55 представляет собой аминокислоты 1-36 из гипотетического белка YP006612525 Bacillus Thuringiensis и SEQ ID №: 57 представляет собой аминокислоты 1-136 из гипотетического белка TIGR03720 Bacillus mycoides. Как проиллюстировано на Фигуре 1, каждый из N-концевых областей этих белков содержит область, которая является консервативной с аминокислотами 20-35 из BclA (SEQ ID №: 1), и более высоко консервативную область, соответствующую аминокислотам 25-35 из BclA.
[0038] В гибридных белках по данному изобретению любая часть BclA которая включает аминокислоты 20-35, может быть использована в качестве сигнальной последовательности в данном изобретении. Кроме того, полноразмерные белки экзоспория или фрагменты белка экзоспория могут быть использованы для транспортировки гибридных белков в экзоспорий. Таким образом, полноразмерный BclA или фрагмент BclA, включающий аминокислоты 20-35, может быть использован для транспортировки в экзоспорий. Например, полноразмерный BclA (SEQ ID №: 2) или фрагмент BclA среднего размера, в котором отсутствует углеродный конец, такой как SEQ ID №: 59 (аминокислоты 1-196 из BclA), может быть использован для транспортировки гибридных белков в экзоспорий. Фрагменты среднего размера, такие как фрагмент SEQ ID №: 59, имеют меньшую вторичную структуру, чем полноразмерный BclA, и было установлено, что они пригодны для использования в качестве сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность может также содержать намного более короткие части BclA, включающие аминокислоты 20-35, такие как SEQ ID №: 1 (аминокислоты 1-41 из BclA), аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 1, аминокислоты кислоты 20-35 из SEQ ID №: 1 или SEQ ID №: 60 (метиониновый остаток связан с аминокислотами 20-35 из BclA). Даже более короткие фрагменты BclA, включающие лишь некоторые из аминокислот 20-35, также обладают способностью к направлять гибридные белки в экзоспорий. Например, целевая последовательность может включать аминокислоты 22-31 из SEQ ID №: 1, аминокислоты 22-33 из SEQ ID №: 1 или аминокислоты 20-31 из SEQ ID №: 1.
[0039] В альтернативном варианте любая часть BetА/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, генетического продукта KBAB4 2280, генетического продукта KBAB4 3572, лидерного пептида экзоспория В. cereus VD200, лидерного пептида экзоспория В. cereus VD166, гипотетического белка IKG_04663 B. cereus VD200, β-пропеллерного белка YVTN B. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bcerkbab4_2363 B. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bcerkbab4_2131 B. weihenstephensis KBAB4, тройной коллагеновой спирали B. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bmyco0001_21660 B. mycoides 2048, гипотетического белка bmyc0001_22540 B. mycoides 2048, гипотетического белка bmyc0001_21510B. mycoides 2048, белка тройной коллагеновой спирали B. thuringiensis 35646, гипотетического белка WP_69652 B. cereus, лидера WP016117717 экзоспория B. cereus, пептида WP002105192 экзоспория B. cereus, гипотетического белка WP87353 B. cereus, пептида 02112369 экзоспория B. cereus, белка WP016099770 экзоспория B. cereus, гипотетического белка YP006612525 B. thuringiensis или гипотетического белка TIGR03720 B. mycoides, который включает аминокислоты, соответствующие аминокислотам 20-35 из BclA, может служить сигнальной последовательностью. Как видно из рисунка 1, аминокислоты 12-27 из BetА/BAS3290, аминокислоты 23-38 из BAS4623, аминокислоты 13-28 из BclB, аминокислоты 9-24 из BAS1882, аминокислоты 18-33 генетического продукта KBAB4 2280, аминокислоты 18-33 генетического продукта KBAB4 3572, аминокислоты 28-43 лидерного пептида экзоспория B. cereus VD200, аминокислоты 12-27 лидерного пептида экзоспория B. cereus VD166, аминокислоты 18-33 гипотетического белка IKG_04663 B. cereus VD200, аминокислоты 18-33 β-пропеллерного белка В. weihenstephensis KBAB4 YVTN, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2363 B. weihenstephensis KBAB4, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2131 B. weihenstephensis KBAB4, аминокислоты 15-30 тройной коллагеновой спирали B. weihenstephensis KBAB4, аминокислоты 18-33 гипотетического белка bmyco0001_21660 B. mycoides 2048, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bmyc0001_22540 B. mycoides 2048, аминокислоты 1-15 гипотетического белка bmyc0001_21510 B. mycoides 2048, аминокислоты 1-16 белка тройной коллагеновой спирали B. thuringiensis 35646, аминокислоты 14-29 гипотетического белка WP_69652 B. cereus, аминокислоты 20-35 лидера WP016117717 экзоспория B. cereus, аминокислоты 28-43 пептида WP002105192 экзоспория B. cereus, аминокислоты 17-32 гипотетического белка WP87353 B. cereus, аминокислоты 18-33 пептида 02112369 экзоспория B. cereus, аминокислоты 18-33 белка WP016099770 экзоспория B. cereus, аминокислоты 15-30 гипотетического белка YP006612525 B. thuringiensis и аминокислоты 115-130 гипотетического белка TIGR03720 B. mycoides соответствуют аминокислотам 20-35 из BclA. Таким образом, любая часть этих белков, которые включают вышеперечисленные соответствующие аминокислоты, может служить сигнальной последовательностью.
[0040] Кроме того, любая аминокислотная последовательность, содержащая аминокислоты 20-35 из BclA или любые из вышеперечисленных соответствующих аминокислот, может служить сигнальной последовательностью.
[0041] Таким образом, сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 1, аминокислоты 20-35 из SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 60, аминокислоты 22-31 из SEQ ID №: 1, аминокислоты 22-33 из SEQ ID №: 1, или аминокислоты 20-31 из SEQ ID №: 1. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислот 1-35 из SEQ ID №: 1, аминокислот 20-35 из SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 1, или SEQ ID №: 60. В альтернативном варианте сигнальная последовательность может состоять из аминокислот 22-31 в SEQ ID №: 1, аминокислот 22-33 из SEQ ID №: 1, или аминокислот 20-31 из SEQ ID №: 1. В альтернативном варианте белок экзоспория может включать полноразмерный BclA (SEQ ID №: 2), или фрагмент белка экзоспория может включать фрагмент BclA среднего размера, в котором отсутствует углеродный конец, например, SEQ ID №: 59 (аминокислоты 1-196 из BclA). В альтернативном варианте фрагмент белка экзоспория может состоять из SEQ ID №: 59.
[0042] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-27 из SEQ ID №: 3, аминокислоты 12-27 из SEQ ID №: 3, или SEQ ID №: 3, или белок экзоспория может включать полноразмерный BetА/BAS3290 (SEQ ID №: 4). Кроме того, было обнаружено, что остаток метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 12-27 из BetA/BAS3290, может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 61. Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 14-23 из SEQ ID №: 3, аминокислоты 14-25 из SEQ ID №: 3, или аминокислоты 12-23 из SEQ ID №: 3.
[0043] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-38 из SEQ ID №: 5, аминокислоты 23-38 из SEQ ID №: 5, или SEQ ID №: 5, или белок экзоспория может включать полноразмерный BAS4623 (SEQ ID №: 6).
[0044] В альтернативном варианте сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-28 из SEQ ID №: 7, аминокислоты 13-28 из SEQ ID №: 7 или SEQ ID №: 7, или белок экзоспория может включать полноразмерный BclB (SEQ ID №: 8).
[0045] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 9, аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 9 или SEQ ID №: 9 или белок экзоспория может включать полноразмерный BAS1882 (SEQ ID №: 10). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 из BAS1882, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 69.
[0046] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 11, аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 11, или SEQ ID №: 11, или белок экзоспория может включать полноразмерный генетический продукт B. weihenstephensis KBAB4 2280 (SEQ ID №: 12). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 18-33 генетического продукта B. weihenstephensis KBAB4 2280, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать последовательность SEQ ID №: 62.
[0047] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 13, аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 13, или SEQ ID №: 13, или белок экзоспория может включать полноразмерный генетический продукт B. weihenstephensis KBAB4 3572 (SEQ ID №: 14). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 18-33 генетического продукта B. weihenstephensis KBAB4 3572, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 63.
[0048] В альтернативном варианте сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-43 из SEQ ID №: 15, аминокислоты 28-43 из SEQ ID №: 15, или SEQ ID №: 15, или белок экзоспория может включать полноразмерный лидерный пептид экзоспория B. cereus VD200 (SEQ ID №: 16).
[0049] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-27 из SEQ ID №: 17, аминокислоты 12-27 из SEQ ID №: 17, или SEQ ID №: 17, или белок экзоспория может включать полноразмерный лидерный пептид экзоспория B. cereus VD166 (SEQ ID №: 18). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 12-27 лидерного пептида экзоспория B. cereus VD166, может быть также использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 64.
[0050] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 19, аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 19, или SEQ ID №: 19, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок IKG_04663 из B. cereus VD200 (SEQ ID №: 20).
[0051] В альтернативном варианте сигнальная последовательность содержит аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 21, аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 21, или SEQ ID №: 21, или белок экзоспория может включать полноразмерный β-пропеллерный белок из B. weihenstephensis KBAB4 YVTN (SEQ ID №: 22). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 18-33 β-пропеллерного белка из B. weihenstephensis KBAB4 YVTN, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 65.
[0052] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 23, аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 23, или SEQ ID №: 23, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bcerkbab4_2363 из B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID №: 24). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_236 из B. weihenstephensis KBAB4, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 66.
[0053] Сигнальная последовательность содержит аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 25, аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 25, или SEQ ID №: 25, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bcerkbab4_2131 из B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID №: 26). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2131 из B. weihenstephensis KBAB4, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 67.
[0054] В альтернативном варианте сигнальная последовательность содержит аминокислоты 1-30 из SEQ ID №: 27, аминокислоты 15-30 из SEQ ID №: 27, или SEQ ID №: 27, или белок экзоспория может включать полноразмерную тройную коллагеновую спираль из B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID №: 28).
[0055] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 29, аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 29, или SEQ ID №: 29, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bmyco0001_21660 из B. mycoides 2048 (SEQ ID №: 30).
[0056] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-24 из SEQ ID №: 31, аминокислоты 9-24 из SEQ ID №: 31, или SEQ ID №: 31, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок bmyc0001_22540 из B. mycoides 2048 (SEQ ID №: 32). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bmyc0001_22540 из B. mycoides 2048, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 68.
[0057] В альтернативном варианте сигнальная последовательность содержит аминокислоты 1-15 из SEQ ID №: 33, SEQ ID №: 33, или белок экзоспория содержит полноразмерный гипотетический белок bmyc0001_21510 из B. mycoides 2048 (SEQ ID №: 34).
[0058] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-16 из SEQ ID №: 35, SEQ ID №: 35, или белок экзоспория может включать полноразмерный белок тройной коллагеновой спирали из B. thuringiensis 35646 (SEQ ID №: 36).
[0059] Сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-29 из SEQ ID №: 43, аминокислоты 14-29 из SEQ ID №: 43, или SEQ ID №: 43, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок WP_69652 из B. cereus (SEQ ID №: 44).
[0060] В альтернативном варианте сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 45, аминокислоты 20-35 из SEQ ID №: 45, или SEQ ID №: 45, или белок экзоспория может включать полноразмерный лидер WP016117717 из B. cereus (SEQ ID №: 46). Метиониновый остаток, связанный с аминокислотами 20-35 лидера WP016117717 из экзоспория B. cereus, также может быть использован в качестве сигнальной последовательности. Таким образом, сигнальная последовательность может включать SEQ ID №: 70.
[0061] Сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-43 из SEQ ID №: 47, аминокислоты 28-43 из SEQ ID №: 47, или SEQ ID №: 47, или белок экзоспория может включать полноразмерный пептид WP002105192 из экзоспория B. cereus (SEQ ID №: 48).
[0062] Сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-32 из SEQ ID №: 49, аминокислоты 17-32 из SEQ ID №: 49, или SEQ ID №: 49, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок WP87353 из B. cereus (SEQ ID №: 50).
[0063] В альтернативном варианте сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 51, аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 51, или SEQ ID №: 51, или белок экзоспория может включать полноразмерный пептид 02112369 из экзоспория B. cereus (SEQ ID №: 52).
[0064] Сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-33 из SEQ ID №: 53, аминокислоты 18-33 из SEQ ID №: 53, или SEQ ID №: 53, или белок экзоспория может включать полноразмерный белок WP016099770 из экзоспория B. cereus (SEQ ID №: 54).
[0065] В альтернативном варианте сигнальная последовательность может включать аминокислоты 1-30 из SEQ ID №: 55, аминокислоты 15-30 из SEQ ID №: 55, или SEQ ID №: 55, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок YP006612525 из B. thuringiensis (SEQ ID №: 56).
[0066] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислоты 1-130 из SEQ ID №: 57, аминокислоты 115-130 из SEQ ID №: 57, или SEQ ID №: 57, или белок экзоспория может включать полноразмерный гипотетический белок TIGR03720 из B. mycoides (SEQ ID №: 58).
[0067] Кроме того, как легко можно понять из выравнивания последовательностей на Фигуре 1, в то время как аминокислоты 20-35 из BclA являются консервативными, и аминокислоты 25-35 являются более консервативными, в этой области может возникать некоторый уровень вариации, не влияя на способность сигнальной последовательности транспортировать белок в экзоспорий. В Фигуре 1 перечислены проценты идентичности каждой из соответствующих аминокислот каждой последовательности с аминокислотами 20-35 из BclA («20-35% идентичности») и с аминокислотами 25-35 на BclA («25-35% идентичности»). Так, например, по сравнению с аминокислотами 20-35 из BclA, соответствующие аминокислоты из BetA/BAS3290 идентичны на около 81,3%, соответствующие аминокислоты из BAS4623 идентичны на около 50,0%, соответствующие аминокислоты из BclB идентичны на около 43,8%, соответствующие аминокислоты из BAS1882 идентичны на около 62,5%, соответствующие аминокислоты генетического продукта KBAB4 2280 идентичны на около 81,3% и соответствующие аминокислоты генетического продукта KBAB4 3572 идентичны на около 81,3%. Идентичности для остальных последовательностей этой области перечислены на Фигуре 1.
[0068] В отношении аминокислот 25-35 из BclA, соответствующие аминокислоты из BetA/BAS3290 идентичны на около 90,9%, соответствующие аминокислоты из BAS4623 идентичны на около 72,7%, соответствующие аминокислоты из BclB идентичны на около 54,5%, соответствующие аминокислоты из BAS1882 идентичны на около 72,7%, соответствующие аминокислоты генетического продукта KBAB4 2280 идентичны на около 90,9% и соответствующие аминокислоты генетического продукта KBAB4 3572 идентичны на около 81,8%. Идентичности для остальных последовательностей этой области перечислены на Фигуре 1.
[0069] Таким образом, сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 43% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 54%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 43% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 54%.
[0070] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%.
[0071] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%.
[0072] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 56% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 56% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%.
[0073] В альтернативном варианте сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 62% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%. Сигнальная последовательность может также состоять из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 62% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID №: 1 составляет по меньшей мере около 72%.
[0074] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 68% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере 68% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%.
[0075] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID №: 1 составляет по меньшей мере около 72%.
[0076] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID №: 1 составляет по меньшей мере около 81%.
[0077] Сигнальная последовательность может также содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%.
[0078] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 90%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 90%.
[0079] Специалисту в данной области техники будет понятно, что варианты указанных последовательностей могут быть также использованы в качестве сигнальных последовательностей при условии, что данная сигнальная последовательность содержит аминокислоты 20-35 из BclA, соответствующие аминокислоты из BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, генетического продукта KBAB4 2280 или генетического продукта KBAB 3572, или имеется последовательность, содержащая любую из вышеуказанных идентичностей с аминокислотами 20-35 и 25-35 из BclA.
[0080] Дополнительно было обнаружено, что некоторые белки представителей семейства Bacillus cereus, которые не имеют области, гомологичной к аминокислотам 25-35 из BclA, также могут быть использованы для транспортировки пептида или белка в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. В частности, гибридные белки могут содержать белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 71 (B. mycoides InhA), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 72 (B. anthracis Sterne BAS1141 (ExsY)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 73 (B. anthracis Sterne BAS1144 (BxpB/ExsFA)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 74 (B. anthracis Sterne BAS1145 (Coty)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 75 (B. anthracis Sterne BAS1140), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 76 (B. anthracis H9401 ExsFB), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 77 (B. thuringiensis HD74 InhA1), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 78 (B. cereus АТСС 10876 ExsJ), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 79 (B. cereus ExsH), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 80 (B. anthracis Ames YjcA), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 81 (B. anthracis YjcB), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 82 (B. anthracis Sterne BclC), белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 83 (Bacillus thuringiensis к. т. п. 97-27 кислой фосфатазы) или белок экзоспория, содержащий SEQ ID №: 84. (B. thuringiensis HD74 InhA2). Включение белка экзоспория, содержащего SEQ ID №: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84, в гибридные белки, описанные в данном документе, приведет к направлению в экзоспорий представителя семейства B. cereus.
[0081] Кроме того, белки экзоспория, имеющие высокую степень идентичности последовательности с любым из полноразмерных белков экзоспория, или фрагментов белка экзоспория, описанных выше, также могут быть использованы для транспортировки пептида или белка в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. Таким образом, гибридный белок может включать белок экзоспория, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности с любой из SEQ ID №: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 и 84. В альтернативном варианте гибридный белок может включать белок экзоспория, имеющий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности с любой из SEQ ID №: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 и 84.
[0082] В альтернативном варианте гибридный белок может включать фрагмент белка экзоспория, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID №: 59. В альтернативном варианте гибридный белок может включать фрагмент белка экзоспория, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности с SEQ ID №: 59.
[0083] В любой из сигнальных последовательностей, белках экзоспория или фрагментах белка экзоспория, описанных в данном документе, сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может включать аминокислотную последовательность GXT на его углеродном конце, причем Х представляет собой любую аминокислоту.
[0084] В любой из сигнальных последовательностей, белках экзоспория или фрагментах белка экзоспория, описанных в данном документе, сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может содержать аланиновый остаток в положении сигнальной последовательности, соответствующем аминокислоте 20 из SEQ ID №: 1.
Гибридные белки
[0085] Данное изобретение относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, и по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения, причем белок или пептид, стимулирующий рост растения, включает пептидный гормон, негормональный пептид или фермент, участвующий в продуцировании или активации соединения, стимулирующего рост растения. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любую из сигнальных последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, описанных ранее в параграфе [0005].
[0086] Данное изобретение дополнительно относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, который повышает устойчивость к стрессу в растении. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любую из сигнальных последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, описанных ранее в параграфе [0005].
[0087] Кроме того, данное изобретение относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, связывающийся с растением. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любую из сигнальных последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, описанных ранее в параграфе [0005].
[0088] Данное изобретение также относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любую из сигнальных последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, описанных ранее в параграфе [0006].
[0089] Данное изобретение дополнительно относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена. Белок или пептид, защищающий растение от патогена, включает гарпин, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин, пептид флагеллина, бактериоцин, лизоцим, пептид лизоцима, сидерофор, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина или TasA. В альтернативном варианте белок или пептид, защищающий растение от патогена, обладает инсектицидной активностью, антигельминтной активностью, подавляет хищничество насекомых или червей, или их комбинацию. В альтернативном варианте белок, защищающий растение от патогена, включает фермент. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любую из сигнальных последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, описанных ранее в параграфе [0005].
[0090] Гибридный белок может быть получен с использованием стандартных способов клонирования и молекулярной биологии, известных в данной области техники. Например, ген, кодирующий белок или пептид (например, ген, кодирующий белок или пептид, стимулирующий рост растения) может быть амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигирован с кодирующей ДНК для любой из сигнальных последовательностей, описанных выше, с целью сформировать молекулу ДНК, которая кодирует гибридный белок. Молекула ДНК кодирующая гибридный белок, может быть клонирована в виде любого подходящего вектора, например, плазмидного вектора. В подходящем варианте вектор содержит сайт множественного клонирования, в который может быть легко вставлена молекула ДНК, кодирующая гибридный белок. В подходящем варианте вектор также содержит селективный маркер, например, ген резистентности к антибиотику, таким образом, что трансформированные, трансфицированные или соединенные с вектором бактерии могут быть легко идентифицированы и выделены. В случае, когда вектор представляет собой плазмиду, в подходящем варианте плазмида также содержит точку начала репликации. В подходящем варианте ДНК, кодирующая гибридный белок, находится под контролем промотора споруляции, который будет вызывать экспрессию гибридного белка на экзоспории эндоспоры представителя семейства B. cereus (например, нативный промотор BclA представителя семейства B. cereus). В альтернативном варианте ДНК, кодирующая гибридный белок, может быть интегрирована в хромосомную ДНК представителя семейства B. cereus.
[0091] Гибридный белок может также содержать дополнительные последовательности полипептидов, которые не являются частью сигнальной последовательности, белка экзоспория, фрагмента белка экзоспория или белка или пептида, стимулирующего рост растений, белка или пептида, защищающего растение от патогенов, белка или пептида который повышает устойчивость к стрессу в растении, или белка или пептида, который связывается с растением. Например, гибридный белок может включать метки или маркеры с целью облегчить очистку или визуализацию гибридного белка (например, полигистидиновую метку или флуоресцентный белок, такой как GFP или YFP) или визуализации спор рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих гибридный белок.
[0092] Экспрессия гибридных белков на экзоспории с использованием сигнальных последовательностей, белков экзоспория и фрагментов белка экзоспория, описанных в данном документе, усиливается из-за отсутствия вторичной структуры в амино-конце этих последовательностей, что позволяет сохранить нативную структуру и активность гибридных белков. Правильность формы может быть дополнительно усилена включением короткого аминокислотного линкера между сигнальной последовательностью, белком экзоспория, фрагментом белка экзоспория и белком-партнером слияния.
[0093] Таким образом, любой из гибридных белков, описанных в данном документе, может включать аминокислотный линкер между сигнальной последовательностью, белком экзоспория или фрагментом белка экзоспория и белком или пептидом, стимулирующим рост растения, белком или пептидом, защищающим растение от патогена, белком или пептидом, повышающим устойчивость к стрессу в растении, или белком или пептидом, связывающимся с растением.
[0094] Линкер может включать полиаланиновый линкер или полиглициновый линкер. Также может быть использован линкер, содержащий смесь обоих - аланинового и глицинового остатков. Например, если сигнальная последовательность содержит SEQ ID №: 1, гибридный белок может иметь одну из следующих структур:
Линкер отсутствует: SEQ ID №: 1 - белок-партнер слияния
Аланиновый линкер: SEQ ID №: 1-An-белок-партнер слияния
Глициновый линкер: SEQ ID №: 1-Gn -белок-партнер слияния
Смесь аланинового и глицинового линкеров: SEQ ID №: 1-(A/G)n-белок-партнер слияния
где An, Gn, и (A/G) представляют собой аланины в любом количестве, глицины в любом количестве или смесь аланинов и глицинов в любом количестве, соответственно. Например, n может составлять от 1 до 25, и предпочтительно от 6 до 10. Если линкер содержит смесь аланиновых и глициновых остатков, может быть использована любая комбинация глицина и аланина. В приведенных выше структурах «белок-партнер слияния» представляет собой белок или пептид, стимулирующий рост растения, белок или пептид, защищающий растение от патогена, белок или пептид, повышающий устойчивость к стрессу в растении, или белок или пептид, связывающийся с растением.
[0095] В альтернативном варианте или в дополнение, линкер может включать сайт распознавания протеазой. Включение сайта распознавания протеазой позволяет целевое удаление под воздействием протеазы, которая распознает сайт распознавания протеазой, в белке или пептиде, стимулирующем рост растения, белке или пептиде, защищающем растение от патогена, белке или пептиде, повышающем устойчивость к стрессу в растении, или белке или пептиде, связывающемся с растением.
Белки и пептиды, стимулирующие рост растения
[0096] Как отмечено выше, данное изобретение относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения, причем белок или пептид, стимулирующий рост растения, включает пептидный гормон, негормональный пептид или фермент, участвующий в продуцировании или активации соединения, стимулирующего рост растения.
[0097] Например, если белок или пептид, стимулирующий рост растения, содержит пептидный гормон, этот пептидный гормон может включать фитосульфокин (например, фитосульфокин-α), clavata 3 (CLV3), системин, ZmlGF или SCR/SP11.
[0098] Если белок или пептид, стимулирующий рост растения, содержит негормональный пептид, этот негормональный пептид может включать RKN 16D10, Hg-Syv46, eNOD40 пептид, мелиттин, мастопаран, Mas7, RHPP, POLARIS или ингибитор трипсина Кунитца (ИТК).
[0099] Белок или пептид, стимулирующий рост растения, может включать фермент, участвующий в образовании или активации соединения, стимулирующего рост растения. Фермент, участвующий в образовании или активации соединения, стимулирующего рост растения, может представлять собой любой фермент, который катализирует любой этап пути биосинтеза соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, или любой фермент, который катализирует переход неактивного или менее активного производного соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, в активную или более активную форму соединения.
[00100] Соединение, которое стимулирует рост растения, может включать соединение, производимое бактериями или грибами в ризосфере, например, 2,3-бутандиол.
[00101] В альтернативном варианте соединение, которое стимулирует рост растения, может включать гормон роста растений, например, цитокинин или производное цитокинина, этилен, ауксин или производное ауксина, гибберелловую кислоту или ее производное гибберелловой кислоты, абсцизовую кислоту или производное абсцизовой кислоты, жасминовую кислоту или производное жасминовой кислоты.
[00102] Если соединение, стимулирующее рост растений, включает цитокинин или производную цитокинина, цитокинин или производное цитокинина может включать кинетин, цис-зеатин, транс-зеатин, 6-бензиламинопурин, дигидроксизеатин, N6-(D2-изопентенил) аденин, рибозилзеатин, N6-(D2-изопентенил) аденозин, 2-метилтио-цис-рибозилзеатин, цис-рибозилзеатин, транс-рибозилзеатин, 2-метилтио-транс-рибозилзеатин, рибозилзеатин-5-монофосфат, N6-метиламинопурин, N6-диметиламинопурин, 2'-дезоксизеатин рибозид, 4-гидрокси-3-метил-транс-2-бутениламинопурин, орто-тополин, мета-тополин, бензиладенин, орто-метилтополин, мета-метилтополин или их комбинацию.
[00103] Если соединение, стимулирующие рост растения, содержит ауксин или производное ауксина, ауксин или производное ауксина может включать активный ауксин, неактивный ауксин, конъюгированный ауксин, природный ауксин, синтетический ауксин или их комбинацию. Например, ауксин или производное ауксина может включать индол-3-ацетальдоксим, индол-3-ацетамид, индол-3-ацетонитрил, индол-3-этанол, индол-3-пируват, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-масляную кислоту, фенилуксусную кислоту, 4-хлориндол-3-уксусную кислоту, ауксин, конъюгированный с глюкозой, или их комбинацию.
[00104] Фермент, участвующий в образовании или активации соединения, которое стимулирует рост растения, может включать ацетоинредуктазу, индол-3-ацетамидгидролазу, триптофанмонооксигеназу, ацетолактатсинтетазу, α-ацетолактатдекарбоксилазу, пируватдекарбоксилазу, диацетилредуктазу, бутандиолдегидрогеназу, аминотрансферазу, триптофандекарбоксилазу, аминоксидазу, индол-3-пируватдекарбоксилазу, индол-3-ацетальдегид-дегидрогеназу, триптофан боковой цепи-оксидазу, нитрилгидролазу, нитрилазу, пептидазу, протеазу, аденозинфосфат-изопентилтрансферазу, фосфатазу, аденозинкиназу, аденин-фосфорибозилтрансферазу, CYP735A, 5'-рибонуклеотид-фосфогидролазу, аденозин-нуклеозидазу, зеатин-цис-транс-изомеразу, зеатин-О-глюкозилтрансферазу, β-глюкозидазу, цис-гидроксилазу, ЦK-цис-гидроксилазу, ЦК-N-глюкозилтрансферазу, 2,5-рибонуклеотид-фосфогидролазу, аденозин-нуклеозидазу, пурин-нуклеозидфосфорилазу, зеатинредуктазу, гидроксиламинредуктазу, 2-оксоглутаратдиоксигеназу, гибберелловую-2В/3В-гидролазу, гиббереллин-3-оксидазу, гиббереллин-20-оксидазу, хитозиназу, хитиназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты-деаминазу или фермент, участвующий в продуцировании nod-факторов (например, NodA, nodB или NodI).
[00105] Если фермент включает протеазу или пептидазу, эта протеаза или пептидаза может представлять собой протеазу или пептидазу, которая расщепляет белки, пептиды, пробелки или препробелки для получения биологически активного пептида. Биологически активный пептид может представлять собой любой пептид, который проявляет биологическую активность.
[00106] Примеры биологически активных пептидов включают RKN 16D10 и RHPP.
[00107] Протеаза или пептидаза, которая расщепляет белки, пептиды, пробелки или препробелки для получения биологически активного пептида, может включать субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеазу.
[00108] Протеазы или пептидазы могут расщеплять белки в пище, богатой белком (например, соевый шрот или дрожжевой экстракт).
Белки и пептиды, которые защищают растения от патогенов
[00109] Данное изобретение относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, защищающий растение от патогена.
[00110] Белок или пептид, защищающий растение от патогена, может включать белок или пептид, который стимулирует иммунный ответ растения. Например, белок или пептид, который стимулирует иммунную реакцию растения, может включать белок или пептид, усиливающий иммунную систему растения. Белок или пептид, который усиливает иммунную систему растения, может представлять собой любой белок или пептид, который оказывает благоприятное воздействие на иммунную систему растения. Подходящие белки или пептиды, которые усиливают иммунную систему растения, включают гарпины, α-эластины, β-эластины, системины, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситины, дефензины, криптогеины, белки флагеллины и пептиды флагеллина (например, flg22).
[00111] В альтернативном варианте белок или пептид, защищающий растение от патогена, может представлять собой белок или пептид, который обладает антибактериальной активностью, противогрибковой активностью, или обеими - антибактериальной и противогрибковой активностью. Примеры таких белков и пептидов включают бактериоцины, лизоцимы, пептиды лизоцима (например, LysM), сидерофоры, нерибосомальные активные пептиды, кональбумины, альбумины, лактоферрины, пептиды лактоферрина (например, LfcinB) и TasA.
[00112] Белок или пептид, защищающий растение от патогена, может также представлять собой белок или пептид, который обладает инсектицидной активностью, антигельминтной активностью, подавляет хищничество насекомых или червей, или обладает их комбинацией. Например, белок или пептид, защищающий растение от патогена, может включать инсектицидный бактериальный токсин (например, инсектицидный белок VIP), эндотоксин, Cry токсин (например, Cry токсин из Bacillus thuringiensis), белок или пептид ингибитор протеазы (например, ингибитор трипсина или стреловидный ингибитор протеазы), цистеиновую протеазу или хитиназу. Если Cry токсин представляет собой Cry токсин из Bacillus thuringiensis, Cry токсин может представлять собой белок Cry5B или белок Cry21A. Оба Cry5B и Cry21A обладают инсектицидной и нематоцидной активностью.
[00113] Белок, защищающий растение от патогена, может включать фермент. Подходящие ферменты включают протеазы и лактоназы. В протеазы и лактоназы могут быть специфичным для бактериальной сигнальной молекулы (например, бактериальную сигнальную молекулу гомосеринового лактона).
[00114] Если фермент представляет собой лактоназу, такая лактоназа может включать 1,4-лактоназу, 2-пирон-4,6-дикарбоксилат-лактоназу, 3-оксоадипат-енол-лактоназу, актиномицин-лактоназу, дезоксилимонат-А-кольцевую-лактоназу, глюконолактоназу, L-рамноно-1,4-лактоназу, лимонин-D-кольцевую-лактоназу, стероид-лактоназу, триацетат-лактоназу или ксилоно-1,4-лактоназу.
[00115] Фермент также может представлять собой фермент, который является специфичным для клеточного компонента бактерий или грибов. Например, фермент может включать β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозиназу, хитиназу, хитозиназоподобный фермент, литиказу, пептидазу, протеиназу, протеазу (например, щелочную протеазу, кислую протеазу или нейтральную протеазу), мутанолизин, стафолисин или лизоцим.
[00116] Для любого из вышеуказанных гибридных белков, содержащих белок или пептид, защищающий растение от патогена, патоген может представлять собой бактериальный патоген или грибковый патоген. Например, патоген может включать протеобактерию α-класса, протеобактерию β-класса, протеобактерию γ-класса или их комбинацию. Конкретные бактериальные патогены включают Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris и их комбинации.
[00118] Патогенные насекомые и черви включают Acalymma, Acyrthosiphon pisum, Spodoptera exempta, африканизированную пчелу, Agromyzidae, Agrotis munda, Agrotis porphyricollis, Aleurocanthus woglumi, Aleyrodes proletella, Alphitobius diaperinus, Altica chalybea, Anasa tristis, Anguina tritici, Anisoplia austriaca, Anthonomus pomorum, Anthonomus signatus, Aonidiella aurantii, Apamea apamiformis, Apamea niveivenosa, Aphelenchoides spp., тлю, Aphis gossypii, яблонную пестрокрылку, аргентинского муравья, Euxoa auxiliaris, Arotrophora arcuatalis, Asterolecanium coffeae, Athous haemorrhoidalis, Aulacophora, Chortoicetes terminifera Bactericera cockerelli, Bactrocera, Bactrocera correcta, Bagrada hilaris, Knulliana cincta, карадрину, Belonolaimus spp., свекловичную тлю, Blepharidopterus chlorionis, Agrotis infusa, хлопкового долгоносика, Bradysia similigibbosa, стручкового капустного комарика, Brevicoryne brassicae, коричневую саранчу, клопа мраморного щитника, бурую рисовую цикадку, Bursephelenchus spp., капустную совку, купустную гусеницу, Callosobruchus maculatus, Dermolepida albohirtum, морковную муху, овсяную нематоду, Cecidomyiidae, Ceratitis capitata, Ceratitis rosa, пьявицу красногрудую, Chlorops pumilionis, Anoplophora chinensis, Coccus viridis, яблонную плодожорку, кофейного жука, коллорадского жука, хрущака малого мучного, Crambus, полосатого огуречного жука, Curculio nucum, Curculio occidentis, личинок моли, Cyclocephala borealis, совку-ипсилон, пальмового короеда, Delia spp., Delia antiqua, Delia floralis, Delia radicum, пустынную саранчу, Diabrotica, Diabrotica balteata, Diabrotica speciosa, капустную моль, Diaphania indica, Diaphania nitidalis, Diaphorina citri, Diaprepes abbreviatus, Diatraea saccharalis, Melanoplus differentialis, Ditylenchus spp., Dociostaurus maroccanus, Drosophila suzukii, Dryocosmus kuriphilus, Earias perhuegeli, Epicauta vittata, Epilachna varivestis, Erionota thrax, Eriosomatinae, Euleia heraclei, Eumetopina flavipes, Eupoecilia ambiguella, огневку кукурузную, Eurydema oleracea, Eurygaster integriceps, щитника красноногого, Frankliniella tritici, Galleria mellonella, Euxoa nigricans, Homalodisca vitripennis, тепличную белокрылку, Gryllotalpa orientalis, Gryllus pennsylvanicus, непарного шелкопряда, Helicoverpa armigera, Helicoverpa gelotopoeon, Helicoverpa punctigera, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Henosepilachna vigintioctopunctata, гессенскую муху, Heterodera spp., Jacobiasca formosana, хруща японского, кожееда зернового, Lampides boeticus, листового минера, Lepidiota consobrina, Lepidosaphes beckii, Lepidosaphes ulmi, Leptoglossus zonatus, Leptopterna dolabrata, малую восковую моль, Leucoptera (моль), Leucoptera caffeina, бурую плодовую моль, Lissorhoptrus oryzophilus, длиннохвостого шкипера, Lygus, Lygus hesperus, Maconellicoccus hirsutus, Macrodactylus subspinosus, Macrosiphum euphorbiae, долгоносика амбарного кукурузного, Manduca sexta, Mayetiola hordei, Mealybug, Meloidogyne spp., Megacopta cribraria, Metcalfa pruinosa, молей, луковую моль, Myzus persicae, Naccobus spp., Nezara viridula, походного шелкопряда дубового, маслинную муху, Ophiomyia simplex, Opisina arenosella, Opomyza, Opomyza florum, Opomyzidae, Oscinella frit, Ostrinia furnacalis, Oxycarenus hyalinipennis, Paracoccus marginatus, Papilio demodocus, Paratachardina pseudolobata, Pentatomoidea, Phthorimaea operculella, Phyllophaga, Phylloxera, Phylloxeridae, Phylloxeroidea, Pieris brassicae, хлопковую моль, Planococcus citri, Platynota idaeusalis, Plum curculio, Pratylenchus spp., Prionus californicus, Pseudococcus viburni, Pyralis farinalis, красного огненного муравья, красную саранчу, корневых нематод Pratylenchus, корневых галлообразующих фитонематод, Radopholus spp., Rotylenchulus spp., Rhagoletis cerasi, Rhagoletis indifferens, Rhagoletis mendax, Rhopalosiphum maidis, Rhyacionia frustrana, Rhynchophorus ferrugineus, Rhynchophorus palmarum, Rhyzopertha, рисовую моль, рисового клопа щитника, ячменную тлю, калифорнийскую щитовку, щитовок, Schistocerca americana, Sciaridae, Scirtothrips dorsalis, Scutelleridae, Scutiphora pedicellata, пшеничную нематоду, змеевидного листового минера, табачную белокрылку, Sipha flava, малого ульевого жука, огневку кукурузную юго-западную, соевую тлю, Spodoptera cilium, Spodoptera litura, пятнистого огуречного жука, Melittia cucurbitae, стеблевых нематод, Stenotus binotatus, Strauzia longipennis, блошку полосатую, клопа вредную черепашку, Physomerus grossipes, клопа-слепняка, трипсы, Thrips angusticeps, Thrips palmi, Toxoptera citricida, Trichodorus spp., Trioza erytreae, совку озимую, Tuta absoluta, Tylenchulus spp., кожееда домового, Virachola isocrates, личинок восковых молей, западного кукурузного жука, западного цветочного трипса, пшеничного комарика, долгоносика амбарного обыкновенного, белокрылок, зимнюю пяденицу и Xiphenema spp.
[00119] Например, патогенное насекомое или червь может представлять собой совку, совку-ипсилон, кукурузного мотылька, совку травяную, гусеницу озимой совки, хрущика японского, огневку Elasmopalpus lignosellus, долгоносика кукурузного, личинку мухи ростковой, лугового мотылька, огневку кукурузную стеблевую, жука-блошку одиннадцатиточечную, южного картофельного проволочника, совку Papaipema nebris, жука-носорога сахарного тростника, личинку хруща, совку ни, хлопкового долгоносика, совку Spodoptera ornithogalli, пьявицу красногрудую, клопа-черепашку пшеничную североамериканскую, тлю, совку малую, коровку Epilachna varivestis, совку Chrysodeixis includens, Dectes texanus или их комбинацию.
Белки и пептиды, которые повышают устойчивость к стрессу в растениях
[00120] Данное изобретение также относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория и по меньшей мере один белок или пептид, усиливающий устойчивость к стрессу в растении.
[00121] Например, белок или пептид, который повышает устойчивость к стрессу в растении, включает фермент, вызывающий деградацию соединений, связанных со стрессом. Соединения, связанные со стрессом, включают, но не ограничиваются этим, аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (АЦК), активные формы кислорода, оксид азота, оксилипины, и фенольные соединения. Конкретные активные формы кислорода включают гидроксил, перекись водорода, кислород и супероксид. Фермент, вызывающий деградацию соединений, связанных со стрессом, может включать супероксиддисмутазы, оксидазу, каталазу, в деаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, пероксидазу, антиоксидантное фермент, или антиоксидантный пептид.
[00122] Белок или пептид, который повышает устойчивость к стрессу в растении, может также содержать белок или пептид, защищающий растение от воздействия окружающей среды. Экологический стресс может включать, например, засуху, наводнение, высокие температуры, заморозки, засаливание, тяжелые металлы, низкое значение рН, высокое значение рН или их комбинацию. Например, белок или пептид, защищающий растение от воздействия окружающей среды, могут содержит белок, индуцирующий формирование микрокристаллов льда, пролиназу, фенилаланин-аммиак-лиазу, изохоризмат-синтазу, изохоризмат-пируват-лиазу или холиндегидрогеназу.
Белки и пептиды, связывающиеся с растением
[00123] Изобретение также относится к гибридным белкам, содержащим сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория и по меньшей один белок или пептид, связывающийся с растением. Белок или пептид, связывающийся с растением, может представлять собой любой белок или пептид, способный специфически или неспецифически связываться с любой частью растения (например, с корнем или с надземной частью растения, такой как лист, стебель, цветок или плод) или с растительным материалом. Так, например, белок или пептид, связывающийся с растением, может представлять собой белок или пептид, связывающийся с корнем, или белок, или пептид, связывающийся с листом.
[00124] Подходящие белки или пептиды, связывающиеся с растением, включают адгезины, флагеллины (например, рикфлагелин), омптины, лектины, экспансины, структурные белки биопленки (например, TasA или YuaB), белки пилуса, белки Curlus, интимины, инвазины, агглютинины и нефимбриальные белки.
Другие гибридные белки
[00125] Данное изобретение дополнительно относится к гибридным белкам, содержащим по меньшей мере один целевой белок или пептид, и белок экзоспория, содержащий белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере 85% идентичности с любой из SEQ ID №№: 71, 75, 80, 81, 82, 83, и 84. В альтернативном варианте белок экзоспория может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100% идентичности с любой из SEQ ID №№: 71, 75, 80, 81, 82, 83, и 84.
[00126] Целевой белок или пептид, может включать любой белок или пептид. Например, целевой белок или пептид может включать любой из белков или пептидов, описанных в данном документе. Например, целевой белок или пептид может включать любой из описанных в данном документе белков или пептидов, стимулирующих рост растения, любой из описанных в данном документе белков или пептидов, которые защищают растение от патогена, любой из описанных в данном документе белков или пептидов, которые повышает устойчивость к стрессу в растении, или любой из описанных в данном документе белков или пептидов, связывающихся с растением.
[00127] Таким образом, когда целевой белок или пептид включает белок или пептид, стимулирующий рост растения, белок или пептид, стимулирующий рост растения, может включать пептидный гормон, негормональный пептид или фермент, участвующий в образовании или активации соединения, стимулирующего рост растения. В альтернативном варианте белок или пептид, стимулирующий рост растения, может включать любой из ферментов, разрушающих или модифицирующих бактериальный, грибковый или растительный источник питательных веществ, которые описаны ниже.
Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют гибридные белки
[00128] Данное изобретение также относится к рекомбинантному представителю семейства Bacillus cereus, который экспрессирует гибридный белок. Гибридный белок может представлять собой любой из гибридных белков, описанных выше.
[00129] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может дополнительно экспрессировать два или более любых из гибридных белков, описанных выше. Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может дополнительно экспрессировать по меньшей мере один гибридный белок, который содержит белок или пептид, связывающийся с растением, вместе с по меньшей мере одним гибридным белком, содержащим белок или пептид, стимулирующий рост растения, по меньшей мере одним гибридным белком, содержащим белок или пептид, защищающий растение от патогена, или по меньшей мере одним белком или пептидом, повышающим устойчивость к стрессу в растении.
[00130] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis или их комбинацию. Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudomycoides или Bacillus mycoides. В частности, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides.
[00131] С целью создать рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего гибридный белок, любой представитель семейства Bacillus cereus может быть конъюгирован, трансдуцирован или трансформирован вектором, кодирующим гибридный белок, с использованием стандартных способов, известных в данной области техники (например, путем электропорации). После этого бактерии могут быть подвергнуты скринингу для идентификации трансформантов любым способом, известным в данной области техники. Например, если вектор включает ген устойчивости к антибиотику, бактерии могут быть подвергнуты скринингу на устойчивость к антибиотикам. В альтернативном варианте ДНК, кодирующая гибридный белок, может быть интегрирована в хромосомную ДНК хозяина представителя семейства B. cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может быть подвержен условиям, которые вызывают споруляцию. Подходящие условия для индуцирования споруляции известны в данной области техники. Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может быть высеян на чашки с агаром и инкубирован при температуре около 30°С в течение нескольких дней (например, 3 суток).
[00132] Также соответствующим образом могут быть использованы инактивированные штаммы, нетоксичные штаммы, или генетически модифицированные штаммы любого из вышеперечисленных видов. Например, может быть использован Bacillus thuringiensis, в котором отсутствует токсин Cry. В альтернативном варианте или в дополнение, после получения спор рекомбинантного представителя В. cereus, экспрессирующих гибридный белок, они могут быть инактивированы, чтобы предотвратить дальнейшее прорастание во время использования. Может быть использован любой способ инактивации бактериальных спор, который известен в данной области техники. Подходящие способы включают, без ограничения, термообработку, гамма-облучение, рентгеновское облучение, УФ-А облучение, УФ-Б облучение, химическая обработка (например, обработка глютаровым альдегидом, формальдегидом, перекисью водорода, уксусной кислотой, отбеливателем или их комбинацией) или их комбинацией. В альтернативном варианте могут быть использованы споры, полученные из штаммов нетоксигенных штаммов или генетически или физически инактивированных штаммов.
Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, обладающие эффектом стимуляции роста растений и/или другими полезными свойствами.
[00133] Многие штаммы представителей семейства Bacillus cereus обладают полезные свойствами. Например, некоторые штаммы обладают эффектом стимуляции роста растений. В таких штаммах может быть экспрессирован любой из гибридных белков, описанных в данном документе.
[00134] Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать штамм бактерий, стимулирующий рост растения.
[00135] Штамм бактерий, стимулирующий рост растения, может включать штамм бактерий, который продуцирует инсектицидный токсин (например, токсин Cry), продуцирует фунгицидное соединение (например, β-1,3-глуканазу, хитозиназу, лутиказу, или их комбинацию), продуцирует нематоцидное соединение (например, токсин Cry), продуцирует бактерицидное соединение, является устойчивым к одному или более антибиотикам, содержит одну или более самостоятельно реплицирующихся плазмид, прикрепляется к корням растений, колонизирует корни растений, формирует биопленки, растворяет питательные вещества, секретирует органические кислоты, или их комбинацию.
[00136] Например, если рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает штамм бактерий, стимулирующий рост растения, такой штамм бактерий, стимулирующий рост растения, может включать Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL № B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № B-50922), представителя семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL № B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № В-50924) или представителя семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928). Каждый из этих штаммов был помещен на хранение Службой сельскохозяйственных исследований (ССИ) Министерства сельского хозяйства США (МСХСША) по адресу 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U. S. A., 10 марта 2014 года, и идентифицируются по номеру NRRL (Northern Regional Research Laboratory), указанному в скобках.
[00137] Эти штаммы, стимулирующие рост растения, были выделены из ризосфер различных активно растущих растений и были идентифицированы по их последовательности 16S рРНК (указанной в данном документе как SEQ ID №№: 104-110) и с помощью биохимических анализов. Данные штаммы были идентифицированы по меньшей мере до рода с помощью общих биохимических методов и морфологических показателей. Биохимические тесты для подтверждения грам-положительных штаммов, таких как Bacillus, включали выращивание на среде PEA и питательном агаре, микроскопические исследования, выращивание на среде, содержащей 5% и 7,5% NaCl, выращивание при рН 5 и рН 9, выращивание при 42°С и 50°С, способность продуцировать кислоту при ферментации с целлобиозой, лактозой, глицерином, глюкозой, сахарозой, d-маннитом и крахмалом; продуцирование флуоресцентных пигментов; гидролиз желатина; восстановление нитратов; продуцирование каталазы, гидролиз крахмала; оксидативная реакция, продуцирование уреазы и подвижность. Идентификация этих штаммов и демонстрация их стимулирующих эффектов на рост растений описаны далее в примерах, приведенных ниже.
[00138] Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, включающий штамм бактерий, стимулирующий рост растения, может включать Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141 или Bacillus thuringiensis BT013A. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может экспрессировать любой из гибридных белков, описанных в данном документе, например, гибридный белок, содержащий сигнальную последовательность из SEQ ID №: 60 и негормональный пептидный (например, ингибитор трипсина Кунитца (ИКТ)), фермент участвующий в образовании или активации соединения, индуцирующего рост растений (например, хитозиназа), белок или пептид, связывающийся с растением (например, TasA); белок или пептид, защищающий растение от патогенов (например, TasA), или фермент, который разрушает или изменяет бактериальные, грибковые или растительные источники питательных веществ (например, фосфатазы, такие как PhoA или фитазы, или эндоглюканазы).
Промоторы
[00139] В любом из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в данном документе, гибридный белок может экспрессироваться под контролем промотора, который является родным для сигнальной последовательности белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория гибридного белка. Например, если гибридный белок содержит сигнальную последовательность, полученную из B. anthracis Sterne BclA (например, аминокислот 20-35 из SEQ ID №: 1, аминокислот 1-35 из SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 1 или SEQ ID №: 60) или если гибридный белок содержит полноразмерный BclA (SEQ ID №: 2) или фрагмент полноразмерного BclA (например, SEQ ID №: 59), гибридный белок может экспрессироваться под контролем промотора, который, как правило, связан с геном BclA в геноме B. anthracis Sterne (например, промотор SEQ ID №: 85).
[00140] В альтернативном варианте гибридный белок может экспрессироваться под контролем сильного промотора споруляции. В некоторых случаях промотор, который является нативным для сигнальной последовательности, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория будет представлять собой сильный промотор споруляции. В других случаях промотор, который является нативным для сигнальной последовательности, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория не будет представлять собой сильный промотор споруляции. В последнем случае может быть предпочтительным заменить нативный промотор на сильный промотор споруляции. Экспрессия гибридного белка под контролем сильного промотора споруляции обеспечивает повышенную экспрессию гибридного белка на экзоспории представителя семейства Bacillus cereus.
[00141] Сильный промотор споруляции может включать одну или более промоторную последовательность сигма-K, специфическую для полимеразы споруляции.
[00142] Подходящие сильные промоторы споруляции для применения в экспрессировании гибридных белков в представителе семейства Bacillus cereus, включают следующие, перечисленные в таблице 2 ниже:
Таблица 2. Промоторные последовательности
(SEQ ID №)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 85)
(B. anthracis Sterne) (SEQ ID №: 86)
(SEQ ID №: 87)
(B. weihenstephensis KBAB 4)
(SEQ ID №: 88)
(B. weihenstephensis KBAB 4)
(SEQ ID №: 89)
(B. thuringiensis HD-73)
(SEQ ID №: 90)
(B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27)
(SEQ ID №: 91)
(B. thuringiensis Al Hakam)
(SEQ ID №: 92)
(B. thuringiensis serovar kurstaki str. HD 73)
(SEQ ID №: 93)
(B. thuringiensis serovar kurstaki str. HD73)
(SEQ ID №: 94)
(B. thuringiensis Al Hakam)
(SEQ ID №: 95)
(B. thuringiensis Al Hakam)
(SEQ ID №: 96)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 97)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 98)
(B. anthracis Sterne)
(SEQ ID №: 99)
(B. thuringiensis Al Hakam)
(SEQ ID №: 100)
(B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27)
(SEQ ID №: 101)
(B. thuringiensis serovar kurstaki str. HD73)
(SEQ ID №: 102)
(B. thuringiensis Al Hakam)
(SEQ ID №: 103)
[00143] В промоторных последовательностях, перечисленных в Таблице 2 выше, положения промоторных последовательностей сигма-K, специфических для полимеразы споруляции, обозначаются жирным шрифтом и подчеркнутым текстом. Промотор Cry1A (B. thuringiensis HD-73; SEQ ID №: 90) имеет в общей сложности четыре последовательности сигма-K, две из которых перекрываются друг другом, как показано двойным подчеркиванием в таблице 2.
[00144] Предпочтительные сильные промоторы споруляции для использования в экспрессии гибридных белков в представителях семейства Bacillus cereus включают промотор BetA (B. anthracis Sterne; SEQ ID №: 86), промотор BclA (B. anthracis Sterne; SEQ ID №: 85), промоторы оперонов 1 и 2 кластера BclA гликозилтрансферазы (B. anthracis Sterne; SEQ ID №№: 101 и 102), и промотор β-пропеллерного белка YVTN (В. weihenstephensis KBAB 4; SEQ ID №: 89).
[00145] В любом из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в данном документе, гибридный белок может экспрессироваться под контролем промотора споруляции, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности с последовательностью нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID №: 85-103.
[00146] Если промотор споруляции содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID №№№: 85-103, промоторная последовательность или последовательности сигма-K, специфические для полимеразы споруляции, предпочтительно имеют 100% идентичности с соответствующими нуклеотидами из SEQ ID №: 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 или 103. Например, как показано в Таблице 2 выше, промотор BclA B. anthracis Sterne (SEQ ID №: 85) содержит промоторные последовательности сигма-K, специфические для полимеразы споруляции, на нуклеотидах 24-32, 35-43 и 129-137. Таким образом, если промотор споруляции включает последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 85, предпочтительно, чтобы нуклеотиды промотора споруляции, соответствующие нуклеотидам 24-32, 35-43 и 129-137 из SEQ ID №: 85 имели 100% идентичности с нуклеотидами 24-32, 35-43 и 129-137 в SEQ ID №: 85.
Препараты
[00147] Данное изобретение также относится к препаратам, содержащим любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в предыдущем разделе, и сельскохозяйственно приемлемый носитель.
[00148] Сельскохозяйственно приемлемый носитель может представлять собой любой носитель, приемлемый для использования в сельском хозяйстве. Например, подходящие сельскохозяйственно приемлемые носители включают, но не ограничиваются этим, диспергирующие вещества, сурфактанты, примеси, воду, загустители, противослеживающиеся агенты, противоосадочные вещества, компостирующие препараты, гранулированные подкормки, диатомиты, масла, красители, стабилизаторы, консерванты, полимеры, пленки или их комбинации.
[00149] Добавка может представлять собой масло, камедь, смолу, глину, полиоксиэтиленгликоль, терпен, вязкую органику, сложный эфир жирной кислоты, сульфатированный спирт, алкилсульфонат, нефтяной сульфонат, сульфат спирта, алкил бутан diamate натрия, полиэфир тиобутандиоата натрия, производное бензол-ацетонитрила, белковый материал (молочный продукт, пшеничную муку, соевую муку, кровь, альбумин, желатин или их комбинацию) или их комбинацию.
[00150] Загуститель может включать длинную цепь алкилсульфоната полиэтиленгликоля, полиоксиэтиленолеат или их комбинацию.
[00151] Сурфактант может включать тяжелое нефтяное масло, тяжелый нефтяной дистиллят, сложный эфир полиола жирной кислоты, полиэтоксилированный эфир жирной кислоты, арилалкил полиоксиэтиленгликоля, алкиламин ацетат, алкиларилсульфонат, многоатомный спирт, алкилфосфат или их комбинацию.
[00152] Противодействующее слипанию вещество включает соль натрия, карбонат кальция, диатомит или их комбинацию. Например, соль натрия может включать монометил-нафталинсульфонат натриевую соль, диметил- нафталинсульфонат натриевую соль, сульфит натрия, сульфат натрия или их комбинацию.
[00153] Подходящие сельскохозяйственно приемлемые носители включают вермикулит, древесный уголь, отходы сатурационного пресса сахарного завода, рисовую шелуху, карбоксиметилцеллюлозу, торф, перлит, мелкий песок, карбонат кальция, муку, квасцы, крахмал, тальк, поливинилпирролидон или их комбинацию.
[00154] Препарат может включать препарат для покрытия семян, жидкий препарат, применяемый для растений или для растительных ростовых сред, или твердый препарат, применяемый для растений или для растительных ростовых сред.
[00155] Например, композиция для покрытия семян может включать раствор на водной или масляной основе, применяемый для семян, или порошок или гранулированный препарат, применяемый для семян. В альтернативном варианте композиция для покрытия семян может включать порошок или гранулированный препарат, применяемый для семян.
[00156] Жидкий препарат, применяемый для растений или для растительных ростовых сред, может включать концентрированный препарат или препарат, готовый для использования.
[00157] Твердый препарат, применяемый для растений или для растительных ростовых сред, может включать гранулированный препарат или порошковое вещество.
[00158] Любой из указанных выше препаратов также может включать агрохимикат, например, удобрение, материал микроэлементов удобрения, инсектицид, гербицид, фунгицид, моллюскоцид, альгицид, вещество, улучшающее рост растений, бактериальный инокулянт, грибковый инокулянт или их комбинацию.
[00159] Удобрение может включать жидкое удобрение.
[00160] Удобрение может включать сульфат аммония, нитрат аммония, сульфат-нитрат аммония, хлорид аммония, бисульфат аммония, полисульфид аммония, тиосульфат аммония, водный раствор аммиака, безводный аммиак, полифосфат аммония, сульфат алюминия, нитрат кальция, известково-аммиачную селитру, сульфат кальция, обожженный магнезит, кальцитовый известняк, оксид кальция, нитрат кальция, доломитовый известняк, гашеную известь, карбонат кальция, диаммонийфосфат, моноаммонийфосфат, нитрат магния, сульфат магния, нитрат калия, хлорид калия, сульфат калия-магния, сульфат калия, нитраты натрия, магнезиальный известняк, оксид магния, мочевину, карбамидоформальдегидные смолы, мочевино-аммониевый нитрат, покрытую серой мочевину, мочевину с полимерным покрытием, изобутилиден димочевину, K2SO4-2MgSO4, каинит, сильвинит, кизерит, эпсомскую соль, элементарную серу, мергель, измельченные устричные раковины, рыбную муку, жмыхи, рыбный тук, кровяную муку, фосфорит, суперфосфат, шлак, костную муку, древесную золу, навоз, гуано летучих мышей, торф, компост, зеленый песок, муку из семян хлопчатника, муку из перьев, муку из крабов, рыбную эмульсию, гуминовую кислоту или их комбинацию.
[00161] Материал микроэлементного удобрения может включать борную кислоту, борат, борную фритту, сульфат меди, медную фритту, хелат меди, декагидрат тетрабората натрия, сульфат железа, оксид железа, сульфат железа-аммония, железную фритту, хелат железа, сульфат марганца, оксид марганца, хелат марганца, хлорид марганца, марганцевую фритту, молибдат натрия, молибденовую кислоту, сульфат цинка, оксид цинка, карбонат цинка, цинковую фритту, фосфат цинка, хелат цинка или их комбинацию.
[00162] Инсектицид может включать органофосфат, карбамат, пиретроид, акарицид, алкил-фталат, борную кислоту, борат, фторид, серу, мочевину, замещенную ароматическим галоидом, углеводород сложного эфира, инсектицид на биологической основе или их комбинацию.
[00163] Гербицид может включать соединение хлорфенокси, нитрофенольное соединение, соединение нитрокрезола, соединение дипиридила, ацетамид, алифатическую кислоту, анилид, бензамид, бензойную кислоту, производное бензойной кислоты, анисовую кислоту, производное анисовой кислоты, бензонитрил, бензотиадиазинона диоксид, тиокарбамат, карбамат, карбанилат, хлорпиридинил, производное циклогексенона, производное динитроаминобензола, соединение фтор-динитро-толуидин, изоксазолидинон, никотиновую кислоту, изопропиламин, производные изопропиламина, оксадиазолинон, фосфат, фталат, соединение пиколиновой кислоты, триазин, триазол, урацил, производное мочевины, эндотал, хлорат натрия или их комбинацию.
[00164] Фунгицид может включать замещенный бензол, тиокарбамат, этилен-бис-дитиокарбамат, тиофталид амид, соединение меди, ртутьорганическое соединение, оловоорганическое соединение, соединение кадмия, анилазин, беномил, циклогексамид, додин, этридиазол, ипродион, металаксил, тиамимефон, трифорин или их комбинацию.
[00165] Грибковый инокулянт может включать грибковый инокулянт из семейства Glomeraceae, грибковый инокулянт из семейства Claroidoglomeraceae, грибковый инокулянт из семейства Gigasporaceae, грибковый инокулянт из семейства Acaulosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Sacculosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Entrophosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Pacidsporaceae, грибковый инокулянт из семейства Diversisporaceae, грибковый инокулянт из семейства Paraglomeraceae, грибковый инокулянт из семейства Archaeosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Geosiphonaceae, грибковый инокулянт из семейства Ambisporaceae, грибковый инокулянт из семейства Scutellosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Dentiscultataceae, грибковый инокулянт из семейства Racocetraceae, грибковый инокулянт из типа Basidiomycota, грибковый инокулянт из типа Ascomycota, грибковый инокулянт из типа Zygomycota или их комбинацию.
[00166] Бактериальный инокулянт может включать бактериальный инокулянт из рода Rhizobium, бактериальный инокулянт из рода Bradyrhizobium, бактериальный инокулянт из рода Mesorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Azorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Allorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Sinorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Kluyvera, бактериальный инокулянт из рода Azotobacter, бактериальный инокулянт из рода Pseudomonas, бактериальный инокулянт из рода Azospirillium, бактериальный инокулянт из рода Bacillus, бактериальный инокулянт из рода Streptomyces, бактериальный инокулянт из рода PaeniBacillus, бактериальный инокулянт из рода Paracoccus, бактериальный инокулянт из рода Enterobacter, бактериальный инокулянт из рода Alcaligenes, бактериальный инокулянт из рода Mycobacterium, бактериальный инокулянт из рода Trichoderma, бактериальный инокулянт из рода Gliocladium, бактериальный инокулянт из рода Glomus, бактериальный инокулянт из рода Klebsiella или их комбинацию.
[00167] Бактериальный инокулянт может включать штамм бактерий, стимулирующий рост растения. Штамм бактерий, стимулирующий рост растений, может включать штамм бактерий, который продуцирует инсектицидный токсин (например, токсин Сry), продуцирует фунгицидное соединение (например, β-1,3-глюканаза, хитозиназа, литиказа или их комбинация), продуцирует нематоцидное соединение (например, токсин Сry), продуцирует бактерицидное соединение, является устойчивым к одному или более антибиотикам, содержит одну или более самостоятельно реплицирующихся плазмид, прикрепляется к корням растений, колонизирует корни растений, формирует биопленки, растворяет питательные вещества, секретирует органические кислоты, или их комбинации.
[00168] Например, бактериальный инокулянт может включать Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL № B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL № B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL № B-50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL № В-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Enterobacter клоаки CAP12 (NRRL № B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL № NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL № В-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL № B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL № B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № В-50922), представителя семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL № B-50917), Bacillus Thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924), PaeniBacillus massiliensis BT23 (NRRL № B-50923), представителя семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL № B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL № B-50925), или их комбинации. Каждый из этих штаммов был помещен на хранение Центром сельскохозяйственных исследований (ЦСИ) Министерства сельского хозяйства США (МСХСША) по адресу: 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U. S. A., 11 марта 2013 года (Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12, и Bacillus nealsonii BOBA57) или 10 марта 2014 года (Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, представитель семейства Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A, PaeniBacillus massiliensis BT23, представитель семейства Bacillus cereus EE349, Bacillus subtilis EE218, и Bacillus megaterium EE281), и идентифицируется по номерам NRRL, указанным в скобках.
[00169] Эти штаммы, стимулирующие рост растения, были выделены из ризосфер различных активно растущих растений и были идентифицированы по их последовательности 16S рРНК (указанной в данном документе как SEQ ID №№: 104-121) и с помощью биохимических анализов. Данные штаммы были идентифицированы по меньшей мере до рода с помощью общих биохимических методов и морфологических показателей. Биохимические тесты для подтверждения грам-отрицательных штаммов, таких как Paracoccus kondratievae, Alcaligenes faecalis и Enterobacter cloacae, включали выращивание на среде MacConkey и питательном агаре, микроскопические исследования, выращивание на среде, содержащей 5% и 7,5% NaCl, выращивание при рН 5 и рН 9, выращивание при 42°С и 50°С, способность продуцировать кислоту при ферментации с целлобиозой, лактозой, глицерином, глюкозой, сахарозой, d-маннитом и крахмалом; продуцирование флуоресцентных пигментов; гидролиз желатина; восстановление нитратов; продуцирование каталазы, гидролиз крахмала; оксидативная реакция, продуцирование уреазы и подвижность. Аналогичным образом биохимические тесты для подтверждения грам-положительных штаммов, таких как Bacillus и Paenibacillus, включали выращивание на среде PEA и питательном агаре, микроскопические исследования, выращивание на среде, содержащей 5% и 7,5% NaCl, выращивание при рН 5 и рН 9, выращивание при 42°С и 50°С, способность продуцировать кислоту при ферментации с целлобиозой, лактозой, глицерином, глюкозой, сахарозой, d-маннитом и крахмалом; продуцирование флуоресцентных пигментов; гидролиз желатина; восстановление нитратов; продуцирование каталазы, гидролиз крахмала; оксидативная реакция, продуцирование уреазы и подвижность. Идентификация этих штаммов и демонстрация их стимулирующих эффектов на рост растений описаны далее в примерах, приведенных ниже.
[00170] Например, препарат может включать штамм бактерий, стимулирующий рост растения, включающий Paracoccus kondratievae NC35, Bacillus aryabhattai CAP53 или Bacillus megaterium EE281, причем данный препарат дополнительно содержит любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в данном документе, в том числе любой из описанных в данном документе штаммов рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, стимулирующих рост растений (например, рекомбинантный Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141 или Bacillus thuringiensis BT013A). Штамм рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, стимулирующий рост растения, может экспрессировать любой из гибридных белков, описанных в данном документе, например, гибридный белок, содержащий сигнальную последовательность SEQ ID №: 60 и негормональный пептид (например, ингибитор трипсина Кунитца (ИТК)), фермент, участвующий в продуцировании или активации соединения, стимулирующего рост растений (например, хитозиназы), белок или пептид, связывающийся с растением (например, TasA); белок или пептид, защищающий растение от патогенов (например, TasA), или фермент, который разрушает или изменяет бактериальные, грибковые или растительные источники питательных веществ (например, фосфатазы, такие как PhoA или фитазы, или эндоглюканазы).
Способы стимуляции роста растений
[00171] Данное изобретение также относится к способам стимуляции роста растений. Способ стимуляции роста растений включает введение в среду для роста растений любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые обсуждались выше, или любого из препаратов, которые обсуждались выше. В альтернативном варианте любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые обсуждались выше, или любой из препаратов, которые обсуждались выше, могут быть применены к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растений. В таких способах белок или пептид, стимулирующий рост растения, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus.
[00172] В альтернативном варианте способ стимуляции роста растений включает введение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего гибридный белок, в среду для роста растений, или применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего гибридный белок, к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растения. Гибридный белок содержит по меньшей мере один белок или пептид, стимулирующий рост растения, и сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория. Белок или пептид, стимулирующий рост растения, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus. Сигнальная последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может представлять собой любую из сигнальных последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, перечисленных ранее в параграфе [0005].
[00173] Сигнальная последовательность может дополнительно состоять из 16 аминокислот и иметь по меньшей мере около 43% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 54%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность может состоять из аминокислот 1-35 из SEQ ID №: 1, аминокислот 20-35 из SEQ ID №: 1; SEQ ID №: 1 или SEQ ID №: 60.
[00174] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%.
[00175] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 50% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%.
[00176] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 56% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 56% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 63%.
[00177] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 62% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 62% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID №: 1 составляет по меньшей мере около 72%.
[00178] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 68% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 68% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%.
[00179] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 72%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID №: 1 составляет по меньшей мере около 72%.
[00180] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 75% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 из SEQ ID №: 1 составляет по меньшей мере около 81%.
[00181] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 81%.
[00182] Сигнальная последовательность может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 90%. В альтернативном варианте сигнальная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере около 81% идентичности с аминокислотами 20-35 из SEQ ID №: 1, причем идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере около 90%.
[00183] В альтернативном варианте белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности с любой из SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 и 84.
[00184] Белок, стимулирующий рост растения, может включать фермент. Например, фермент может включать фермент, который разрушает или изменяет бактериальный, грибковый или растительный источник питательных веществ. Такие ферменты включают целлюлазы, липазы, оксидазы, лигнин протеазы, гликозид гидролазы, фосфатазы, нитрогеназы, нуклеазы, амидазы, нитрат редуктазы, нитрит редуктазы, амилазы, аммиак оксидазы, лигниназы, глюкозидазы, фосфолипазы, фитазы, пектиназы, глюканазы, сульфатазы, уреазы, ксиланазы и сидерофоры. При введении в среду для роста растений или применении на растение, семенах или области, окружающей растение или семя растений, гибридные белки, содержащие ферменты, которые разрушают или изменяют бактериальный, грибковый или растительный источник питательных веществ, могут помочь в обработке питательных веществ в непосредственной близости от растения и привести к повышенному поглощению питательных веществ растением или полезных бактериями или грибками в непосредственной близости от растения.
[00185] Подходящие целлюлазы включают эндоцеллюлазы (например, эндоглюканазу, такую как эндоглюканаза Bacillus subtilis, эндоглюканаза Bacillus thuringiensis, эндоглюканаза Bacillus cereus или эндоглюканаза Bacillus clausii), экзоглюканазы (например, экзоглюканазу Trichoderma reesei), и β-глюкозидазы (например, β-глюкозидазу Bacillus subtilis, β-глюкозидазу Bacillus thuringiensis, β-глюкозидазу Bacillus cereus или β-глюкозидазу Bacillus clausii).
[00186] Липаза может включать липазу Bacillus subtilis, липазу Bacillus thuringiensis, липазу Bacillus cereus или липазу Bacillus clausii.
[00187] Подходящие лигнин оксидазы включают лигнин пероксидазы, лакказы, глиоксал оксидазы, лигниназы и марганец пероксидазы.
[00188] Протеаза может включать субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, пептидазу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеазу.
[00189] Фосфатаза может включать фосфорную моноэфир-гидролазу, фосфомоноэстеразу, (например, PhoA4), фосфорную диэфир-гидролазу, фосфодиэстеразу, трифосфорную моноэфир-гидролазу, фосфорил ангидрид-гидролазу, пирофосфатазу, фитазу, (например, фитазу Bacillus subtilis EE148 или фитазу Bacillus thuringiensis BT013A), триметафосфатазу или трифосфатазу.
[00190] Нитрогеназа может включать нитрогеназу из Nif семейства (например, NifBDEHKNXV PaeniBacillus massiliensis).
[00191] В любом из описанных выше способов стимуляции роста растений растения, выращиваемые в среде для роста растений, содержащей рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, проявляют усиленный рост по сравнению с ростом растений в идентичной среде для роста растений, не содержащей рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00192] В любом из описанных выше способов стимуляции роста растений рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать любой из описанных выше рекомбинантных штаммов бактерий, стимулирующих рост растений.
[00193] В любом из описанных выше способов стимуляции роста растений гибридный белок может экспрессироваться под контролем любого из промоторов, описанных ранее.
Способы защиты растения от патогена
[00194] Данное изобретение также относится к способам защиты растения от патогена. Такие способы включают введение любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, описанных выше, или любого из препаратов, описанных выше, в среду для роста растений. В альтернативном варианте такие способы включают применение любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, описанных выше, или любого из препаратов, описанных выше, к растению, к семени растения или к области, окружающей растение или семя растения. В этих способах белок или пептид, защищающий растение от патогена, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00195] Растения, выращиваемые в среде для роста растений, содержащей рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, менее восприимчивы к инфицированию патогеном по сравнению с растениями, выращиваемыми в идентичной среде для роста растений, не содержащей рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Снижение чувствительности к патогену может являться результатом стимуляции иммунной системы растения белком или пептидом, защищающим растение от патогена, или может являться результатом прямого или косвенного воздействия белка или пептида, защищающего растение от патогена, на патоген.
Способы повышения устойчивости к стрессу в растении
[00196] Данное изобретение также относится к способам повышения устойчивости к стрессу в растении. Такие способы включают введение любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, описанных выше, или любого из препаратов, описанных выше в среде для роста растений. В альтернативном варианте такие способы включают применение любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, описанных выше, или любого из препаратов, описанных выше, к растению, к семени растения или к области, окружающей растение или семя растения. В этих способах белок или пептид, который повышает устойчивость к стрессу в растении, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00197] Растения, выращиваемые в среде для роста растений, содержащей рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, менее восприимчивы к стрессу по сравнению с растениями, выращиваемыми в идентичной среде для роста растений, не содержащей рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
Способы иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении
[00198] Данное изобретение также относится к способам иммобилизации споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении. Эти способы включают введение любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, описанных выше, или любого из препаратов, описанных выше, в среду для роста растений. В альтернативном варианте такие способы включают применение любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus сereus, описанных выше, или любого из препаратов, описанных выше, к растению, к семени растения или к области, окружающей растение или семя растения. Белок или пептид, связывающийся с растением, физически прикреплен к экзоспорию рекомбинантного представителя семейства Bacillus.
[00199] Эти способы позволяют споре представителя семейства Bacillus cereus связываться с растением таким образом, что спора остается на растении. Например, эти способы позволяют споре представителя семейства Bacillus cereus связываться с корнем растения или с надземной частью растения (например, листья, стебли, плоды или цветы) таким образом, что спора остается на корневой структуре растения или на его надземной части и не проникает в среду роста растения или в среду, окружающую надземные части растения.
[00200] В любом из способов иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении белок или пептид, связывающийся с растением, может избирательно воздействовать и удерживать представителя семейства Bacillus cereus на растительной структуре или субструктуре (например, на корнях растения или субструктуре корней растения или на воздушной части растения или субструктуре воздушной части растения).
Среда роста растений
[00201] В любом из описанных выше способов среда для роста растений представляет собой материал, который способен поддерживать рост растений. Среда роста растений может включать почву, воду, водную среду, песок, гравий, полисахарид, мульчу, компост, торф, солому, древесину, глину, соевую муку, дрожжевой экстракт или их комбинацию. Например, среда для роста растений включает почву, компост, торф или их комбинацию.
[00202] Среда роста растений необязательно может быть с добавлением субстрата для фермента. Например, субстрат может включать триптофан, аденозинмонофосфат, аденозиндифосфат, аденозинтрифосфат (например, аденозин-3-трифосфат), индол, триметафосфат, ферродоксин, ацетоин, диацетил, пируват, ацетолактат, пектин, целлюлозу, метилцеллюлозу, крахмал, хитин, пектин, белоковую муку, производное целлюлозы, фосфат, ацетоин, хитозан, неактивное производное индол-3-уксусной кислоты, неактивное производное гибберелловой кислоты, ксилан, холин, производное холина, пролин, полипролин, пролин-содержащую муку, пролинсодержащий белок, фенилаланин, хоризмат, арабиноксилан, жир, воск, масло, фитиновую кислоту, лигнин, гуминовую кислоту, холин, производное холина или их комбинацию.
Способы применения
[00203] В любом из описанных выше способов рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или препарат может быть введен в среду роста растения или применен к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растения.
[00204] Например, способ может включать покрытие семян рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus или препаратом, содержащим рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, до посадки.
[00205] В альтернативном варианте способ может включать применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или препарата к воздушной части растения, например, к листьям, стеблям, плодам или цветам. Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или препарат может быть распылен, нанесен щеткой, инфильтрирован или иным способом применен к листьям или другим воздушным частям растения.
[00206] Способ может включать введение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus в среду для роста растений путем применения жидкого или твердого препарата, содержащего рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus к среде (например, почве, компосту, торфу или их комбинации).
[00207] Препарат может быть применен к среде для роста растений до, одновременно с или после посадки семян, саженцев, черенков, луковиц или растений в среду для роста растений.
Дополнительное применение агрохимикатов
[00208] Любой из описанных выше способов может дополнительно включать введение по меньшей мере одного агрохимиката в среду для роста растений или применения по меньшей мере одного агрохимиката на растения или семена. Агрохимикат может представлять собой любой из перечисленных выше, предназначенных для включения в препараты, или любую их комбинацию.
Растения
[00209] Вышеуказанные способы могут быть осуществлены на различных растениях. Например, растения могут относиться к двудольным, однодольным или голосеменным.
[00210] Например, если растение относится к двудольным, двудольные могут быть выбраны из группы, состоящей из фасоли, гороха, томатов, перца, кабачков, люцерны, миндаля, аниса, яблока, абрикоса, артишока, арракачи, авокадо, земляных бобов, свеклы, бергамота, черного перца, акации черной, ежевики, черники, апельсина горького, бок чой, бразильского ореха, хлебного дерева, брокколи, бобов, брюссельской капусты, гречки, капусты, рыжика, китайской капусты, какао, дыни, тмина, артишока испанского, рожкового дерева, моркови, ореха кешью, маниоки, клещевины обыкновенной, цветной капусты, сельдерея корневого, сельдерей салатного, вишни, каштана, нута, цикория, перца чили, хризантемы, корицы, цитрона, клементина, гвоздики, клевера, кофе, гуру, рапса, кукурузы, хлопка, хлопчатника, коровьего гороха, крамбе, клюквы, кресс-салата, огурца, смородины, кремовой яблони, кассии пучковатой, чины клубненосной, баклажана, цикория-эндивия, укропа, пажитника, риса, фундука, льна, герань, крыжовника, тыквы, винограда, грейпфрута, гуавы, конопли, хны, хмеля, конских бобов, хрена, индиго, жасмина, топинамбура, джута, капусты кормовой, капка, кенафа, кольраби, кумквата, лаванды, лимона, чечевицы, леспедецы, салата-латука, лайма настоящего, солодки, личи, мушмула, люпин, ореха макадамии, булава, мандарин, кормовой, манго, мушмулы японской, дыни, мяты, шелковицы, горчицы, нектарина, масличного нуга, мускатного ореха, бамии, маслины, опиумного мака, апельсина, папайи, пастернака, гороха, персика, арахиса, груши, ореха пекана, хурмы, голубиного гороха, фисташкового ореха, подорожника, сливы, граната, грейпфрута, мака, картофеля, сладкого картофеля, чернослива, тыквы, квебрахо, айвы, деревьев из рода Cinchona, лебеды, редиса, рами, рапса, малины, нанду, ревня, розы, фикуса каучуконосного, брюквы, сафлора, эспарцета, козлобородника, саподиллы, мандарина уншиу, козлеца испанского, кунжута, масляного дерева, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкого перца, танжерина, чая, теффа, табака, помидора, трилистника, тунга, репы, растения рода Urena, вики, грецкого ореха, арбуза, мате, сурепки, пастушей сумки, кресс-салата, ярутки, иллициума настоящего, лавра, лавра благородного, кассии, джамболана, укропа, тамаринда, мяты перечной, орегана, розмарина, шалфея, сметанного яблока, щитолистника, калофилла, момордики харантской, лумбанга, инокарпуса съедобного, базилика, черники облиствленной, гибискуса, пассифлоры, златолиста каймито, сассафрасы, кактуса, зверобоя, вербейника, боярышника, кориандра, карри, киви, тимьяна, цукини, уллюки, джикамы, гидрофиллума, стрихноса колючего, момбина желтого, карамболя, амаранта, васаби, японского перца, желтой сливы, настурции клубненосной, Toona sinensis, новозеландского шпината, тетрагонии, угу, пижмы, песчанка, момбина пурпурного, малайского яблока, акмеллы осота огородного, китайского картофеля, смирнии европейской, гулявника лекарственного, смолевки, агата, дерева кассия, чертополоха, кровохлебки, антильскогой крыжовника, солянки, солероса, щавля, птеридиса мечевидного, капусты листовой, примулы, первоцвет, портулака, спорыша, терпентинного дерева, пизонии белой, дикого бетеля, западноафриканского переца, эриодиктиона клейкого, эстрагона, петрушки, кервеля, сурепки весенней, бедренца камнеломкового, липпии сладкой, белокопытника, сисо, водяного перца, периллы, паркии красивой, оки, кампонга, китайской селеры, лимонного базилика, тайского базилика, водяной мимозы, кокорыша, кордилины южной, моринги, мирабилиса, страусника обыкновенного, лимнофилы ароматной, лимнохариса желтого, любистка, клоповника, маки, бутылочной тыквы, лобия, водяного шпината, пазника стержнекорневого, хаттюнии сердцевидной, окинавского шпината, глинуса лядвенцевидного, галинсоги мелкоцветковой, синеголовника пахучего, рукколы, артишока испанского, циклантеры съедобной, петрушки японской, чипиля, критмума морского, кратоксилума красивого, иван-чая, кокцинии индийской, бодяка огородного, крамбе приморской, чхайи, кионы, горчицы эфиопской, мари гигантской, мари цельнолистной, epazole, мари белой, центеллы перьевидной, петушиного гребня, каперсника, брокколи рапини, пекинской капусты, курчаволистной горчицы, савойской капусты, кай-лан, листовой горчицы, базеллы белой, мангольда, алтея лекарственного, вьющейся акации, канатника Теофраста, паприки, биксы аннатовой, мяты курчавой, чабера, майорана, тмина, ромашки, мелиссы, душистого переца, черника, черимойи, морошки, терносливы, питайи, дуриана, бузины, фейхоа, джекфрута, ююбы, физалиса, мангостана, рамбутана, красной смородины, черной смородины, гаультерии шаллон, фрукта угли фрукты, фасоли адзуки, черной фасоли, коровьего гороха, вьющейся фасоли, фасоли обыкновенной, фасоли зеленой, фасоли лимской, фасоли золотистой, фасоли многоцветковой, фасоли пинто, фасоли огненно-красной, стручкового гороха, спаржевой капусты, крапивы, радиккьо, редьки японской, редьки белой, поручейника сахарного, японского горчичного шпината, брокколини, редьки черной, лопуха, конских бобов, итальянской брокколи, боба индийского, люпина, стеркулии, боба бархатного, боба крылатого, боба бататового, акации безжилковой, вернонии, акации песчаной, акации Муррея, акации колючей, акации иволистой, акации жилистой, чиа, бука, свечного дерева, арбуза кормового, меликокки, ореха Майя, монгонго, ирвингию, райского ореха и чемпедака.
[00211] В альтернативном варианте двудольные могут относиться к семействам, выбранным из группы, состоящей из Acanthaceae (акант), Aceraceae (клен), Achariaceae, Achatocarpaceae (ачатокарпус), Actinidiaceae (киви), Adoxaceae (адокса), Aextoxicaceae, Aizoaceae (фига готтентотская), Akaniaceae, Alangiaceae, Alseuosmiaceae, Alzateaceae, Amaranthaceae (амарант), Amborellaceae, Anacardiaceae (сумах), Ancistrocladaceae, Anisophylleaceae, Annonaceae (аннона сетчатая), Apiaceae (морковь), Apocynaceae (кутра), Aquifoliaceae (падуб), Araliaceae (женьшень), Aristolochiaceae (кирказон), Asclepiadaceae (ваточник), Asteraceae (астра), Austrobaileyaceae, Balanopaceae, Balanophoraceae (баланофора), Balsaminaceae (мимоза стыдливая), Barbeyaceae, Barclayaceae, Basellaceae (базелла), Bataceae (солерос), Begoniaceae (бегония), Berberidaceae (барбарис), Betulaceae (береза), Bignoniaceae (кампсис укореняющийся), Bixaceae (аннато), Bombacaceae (хлопковое дерево), Boraginaceae (огуречная трава), Brassicaceae (горчица, также Cruciferae), Bretschneideraceae, Brunelliaceae (брунеллия), Bruniaceae, Brunoniaceae, Buddlejaceae (буддлея Давида), Burseraceae (босвеллия), Buxaceae (самшит), Byblidaceae, Cabombaceae (бразения), Cactaceae (кактус), Caesalpiniaceae, Callitrichaceae (болотник), Calycanthaceae (ластовень Шорта), Calyceraceae (калицера), Campanulaceae (колокольчик), Canellaceae (корица), Cannabaceae (конопля), Capparaceae (каперсы колючие), Caprifoliaceae (жимолость), Cardiopteridaceae, Caricaceae (папайя), Caryocaraceae (кариокар ореховый), Caryophyllaceae (гвоздика), Casuarinaceae (казуарина), Cecropiaceae (цекропия), Celastraceae (паслен сладко-горький), Cephalotaceae, Ceratophyllaceae (роголистник), Cercidiphyllaceae (церцидифиллюм), Chenopodioideae (лебеда), Chloranthaceae (хлорант), Chrysobalanaceae (икако), Circaeasteraceae, Cistaceae (ладанник), Clethraceae (клетра), Clusiaceae (мангостан, также Clusiaceae), Cneoraceae, Columelliaceae, Combretaceae (индийский миндаль), Compositae (астра), Connaraceae (коннарус), Convolvulaceae (ипомеи), Coriariaceae, Cornaceae (кизил), Corynocarpaceae (коринокарпус), Crassulaceae (очиток), Crossosomataceae (кроссосома), Crypteroniaceae, Cucurbitaceae (огурец), Cunoniaceae (кунония), Cuscutaceae (повилика), Cyrillaceae (цирилла), Daphniphyllaceae, Datiscaceae (датиска), Davidsoniaceae, Degeneriaceae, Dialypetalanthaceae, Diapensiaceae (диапенсия), Dichapetalaceae, Didiereaceae, Didymelaceae, Dilleniaceae (дилления), Dioncophyllaceae, Dipentodontaceae, Dipsacaceae (ворсянка), Dipterocarpaceae (шорея), Donatiaceae, Droseraceae (росянка), Duckeodendraceae, Ebenaceae (черное дерево), Elaeagnaceae (лох), Elaeocarpaceae (элеокарпус), Elatinaceae (повойничек), Empetraceae (водяника), Epacridaceae (эпакрис), Eremolepidaceae (сережка-омелы), Ericaceae (эрика), Erythroxylaceae (кока), Eucommiaceae, Eucryphiaceae, Euphorbiaceae (молочай), Eupomatiaceae, Eupteleaceae, Fabaceae (горох или бобы), Fagaceae (бук), Flacourtiaceae (флакуртия), Fouquieriaceae (фукьерия блестящая), Frankeniaceae (франкения), Fumariaceae (дымянка), Garryaceae (гаррия), Geissolomataceae, Gentianaceae (горечавка), Geraniaceae (герань), Gesneriaceae (геснера), Globulariaceae, Gomortegaceae, Goodeniaceae (гудения), Greyiaceae, Grossulariaceae (смородина), Grubbiaceae, Gunneraceae (гуннера), Gyrostemonaceae, Haloragaceae (уруть), Hamamelidaceae (гамамелиса), Hernandiaceae (эрнадия), Himantandraceae, Hippocastanaceae (конский каштан), Hippocrateaceae (Hippocratea), Hippuridaceae (водяная сосенка), Hoplestigmataceae, Huaceae, Hugoniaceae, Humiriaceae, Hydnoraceae, Hydrangeaceae (гортензия), Hydrophyllaceae (водолюб), Hydrostachyaceae, Icacinaceae (икацина), Idiospermaceae, Illiciaceae (анис звездчатый), Ixonanthaceae, Juglandaceae (грецкий орех), Julianiaceae, Krameriaceae (ратания), Lacistemataceae, Lamiaceae (мята, также Labiatae), Lardizabalaceae (лардизабала), Lauraceae (лавр), Lecythidaceae (бразильский орех), Leeaceae, Leitneriaceae (пробковое дерево), Lennoaceae (lennoa), Lentibulariaceae (пузырчатка), Limnanthaceae (пенник луговой), Linaceae (лен), Lissocarpaceae, Loasaceae (лоаза), Loganiaceae (логания), Loranthaceae (ремнецветник), Lythraceae (вербейник), Magnoliaceae (магнолия), Malesherbiaceae, Malpighiaceae (мальпигия), Malvaceae (мальва), Marcgraviaceae (маркгавия), Medusagynaceae, Medusandraceae, Melastomataceae (меластома), Meliaceae (красное дерево), Melianthaceae, Mendonciaceae, Menispermaceae (луносемянник), Menyanthaceae (вахта трилистная), Mimosaceae, Misodendraceae, Mitrastemonaceae, Molluginaceae (моллюго мутовчатая), Monimiaceae (монимия), Monotropaceae (вертляница одноцветковая), Moraceae (шелковица), Moringaceae (моринга), Myoporaceae (миопорум), Myricaceae (восковница), Myristicaceae (мускатный орех), Myrothamnaceae, Myrsinaceae (мурсин), Миртовые (мирт), Nelumbonaceae (лотос), Nepenthaceae (непентес кхаси), Neuradaceae, Nolanaceae, Nothofagaceae, Nyctaginaceae (ночная красавица), Nymphaeaceae (кувшинка), Nyssaceae (нисса лесная), Ochnaceae (охна), Olacaceae (олакс), Oleaceae (оливка), Oliniaceae, Onagraceae (энотера), Oncothecaceae, Opiliaceae, Orobanchaceae (заразиха), Oxalidaceae (кислица обыкновенная), Paeoniaceae (пион), Pandaceae, Papaveraceae (мак), Papilionaceae, Paracryphiaceae, Passifloraceae (пассифлора), Pedaliaceae (кунжут), Pellicieraceae, Penaeaceae, Pentaphragmataceae, Pentaphylacaceae, Peridiscaceae, Physenaceae, Phytolaccaceae (лаконоса), Piperaceae (перец), Pittosporaceae (питтоспорум), Plantaginaceae (подорожник), Platanaceae (платан), Plumbaginaceae (свинчатка), Podostemaceae (подостемовые), Polemoniaceae (флокс), Polygalaceae (молочай), Polygonaceae (гречка), Portulacaceae (портулак), Primulaceae (примула), Proteaceae (протея), Punicaceae (гранат), Pyrolaceae (грушанка), Quiinaceae, Rafflesiaceae (раффлезия), Ranunculaceae (лютик), Resedaceae (резеда), Retziaceae, Rhabdodendraceae, Rhamnaceae (крушина), Rhizophoraceae (красное мангровое дерево), Rhoipteleaceae, Rhynchocalycaceae, Rosaceae (роза), Rubiaceae (марена), Rutaceae (рута), Sabiaceae (сабия), Saccifoliaceae, Salicaceae (ива), Salvadoraceae, Santalaceae (сандаловое дерево), Sapindaceae (сапиндус), Sapotaceae (саподилла), Sarcolaenaceae, Sargentodoxaceae, Sarraceniaceae (саррацения), Saururaceae (заурурус поникший), Saxifragaceae (камнеломка), Schisandraceae (лимонник), Scrophulariaceae (норичник), Scyphostegiaceae, Scytopetalaceae, Simaroubaceae (кассия), Simmondsiaceae (жожоба), Solanaceae (картофель), Sonneratiaceae (соннератия), Sphaerosepalaceae, Sphenocleaceae (спеноклея), Stackhousiaceae (стакхузия), Stachyuraceae, Staphyleaceae (клетчатка), Sterculiaceae (какао), Stylidiaceae, Styracaceae (стиракс), Surianaceae (суриана), Symplocaceae (симплокос красильный), Tamaricaceae (тамарикс), Tepuianthaceae, Tetracentraceae, Tetrameristaceae, Theaceae (чай), Theligonaceae, Theophrastaceae (теофраст), Thymelaeaceae (волчье лыко), Ticodendraceae, Tiliaceae (липа), Tovariaceae, Trapaceae (водяной орех), Tremandraceae, Trigoniaceae, Trimeniaceae, Trochodendraceae, Tropaeolaceae (настурция), Turneraceae (турнера), Ulmaceae (вяз), Urticaceae (крапива), Valerianaceae (валериан), Verbenaceae (вербена), Violaceae (фиалка), Viscaceae (омела), Vitaceae (виноград), Vochysiaceae, Winteraceae (винтера), Xanthophyllaceae и Zygophyllaceae (креозотовый куст).
[00212] Если растения относятся к однодольным, однодольные могут быть выбраны из группы, состоящей из кукурузы, пшеницы, овса, риса, ячменя, проса, банана, лука, чеснока, спаржи, плевела, фонио, райшана, нипы, куркумы, шафраны, калганы, чеснока, кардамона, финика, ананаса, лука-шалота, лука-порея, водяного каштана, дикого лука, бусенника, бамбука, дагусса, вольфии бескорневой, маланги, ксантосомы, абаки, ареки, африканского проса, бетеля, сорго технического, цитронеллы, кокоса, колоказии съедобной, кукурузы, сорго, твердой пшеницы, эдо, фуркреа, формио, имбиря, ежы сборной, эспарто, суданской травы, сорго гвинейского, мексиканской пеньки, гибридной кукурузы, джовара, сорго лимонного, агавы, проса тростникового, проса пальчатого, проса итальянского, проса японского, проса обыкновенного, льна новозеландского, овса, масличной пальмы, пальмировой пальмы, саговой пальмы, полевицы белой, сизаля, пшеницы спельты, сахарной кукурузы, сорго сахарного, таро, теффа, тимофеевки луговой, тритикале, ванили, пшеницы и батата.
[00213] В альтернативном варианте однодольные могут относится к семействам, выбранным из группы, состоящей из Acoraceae (аира), Agavaceae (агава американская), Alismataceae (частуха подорожниковая), Aloeaceae (алоэ), Aponogetonaceae (апоногетон двуколосый), Araceae (арум), Arecaceae (пальма), Bromeliaceae (бромелия), Burmanniaceae (бурманния), Butomaceae (сусак зонтичный), Cannaceae (пушница), Centrolepidaceae, Commelinaceae (традесканция), Corsiaceae, Costaceae (костус), Cyanastraceae, Cyclanthaceae (панамская пальма), Cymodoceaceae (сирингодиум), Cyperaceae (осока), Dioscoreaceae (батат), Eriocaulaceae (шерстестебельник), Flagellariaceae, Geosiridaceae, Haemodoraceae (тысячелистник), Hanguanaceae (гангуана), Heliconiaceae (хеликония), Hydatellaceae, Hydrocharitaceae (валлиснерия), Iridaceae (ирис), Joinvilleaceae (жуанвилея), Juncaceae (тростник), Juncaginaceae (триостренник), Lemnaceae (ряска), Liliaceae (лилия), Limnocharitaceae (гидроклеис кувшинковидный), Lowiaceae, Marantaceae (маранта беложильчатая), Mayacaceae (маяка), Musaceae (банан), Najadaceae (кувшинка пахучая), Orchidaceae (орхидея), Pandanaceae (панданус), Petrosaviaceae, Philydraceae (филидровые), Poaceae (травы), Pontederiaceae (водяной гиацинт), Posidoniaceae (посидония), Potamogetonaceae (рдест), Rapateaceae, Restionaceae, Ruppiaceae (паспалум двухрядный), Scheuchzeriaceae (шейхцерия), Smilacaceae (смилакс), Sparganiaceae (ежеголовник малый ), Stemonaceae (стемона), Strelitziaceae, Taccaceae (така), Thurniaceae, Triuridaceae, Typhaceae (рогоз), Velloziaceae, Xanthorrhoeaceae, Xyridaceae (сисиринхиум полосатый), Zannichelliaceae (цаникеллия болотная), Zingiberaceae (имбирь) и Zosteraceae (зостера).
[00214] Если растения относятся к голосеменным, голосеменные могут относиться к семействам, выбранным из группы, состоящей из Araucariaceae, Boweniaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycadaceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpaceae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae и Zamiaceae.
ПРИМЕРЫ
[00215] Следующие не ограничивающие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения.
Пример 1. Использование рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, выводящего липазы или эндоглюканазы для стимуляции роста растений сои.
[00216] Гены липазы и эндоглюканазы Bacillus subtilis были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием следующих праймеров, приведенных ниже в таблице 3:
Таблица 3
(SEQ ID №: 37)
(SEQ ID №: 39)
(SEQ ID №: 38)
(SEQ ID №: 40)
[00217] Для создания гибридных конструкций гены сливали с нативным промотором BclA ДНК Bacillus thuringiensis, которая кодирует первые 35 аминокислот BclA (аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 1) с использованием техники сплайсинга путем перекрывающихся участков (SOE). Правильные ампликоны были клонированы в челночный вектор E. coli/Bacillus pHP13 и правильные клоны были скринированы ДНК секвенированием последовательности ДНК. Правильные клоны были электропорированы в Bacillus Thuringiensis (Cry-, плазмида-) и скринированы на устойчивость к хлорамфениколу. Правильные трансформанты выращивали в сердечно-мозговом бульоне в течении ночи при 30°С, высевали на чашки с питательным агаром и инкубировали при 30°С в течение 3 дней. Споры, экспрессирующие гибридную конструкцию (BEMD споры), были собраны с чашек путем промывки в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) и очищали центрифугированием и дополнительными промывками в натрий-фосфатном буфере. Нетрансформированные контрольные споры Bacillus thuringiensis (Bt.) получали идентичным образом.
[00218] Соевые бобы (штамм Jake 011-28-04) были посажены на 2,54 см в глубину в горшки глубиной 10 см со стандартным верхним суглинистым слоем. Споры разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому семени при посадке. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 11-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение двухнедельного обследования. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормализованы к контрольным спорам Bacillus thuringiensis. Было проведено два независимых исследования.
[00219] Результаты показаны в таблице 4 вместе со стандартной ошибкой среднего. В обоих испытаниях растения сои, выращенные в присутствии спор ВЭВ, выводящих липазу или эндоглюканазу, вырастали значительно выше, чем контрольные растения сои, обработанные спорами Bt. (статистический анализ проводили с помощью t-теста).
Таблица 4
Пример 2. Использование рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, выводящего эндоглюканазу, для стимуляции роста растений кукурузы.
[00220] ВЭВ споры, экспрессирующие эндоглюканазу были созданы идентичным образом, как описано выше в примере 1. Кукуруза была посажена на 3,8 см в глубину 3 см в горшки глубиной 10 см со стандартным верхним суглинистым слоем. Споры, контрольные и ВЭВ, экспрессирующие эндоглюканазу, разводили до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому растению при посадке. Также был включен контроль с одной водой. Растения были выращены при идеальном свете, используя лампы T5, 54 Вт, и 11-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение одной недели испытаний. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормализованы к контрольным спорам Bacillus thuringiensis.
[00221] Результаты приведены в таблице 5, вместе со стандартной ошибкой среднего. Кукуруза, выращенная в присутствии ВЭВ спор, выводящих эндоглюканазу, выросла значительно выше, чем контрольные растения сои, обработанные спорами Bt., и контрольные растения, обработанные только водой (статистический анализ проводили с помощью t-теста).
Таблица 5.
Пример 3. Использование рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, выводящего эндоглюканазы или протеазы для стимуляции роста растений пшеницы.
[00222] Споры ВЭВ, экспрессирующие эндоглюканазу, были созданы идентичным образом, как описано выше в примере 1. Споры ВЭВ, эспрессирующие протеазу PtrB E. coli, были созданы с использованием аналогичных способов, которые описаны выше в примере 1, и следующих праймеров: ggatccatgctaccaaaagcc (прямой, SEQ ID №: 41) и ggatccttagtccgcaggcgtagc (обратный, SEQ ID №: 42).
[00223] Твердая озимая пшеница была посажена на 2,54 см в глубину в горшки глубиной 10 см со стандартным верхним суглинистым слоем. Споры, контроль и ВЭВ, экспрессирующие эндоглюканазу или протеазу, разводили до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому растению при посадке. Также был включен контроль только с водой. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 11-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение одной недели испытаний. В конце одной недели измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормализованы по контрольным растениям.
[00224] Результаты приведены в таблице 6, вместе со стандартной ошибкой среднего. Пшеница, росшая в присутствии спор ВЭВ, выводящих эндоглюканазу или протеазу, выросла значительно выше, чем контрольные растения сои, обработанные спорами B.t., и контрольные растения, обработанные только водой (статистический анализ проводили с помощью t-теста).
Таблица 6.
Пример 4. Использование рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, выводящего эндоглюканазу для стимуляции роста растений плевела.
[00225] Споры ВЭВ, экспрессирующие эндоглюканазу, были созданы идентичным образом, как описано выше в примере 1. Пастбищный плевел был посажен на 6,4 мм в глубину в горшки глубиной 10 см со стандартным верхним суглинистым слоем. Споры, контроль и ВЭВ, экспрессирующие эндоглюканазу, разводили до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому растению при посадке. Также был включен контроль только с водой. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 11-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение двухнедельного обследования. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормализованы по контрольным растениям, обработанным только водой.
[00226] Результаты приведены в таблице 7, вместе со стандартной ошибкой среднего. Плевел, выращенный в присутствии спор ВЭВ, выводящих эндоцеллюлазу, вырос значительно выше, чем контрольный, обработанный спорами B.t. или водой плевел (статистический анализ проводили с помощью t-теста).
Таблица 7.
Пример 5. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих ферменты, участвующие в синтезе или активации растительных гормонов для стимуляции роста растений.
[00227] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, участвующих в синтезе гормонов растений. Например, растительный гормон индол-3-уксусная кислота является мощным стимулятором роста растений. Индол-3-уксусная кислота синтезируется in vivo из триптофана ферментами триптофан монооксигеназной и индол-3-ацетамид гидролазой. Индол-3-уксусная кислота и другие ауксиновые гормоны могут также быть синтезированы in vivo из триптофана и/или из индола ферментами нитрилазой, триптофан аминотрансферазой, индол-3-ацетальдегид дегидрогеназой, индол-3-пируват-декарбоксилазой, амин оксидазой, триптофан-декарбоксилазой и триптофан-оксидазой боковой цепи.
[00228] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, участвующих в модификации гормонов роста растений в биологически активные или неактивные формы. Например, нитрилаза может экспрессироваться в системе ВЭВ для катализа превращения индол-3-ацетонитрила в биологически активную форму индол-3-уксусная кислота. Кроме того, неактивные формы гормонов растений, такие как индол-3-ацетонитрил, могут вводиться в среды роста растений с нитрилазой, экспрессированной в ВЭВ, чтобы обеспечить постепенное высвобождение активного гормона в среду роста растений. Многие другие неактивные или менее активные формы растительных гормонов могут быть изменены с помощью соответствующих им ферментов.
[00229] Подобные гормоны роста растений (ауксины) включают индол-3-пировиноградную кислоту, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-ацетамид, индол-3-ацетонитрил, индол-3-этанол, индол-3-пируват, индол-3-масляную кислоту, фенилуксусную кислоту, 4-хлориндол-3-уксусную кислоту и индол-3-ацетальдоксим. Эти гормоны синтезируются из триптофана и/или индола в естественных условиях с помощью ферментов триптофан монооксигеназы, индол-3-ацетамид гидролазы, нитрилазы, нитрил гидролазы, ацетолактат синтетазы, альфа-ацетолактат декарбоксилазы, триптофан аминотрансферазы, индол-3-ацетальдегид дегидрогеназы, индол 3-пируватдекарбоксилазы, амин оксидазы, триптофан-декарбоксилазы и триптофан-оксидазы боковой цепи.
[00230] Гормоны роста цитокининового семейства можно также синтезировать с помощью ферментов, экспрессированных в системе ВЭВ. Примеры цитокининов включают кинетин, зеатин (цис и транс), 6-бензиламинопурин, дигидроксизеатин, N6-(D2-изопентенил) аденин, рибозилзеатин, N6-(D2-изопентенил) аденозин, 2-метилтио-цис-рибозилзеатин, цис-рибозилзеатин, рибозилзеатин-5-монофосфат, N6-метиламинопурин, N6-диметиламинопурин, 2'-дезоксизеатина рибозид, 4-гидрокси-3-метил-транс-2-бутенил аминопурин, орто-тополин, мета-тополин, бензиладенин, орто-метилтополин и мета-метилтополин. Эти соединения, стимулирующие рост растения, синтезируются in vivo из мевалоната или аденозин моно/ди/трифосфата ферментами, включающими аденозинфосфат изопентенилтрансферазы, фосфатазы, аденозин-киназы, аденин фосфорибозилтрансферазу, CYP735A, 5'-рибонуклеотид фосфогидролазу, аденозин нуклеозидазы, зеатин цис-транс-изомеразу, зеатин O-глюкозилтрансферазы, β-глюкозидазы, цис-гидроксилазы, CK цис-гидроксилазы, CK N-глюкозилтрансферазы, 2,5-рибонуклеотид фосфогидролазы, аденозин нуклеозидазы, пурин нуклеозидфосфорилазы и зеатин редуктазы.
[00231] Используя способы, подобные описанным выше в примере 1, любой из этих ферментов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на ВЭВ споры путем создания слитой конструкции, содержащей фермент и сигнальную последовательность, которая направляет экспрессированный фермент в экзоспорий, когда гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий такую конструкцию, может быть добавлен в почву, или другую среду для роста растений, или нанесен непосредственно на листву растений с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны выше в примере 1 для стимуляции роста растений.
[00232] Среда роста растений может быть дополнена предшественниками или субстратами для ферментов. Например, среда для роста растений может быть дополнена триптофаном, аденозинмонофосфатом, аденозиндифосфатом, аденозинтрифосфатом или индолом. Подходящие концентрации этих субстратов находятся между 100 нМ и 100мкМ.
Пример 6. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих протеазы или пептидазы, расщепляющие белки, пептиды, пробелки или препробелки в биологически активные пептиды для стимуляции роста растений.
[00233] Протеазы и пептидазы могут быть экспрессированы в системе ВЭВ, что может ферментативно расщеплять доступные белки в среде для роста растений в биологически активных пептидов, которые могут действовать на растение непосредственно или косвенно. Примеры включают ферментативное расщепление соевого шрота, дрожжевого экстракта или другой богатой белком пищи, добавляющейся к среде для роста растений, в активные пептиды, которые могут непосредственно стимулировать рост растений. Биологически активные пептиды, полученные путем ферментативного расщепления белковых питательных добавок, включают RHPP и RKN 16D10, мощные стимуляторы развития корневой системы растений. Кроме того, пробелки или препробелки могут разрезаться в активные формы с помощью протеаз и пептидаз, экспрессированых в ВЭВ. Неактивные пробелки или препробелки могут быть добавлены в среду роста растений чтобы облегчить их постепенное расщепление ВЭВ протеазами и замедлить высвобождение биологически активных белков.
[00234] Используя способы, подобные описанным выше в примере 1, любая из этих протеаз и пептидаз может быть включена в систему ВЭВ для выведения на ВЭВ споры путем создания слитой конструкции, содержащей протеазу или пептидазу и сигнальную последовательность, которая направляет экспрессированный фермент в экзоспорий, когда гибридная конструкция экспрессирована в представителе семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий такую конструкцию, может потом быть добавлен к почве или другой среде для роста растений с добавлением соевой муки, дрожжевого экстракта или другой богатой белком питательной добавки для стимуляции роста растений. Соевый шрот, дрожжевой экстракт, или другая богатая белком питательная добавка предпочтительно добавляется к среде для роста растений в виде жидкой композиции, содержащей от около 10 мкг/л до около 100 мг/л в белковой муки, дрожжевого экстракта или другой богатой белком питательной добавки.
Пример 7. Использование спор ВЭВ, экспрессирующих протеазы PtrB, для стимуляции роста растений.
[00235] Споры ВЭВ, экспрессирующие протеазы PtrB E. coli, были получены, как описано выше в примере 3. Семена сои были посажены на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см со стандартным суглинистым верхним слоем почвы. Споры, контрольные и ВЭВ, экспрессирующие протеазу, разводили до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому растению при посадке. Также был включен контроль с одной водой. Соевая мука в дозе 25 мг/горшок была добавлена в воду при посадке. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 13-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение одной недели испытаний. По окончанию двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормированы по контрольным растениям, обработанным только водой.
[00236] Результаты показаны в таблице 8, вместе со стандартной ошибкой среднего, в процентах от контроля с водой. Соя, росшая в присутствии спор ВЭВ, выводящих протеазу, выросла значительно выше чем контрольные растения сои, обработанные спорами Bt. и контрольные растения, обработанные только водой (статистический анализ проводили с помощью t-теста). Добавление соевой муки к контролю с водой или контролю B. thuringiensis не производило большого эффекта. В отличие от этого, в присутствии соевой муки и системы протеаз ВЭВ, растения сои существенно отвечали на все другие виды обработки.
Таблица 8.
Пример 8. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих белки или пептиды, участвующие в стимулировании роста растений.
[00237] Система ВЭВ также может быть использована для выведения белков или пептидов, которые непосредственно вовлечены в стимулировании роста растений. Например, пептидные гормоны растений или не гормональные пептиды, которые стимулируют рост растений, могут экспрессироваться в системе ВЭВ. Например, негормональные пептиды, которые непосредственно связываются и активируют рецепторы растений, могут экспрессироваться в системе ВЭВ для непосредственного воздействия на рецепторы в растении и корнях целевых растений. Такие пептидные гормоны и негормональные пептиды включают фитосульфокин, calcalva 3 (CLV3), системин, РКН 16D10, Hg-Syv46, eNOD40, NOD белков семейства, ZmlGF, белки семейства SCR/SP11 и пептиды, RHPP, POLARIS и ИТК. Эти пептиды и родственные пептиды могут быть выражены в системе ВЭВ и доставлены в среде для роста растений или непосредственно применены на листву для стимуляции роста растений.
[00238] Используя способы, подобные описанным выше в примере 1, любой из этих белков или пептидов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на ВЭВ спорах путем создания слитой конструкции, содержащей фермент и сигнальную последовательность, которая направляет экспрессированный фермент в экзоспорий, когда гибридная конструкция экспрессирован в представителе семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий такую конструкцию, может быть добавлен в почву, или другую среду для роста растений, или нанесен непосредственно на листву растений с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны выше в примере 1, для стимуляции роста растений.
Пример 9. Использование спор ВЭВ, экспрессирующих POLARIS или ИТК для стимуляции роста растений.
[00239] Споры ВЭВ растений, экспрессирующие пептид POLARIS и соевый пептид ИТК, были созданы путем синтеза генов, кодирующих пептиды POLARIS или ИТК, связанных с сигнальной последовательностью SEQ ID №: 60. Гены затем были введены в Bacillus thuringiensis и были получены споры, как описано в примере 1. Семена сои были посажены на 2,54 см в глубину в горшки глубиной 10 см со стандартным верхним суглинистым слоем. Споры ВЭВ, экспрессирующие POLARIS или ИТК, разводили до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому растению при посадке. Также включали контроль только с водой. Чистые пептиды POLARIS и ИТК также были протестированы на их воздействие на сою в количестве 0,05 мг/горшок. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 13-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение двух недельного испытания. По окончанию двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормированы по контрольным растениям, обрабатываемых только водой.
[00240] Результаты приведены в таблице 9, вместе со стандартной ошибкой среднего в процентах от контроля только с водой. Соя, росшая в присутствии спор ВЭВ, выводящих POLARIS, выросла выше и имела некоторое повышение в развитии корней при сравнении с контрольной соей. Присутствие свободного пептида ИТК приводило к значительной низкорослости растений, терявших 6-8% их высоты, но прибавлявших 15% в длине корней. Экспрессия ИТК в системе ВЭВ приводила к повышению в росте корней, но не вызывала задержки в росте растений в высоту. Важно отметить, что присутствие контрольных спор Bacillus thuringiensis со свободным пептидом ИТК не предотвращало эффект задержки в росте, вызванный ИТК, в то время как ВЭВ с ИТК не проявляла такой задержки роста.
Таблица 9.
Пример 10. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих ферменты, разрушающие или модифицирующие бактериальный, грибковый или растительный источник питательных веществ, для стимуляции роста растений и/или получения питательных веществ.
[00241] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, разрушающих или благотворно модифицирующих бактериальный, грибковый или растительный источник питательных веществ, присутствующий в почве или другой среде для роста растений. Такие ферменты разлагают продукты, присутствующие в почве или другой среде для роста растений в формы, которые могут быть легко поглощены растениями и/или полезными бактериями и/или грибами ризосферы. Такие ферменты включают, например, глюкозид-гидролазы для расщепления сложных углеводов, целлюлазы для расщепления целлюлозы; липазы для расщепления липидов, в том числе масла, жиров и восков; лигнин оксидазы для расщепления лигнина и гуминовых кислот; протеазы для расщепления полипептидов; фосфолипазы для расщепления мембран; амидазы и нитрогеназы для восстановления азота; амилазы для обработки крахмалов; нуклеазы для восстановления нуклеотидов, пектиназы для расщепления пектина, сульфатазы для восстановления серы и ксиланазы для расщепления ксиланов и арабиноксиланов. Полученные продукты, в том числе простые сахара, аминокислоты, жирные кислоты и другие питательных вещества, будут легко доступна для прямого поглощения растениями и/или для стимуляции роста и разрастания полезных бактерий и/или грибов в ризосфере растений.
[00242] Кроме того, ферменты и другие биологические молекулы могут быть использованы для высвобождения или изолирования фосфата, азота и других ключевых элементарных питательных веществ для поглощения растениями из их различных органических и неорганических форм в почве. Например, фосфатазы могут быть использованы для разложения фосфатов в среде в неорганические фосфаты, пригодные для использования растениями. Фосфатами могут быть природные фосфаты, присутствующие в среде для роста растений. В альтернативном варианте или в дополнение, среда для роста растений может быть дополнена фосфатами, такими как триметафосфат, обычной сельскохозяйственной добавки. Примеры полезных фосфатаз включают фосфорный моноэфир гидролазы, фосфомоноэстеразы, фосфорный диэфир гидролазы, фосфодиэстеразы, трифосфорный моноэфир гидролазы, фосфорный ангидрид гидролазы, пирофосфатазы, фитазу, триметафосфатазы и трифосфатазы. Например, ферменты триметафосфатазы, трифосфатазы и пирофосфатазы последовательно расщепляют триметафосфат в доступный неорганический фосфат.
[00243] Семейство ферментов нитрогеназ преобразует атмосферный азот (N2) в аммиак, таким образом превращая азот, по-другому не доступный для растений, в доступную форму. Подходящие ферменты относятся к семейству нитрогеназ Nif.
[00244] Химическая энергия может быть непосредственно добавлена в среду для роста растений в виде аденозинтрифосфата, ферродоксина или дополнительных ферментов, которые производят такую энергию в системе ВЭВ. Они являются кофакторами для нитрогеназ и ограничено присутствуют в почве. Таким образом, такие кофакторы могут быть добавлены в почву, чтобы ускорить реакции, описанные ранее.
[00245] Другие добавки, которые могут быть добавлены в среду для роста растений, включают крахмалы, целлюлозу и производные целлюлозы, пектины, ксиланы и арабиноксиланы, жиры, воски, масла, фитиновые кислоты, лигнины, гуминовые кислоты и других источники питательных веществ, к которым выше приведенные классы ферментов проявляют активность.
[00246] Используя способы, подобные описанным выше в примере 1, любой из этих ферментов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на ВЭВ споры путем создания слитой конструкции, содержащей фермент и сигнальную последовательность, которая направляет экспрессированный фермент в экзоспорий, когда гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Гибридная конструкция затем может экспрессироваться в представителе семейства Bacillus cereus, и этот рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может быть добавлен к почве или другой среде для роста растений с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны выше в примере 1 для стимуляции роста растений.
Пример 11. Использование ВЭВ спор, экспрессирующих фосфатазы для стимуляции роста растений.
[00247] ВЭВ споры Bacillus subtilis, экспрессирующие фосфатазу A4 (PhoA4) были созданы путем синтеза гена, кодирующего PhoA4, связанного с сигнальной последовательностью SEQ ID №: 60. Этот ген затем был введен в Bacillus thuringiensis, и споры были получены, как в примере 1. Кукуруза была посажена на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см со стандартным верхним суглинистым слоем. ВЭВ споры, экспрессирующие PhoA4, разводили до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому растению при посадке. Также включали контроль только с водой. Полифосфат был добавлен в горшки в жидком виде в расчете 0,5 мг/горшок. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 13-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение двухнедельного испытания. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормализованы по контрольным растениям, обработанным только водой.
[00248] Результаты приведены в таблице 10. Кукуруза, росшая в присутствии спор ВЭВ, выводящих PhoA4, показывает повышенный рост, в особенности в присутствии добавленного полифосфата. Этот эффект был выше, чем эффект только от полифосфата.
Таблица 10.
Пример 12. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих ферменты, участвующие в синтезе 2,3-бутандиола или активации гибберелловой кислоты для стимуляции роста растений.
[00249] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, участвующие в синтезе 2,3-бутандиола, соединения, способствующего росту растений. in vivo 2,3-бутандиол синтезируется полезными бактериями и грибами в ризосфере из ацетоина, диацетила, ацетолактата или пирувата ферментами ацетолактат синтетазой, α-ацетолактат декарбоксилазой, пируватдекарбоксилазой, диацетил редуктазой, бутандиол дегидрогеназой и ацетоин редуктазой.
[00250] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, участвующих в синтезе или активации соединения, способствующего росту растения, гибберелловой кислоты. Гибберелловая кислота может быть образована путем действия ферментов, включая, но не ограничиваясь, гидроксиламин редуктазы, 2-оксоглутарат диоксигеназы, гиббереллин 2B/3B гидролазы, гиббереллина-3 оксидазы и гиббереллина-20 оксидазы.
[00251] Любой из этих ферментов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на ВЭВ споры с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны выше в примере 1. Может быть получена гибридная конструкция, содержащая фермент и сигнальную последовательность, которая направляет фермент в экзоспорий, если гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Гибридная конструкция затем экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus и представитель семейства Bacillus cereus вносится в почву или другую среду роста растений для стимуляции роста растений.
[00252] Чтобы увеличить эффект отображаемых на ВЭВ ферментов, почва может быть дополнена субстратами для ферментов. Например, почва или другая среда для роста растений может быть дополнена ацетоином, который является субстратом для ацетоин редуктазы; пируватом, который является субстратом для пируватдекарбоксилазы; диацетилом, который является субстратом для диацетил редуктазы; и/или ацетолактатом, который является субстратом для ацетолактат декарбоксилазы. В альтернативном варианте или в дополнение, почва или другая среда для роста растений может быть дополнена более слабыми или неактивными формами гибберелловой кислоты, которые будут преобразованы в более активные формы в почве или другой среде роста растений под действием ферментов, описанных ранее.
Пример 13. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих протеазы для защиты растений от патогенов.
[00253] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, которые защищают растения от одного или нескольких патогенов. Например, некоторые бактериальные патогены могут взаимодействовать между отдельными особями с помощью секреции бактериальных гомосеринлактонов или похожих сигнальных молекул. Таким образом, протеазы, специфичные к бактериальным сигнальным молекулам гомосеринлактонам, могут защитить растения от таких бактериальных патогенов, разрушая коммуникацию между бактериями - шаг, необходимый бактериям для вырабатывания токсинов и активирования факторов вирулентности. Подходящие протеазы, специфичные к бактериальным сигнальным молекулам гомосеринлактонам, включают эндопептидазы и экзопептидазы.
[00254] Протеазы, специфичные к бактериальным сигнальным молекулам гомосеринлактонам, могут быть включены в систему ВЭВ, используя способы, аналогичные описанным выше в примере 1. Может быть получена гибридная конструкция, включающая протеазу и сигнальную последовательность, которая направляет фермент в экзоспорий, если гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Гибридная конструкция затем экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus вносится в почву или другую среду для роста растений для стимуляции роста растений. Протеаза затем может расщепить бактериальные сигнальные молекулы гомосеринов, блокируя ключевой шаг в вирулентности этих микроорганизмов и, таким образом, помогает защитить растение от этих патогенов. Другие протеазы и пептидазы эффективно работают в этом применении в системе ВЭВ, как было показано выше в примере 6 и 7.
Пример 14. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих антимикробные белки и пептиды для защиты растений от патогенов.
[00255] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, которые имеют антибактериальные и/или антигрибковые активности, что может защитить растения от одного или более патогенов. Например, антимикробные белки и пептиды, такие как бактериоцины, лизоцимы (например, LysM), сидерофоры, кональбумин, альбумин, лактоферрины (например, LfcinB) или TasA могут быть экспрессированы в системе ВЭВ для оказывания своего воздействия на бактериальные и грибковые патогены растений. Бактериоцины, альбумин, кональбумин, лизоцимы и лактоферрин оказывают прямое антимикробное действие на свои цели, в то время как сидерофоры связывают важные питательные вещества, требуемые патогенами для вирулентности. Например, пептид лактоферрина LfcinB, при экспрессии на поверхности системы ВЭВ, будет лизировать клетки бактерий, которые чувствительны к пептидам лактоферрина в среде для роста растений. Эти белки и пептиды имеют специфическое действие на некоторых микробов и могут быть селективно направлены против целевой группы патогенов, не влияя на все микробы в среде для роста растений.
[00256] Любой из этих белков или пептидов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на спорах ВЭВ с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны ранее в примере 1. Может быть получена гибридная конструкция, содержащая фермент и сигнальную последовательность, которая направляет фермент в экзоспорий, если гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Гибридная конструкция затем экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus вносится в почву или другую среду для роста растений для защиты растений от одного или более патогенов.
Пример 15. Использование спор ВЭВ, экспрессирующих антимикробные пептиды для защиты растений от бактерий.
[00257] Гены были синтезированы таким образом, что они кодировали любой из двух антимикробных пептидов, LfcinB (получен из бычьего лактоферрина) и LysM (получен из куриного лизоцима), связанных с сигнальной последовательностью BclA (SEQ ID №: 60), находящейся под контролем промотора BclA (SEQ ID №: 85). Гены были введены в Bacillus thuringiensis BT013A и споры были получены путем выращивания ночной культуры трансформированных Bacillus на бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой, высевание на чашки с питательным агаром при 30°С и последующим выращиванием в течение 3 дней. Споры смывали с чашек и промывали 3 раза в натрий-фосфатном буфере. Культуры Staphylococcus epidermidis выращивали в течение ночи на трипсиновом соевом бульоне при 37°С. После этого ночную культуру затем осаждали, промывали в натрий-фосфатном буфере и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере при Abs595=0,2. ВЭВ в концентрации 1×104, экспрессирующий пептиды LysM или LfcinB, инкубировали в натрий-фосфатном буфере с S. epidermidis в течение 3 часов при 37°С со встряхиванием. Контрольный образец S. epidermidis не обрабатывали (без спор ВЭВ). После 3-часовой инкубации разбавление пластины S. epidermidis были сделаны и инкубировали при 37°С в течение ночи. На следующий день культуры S. epidermidis подсчитывали и определяли процент погибших. Максимальная активность уничтожения зарегистрирована в таблице 11 ниже. Пептиды, экспрессированные ВЭВ, уничтожили значительное число клеток S. epidermidis. Это может непосредственно привести к уничтожению бактерий на ризосфере, семени или другом растительном материале. Выбор пептидов, специфичных для некоторых классов бактерий, также может изменить популяцию микроорганизмов в районе растения в выгодную сторону, или селективно воздействовать на ключевые патогены.
Таблица 11.
Пример 16. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих ферменты для защиты растений от патогенов.
[00258] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов, которые защищают растения от одного или более патогенов. Например, поименный клеточные стенки дрожжей и плесневого гриба разрушаются под действием ферментов, таких как β-1,3-глюканазы, β-1,4-глюканазы, β-1,6-глюканазы, хитозиназы, хитиназы, хитозиназа-подобные белки и лутиказы. Клеточные стенки бактерий разрушаются ферментами, выбранными из протеиназ, протеаз, мутанолизина, стафолизина и лизоцимов. Каждый из этих ферментов, разрушающих клеточные стенки, может быть экспрессирован на системе ВЭВ и внесен в среду для роста растений для селективного ингибирования патогенных микробов в ризосфере.
[00259] Система ВЭВ также может быть использована для выведения ферментов или белков, которые защищают растения от патогенных насекомых или червей, например, путем подавления поедания желаемых растений насекомым или червями. Примеры таких целевых белков и ферментов включают эндотоксины, Cry токсины, другие инсектицидные белковые токсины, ингибиторы протеаз, цистеиновые протеазы, белок Cry5B, белок Cry 21A, хитиназа, белки ингибитора протеазы, пептиды ингибитора протеазы, ингибиторы трипсина, и стреловидный ингибитор протеазы.
[00260] Любой из этих белков или пептидов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на спорах ВЭВ спор с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны выше в примере 1. Также может быть получена гибридная конструкция, включающая фермент и сигнальную последовательность, которая транспортирует фермент в экзоспорий, если гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Данная гибридная конструкция затем экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus вносится в почву или другую среду для роста растений для защиты растений от патогенов.
Пример 17. Использование спор ВЭВ, экспрессирующих противогрибковый фермент, для защиты растений, и демонстрация эффективности против Sacchromyces.
[00261] Ген синтезировали таким образом, что он кодировал противогрибковый фермент β-1,3-глюканазу из Bacillus subtilis, связанный с сигнальной последовательностью BclA (SEQ ID №: 60) под контролем промотора BclA (SEQ ID №: 85). Ген вводили в Bacillus thuringiensis BT013A, и споры были получены путем выращивания ночной культуры трансформированного Bacillus на бульоне в сердечно-мозговой вытяжкой, высевания на чашки с питательным агаром при 30°С и последующего выращивания в течение 3 дней. Споры смывали с чашек и промывали 3 раза в натрий-фосфатном буфере. Культуры Saccharomyces сerevisiae выращивали в течение ночи в бульоне YZ при 37°С. После этого ночную культуру осаждали, промывали в натрий-фосфатном буфере и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере при Abs595=0,2. ВЭВ в концентрации 1×104, экспрессирующую β-1,3-глюканазу, инкубировали в натрий-фосфатном буфере с Saccharomyces в течение 1 часа при 37°C со встряхиванием. Контрольный образец Saccharomyces не обрабатывали (без спор ВЭВ). После 3 часов инкубации делали разведение Saccharomyces на чашках и инкубировали при 37°С в течение ночи. На следующий день культуры Saccharomyces подсчитывали и определяли процент погибших. В таблице 12 ниже показана активность уничтожения спорами ВЭВ, экспрессирующими β-1,3-глюканазу. Фермент, экспрессируемый ВЭВ, уничтожил значительное количество клеток Saccharomyces. Это может непосредственно привести к уничтожению грибковых микроорганизмов на ризосфере, семени или другом растительном материале. Выбор белков, специфичных для некоторых классов грибов, также может изменить популяцию микроорганизмов в районе растения в выгодную сторону, или селективно воздействовать на ключевые грибковые патогены.
Таблица 12.
Пример 18. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих пептиды или белки, стимулирующие иммунную систему растений, для защиты растений от патогенов.
[00262] Система ВЭВ также может быть использована для выведения пептидов и белков, усиливающих иммунную систему растений. Эти белки могут экспрессироваться на внешней стороне споры ВЭВ доставляться в среду для роста растений, для стимуляции иммунной системы растений, чтобы позволить растению, защищать себя от фитопатогенов. Белки и пептиды-примеры включают гарпин, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситин, дефензин, криптогеин и белок и пептид флагеллина. Воздействие этих белков и пептидов на растение будет стимулировать устойчивость ко многим растительным патогенам в растениях.
[00263] Любой из этих белков или пептидов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на спорах ВЭВ с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны выше в примере 1. Также может быть получена гибридная конструкция, включающая фермент и сигнальную последовательность, которая транспортирует фермент в экзоспорий, если гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Данная гибридная конструкция затем экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus вносится в почву или другую среду для роста растений для защиты растений от патогенов.
Пример 19. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих белок или пептид, связывающийся с корнем или листом, для иммобилизации рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на корневой системе растения или листьях растения.
[00264] Белки или пептиды, связывающиеся с корнем или листом, могут также быть включены в систему ВЭВ, чтобы иммобилизировать споры ВЭВ на корневой системе или на листьях растения. Выведение на ВЭВ таких лигандов, связывающихся с корнем или листом, позволяет транспортировать споры на корневую систему растения или субструктуру корневой системы, или на листья, или на субструктуру листьев для сохранения споры ВЭВ в месте, оптимальном для того, чтобы другие выведенные биологические молекулы и ферменты были эффективными.
[00265] Например, rhicadhesin представляет собой лиганд, связывающийся с корнем, который связывается с корневыми волосками. Таким образом, выведение rhicadhesin на спорах ВЭВ приводит к транспортировке спор на корневые волоски. Дополнительные белки, которые можно использовать для избирательного связывания с корнем или листьями растений, включают адгезины, флагеллины, омптины, лектины, нитевидные белки, белки curlus, интимины, инвазины, агглютинин, нефибриальные белки, TasA или YuaB.
[00266] Такие белки или пептиды, связывающиеся с корнем или листом, могут быть включены в систему ВЭВ с использованием способов, аналогичных описанным выше в примере 1. Также может быть получена гибридная конструкция, включающая белок или пептид, связывающиеся с корнем или листом, и сигнальную последовательность, которая транспортирует белок или пептид в экзоспорий, если гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. После этого гибридная конструкция, содержащая лиганд, связывающийся с корнем или листом, экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Такие гибридные конструкции могут экспрессироваться совместно с одной или более дополнительной гибридной конструкцией, включающей любой из полезных ферментов, описанных в данном документе (например, фермент, участвующий в синтезе растительного гормона, фермент, разрушающий источник питательных веществ, или протеазы, защищающие растение от патогена). Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus вносится в почву или другую среду для роста растений или применяется к листьям растения. Лиганд, связывающийся с корнем или листом, транспортирует представителя семейства Bacillus cereus на корневую систему растения или на листья растения и иммобилизует его там, позволяя таким образом дополнительно экспрессированной гибридной конструкции оказывать воздействие в непосредственной близости к корневой системе или листьям.
Пример 20. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих ферменты для повышения устойчивости растений к стрессу.
[00267] Белки, пептиды и ферменты, которые повышают устойчивость к стрессу в растении могут быть включены в систему ВЭВ и доставлены в целевые растения путем введения в корни, листья или среду для роста растений. В периоды стресса, растения выделяют соединения, связанные со стрессом, в том числе аминоциклопропан-1 карбоновую кислоту (АКК), активные формы кислорода и другие, что отрицательно влияет на рост растения. Система ВЭВ может быть использована для выведения ферментов, которые расщепляют такие связанные со стрессом соединения, такие как дезаминаза аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, супероксиддисмутазы, оксидазы, каталазы и другие ферменты, которые действуют на реактивные формы кислорода. Эти ферменты снижают количество этих вызванных стрессом соединений и позволяют растениям расти и даже развиваться при стрессовых условиях.
[00268] Любой из этих белков или пептидов может быть включен в систему ВЭВ для выведения на спорах ВЭВ с помощью способов, аналогичных тем, которые описаны выше в примере 1. Может быть получена гибридная конструкция, содержащая фермент и сигнальную последовательность, которая направляет фермент в экзоспорий, если гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Затем гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus добавляется в почву или другую среду для роста растений или применяется к листьям растения для повышения устойчивости растения к стрессу.
Пример 21. Получение спор ВЭВ, экспрессирующих защитный фермент каталазу.
[00269] Синтезировали ген, который кодировал защитный фермент каталазу из Bacillus cereus, связанный с сигнальной последовательностью BetA (SEQ ID NO: 61), под контролем промотора BetA (SEQ ID NO: 86). Этот ген был введен в Bacillus Thuringiensis BT013A. Споры были получены путем выращивания культур трансформированного Bacillus и штамма дикого типа в сердечно-мозговым бульоне в течение ночи, высаживания на питательные чашки с агаром при 30°С, после чего их оставляли расти в течение 3 дней. Споры смывались с чашек и промывались 3 раза в натрий-фосфатном буфере. Было добавлено 3 капли перекиси водорода в каждую гранулу спор. Фермент каталаза преобразует пероксид водорода на воду и газ O2. Контрольные спор не пенились, в то время как ВЭВ споры с каталазой активно это делали, демонстрируя активность фермента на поверхности спор. Другие защитные ферменты могут выводиться аналогичным образом и доставляться в растение для влияния на свободные радикалы, образующиеся во растениями во время стресса.
Пример 22. Использование рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, выводящих белки или ферменты, которые защищают семена или растения от стрессовой среды.
[00270] Белки, пептиды и ферменты, которые защищают растение от воздействия окружающей среды, могут быть включены в систему ВЭВ и доставлены в целевые растения путем введения в корни, листья, плоды или в среду роста растений. В периоды замерзания растения могут быть повреждены действием льда. Система ВЭВ может быть использована для выведения пептидов, белков или ферментов, которые защищают растения от таких эффектов. Например, система ВЭВ может быть использована для выведения холин дегидрогеназ, которые действуют путем создания защитных продуктов, которые защищают растения или семена от мороза. Субстраты для этих ферментов (например, холин и/или производные холина) также могут быть добавлены в среду роста растений. Добавление таких субстратов может увеличить количество защитного вещества (бетаин и подобные соединения), образованного в растении ферментами, экспрессированными в ВЭВ. Известно, что производные бетаина защищают семена от холодового стресса.
[00271] Любой из этих белков или пептидов может быть включен в систему BЭВ для выведения на BЭВ спорах, используя способы, аналогичные описанным выше в примере 1. Гибридная конструкция может быть сделана так, чтобы включать фермент и сигнальную последовательность, которая направляет фермент в экзоспорий, при условии, что гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Затем гибридная конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus добавляется в почву или другую среду для роста растений или применяется к листьям растения для защиты растения от воздействий и факторов окружающей среды.
Пример 23. Усиленная экспрессия гибридных конструкций в системе ВЭВ с использованием усиленых или альтернативных элементов промотора.
[00272] Система ВЭВ может выявлять широкий спектр белков, пептидов и ферментов, используя одну или более сигнальных последовательностей, описанных в данном документе. Некоторые из этих сигнальных последовательностей имеют высокое сродство к экзоспорию, что было бы полезным для экспрессии гибридного белка, но низкий уровень экспрессии гибридного белка ограничивает их использование в системе ВЭВ. Для таких гибридных белков и последовательностей могут быть использованы альтернативные сильные промоторы споруляции вместо нативных промоторов.
[00273] Например, SEQ ID №: 13 (аминокислоты 1-39 из гена 3572 B. weihenstephensis КBAB4) обеспечивает очень эффективную N-концевую последовательность для доставки белков в экзоспорий представителей семейства Bacillus cereus, как показано ниже в таблице 13. Все гены были синтезированы в полноразмерной форме (включая промоторные области и области, кодирующие гибридные белки), как описано в данном документе. При использовании нативных элементов промотора гена 3572 В. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID №: 88) для экспрессии гибридного белка, содержащего сигнальную последовательность из SEQ ID №: 13 слитую с ферментом β-галактозидазой (из E. coli), наблюдали низкий уровень экспрессии гибридного белка, что приводило к снижению ферментативной активности на поверхности спор. Активность фермента измеряли по превращению 0,5 М о-нитрофенилгалактозида в растворе в течение 10 минут. Ферментативное превращение измеряли с помощью спектрофотометра при ABS540. Замена нативных элементов промотора гена 3572 В. weihenstephensis KBAB4 на сильные промоторы SEQ ID №: 86 (B. anthracis BetА/BAS3290) или SEQ ID №: 89 (YVTN β-пропеллер белок B. weihenstephensis KBAB4) привела к значительному увеличению ферментативной активности спор. С другой стороны, замена нативных элементов промотора гена 3572 В. weihenstephensis KBAB4 на нативный промотор Sterne BAS1882 B. anthracis (SEQ ID №: 87) привела к снижению ферментативной активности спор. Уровень экспрессии сигнальной последовательности SEQ ID №: 13, слитой с β-галактозидазой, был значительно ниже (0,38х), когда контролировался промотором BAS1882 (SEQ ID №: 87), и был значительно улучшен, когда контролировался промотором BetA (SEQ ID №: 86) или промотором белка YVTN (SEQ ID №: 89).
Таблица 13.
Пример 24. Изолирование и идентификация бактериальных штаммов, усиливающих рост растений.
[00274] Были отобраны образцы грунта из ризосфер наиболее здоровых и наиболее устойчивых растений картофеля (Solanum tuberosum), тыквы обыкновенной (Cucurbita pepo), томата (Solanum lycopersicum) и фасоли огненно-красной (Phaseolus coccineus), разведены в стерильной воде и нанесены на чашки с агаризированной питательной средой. Бактериальные изоляты, показавшие высокие темпы роста и которые можно было пассировать и размножать, были отобраны для дальнейшего изучения. Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для одной обработки десять семян салата латука были посажены на глубину 1 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке в 4 см горшки семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированных в воде, смешанными с 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) при 11-часовом световом дне и с поливом по 5 мл каждые 3 дня. Через неделю данные по высоте растений и диаметру листьев, а также по общему физиологическому состоянию растений были собраны. Предварительный скрининг ризосферных изолятов привел в результате к получению более чем 200 различных видов бактерий и грибков из ризосферы четырех растений. Некоторые из видов бактерий описаны в таблице 14. Идентифицированные штаммы указаны под своими присущими бактериальными названиями. Другие штаммы указаны под неизвестным идентификационным номером. Инокулянты, давшие результаты вблизи контроля (± 2%), не были включены в таблицу.
Таблица 14
[00275] Бактериальные штаммы, произведшие наибольшее влияние на общее физиологическое состояние растения и высоту растения в предварительном испытании на салате латуке, в дальнейшем идентифицировались. Бактериальные штаммы выращивали в течение ночи в бульоне Лурии-Бертани при 37°С, и ночные культуры осаждали в центрифуге. Среду удаляли, а из оставшегося бактериального осадка выделяли хромосомную ДНК с помощью набора Qiagen Bacterial Chromosomal DNA Isolation. Хромосомную ДНК подвергали ПЦР-амплификации 16S рРНК кодирующих областей с использованием праймеров E338F 5'- ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT -3' (SEQ ID №: 122), E1099R A 5'- GGG TTG CGC TCG TTG C -3' (SEQ ID №: 123) и E1099R B 5'- GGG TTG CGC TCG TTA C-3' (SEQ ID №: 124). ПЦР ампликоны очищали, используя набор Promega PCR purification, и полученные ампликоны разводили и отправляли в университет Миссури (DNA Core) для секвенирования ДНК. Последовательности ДНК сравнивали с базой данных NCBI BLAST бактериальных изолятов, и род и вид идентифицировали путем непосредственного сравнения с известными штаммами. Наиболее хорошо идентифицированные виды приведены в таблице 14. Во многих случаях по последовательностям ДНК 16S рРНК можно было лишь определить род выбранного бактериального штамма. В тех случаях, когда прямая идентификация не удалась, проводили дополнительные биохимические анализы с использованием стандартных в данной области техники способов для дифференцирования штаммов на видовом и штаммовом уровнях, и они приведены в таблице 15.
Таблица 15
Пример 25. Изолирование и идентификация дополнительных бактериальных штаммов, усиливающих рост растений.
[00276] Были отобраны образцы грунта из сельскохозяйственных полей вблизи г. Газа, штат Канзас, разбавлены в стерильной воде и нанесены на чашки с агаризированной питательной средой. Бактериальные изоляты, продемонстрировавшие высокие темпы роста и которые можно было пассировать и размножать, были отобраны для дальнейшего изучения. Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Семена кукурузы покрывали коммерческим полимером для семян, смешанным только с водой (1,6 мкл на все семена), или коммерческим полимером для семян, содержащим выбранные бактериальные штаммы (1,6 мкл на все семена). Покрытые семена сажали в 3-дюймовые (7,62 см в диаметре) горшки на глубину 1 дюйм (2,54 см) в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. Растения выращивали при температуре 18-24°C (65-75°F) при 11-часовом световом дне и с поливом по 50 мл каждые 3 дня. Через две недели данные по высоте растений и диаметру листьев, а также по общему физиологическому состоянию растений были собраны. Для анализа прорастания и определения длины 3-дневного корня, семена покрывали так, как указано ранее, и равномерно распределяли по 10 семян на бумажное полотенце. Бумажные полотенца смачивали 10 мл воды, скручивали, помещали в небольшой пластиковый пакет и инкубировали при 30°С или помещали на подогреваемый коврик для прорастания при 27-30°C (80-85°F). Измерения корней регистрировали после 3 дней. Предварительный скрининг ризосферных изолятов привел в результате к получению более чем 100 различных видов бактерий и грибков из ризосферы. Некоторые из бактериальных видов описаны в таблице 16. Идентифицированные штаммы указаны под своими присущими бактериальными названиями.
Таблица 16
нормированная к полимерному контролю (%)
[00277] Бактериальные штаммы, произведшие наибольшее влияние на общее физиологическое состояние растения, описаны в таблице 16. Бактериальные штаммы выращивали в течение ночи в бульоне Лурии-Бертани при 37°С, и ночные культуры осаждали в центрифуге. Среду удаляли, а из оставшегося бактериального осадка выделяли хромосомную ДНК с помощью набора Qiagen Bacterial Chromosomal DNA Isolation. Хромосомную ДНК подвергали ПЦР-амплификации 16S рРНК кодирующих областей с использованием праймеров E338F 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3' (SEQ ID №: 122), E1099R А 5'-GGG TTG CGC TCG TTG C-3' (SEQ ID №: 123) и E1099R В 5'-GGG TTG CGC TCG TTA C-3' (SEQ ID №: 124). ПЦР ампликоны очищали, используя набор Promega PCR purification, и полученные ампликоны разводили и отправляли в университет Миссури (DNA Core) для секвенирования ДНК. Последовательности ДНК сравнивали с базой данных NCBI BLAST бактериальных изолятов, и род и вид идентифицировали путем непосредственного сравнения с известными штаммами. Наиболее хорошо идентифицированные виды приведены в таблице 16. Во многих случаях по последовательностям ДНК 16S рРНК можно было лишь определить род выбранного бактериального штамма. В тех случаях, когда прямая идентификация не удалась, проводили дополнительные биохимические анализы с использованием стандартных в данной области техники способов для дифференцирования штаммов на видовом и штаммовом уровнях, и дифференцированные штаммы приведены в таблице 17.
Таблица 17
Пример 26. Тестирование бактериальных штаммов, усиливающих рост растений, на люцерне.
[00278] Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для каждой обработки десять семян люцерны, покрытые Zeba полимером, были посажены на глубину 0,6 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированных в воде, смешанными с 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) при 11-часовом световом дне и с поливом по 5 мл каждые 3 дня. Люцерну растили в течение 1 недели для анализирования появления и начального прироста растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные под своими присущими бактериальными названиями, и конечные данные о высоте приведены в таблице 18.
Таблица 18
Пример 27. Тестирование бактериальных штаммов, усиливающих рост растений, на огурцах.
[00279] Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для каждой обработки десять семян огурцов были посажены на глубину 1 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированных в воде, смешанными с 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) при 11-часовом световом дне и с поливом по 5 мл каждые 3 дня. Огурцы растили в течение 2 недель для анализирования появления и начального прироста растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные под своими присущими бактериальными названиями, и конечные данные о высоте приведены в таблице 19.
Таблица 19
Пример 28. Тестирование бактериальных штаммов, усиливающих рост растений, на тыкве.
[00280] Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для каждой обработки десять семян тыквы были посажены на глубину 1 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированных в воде, смешанными с 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) при 11-часовом световом дне и c поливом по 5 мл каждые 3 дня. Тыкву растили в течение 2 недель для анализирования появления и начального прироста растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные под своими присущими бактериальными названиями, и конечные данные о высоте и конечном диаметре листа (по ширине двух листьев) приведены в таблице 20.
Таблица 20
Пример 29. Тестирование бактериальных штаммов, усиливающих рост растений, на плевеле.
[00281] Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для каждой обработки тридцать семян плевела были посажены на глубину 0,3 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированных в воде, смешанными с 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) при 11-часовом световом дне и c поливом по 5 мл каждые 3 дня. Плевел растили в течение 1,5 недели для анализирования появления и начального прироста растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные под своими присущими бактериальными названиями, и конечные данные о высоте приведены в таблице 21.
Таблица 21
Пример 30. Тестирование бактериальных штаммов, усиливающих рост растений, на кукурузе.
[00282] Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для каждой обработки десять семян кукурузы были посажены на глубину 2,5 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированными в воде, смешанными с 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) при 11-часовом световом дне и c поливом по 5 мл каждые 3 дня. Кукурузу растили в течение 2 недель для анализирования появления и начального прироста растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные под своими присущими бактериальными названиями, и конечные данные о высоте приведены в таблице 22.
Таблица 22
Пример 31. Тестирование бактериальных штаммов, усиливающих рост растений, на сое.
[00283] Выбранные штаммы выращивали на минимальной среде (КН2РО4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г на л сухого веса или для Bradyrhizobium или Rhizobium на дрожжевой среде с маннитолом). Ночные культуры (30°С) выбранных штаммов осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для каждой обработки десять семян сои были посажены на глубину 2,5 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированных в воде, смешанными с 10 мл H2O. При тестировании двух бактериальных штаммов 0,5 мкл каждой суспензии бактерий смешивали с 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 3 дюймах 3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) при 11-часовом световом дне и c поливом по 5 мл каждые 3 дня. Сою растили в течение 2 недель для анализирования появления и начального прироста растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы указаны под своими присущими бактериальными названиями и конечные данные о высоте приведены в таблице 23. Ко-инокуляция бактериальных штаммов по данному изобретению с представителями Bradyrhizobium sp. или Rhizobium sp. привела к увеличению роста растений по сравнению с любым единичным инокулянтом.
Таблица 23
Пример 32. Члены семейства Bacillus cereus, обладающие свойствами усиления роста растений.
[00284] Bacillus mycoides штамм BT155, Bacillus mycoides штамм EE118, Bacillus mycoides штамм EE141, Bacillus mycoides штамм BT46-3, член семейства Bacillus cereus штамм EE349, Bacillus thuringiensis штамм BT013A и Bacillus megaterium штамм EE281 выращивали в бульоне Лурии-Бертани при 37°C, и ночные культуры осаждали, удаляли среду и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Для каждой обработки 20 семян кукурузы были посажены на глубину 2,5 см в суглинистый верхний слой почвы (Колумбия, MO), который просеивали для удаления крупных частиц. При посадке семена инокулировали 0,5 мкл бактерий, ресуспендированных в воде, смешанными с 50 мл H2O. Пятьдесят мл H2O было достаточно для разнесения бактерий в 29 дюймах3 (442,5 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-72°F при 13-часовом световом дне и c поливом по 5 мл каждые 3 дня. Саженцы растили в течение 2 недель для анализирования появления и начального прироста растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы указаны под своими присущими бактериальными названиями и конечные данные о высоте приведены в таблице 24.
Таблица 24
Все протестированные бактерии, усиливающие рост растений, оказали благоприятное влияние на высоту кукурузы на вторую неделю в описанных условиях. Член семейства Bacillus cereus штамм EE128 имел наибольший эффект в этом испытании, давая более чем 14% прироста высоты кукурузы.
Пример 33. Повышенный отбор членов семейства Bacillus cereus для скрининга на усиленный рост растений и другие полезные изменения, как хозяина для ВЭВ экспрессии.
[00285] Система ВЭВ может быть использована для выявления широкого спектра белков, пептидов и ферментов с использованием любой из сигнальных последовательностей, описанных в данном документе, для обеспечения полезных сельскохозяйственных эффектов. Дополнительные полезные эффекты могут быть получены путем отбора хозяина для экспрессии (члена семейства Bacillus cereus), имеющего присущие полезные свойства. Многие штаммы членов семейства Bacillus cereus имеют преимущества по улучшению роста растений. Кроме того, многие штаммы членов семейства Bacillus cereus обеспечивают наличие защитных эффектов, посредством прямых фунгицидных, инсектицидных, нематоцидных или других защитных действий. При использовании таких штаммов в качестве хозяина для экспрессии в системе ВЭВ, конечный споровый продукт будет иметь комбинацию положительных преимуществ для сельского хозяйства.
[00286] Таблица 25 предоставляет результаты экспериментов, в которых гибридный белок экспрессировался в различных штаммах членов семейства Bacillus cereus. Все штаммы экспрессировали гибридный белок, содержащий аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 1, и фосфатазу PhoA4 из Bacillus subtilis, фермент, полезный для интенсивного поглощение фосфата, в кукурузе. Ген был синтезирован, клонирован в вектор pMK4 и введен в каждый из Bacillus spp., указанный ниже в таблице 25. Штаммы вводили в споруляцию путем инкубации при 30°С на чашках с питательной агаризированной средой, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола, в течение трех дней. Споры собирали, промывали и применяли к кукурузе при посадке с показателем 1×105 КОЕ/мл в 50 мл воды на горшок с диаметром 7,62 см с 5 мг полифосфата на горшок. Кукурузу выращивали в иловой суглинистой почве в течение двух недель. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 13-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение двухнедельного испытания. По окончанию двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормированы по контролю спор Bacillus thuringiensis. Экспрессия гибридного белка SEQ ID №: 1-фосфатаза привела к увеличению высоты кукурузы на 2-ю неделю, независимо от выбранного для экспрессии штамма хозяина. Как показано в таблице 25, использование члена семейства Bacillus cereus, усиливающего рост растений, дополнительно увеличивало высоту кукурузы.
Таблица 25.
Пример 34. Использование различных сигнальных последовательностей для экспрессии β-галактозидазы на поверхности Bacillus thuringiensis.
[00287] Широкое разнообразие сигнальных последовательностей, имеющих высокую степень гомологии с аминокислотами 20-35 из BclA (аминокислоты 20-35 из SEQ ID №: 1), может быть использовано для выявления ферментов, белков и пептидов на поверхности членов семейства Bacillus cereus. Несколько сигнальных последовательностей сравнивали путем создания гибридных белков, содержащих сигнальные последовательности, связанные с липазой Bacillus subtilis. Гибридные конструкции синтезировали, используя нативные для сигнальных последовательностей промоторы, клонировали в репликативную плазмиду pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Штаммы вводили в споруляцию путем инкубации при 30°С на чашках с питательной агаризированной средой, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола, в течение трех дней. Споры собирали, промывали и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере до показателя 1×108/мл. Использовали 1×105 спор для каждой гибридной конструкции, споры суспендировали в 400 мкл дистилированной Н2O. Реакционные смеси нагревались реакционными компонентами до желаемой температуры реакции (40°C). Добавляли 200 мкл рабочего буфера (9:1 раствор А: раствор Б). Раствор А содержал 50 мМ Трис рН 10 и 13,6 мМ деоксихолевую кислоту, а раствор Б содержал 3 мг/мл р-нитрофенил пальмитат в изопропаноле. Реакционную смесь инкубировали при 40°С в течение 10 минут и помещали в лед, центрифугировали для удаления спор, и регистрировали оптическую плотность при 420 нм. Результаты показаны ниже в таблице 26. Активность была нормирована по контрольному гибридному белку, содержащему аминокислоты 1-35 из SEQ ID №: 1, слитые с липазой Bacillus subtilis.
Таблица 26.
[00288] Связывание нескольких сигнальных последовательностей с липазой приводит к более высоким уровням экспрессии и активности фермента на поверхности спор. В частности, SEQ ID №№ 60, 62 и 64, каждый из которых содержит более короткую сигнальную последовательность, приводило в результате к усиленной гибридной экспрессии на поверхности ВЭВ спор. Все гибридные белки, содержащие тестированные сигнальные последовательности, приводили к выявлению на поверхностности липазы.
Пример 35. Использование различных последовательностей экзоспория для экспрессии липазы на поверхности Bacillus thuringiensis и демонстрация локализации гибридного белка на поверхности экзоспория.
[00289] Широкое разнообразие белков экзоспория может быть использовано для выявления ферментов, белков и пептидов на поверхности членов семейства Bacillus cereus. Несколько различных белков экзоспория сравнивали путем создания гибридных белков, содержащих белки экзоспория, связанные с липазой Bacillus subtilis, как описано в примере 34. Гибридные конструкции синтезировали, используя нативный для белка экзоспория промотор, указанный ниже в таблице 27, клонировали в репликативную плазмиду pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, выявляющие различные гибриды белка экзоспория-липазы Bacillus subtilis 168, были получены путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой при селективном давлении 10 мкг/мл хлорамфеникола, высеванием на чашки с питательной агаризированной средой и инкубированием при 30°С в течение 3 дней. После 3 дней споры смывали с чашек, очищали центрифугированием и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере до 1×108 КОЕ/мл.
[00290] 1×105 спор для каждой гибридной конструкции суспендировали в 400 мкл дистилированной Н2O. Реакционные смеси нагревались реакционными компонентами до желаемой температуры реакции (40°C). Добавляли 200 мкл рабочего буфера (9:1 раствор А: раствор Б). Раствор А содержал 50 мМ Трис рН 10 и 13,6 мМ деоксихолевую кислоту, а раствор Б содержал 3 мг/мл р-нитрофенил пальмитат в изопропаноле. Реакционную смесь инкубировали при 40°С в течение 10 минут и помещали в лед, центрифугировали для удаления спор, и регистрировали оптическую плотность при 420 нм. Результаты показаны ниже в таблице 27. Активность была нормирована по SEQ ID №: 72, связанному с липазой.
Таблица 27.
[00291] Использование белков экзоспория из SEQ ID №№ 72 и 73 привело в результате к самой высокой активности фермента на споре. Все гибридные белки, содержащие белки экзоспория, в результате выявляли на поверхности активную липазу Bacillus subtilis 168, хотя на различных уровнях.
[00292] С использованием флуоресцентного репортера mCherry было показано, что дополнительные белки экзоспория в результате направляли гибридные белки в экзоспорий. Были созданы гибридные конструкции, включающие белки экзоспория из SEQ ID №№ 74, 83 и 73, присоединенные к репортеру mCherry. Споры выращивали в течение 1,5 дня, собирали и ресуспендировали, как описано ранее. 7 мкл флуоресцентных спор клали под микроскоп Nikon E1000 и делали изображения во время поздней споруляции. Круговая локализация в кольце указывает на локализацию внешнего слоя споры, а проявление соответствует белку экзоспория. Результаты флуоресцентной микроскопии проиллюстрированы на фигуре 2. Фиг. 2A, 2Б и 2В представляют собой изображения флуоресцентной микроскопии спор, экспрессирующих гибридные белки, содержащие белки экзоспория из SEQ ID №№ 74, 83 и 73, соответственно, и репортер mCherry. Все три гибрида продемонстрировали высокий уровень флуоресценции и локализации на экзоспории, демонстрируя свою потенциальную полезность для экспрессии чужеродных белков на поверхности экзоспория.
Пример 36. Использование различных сигнальных последовательностей и белков экзоспория для экспрессии фосфатазы в спорах Bacillus subtilis, и воздействия спор, содержащих фосфатазу, в сое.
[00293] ВЭВ споры, экспрессирующие фосфатазу A4 (PhoA4) Bacillus subtilis EE148, были созданы путем генного синтеза генов, кодирующих различные сигнальные последовательности и белки экзоспория под контролем нативных промоторов, связанных с PhoA4. Синтезированные гены были клонированы в pMK4 и введены в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, выявляющие различные гибриды белка экзоспория-PhoA4 Bacillus subtilis EE148, были получены путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой при селективном давлении 10 мкг/мл хлорамфеникола, высеванием на чашки с питательной агаризированной средой и инкубированием при 30°С в течение 3 дней. После 3 дней споры смывали с чашек, очищали центрифугированием и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере до 1×108 КОЕ/мл.
[00294] Сою сажали на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см, наполненные стандартным суглинистым верхним слоем почвы. ВЭВ споры, экспрессирующие PhoA4, разводили до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и применяли к каждому растению при посадке. Также включали контроль только с водой. Полифосфат добавляли в горшки в форме жидкости в рассчете 0,5 мг/горшок. Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 13-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение двухнедельного испытания. По окончанию двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормированы по контролю растения только с водой.
[00295] Результаты приведены в таблице 28. Сою выращивали в присутствии ВЭВ спор, экспрессирующих гибридные белки, содержащие PhoA4, связанную с различными сигнальными последовательностями, и белки экзоспория с различными партнерами слияния, с PhoA4 все демонстрировали усиленный рост, но продолжительность влияния варьировала в зависимости от используемой сигнальной последовательности или белка экзоспория.
Таблица 28.
Пример 37. Совместное применение ВЭВ спор с обработками семян, жидкими удобрениями и другими добавками.
[00296] ВЭВ споры, экспрессирующие гибридные белки, тестировали на совместимость с различными обработками семян. ВЭВ споры экспрессировали гибридные белки, содержащие сигнальную последовательность аминокислот 1-35 SEQ ID №: 1, связанную с фосфатазой (PhoA4) из Bacillus subtilis EE148 или пептидом POLARIS. Синтезированные гены клонировали в pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, выявляющие различные гибриды белка экзоспория-PhoA4 Bacillus subtilis EE148 или POLARIS, были получены путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой при селективном давлении от 10 мкг/мл хлорамфеникола, высеванием на чашки с питательной агаризированной средой и инкубированием при 30°С в течение 3 дней. После 3 дней споры смывали с чашек, очищали центрифугированием и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере до 1×108 КОЕ/мл.
[00297] Растения выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 13-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение двухнедельного испытания. По окончанию двух недель измеряли высоту каждого растения, и измерения были нормированы по контролю растений только с водой. Результаты показаны ниже в таблице 29. Смачивание=применялось к почве по 50 мл на горшок. Полимер=только полимер ACCELERON для покрытия семян. ВЭВ споры в количестве 1×104 клеток/50 мл добавляли для смачивания. ВЭВ споры в количестве 1,3×104/клетки/семя добавляли для покрытия семян. 10-34-0 и 6-24-6 представляют собой стандартные коммерческие стартовые композиции удобрений. 10-34-0 представляет собой жидкий фосфат аммония. 6-24-6 представляет собой слабосолевое жидкое фосфатное удобрение с орто/поли композицией. Краситель=Becker Underwood красный, краситель для покрытия семян. MACHO, APRON и CRUISER представляют собой коммерческие фунгициды, используемые для семян. MACHO содержит активный ингредиент имидаклоприд, APRON содержит активный ингредиент мефеноксам, и CRUISER содержит смесь активных ингредиентов тиаметоксама, мефеноксама и флудиоксонила. Было обнаружено, что споры совместимы со многими обработками семян и сохраняли способность стимулировать рост растений кукурузы.
Таблица 29.
[00298] Было обнаружено, что ВЭВ споры совместимы со всеми тестируемыми веществами для покрытия семян. Показано незначительное снижение активности, когда ВЭВ PhA4 споры сочетались только с красителем и полимером, но споры восстанавливали полноценную активность с красителем в комбинации с другими фунгицидами. ВЭВ споры также хорошо работали с жидкими удобрениями. Наиболее вероятно, что стартовые удобрения способствовали росту растений через непосредственное дополнение питательных веществ. ВЭВ споры работали с обоими стартовыми удобрениями, предполагая, что активность фосфатазы все еще может приводить к увеличению роста растений в присутствии избытка питательных веществ. Комбинации ВЭВ спор с фунгицидами представляли большее увеличение роста растений, чем только ВЭВ споры, что, похоже, связано с защитой, обеспечиваемой молодым растениям кукурузы на ранних этапах роста.
Пример 38. Использование ВЭВ спор, как добавку для листьев для уменьшения ингибирования роста во время стресса, на кукурузе.
[00299] Система выявления ВЭВ спор может быть использована для доставки ферментов, способных облегчать воздействие некоторых стрессовых факторов на растущие в поле или теплице растения. Для достижения этого выбирали ферменты, избирательно действующие на активные формы кислорода в почве. Активные формы кислорода являются основными маркерами стресса у растений.
[00300] Были получены ВЭВ споры, экспрессирующие гибридные белки, содержащие сигнальную последовательность аминокислот 1-35 из SEQ ID №: 1, связанную с хитозиназой, супероксиддисмутазой, каталазой или β-1,3-глюканазой из Bacillus thuringiensis BT013A. Синтезированные гены клонировали в pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, выявляющие различные гибридные белки, были получены путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой при селективном давлении 10 мкг/мл хлорамфеникола, высеванием на чашки с питательной агаризированной средой и инкубированием при 30°С в течение 3 дней. После 3 дней споры смывали с чашек, очищали центрифугированием и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере до 1×108 КОЕ/мл.
[00301] Трехнедельные растения кукурузы на стадии V5 выращивали при идеальном освещении, используя лампы T5, 54 Вт, и 13-часовой световой экспозиции в день, при контролируемых температурных условиях в пределах 15,5-25,5°С. Растения поливали до насыщения каждые три дня в течение всего испытания. Когда растения достигали стадии V5, ВЭВ споры или положительные контрольные химикаты распыляли на листья либо 1×105 ВЭВ спор/мл, либо в рекомендуемых дозах для химических реагентов. Для каждого индивидуального растения применяли 1 мл расплытеля. Высоту растений измеряли непосредственно перед нанесением листовых распылителей. Затем растения кукурузы подвергали тепловому стрессу при 32,2°С и уменьшали полив до одного раза в неделю. Растения содержали в стрессовых условиях в течение двух недель. По окончанию двух недель снова измеряли высоту растений и регистрировали внешние проявления. В этих стрессовых условиях рост растений при контрольных обработках был минимальным. Способность расти в стрессовых условиях оценивали по увеличению высоты растения в течение двухнедельного промежутка по сравнению с контролем, обработанным только водой. Результаты показаны ниже в таблице 30.
Таблица 30.
[00302] Несколько противострессовых ферментов применяли для кукурузы, используя систему ВЭВ, как показано ранее в таблице 30. Контольные споры не оказали существенного влияния (снижение высоты растений -1,6%). ВЭВ фермент хитозиназа оказал положительное влияние в сочетании со своим субстратом хитозаном. Двумя наиболее показательными ферментами были ВЭВ β-1,3-глюканаза и ВЭВ супероксиддисмутаза. ВЭВ β-1,3-глюканаза обладает, в первую очередь, противогрибковой активностью, но также может непосредственно влиять на растения. Салициловая кислота и БТД служили положительными контролями анализа листьев и положительные ответы были отмечены для обоих. Этот способ переноса на листья может быть использован для доставки противострессовых ферментов растениям в разное сезонное время.
Пример 39. Уровни экспрессии гибридных белков с использованием различных промоторов, содержащих сигма-К.
[00303] Как показано ранее в примере 23, замена нативного промотора сигнальной последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория может существенно повлиять на уровень гибридного белка, экспрессируемого на экзоспории споры семейства Bacillus cereus. Например, замена нативного промотора BclA на промотор BclB значительно снижает уровень гибридного белка на поверхности спор члена семейства Bacillus cereus. В альтернативном варианте замена нативного промотор BclB на промотор BclA существенно повышает уровни гибридного белка на экзоспории.
[00304] Относительные уровни экспрессионной активности промотора для различных белков экзоспория под контролем нативных промоторов споруляции были получены по данным микрочипов из Bergman et al., 2008. Относительные уровни экспрессии определяли во время поздней стадии споруляции (300 минут после начала эксперимента), когда сигма K промоторы наиболее активны. Сигма K промоторы являются основными промоторами при экспрессии генов локализации в экзоспории и ассоциированных белков. Относительная экспрессия представляет собой увеличение уровня экспрессии гена по сравнению со средним показателем всех других генов хромосомы на всех заданных временных точках. Таблица 31 ниже показывает относительные уровни экспрессии различных генов под контролем сигма К у членов семейства Bacillus cereus.
Таблица 31.
[00305] В свете вышеизложенного, будет видно, что достигнуто несколько объектов изобретения и достигнуты другие полезные результаты.
[00306] Поскольку различные изменения могут быть произведены в указанных ранее гибридных белках, членах семейства Bacillus cereus, препаратах и способах, без отклонения от объема изобретения, поразумевается, что весь материал, содержащийся в приведенном ранее описании и проиллюстрированный в прилагаемых графических материалах, должен быть интерпретирован в иллюстративном, а не в ограничивающем смысле.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Spogen Biotech Inc.
Thompson, Brian
Thompson, Katie
<120> ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ,
ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ И ИММОБИЛЛИЗАЦИИ СПОР BACILLUS НА РАСТЕНИЯХ
<130> ELEN 3004.WO
<150> США 61/799262
<151> 2013-03-15
<160> 124
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 1
Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro
20 25 30
Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly
35 40
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 2
Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro
20 25 30
Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Phe Thr Thr
35 40 45
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly
50 55 60
Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro
65 70 75 80
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr
85 90 95
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Phe Thr Pro Thr Gly Pro
100 105 110
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr
115 120 125
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
130 135 140
Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
145 150 155 160
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly
165 170 175
Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
180 185 190
Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ala Gly Leu Tyr Ala Phe Asn Ser Gly Gly
195 200 205
Ile Ser Leu Asp Leu Gly Ile Asn Asp Pro Val Pro Phe Asn Thr Val
210 215 220
Gly Ser Gln Phe Phe Thr Gly Thr Ala Ile Ser Gln Leu Asp Ala Asp
225 230 235 240
Thr Phe Val Ile Ser Glu Thr Gly Phe Tyr Lys Ile Thr Val Ile Ala
245 250 255
Asn Thr Ala Thr Ala Ser Val Leu Gly Gly Leu Thr Ile Gln Val Asn
260 265 270
Gly Val Pro Val Pro Gly Thr Gly Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gly Ala
275 280 285
Pro Phe Thr Ile Val Ile Gln Ala Ile Thr Gln Ile Thr Thr Thr Pro
290 295 300
Ser Leu Val Glu Val Ile Val Thr Gly Leu Gly Leu Ser Leu Ala Leu
305 310 315 320
Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ile Ile Glu Lys Val Ala
325 330
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 3
Met Ser Glu Lys Tyr Ile Ile Leu His Gly Thr Ala Leu Glu Pro Asn
1 5 10 15
Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Asn
20 25 30
Gly
<210> 4
<211> 209
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 4
Met Ser Glu Lys Tyr Ile Ile Leu His Gly Thr Ala Leu Glu Pro Asn
1 5 10 15
Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Asn
20 25 30
Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Phe Thr Gly
35 40 45
Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ile Gly
50 55 60
Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Ile Leu Pro Val Phe
65 70 75 80
Gly Thr Ile Thr Thr Asp Val Gly Ile Gly Phe Ser Val Ile Val Asn
85 90 95
Thr Asn Ile Asn Phe Thr Leu Pro Gly Pro Val Ser Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Asn Pro Val Asp Asn Ser Ile Ile Ile Asn Thr Thr Gly Val Tyr Ser
115 120 125
Val Ser Phe Ser Ile Val Phe Val Ile Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile
130 135 140
Leu Asn Leu Thr Ile Asn Asp Ser Ile Gln Phe Ala Ile Glu Ser Arg
145 150 155 160
Ile Gly Gly Gly Pro Gly Val Arg Ala Thr Ser Ala Arg Thr Asp Leu
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Gln Gly Asp Val Leu Arg Val Arg Ile Arg Glu Ala
180 185 190
Thr Gly Asp Ile Ile Tyr Ser Asn Ala Ser Leu Val Val Ser Lys Val
195 200 205
Asp
<210> 5
<211> 44
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 5
Met Val Lys Val Val Glu Gly Asn Gly Gly Lys Ser Lys Ile Lys Ser
1 5 10 15
Pro Leu Asn Ser Asn Phe Lys Ile Leu Ser Asp Leu Val Gly Pro Thr
20 25 30
Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Met Thr Gly Ile Thr
35 40
<210> 6
<211> 647
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 6
Val Val Lys Val Val Glu Gly Asn Gly Gly Lys Ser Lys Ile Lys Ser
1 5 10 15
Pro Leu Asn Ser Asn Phe Lys Ile Leu Ser Asp Leu Val Gly Pro Thr
20 25 30
Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Met Thr Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly
35 40 45
Ala Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ser
50 55 60
Ala Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Gly Thr
65 70 75 80
Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly
85 90 95
Val Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser
100 105 110
Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Gly Thr
115 120 125
Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly
130 135 140
Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Asn
145 150 155 160
Thr Gly Ser Ile Gly Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ser Met Gly Pro Thr
165 170 175
Gly Glu Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Gly Thr Gly Ser Thr Gly
180 185 190
Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser
195 200 205
Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr
210 215 220
Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly
225 230 235 240
Val Thr Gly Asn Met Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn
245 250 255
Thr Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Pro Met
260 265 270
Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly
275 280 285
Glu Thr Gly Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn
290 295 300
Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr
305 310 315 320
Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly
325 330 335
Ala Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Gly Thr Gly Ser
340 345 350
Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr
355 360 365
Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly
370 375 380
Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Glu
385 390 395 400
Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Val Thr
405 410 415
Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly
420 425 430
Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr
450 455 460
Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly
465 470 475 480
Ala Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Asn
485 490 495
Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Ser
500 505 510
Thr Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Val Ile
515 520 525
Ser Val Leu Leu Gly Gly Thr Asn Ile Pro Leu Pro Asn Asn Gln Asn
530 535 540
Ile Gly Pro Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Asn Thr Val Phe Thr Val
545 550 555 560
Ala Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Leu Thr Ala
565 570 575
Gly Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Thr Val Asn Gly Ser Pro Leu Ala
580 585 590
Gly Thr Ile Asn Ser Pro Thr Val Ala Thr Gly Ser Phe Ser Ala Thr
595 600 605
Ile Ile Ala Ser Leu Pro Ala Gly Ala Ala Val Ser Leu Gln Leu Phe
610 615 620
Gly Val Val Ala Leu Ala Thr Leu Ser Thr Ala Thr Pro Gly Ala Thr
625 630 635 640
Leu Thr Ile Ile Arg Leu Ser
645
<210> 7
<211> 34
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 7
Met Lys Gln Asn Asp Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Ile Gly Pro
1 5 10 15
Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Val Leu Pro Pro Ile His Ile Pro
20 25 30
Thr Gly
<210> 8
<211> 366
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 8
Met Lys Gln Asn Asp Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Ile Gly Pro
1 5 10 15
Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Val Leu Pro Pro Ile His Ile Pro
20 25 30
Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr
35 40 45
Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly
50 55 60
Val Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ile
65 70 75 80
Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr
85 90 95
Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly
100 105 110
Pro Ala Gly Ile Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr
130 135 140
Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Ala Gly
145 150 155 160
Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala
165 170 175
Thr Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr
180 185 190
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ala Ile Ile Pro
195 200 205
Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ala Leu Leu Val Asn Ala Val Leu Ala
210 215 220
Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe Gly Phe Ser Gln Pro Gly Ile Ala
225 230 235 240
Pro Gly Val Gly Gly Thr Leu Thr Ile Leu Pro Gly Val Val Gly Asp
245 250 255
Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Asp Gly Ile Ile Thr Ser Leu Ala Gly
260 265 270
Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ala Pro Leu Thr Pro Val Gln Ile
275 280 285
Gln Met Gln Ile Phe Ile Ala Pro Ala Ala Ser Asn Thr Phe Thr Pro
290 295 300
Val Ala Pro Pro Leu Leu Leu Thr Pro Ala Leu Pro Ala Ile Ala Ile
305 310 315 320
Gly Thr Thr Ala Thr Gly Ile Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Val Ala
325 330 335
Gly Asp Lys Ile Leu Val Tyr Val Ser Leu Thr Gly Ala Ser Pro Ile
340 345 350
Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala Gly Leu Asn Ile Val
355 360 365
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 9
Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Val Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Arg Thr Gly
20 25 30
<210> 10
<211> 77
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 10
Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Val Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Arg Thr Gly Pro Thr
20 25 30
Gly Ser Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ile Gly Asn Thr Glu Pro Tyr Trp
35 40 45
His Thr Gly Pro Pro Gly Ile Val Leu Leu Thr Tyr Asp Phe Lys Ser
50 55 60
Leu Ile Ile Ser Phe Ala Phe Arg Ile Leu Pro Ile Ser
65 70 75
<210> 11
<211> 39
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 11
Met Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly
35
<210> 12
<211> 299
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 12
Met Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly
35 40 45
Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr
65 70 75 80
Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly
85 90 95
Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro
100 105 110
Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Glu Thr
115 120 125
Gly Pro Thr Gly Gly Thr Glu Gly Cys Leu Cys Asp Cys Cys Val Leu
130 135 140
Pro Met Gln Ser Val Leu Gln Gln Leu Ile Gly Glu Thr Val Ile Leu
145 150 155 160
Gly Thr Ile Ala Asp Thr Pro Asn Thr Pro Pro Leu Phe Phe Leu Phe
165 170 175
Thr Ile Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr Val Thr Asp Gly Thr
180 185 190
Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Thr Gly Val Gly Phe Leu
195 200 205
Pro Pro Gly Pro Pro Ile Thr Leu Leu Pro Pro Thr Asp Val Gly Cys
210 215 220
Glu Cys Glu Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Gln Leu Leu Asp Ala Phe
225 230 235 240
Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn Gly Ser Ile Ala Ala
245 250 255
Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile Val Leu Gly Thr Leu
260 265 270
Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr Val Arg Phe Ala Ile Ser Thr Cys Lys
275 280 285
Ile Thr Ala Val Asn Ile Thr Pro Ile Thr Met
290 295
<210> 13
<211> 39
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 13
Met Phe Asp Lys Asn Glu Met Lys Lys Thr Asn Glu Val Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly
35
<210> 14
<211> 289
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 14
Met Phe Asp Lys Asn Glu Met Lys Lys Thr Asn Glu Val Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly
35 40 45
Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr
65 70 75 80
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly
85 90 95
Pro Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Gln Thr Gly Ser Thr Gly Pro
100 105 110
Thr Gly Ala Thr Glu Gly Cys Leu Cys Asp Cys Cys Val Phe Pro Met
115 120 125
Gln Glu Val Leu Arg Gln Leu Val Gly Gln Thr Val Ile Leu Ala Thr
130 135 140
Ile Ala Asp Ala Pro Asn Val Ala Pro Arg Phe Phe Leu Phe Asn Ile
145 150 155 160
Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr Val Thr Asp Pro Val Ser Asn
165 170 175
Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Ile Gly Val Gly Phe Ser
180 185 190
Leu Thr Val Pro Pro Leu Thr Leu Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gly Cys
195 200 205
Glu Cys Asp Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Glu Leu Leu Asp Thr Leu
210 215 220
Ile Gly Ser Thr Val Asn Leu Leu Val Ser Asn Gly Ser Ile Ala Thr
225 230 235 240
Gly Phe Asn Val Glu Gln Thr Ala Leu Gly Ile Val Ile Gly Thr Leu
245 250 255
Pro Ile Pro Ile Asn Pro Pro Pro Pro Thr Leu Phe Arg Phe Ala Ile
260 265 270
Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asp Ile Thr Pro Thr Pro Thr Ala
275 280 285
Thr
<210> 15
<211> 49
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 15
Met Ser Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Met Ser Arg Lys Asp
1 5 10 15
Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Ser Ile Ser Pro Asp
20 25 30
Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr
35 40 45
Gly
<210> 16
<211> 189
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 16
Met Ser Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Met Ser Arg Lys Asp
1 5 10 15
Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Ser Ile Ser Pro Asp
20 25 30
Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr
35 40 45
Gly Ile Thr Gly Pro Thr Phe Asn Ile Asn Phe Arg Ala Glu Lys Asn
50 55 60
Val Ala Gln Ser Phe Thr Pro Pro Ala Asp Ile Gln Val Ser Tyr Gly
65 70 75 80
Asn Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Val Thr Asn Thr
85 90 95
Phe Thr Ala Pro Ile Asn Gly Ile Tyr Leu Phe Ser Ala Ser Ile Gly
100 105 110
Phe Asn Pro Thr Leu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Arg Ile Thr Ile Arg
115 120 125
Lys Asn Leu Val Ser Val Ala Ser Gln Thr Gly Thr Ile Thr Thr Gly
130 135 140
Gly Thr Pro Gln Leu Glu Ile Thr Thr Ile Ile Asp Leu Leu Ala Ser
145 150 155 160
Gln Thr Ile Asp Ile Gln Phe Ser Ala Ala Glu Ser Gly Thr Leu Thr
165 170 175
Val Gly Ser Ser Asn Phe Phe Ser Gly Ala Leu Leu Pro
180 185
<210> 17
<211> 33
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 17
Met Asn Glu Glu Tyr Ser Ile Leu His Gly Pro Ala Leu Glu Pro Asn
1 5 10 15
Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Thr
20 25 30
Gly
<210> 18
<211> 84
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 18
Met Asn Glu Glu Tyr Ser Ile Leu His Gly Pro Ala Leu Glu Pro Asn
1 5 10 15
Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Thr
20 25 30
Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Phe Thr Gly
35 40 45
Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ile Gly
50 55 60
Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ile Gly Ile Thr
65 70 75 80
Gly Pro Thr Gly
<210> 19
<211> 39
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 19
Met Lys Asn Arg Asp Asn Asn Arg Lys Gln Asn Ser Leu Ser Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly
35
<210> 20
<211> 1056
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 20
Met Lys Asn Arg Asp Asn Asn Arg Lys Gln Asn Ser Leu Ser Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly
35 40 45
Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Leu Gln Gly Pro Met Gly Glu
50 55 60
Met Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ser Val
65 70 75 80
Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Gln Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Val
100 105 110
Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln
115 120 125
Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly
130 135 140
Pro Glu Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala
145 150 155 160
Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Thr Pro
165 170 175
Gly Pro Ser Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr
195 200 205
Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr
210 215 220
Gly Pro Gly Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly
245 250 255
Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Ile
260 265 270
Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Ile Gln Gly Ile Pro Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Gln Gly
290 295 300
Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asp
305 310 315 320
Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Ile Gly Pro Gln Gly Val Thr
325 330 335
Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly
340 345 350
Pro Ser Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro
355 360 365
Met Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Glu Gly Leu Gln
370 375 380
Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Val Gly Ala Thr Gly
385 390 395 400
Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val Gly Ala
405 410 415
Thr Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln
420 425 430
Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Ala Thr Gly Ile Gln Gly
435 440 445
Ile Gln Gly Glu Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Val
450 455 460
Gln Gly Ala Gln Gly Ala Ile Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Gln
465 470 475 480
Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly
485 490 495
Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala
500 505 510
Thr Gly Asp Met Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Gly Thr Thr Gly
515 520 525
Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly
530 535 540
Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Val
545 550 555 560
Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala
565 570 575
Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr
580 585 590
Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Leu Gln Gly
595 600 605
Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Pro
610 615 620
Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Thr Gly Ala Thr
625 630 635 640
Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Asp Ile Gly
645 650 655
Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Ile
660 665 670
Gln Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln
675 680 685
Gly Pro Gln Gly Asp Ile Gly Leu Thr Gly Ser Gln Gly Pro Thr Gly
690 695 700
Ile Gln Gly Ile Gln Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro
705 710 715 720
Glu Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val
725 730 735
Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly
740 745 750
Val Gln Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile
755 760 765
Gln Gly Val Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Ala Thr
770 775 780
Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Glu Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly
785 790 795 800
Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ala Ile Gly Pro Thr Gly Pro
805 810 815
Met Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr
820 825 830
Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly
835 840 845
Pro Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu
850 855 860
Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly
865 870 875 880
Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly
885 890 895
Pro Ala Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly
900 905 910
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr Gly Ser
915 920 925
Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr
930 935 940
Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Glu Ile Gly
945 950 955 960
Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val
965 970 975
Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln
980 985 990
Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly
995 1000 1005
Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly
1010 1015 1020
Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly
1025 1030 1035
Pro Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly
1040 1045 1050
Pro Thr Gly
1055
<210> 21
<211> 39
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 21
Met Ser Asp Lys His Gln Met Lys Lys Ile Ser Glu Val Leu Gln Ala
1 5 10 15
His Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Pro Leu Pro Pro Ile Thr
20 25 30
Pro Phe Thr Phe Pro Thr Gly
35
<210> 22
<211> 365
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 22
Met Ser Asp Lys His Gln Met Lys Lys Ile Ser Glu Val Leu Gln Ala
1 5 10 15
His Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Pro Leu Pro Pro Ile Thr
20 25 30
Pro Phe Thr Phe Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly
35 40 45
Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Pro Pro Val Gly Thr Asn Leu Asp Thr Ile Tyr Val Thr Asn
65 70 75 80
Asp Ile Ser Asn Asn Val Ser Ala Ile Asp Gly Asn Thr Asn Thr Val
85 90 95
Leu Thr Thr Ile Pro Val Gly Thr Asn Pro Val Gly Val Gly Val Asn
100 105 110
Ser Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val Val Asn Asn Gly Ser Asp Asn Ile
115 120 125
Ser Val Ile Asn Gly Ser Thr Asn Thr Val Val Ala Thr Ile Pro Val
130 135 140
Gly Thr Gln Pro Phe Gly Val Gly Val Asn Pro Ser Thr Asn Leu Ile
145 150 155 160
Tyr Val Ala Asn Arg Thr Ser Asn Asn Val Ser Val Ile Lys Gly Gly
165 170 175
Thr Asn Thr Val Leu Thr Thr Ile Pro Val Gly Thr Asn Pro Val Gly
180 185 190
Val Gly Val Asn Ser Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val Thr Asn Glu Ile
195 200 205
Pro Asn Ser Val Ser Val Ile Lys Gly Gly Thr Asn Thr Val Val Ala
210 215 220
Thr Ile Pro Val Gly Leu Phe Pro Phe Gly Val Gly Val Asn Ser Leu
225 230 235 240
Thr Asn Leu Ile Tyr Val Val Asn Asn Ser Pro His Asn Val Ser Val
245 250 255
Ile Asp Gly Asn Thr Asn Thr Val Leu Thr Thr Ile Ser Val Gly Thr
260 265 270
Ser Pro Val Gly Val Gly Val Asn Leu Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val
275 280 285
Ala Asn Glu Val Pro Asn Asn Ile Ser Val Ile Asn Gly Asn Thr Asn
290 295 300
Thr Val Leu Thr Thr Ile Pro Val Gly Thr Thr Pro Phe Glu Val Gly
305 310 315 320
Val Asn Ser Ser Thr Asn Leu Ile Tyr Val Ser Asn Leu Asn Ser Asn
325 330 335
Asn Val Ser Val Ile Asn Gly Ser Ala Asn Thr Val Ile Ala Thr Val
340 345 350
Pro Val Gly Ser Val Pro Arg Gly Ile Gly Val Lys Pro
355 360 365
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 23
Met Asp Glu Phe Leu Ser Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Val Pro Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly
20 25 30
<210> 24
<211> 160
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 24
Met Asp Glu Phe Leu Ser Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Val Pro Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly Pro Thr
20 25 30
Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly
35 40 45
Pro Thr Gly Phe Asn Leu Pro Ala Gly Pro Ala Ser Ile Thr Leu Thr
50 55 60
Ser Asn Glu Thr Thr Ala Cys Val Ser Thr Gln Gly Asn Asn Thr Leu
65 70 75 80
Phe Phe Ser Gly Gln Val Leu Val Asn Gly Ser Pro Thr Pro Gly Val
85 90 95
Val Val Ser Phe Ser Phe Ser Asn Pro Ser Leu Ala Phe Met Val Pro
100 105 110
Leu Ala Val Ile Thr Asn Ala Ser Gly Asn Phe Thr Ala Val Phe Leu
115 120 125
Ala Ala Asn Gly Pro Gly Thr Val Thr Val Thr Ala Ser Leu Leu Asp
130 135 140
Ser Pro Gly Thr Met Ala Ser Val Thr Ile Thr Ile Val Asn Cys Pro
145 150 155 160
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 25
Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Thr Ala Leu Asn Pro Cys Ser Ile Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly
20 25 30
<210> 26
<211> 69
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 26
Met Asp Glu Phe Leu Ser Ser Thr Ala Leu Asn Pro Cys Ser Ile Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly Pro Thr
20 25 30
Gly Ser Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Ser Ile Gly Pro Thr Gly
35 40 45
Asn Thr Gly Leu Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Asp Thr Gly
65
<210> 27
<211> 36
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 27
Met Lys Glu Arg Asp Arg Gln Asn Ser Leu Asn Ser Asn Phe Arg Ile
1 5 10 15
Ser Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe
20 25 30
Thr Gly Ile Gly
35
<210> 28
<211> 934
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 28
Met Lys Glu Arg Asp Arg Gln Asn Ser Leu Asn Ser Asn Phe Arg Ile
1 5 10 15
Ser Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe
20 25 30
Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly
35 40 45
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu Met Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala Gly Gln Met
65 70 75 80
Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Gln Gly Leu Arg Gly
85 90 95
Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Leu
100 105 110
Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Ile Gln
115 120 125
Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly
130 135 140
Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Val Pro Gly Ala Thr Gly Ser
145 150 155 160
Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Pro Ser
165 170 175
Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Gln Gly Ile Ser Gly Pro
180 185 190
Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro
195 200 205
Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Gly Pro
210 215 220
Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Ala Gly Val Thr Gly Asn Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Glu Thr Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Pro
260 265 270
Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Pro
275 280 285
Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly
290 295 300
Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile
305 310 315 320
Gln Gly Ala Ile Gly Pro Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln
325 330 335
Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
340 345 350
Ser Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Met Gly Asp Ile Gly Pro
355 360 365
Thr Gly Pro Glu Gly Pro Glu Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln
370 375 380
Gly Val Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly
385 390 395 400
Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Val Thr Gly Pro Glu Gly Pro
405 410 415
Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr
420 425 430
Gly Ala Gln Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Asn Ile Gly
435 440 445
Ala Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Thr Gln Gly Asp
450 455 460
Ile Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln
465 470 475 480
Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Gln Gly Val Gln Gly Pro Gln Gly
485 490 495
Ile Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Asp Thr Gly Thr
500 505 510
Thr Gly Ala Thr Gly Glu Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly
515 520 525
Pro Ser Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly
530 535 540
Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Pro Ser Gly Gly
545 550 555 560
Pro Pro Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Gly Val Gly Asp
565 570 575
Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr
580 585 590
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly
595 600 605
Val Gln Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro
610 615 620
Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro Gln
625 630 635 640
Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly
645 650 655
Ile Gln Gly Gly Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ala
660 665 670
Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln
675 680 685
Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly
690 695 700
Glu Ile Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Leu Gln Gly Pro
705 710 715 720
Gln Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Gln
725 730 735
Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly
740 745 750
Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Ile
755 760 765
Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr
770 775 780
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Val Ser Thr
785 790 795 800
Thr Ala Thr Tyr Ser Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Ala Ile Ser
805 810 815
Val Leu Leu Gly Gly Thr Asn Ile Pro Leu Pro Asn Asn Gln Asn Ile
820 825 830
Gly Pro Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Asn Thr Val Phe Thr Val Thr
835 840 845
Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Ile Thr Ala Ala
850 855 860
Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Thr Val Asn Gly Ser Pro Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Asn Ser Pro Ala Val Ala Thr Gly Ser Phe Asn Ala Thr Ile
885 890 895
Ile Ser Asn Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Leu Gln Leu Phe Gly
900 905 910
Leu Leu Ala Val Ala Thr Leu Ser Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Leu
915 920 925
Thr Ile Ile Arg Leu Ser
930
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 29
Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly
35
<210> 30
<211> 287
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 30
Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
20 25 30
Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Gly Pro Thr Gly
35 40 45
Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr
65 70 75 80
Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly
85 90 95
Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro
100 105 110
Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Glu Gly Cys Leu Cys Asp
115 120 125
Cys Cys Val Leu Pro Met Gln Ser Val Leu Gln Gln Leu Ile Gly Glu
130 135 140
Thr Val Ile Leu Gly Thr Ile Ala Asp Thr Pro Asn Thr Pro Pro Leu
145 150 155 160
Phe Phe Leu Phe Thr Ile Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr Val
165 170 175
Thr Asp Gly Thr Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Thr Gly
180 185 190
Val Gly Phe Leu Pro Pro Gly Pro Pro Ile Thr Leu Leu Pro Pro Thr
195 200 205
Asp Val Gly Cys Glu Cys Glu Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Gln Leu
210 215 220
Leu Asp Ala Phe Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn Gly
225 230 235 240
Ser Ile Ala Ala Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile Val
245 250 255
Leu Gly Thr Leu Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr Val Arg Phe Ala Ile
260 265 270
Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asn Ile Thr Pro Ile Thr Met
275 280 285
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 31
Met Asp Glu Phe Leu Tyr Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Val Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly
20 25 30
<210> 32
<211> 190
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 32
Met Asp Glu Phe Leu Tyr Phe Ala Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Val Gln Pro Phe Gln Phe Pro Thr Gly Pro Thr
20 25 30
Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly
35 40 45
Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr
65 70 75 80
Gly Phe Asn Leu Pro Ala Gly Pro Ala Ser Ile Thr Leu Thr Ser Asn
85 90 95
Glu Thr Thr Ala Cys Val Ser Thr Gln Gly Asn Asn Thr Leu Phe Phe
100 105 110
Ser Gly Gln Val Leu Val Asn Gly Ser Pro Thr Pro Gly Val Val Val
115 120 125
Ser Phe Ser Phe Ser Asn Pro Ser Leu Ala Phe Met Val Pro Leu Ala
130 135 140
Val Ile Thr Asn Ala Ser Gly Asn Phe Thr Ala Val Phe Leu Ala Ala
145 150 155 160
Asn Gly Pro Gly Thr Val Thr Val Thr Ala Ser Leu Leu Asp Ser Pro
165 170 175
Gly Thr Met Ala Ser Val Thr Ile Thr Ile Val Asn Cys Pro
180 185 190
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 33
Met Asp Ser Lys Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Leu Pro Ser Ile
1 5 10 15
Asn Phe Pro Thr Gly
20
<210> 34
<211> 335
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 34
Met Asp Ser Lys Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Leu Pro Ser Ile
1 5 10 15
Asn Phe Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr
20 25 30
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly
35 40 45
Glu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Glu
50 55 60
Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr
65 70 75 80
Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly
85 90 95
Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Glu Thr Gly Ala
100 105 110
Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Glu Thr Gly Ile Thr Gly Val Thr
115 120 125
Gly Pro Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly
130 135 140
Ala Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Ala Gly Ala
145 150 155 160
Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Gly Ala Ile Gly Ala Ile Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly
180 185 190
Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ile
195 200 205
Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr
210 215 220
Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ile Thr Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Pro Gly Thr Ile Pro Thr Thr Asn Leu
245 250 255
Leu Tyr Phe Thr Phe Ser Asp Gly Glu Lys Leu Ile Tyr Thr Asn Ala
260 265 270
Asp Gly Ile Ala Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Ile Leu Ser Pro Ser Glu
275 280 285
Val Ser Tyr Ile Asn Leu Phe Ile Asn Gly Ile Leu Gln Pro Gln Pro
290 295 300
Phe Tyr Glu Val Thr Ala Gly Gln Leu Thr Leu Leu Asp Asp Glu Pro
305 310 315 320
Pro Ser Gln Gly Ser Ser Ile Ile Leu Gln Phe Ile Ile Ile Asn
325 330 335
<210> 35
<211> 22
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 35
Met Ile Gly Pro Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Ile Tyr Ile Pro Thr Gly
20
<210> 36
<211> 234
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 36
Met Ile Gly Pro Glu Asn Ile Gly Pro Thr Phe Pro Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Ile Tyr Ile Pro Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ala
20 25 30
Thr Gly Glu Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr
35 40 45
Gly Ala Thr Gly Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly
50 55 60
Glu Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Thr Gly Glu Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Glu Thr
85 90 95
Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Ile Thr Gly Leu Thr Gly
100 105 110
Val Thr Gly Leu Thr Gly Glu Thr Gly Pro Ile Gly Ile Thr Gly Pro
115 120 125
Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr
130 135 140
Gly Gly Ile Gly Pro Ile Thr Thr Thr Asn Leu Leu Tyr Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Ala Asp Gly Glu Lys Leu Ile Tyr Thr Asp Thr Asp Gly Ile Pro Gln
165 170 175
Tyr Gly Thr Thr Asn Ile Leu Ser Pro Ser Glu Val Ser Tyr Ile Asn
180 185 190
Leu Phe Val Asn Gly Ile Leu Gln Pro Gln Pro Leu Tyr Glu Val Ser
195 200 205
Thr Gly Lys Leu Thr Leu Leu Asp Thr Gln Pro Pro Ser Gln Gly Ser
210 215 220
Ser Ile Ile Leu Gln Phe Ile Ile Ile Asn
225 230
<210> 37
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 37
ggatccatgg ctgaacacaa tcc
23
<210> 38
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 38
ggatccttaa ttcgtattct ggcc
24
<210> 39
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 39
ggatccatga aacggtcaat c
21
<210> 40
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 40
ggatccttac taatttggtt ctgt
24
<210> 41
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 41
ggatccatgc taccaaaagc c
21
<210> 42
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 42
ggatccttag tccgcaggcg tagc
24
<210> 43
<211> 35
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 43
Met Ser Asn Asn Asn Ile Pro Ser Pro Phe Phe Phe Asn Asn Phe Asn
1 5 10 15
Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Pro Leu Thr Leu
20 25 30
Pro Thr Gly
35
<210> 44
<211> 222
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 44
Met Ser Asn Asn Asn Ile Pro Ser Pro Phe Phe Phe Asn Asn Phe Asn
1 5 10 15
Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Pro Leu Thr Leu
20 25 30
Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro
35 40 45
Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr
50 55 60
Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly
65 70 75 80
Thr Phe Ser Ser Ala Asn Ala Ser Ile Val Thr Pro Ala Pro Gln Thr
85 90 95
Val Asn Asn Leu Ala Pro Ile Gln Phe Thr Ala Pro Val Leu Ile Ser
100 105 110
Lys Asn Val Thr Phe Asn Gly Ile Asp Thr Phe Thr Ile Gln Ile Pro
115 120 125
Gly Asn Tyr Phe Phe Ile Gly Ala Val Met Thr Ser Asn Asn Gln Ala
130 135 140
Gly Pro Val Ala Val Gly Val Gly Phe Asn Gly Ile Pro Val Pro Ser
145 150 155 160
Leu Asp Gly Ala Asn Tyr Gly Thr Pro Thr Gly Gln Glu Val Val Cys
165 170 175
Phe Gly Phe Ser Gly Gln Ile Pro Ala Gly Thr Thr Ile Asn Leu Tyr
180 185 190
Asn Ile Ser Asp Lys Thr Ile Ser Ile Gly Gly Ala Thr Ala Ala Gly
195 200 205
Ser Ser Ile Val Ala Ala Arg Leu Ser Phe Phe Arg Ile Ser
210 215 220
<210> 45
<211> 41
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 45
Met Phe Ser Glu Lys Lys Arg Lys Asp Leu Ile Pro Asp Asn Phe Leu
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro
20 25 30
Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr Gly
35 40
<210> 46
<211> 293
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 46
Met Phe Ser Glu Lys Lys Arg Lys Asp Leu Ile Pro Asp Asn Phe Leu
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro
20 25 30
Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Pro
35 40 45
Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Ala Thr Ile Cys Ile Arg
50 55 60
Thr Asp Pro Asp Asn Gly Cys Ser Val Ala Glu Gly Ser Gly Thr Val
65 70 75 80
Ala Ser Gly Phe Ala Ser His Ala Glu Ala Cys Asn Thr Gln Ala Ile
85 90 95
Gly Asp Cys Ser His Ala Glu Gly Gln Phe Ala Thr Ala Ser Gly Thr
100 105 110
Ala Ser His Ala Glu Gly Phe Gln Thr Thr Ala Ser Gly Phe Ala Ser
115 120 125
His Thr Glu Gly Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Asn Phe Ser His Thr
130 135 140
Glu Gly Ile Asn Thr Ile Val Asp Val Leu His Pro Gly Ser His Ile
145 150 155 160
Met Gly Lys Asn Gly Thr Thr Arg Ser Ser Phe Ser Trp His Leu Ala
165 170 175
Asn Gly Leu Ala Val Gly Pro Ser Leu Asn Ser Ala Val Ile Glu Gly
180 185 190
Val Thr Gly Asn Leu Tyr Leu Asp Gly Val Val Ile Ser Pro Asn Ala
195 200 205
Ala Asp Tyr Ala Glu Met Phe Glu Thr Ile Asp Gly Asn Leu Ile Asp
210 215 220
Val Gly Tyr Phe Val Thr Leu Tyr Gly Glu Lys Ile Arg Lys Ala Asn
225 230 235 240
Ala Asn Asp Asp Tyr Ile Leu Gly Val Val Ser Ala Thr Pro Ala Met
245 250 255
Ile Ala Asp Ala Ser Asp Leu Arg Trp His Asn Leu Phe Val Arg Asp
260 265 270
Glu Trp Gly Arg Thr Gln Tyr His Glu Val Val Val Pro Glu Lys Lys
275 280 285
Met Ala Met Glu Glu
290
<210> 47
<211> 49
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 47
Met Thr Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Ile Ser Arg Arg Asp
1 5 10 15
Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Leu Ile Ser Pro Asp
20 25 30
Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr
35 40 45
Gly
<210> 48
<211> 83
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 48
Met Thr Arg Lys Asp Lys Phe Asn Arg Ser Arg Ile Ser Arg Arg Asp
1 5 10 15
Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile Leu Ile Ser Pro Asp
20 25 30
Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser Phe Thr Leu Pro Thr
35 40 45
Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly
50 55 60
Pro Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Ile
65 70 75 80
Thr Gly Pro
<210> 49
<211> 38
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 49
Met Ser Arg Lys Asp Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile
1 5 10 15
Ser Ile Ser Pro Asp Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser
20 25 30
Phe Thr Leu Pro Thr Gly
35
<210> 50
<211> 163
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 50
Met Ser Arg Lys Asp Arg Phe Asn Ser Pro Lys Ile Lys Ser Glu Ile
1 5 10 15
Ser Ile Ser Pro Asp Leu Val Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro Ser
20 25 30
Phe Thr Leu Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Pro
35 40 45
Thr Gly Asp Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Asn Ile Asn Phe Arg
50 55 60
Ala Glu Lys Asn Gly Ala Gln Ser Phe Thr Pro Pro Ala Asp Ile Gln
65 70 75 80
Val Ser Tyr Gly Asn Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gly Gly Tyr Ser Ser
85 90 95
Val Thr Asn Thr Phe Thr Ala Pro Ile Asn Gly Ile Tyr Leu Phe Ser
100 105 110
Ala Asn Ile Gly Phe Asn Pro Thr Leu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Arg
115 120 125
Ile Thr Ile Arg Lys Asn Leu Val Ser Val Ala Ser Gln Thr Ile Asp
130 135 140
Ile Gln Phe Ser Ala Ala Glu Ser Gly Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asn Phe Phe
<210> 51
<211> 39
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 51
Met Lys Glu Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln His Ser Leu Asn Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly
35
<210> 52
<211> 323
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 52
Met Lys Glu Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln His Ser Leu Asn Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Ile Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly
35 40 45
Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu
50 55 60
Met Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala
65 70 75 80
Gly Gln Met Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Glu Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Pro Val Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gln Gly Val
100 105 110
Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln
115 120 125
Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly
130 135 140
Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala
145 150 155 160
Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Val Gln Gly Val Ile Gly Pro Gln
165 170 175
Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gln Gly Val
180 185 190
Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Pro Ser
195 200 205
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly
210 215 220
Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ser Thr Gly Asn Thr
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly
245 250 255
Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ile Gln Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Ile
260 265 270
Gln Gly Ile Gln Gly Pro Leu Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln
275 280 285
Gly Ile Gln Gly Ile Pro Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Glu Gln Gly
290 295 300
Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp
305 310 315 320
Gln Gly Thr
<210> 53
<211> 39
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 53
Met Arg Glu Arg Asp Asn Lys Arg Gln Gln His Ser Leu Asn Pro Asn
1 5 10 15
Phe Arg Ile Ser Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly
35
<210> 54
<211> 436
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 54
Met Arg Glu Arg Asp Asn Lys Arg Gln Gln His Ser Leu Asn Pro Asn
1 5 10 15
Phe Arg Ile Ser Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro
20 25 30
Thr Gly Phe Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly
35 40 45
Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu
50 55 60
Met Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val
65 70 75 80
Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Pro Gln Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Val
100 105 110
Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln
115 120 125
Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly
130 135 140
Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala
145 150 155 160
Thr Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln
165 170 175
Gly Pro Ser Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Gly Ile
180 185 190
Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ser
195 200 205
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly
210 215 220
Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Asn Thr Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Ile Gln Gly Ile
260 265 270
Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Ile Gln
275 280 285
Gly Ile Pro Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Glu Gln Gly Ile Gln Gly
290 295 300
Val Gln Gly Ile Gln Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Asp Gln Gly Pro
305 310 315 320
Gln Gly Ile Gln Gly Val Ile Gly Ala Gln Gly Val Thr Gly Ala Thr
325 330 335
Gly Asp Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Ser Gly
340 345 350
Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Met Gly Asp
355 360 365
Ile Gly Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Glu Gly Leu Gln Gly Pro Gln
370 375 380
Gly Ile Gln Gly Val Pro Gly Pro Val Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly
385 390 395 400
Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Ala Thr Gly Pro
405 410 415
Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Ile Thr
420 425 430
Gly Ala Thr Gly
435
<210> 55
<211> 36
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 55
Met Lys Asn Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln Gln Ser Asn Phe Arg Ile
1 5 10 15
Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe
20 25 30
Thr Gly Ile Gly
35
<210> 56
<211> 470
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 56
Met Lys Asn Arg Asp Asn Lys Gly Lys Gln Gln Ser Asn Phe Arg Ile
1 5 10 15
Pro Pro Glu Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Val Pro Thr Gly Phe
20 25 30
Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly
35 40 45
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Phe Gln Gly Pro Met Gly Glu Met Gly Pro
50 55 60
Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Val Gly Pro Ile
65 70 75 80
Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly Gln Gln Gly Ala Gln Gly Leu Arg Gly
85 90 95
Pro Gln Gly Glu Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Leu
100 105 110
Gln Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Ile Gln
115 120 125
Gly Ile Gln Gly Leu Gln Gly Pro Ile Gly Ala Thr Gly Pro Glu Gly
130 135 140
Pro Gln Gly Ile Gln Gly Val Gln Gly Leu Pro Gly Ala Thr Gly Pro
145 150 155 160
Gln Gly Ile Gln Gly Ala Gln Gly Ile Gln Gly Thr Gln Gly Pro Ser
165 170 175
Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gln Gly Leu Thr Gly Pro
180 185 190
Thr Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Ile Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro
195 200 205
Pro Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gly Gly Gly Pro
210 215 220
Ser Gly Ser Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Asp Thr Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Ser Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gln Gly Pro Gln Gly
245 250 255
Val Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala
260 265 270
Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr
275 280 285
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ser Gln Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly
290 295 300
Pro Thr Gly Ser Gln Gly Ile Gln Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala
305 310 315 320
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Ser Thr
325 330 335
Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Ala Asn Asn Thr Ser Gly Ser Ile Ile Ser
340 345 350
Val Leu Leu Gly Gly Thr Asn Ile Pro Leu Pro Asn Asn Gln Asn Ile
355 360 365
Gly Pro Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Asn Thr Val Phe Thr Val Ala
370 375 380
Asn Ala Gly Asn Tyr Tyr Ile Ala Tyr Thr Ile Asn Leu Thr Ala Gly
385 390 395 400
Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Thr Val Asn Gly Ser Pro Leu Ala Gly
405 410 415
Thr Ile Asn Ser Pro Ala Val Ala Ala Gly Ser Phe Ser Ala Thr Ile
420 425 430
Ile Ala Asn Leu Pro Ala Gly Ala Ala Val Ser Leu Gln Leu Phe Gly
435 440 445
Val Ile Ala Leu Ala Thr Leu Ser Thr Ala Thr Pro Gly Ala Thr Leu
450 455 460
Thr Ile Ile Arg Leu Ser
465 470
<210> 57
<211> 136
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 57
Met Lys Phe Ser Lys Lys Ser Thr Val Asp Ser Ser Ile Val Gly Lys
1 5 10 15
Arg Val Val Ser Lys Val Asn Ile Leu Arg Phe Tyr Asp Ala Arg Ser
20 25 30
Cys Gln Asp Lys Asp Val Asp Gly Phe Val Asp Val Gly Glu Leu Phe
35 40 45
Thr Ile Phe Arg Lys Leu Asn Met Glu Gly Ser Val Gln Phe Lys Ala
50 55 60
His Asn Ser Ile Gly Lys Thr Tyr Tyr Ile Thr Ile Asn Glu Val Tyr
65 70 75 80
Val Phe Val Thr Val Leu Leu Gln Tyr Ser Thr Leu Ile Gly Gly Ser
85 90 95
Tyr Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln
100 105 110
Ala Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile
115 120 125
Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly
130 135
<210> 58
<211> 384
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 58
Met Lys Phe Ser Lys Lys Ser Thr Val Asp Ser Ser Ile Val Gly Lys
1 5 10 15
Arg Val Val Ser Lys Val Asn Ile Leu Arg Phe Tyr Asp Ala Arg Ser
20 25 30
Cys Gln Asp Lys Asp Val Asp Gly Phe Val Asp Val Gly Glu Leu Phe
35 40 45
Thr Ile Phe Arg Lys Leu Asn Met Glu Gly Ser Val Gln Phe Lys Ala
50 55 60
His Asn Ser Ile Gly Lys Thr Tyr Tyr Ile Thr Ile Asn Glu Val Tyr
65 70 75 80
Val Phe Val Thr Val Leu Leu Gln Tyr Ser Thr Leu Ile Gly Gly Ser
85 90 95
Tyr Val Phe Asp Lys Asn Glu Ile Gln Lys Ile Asn Gly Ile Leu Gln
100 105 110
Ala Asn Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile
115 120 125
Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Gly Pro Thr
130 135 140
Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly
145 150 155 160
Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val
165 170 175
Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr
180 185 190
Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly
195 200 205
Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Gly Thr Glu Gly Cys Leu Cys
210 215 220
Asp Cys Cys Val Leu Pro Met Gln Ser Val Leu Gln Gln Leu Ile Gly
225 230 235 240
Glu Thr Val Ile Leu Gly Thr Ile Ala Asp Thr Pro Asn Thr Pro Pro
245 250 255
Leu Phe Phe Leu Phe Thr Ile Thr Ser Val Asn Asp Phe Leu Val Thr
260 265 270
Val Thr Asp Gly Thr Thr Thr Phe Val Val Asn Ile Ser Asp Val Thr
275 280 285
Gly Val Gly Phe Leu Pro Pro Gly Pro Pro Ile Thr Leu Leu Pro Pro
290 295 300
Thr Asp Val Gly Cys Glu Cys Glu Cys Arg Glu Arg Pro Ile Arg Gln
305 310 315 320
Leu Leu Asp Ala Phe Ile Gly Ser Thr Val Ser Leu Leu Ala Ser Asn
325 330 335
Gly Ser Ile Ala Ala Asp Phe Ser Val Glu Gln Thr Gly Leu Gly Ile
340 345 350
Val Leu Gly Thr Leu Pro Ile Asn Pro Thr Thr Thr Val Arg Phe Ala
355 360 365
Ile Ser Thr Cys Lys Ile Thr Ala Val Asn Ile Thr Pro Ile Thr Met
370 375 380
<210> 59
<211> 196
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 59
Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro
20 25 30
Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Phe Thr Thr
35 40 45
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly
50 55 60
Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro
65 70 75 80
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr
85 90 95
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Phe Thr Pro Thr Gly Pro
100 105 110
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr
115 120 125
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
130 135 140
Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
145 150 155 160
Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Phe Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly
165 170 175
Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro
180 185 190
Ser Gly Leu Gly
195
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 60
Met Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 61
Met Ala Leu Glu Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 62
Met Ala Leu Asn Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 63
Met Ala Leu Asp Pro Asn Ile Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 64
Met Ala Leu Glu Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Ile Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 65
Met Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Pro Leu Pro Pro Ile Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 66
Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Val Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 67
Met Ala Leu Asn Pro Cys Ser Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln
1 5 10 15
Pro
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 68
Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Val Gln
1 5 10 15
Pro
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 69
Met Ala Leu Asn Pro Gly Ser Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro Met Gln
1 5 10 15
Pro
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 70
Met Ala Leu Asp Pro Asn Leu Ile Gly Pro Thr Phe Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
Ser
<210> 71
<211> 799
<212> PRT
<213> Bacillus mycoides
<400> 71
Met Lys Arg Lys Thr Pro Phe Lys Val Phe Ser Ser Leu Ala Ile Thr
1 5 10 15
Thr Met Leu Gly Cys Thr Phe Ala Leu Gly Thr Ser Val Ala Tyr Ala
20 25 30
Glu Thr Thr Ser Gln Ser Lys Gly Ser Ile Ser Thr Thr Pro Ile Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Ile Gln Glu Glu Arg Leu Ala Glu Ala Leu Lys Glu Arg
50 55 60
Gly Thr Ile Asp Gln Ser Ala Ser Lys Glu Glu Thr Gln Lys Ala Val
65 70 75 80
Glu Gln Tyr Ile Glu Lys Lys Lys Gly Asp Gln Pro Asn Lys Glu Ile
85 90 95
Leu Pro Asp Asp Pro Ala Lys Glu Ala Ser Asp Phe Val Lys Lys Val
100 105 110
Lys Glu Lys Lys Met Glu Glu Lys Glu Lys Val Lys Lys Ser Val Glu
115 120 125
Asn Ala Ser Ser Glu Gln Thr Pro Ser Gln Asn Lys Lys Gln Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Val Pro Thr Ser Pro Ala Lys Gln Ala Pro Tyr Asn Gly Ala
145 150 155 160
Val Arg Thr Asp Lys Val Leu Val Leu Leu Val Glu Phe Ser Asp Tyr
165 170 175
Lys His Asn Asn Ile Glu Gln Ser Pro Gly Tyr Met Tyr Ala Asn Asp
180 185 190
Phe Ser Arg Glu His Tyr Gln Lys Met Leu Phe Gly Asn Glu Pro Phe
195 200 205
Thr Leu Phe Asp Gly Ser Lys Val Lys Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu
210 215 220
Glu Gln Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Tyr Val Thr Glu Trp
225 230 235 240
Leu Thr Val Pro Gly Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Gly Lys Thr
245 250 255
Gly His Asp Asn Lys Gly Pro Lys Gly Ala Arg Asp Leu Val Lys Glu
260 265 270
Ala Leu Lys Ala Ala Ala Glu Lys Gly Leu Asp Leu Ser Gln Phe Asp
275 280 285
Gln Phe Asp Arg Tyr Asp Thr Asn Gly Asp Gly Asn Gln Asn Glu Pro
290 295 300
Asp Gly Val Ile Asp His Leu Met Val Ile His Ala Gly Val Gly Gln
305 310 315 320
Glu Ala Gly Gly Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg
325 330 335
Ser Lys Leu Ala Gln Asp Pro Val Ala Ile Glu Gly Thr Lys Ser Lys
340 345 350
Val Ser Tyr Trp Asp Gly Lys Val Ala Ala His Asp Tyr Thr Ile Glu
355 360 365
Pro Glu Asp Gly Ala Val Gly Val Phe Ala His Glu Phe Gly His Asp
370 375 380
Leu Gly Leu Pro Asp Glu Tyr Asp Thr Asn Tyr Thr Gly Ala Gly Ser
385 390 395 400
Pro Val Glu Ala Trp Ser Leu Met Ser Gly Gly Ser Trp Thr Gly Arg
405 410 415
Ile Ala Gly Thr Glu Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Asp Phe
420 425 430
Leu Gln Lys Asn Met Asp Gly Asn Trp Ala Lys Ile Val Glu Val Asp
435 440 445
Tyr Asp Lys Ile Lys Arg Gly Val Gly Phe Pro Thr Tyr Ile Asp Gln
450 455 460
Ser Val Thr Lys Ser Asn Arg Pro Gly Leu Val Arg Val Asn Leu Pro
465 470 475 480
Glu Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Thr Gly Phe Gly Lys His Ala Tyr
485 490 495
Tyr Ser Thr Arg Gly Asp Asp Met His Thr Thr Leu Glu Thr Pro Leu
500 505 510
Phe Asp Leu Thr Lys Ala Ala Asn Ala Lys Phe Asp Tyr Lys Ala Asn
515 520 525
Tyr Glu Leu Glu Ala Glu Cys Asp Phe Ile Glu Val His Ala Val Thr
530 535 540
Glu Asp Gly Thr Lys Thr Leu Ile Asp Lys Leu Gly Asp Lys Val Val
545 550 555 560
Lys Gly Asp Gln Asp Thr Thr Glu Gly Lys Trp Ile Asp Lys Ser Tyr
565 570 575
Asp Leu Ser Gln Phe Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Gln Phe Asp Tyr
580 585 590
Ile Thr Asp Pro Ala Leu Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Met Asp Asn Val
595 600 605
Asn Val Thr Val Asp Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly
610 615 620
Gln Ala Lys Met Lys Leu Asn Gly Phe Val Val Ser Asp Gly Thr Glu
625 630 635 640
Lys Lys Pro His Tyr Tyr Tyr Leu Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ser
645 650 655
Asp Glu Gly Leu Lys Val Gly Arg Gly Pro Val Tyr Asn Thr Gly Leu
660 665 670
Val Val Trp Tyr Ala Asp Asp Ser Phe Lys Asp Asn Trp Val Gly Arg
675 680 685
His Pro Gly Glu Gly Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala
690 695 700
Val Val Gly Asn Leu Asn Gly Lys Pro Val Tyr Gly Asn Thr Gly Leu
705 710 715 720
Gln Ile Ala Asp Ala Ala Phe Ser Leu Asp Gln Thr Pro Ala Trp Asn
725 730 735
Val Asn Ser Phe Thr Arg Gly Gln Phe Asn Tyr Pro Gly Leu Pro Gly
740 745 750
Val Ala Thr Phe Asp Asp Ser Lys Val Tyr Ser Asn Thr Gln Ile Pro
755 760 765
Asp Ala Gly Arg Lys Val Pro Gln Leu Gly Leu Lys Phe Gln Val Val
770 775 780
Gly Gln Ala Asp Asp Lys Ser Ala Gly Ala Ile Trp Ile Arg Arg
785 790 795
<210> 72
<211> 152
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 72
Met Ser Cys Asn Glu Asn Lys His His Gly Ser Ser His Cys Val Val
1 5 10 15
Asp Val Val Lys Phe Ile Asn Glu Leu Gln Asp Cys Ser Thr Thr Thr
20 25 30
Cys Gly Ser Gly Cys Glu Ile Pro Phe Leu Gly Ala His Asn Thr Ala
35 40 45
Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr Lys Ala Gly Ala
50 55 60
Pro Phe Glu Ala Phe Ala Pro Ser Ala Asn Leu Thr Ser Cys Arg Ser
65 70 75 80
Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Val Asp Asp Asp Ser Cys Ala Val Leu
85 90 95
Arg Val Leu Ser Val Val Leu Gly Asp Ser Ser Pro Val Pro Pro Thr
100 105 110
Asp Asp Pro Ile Cys Thr Phe Leu Ala Val Pro Asn Ala Arg Leu Val
115 120 125
Ser Thr Ser Thr Cys Ile Thr Val Asp Leu Ser Cys Phe Cys Ala Ile
130 135 140
Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile
145 150
<210> 73
<211> 167
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 73
Met Phe Ser Ser Asp Cys Glu Phe Thr Lys Ile Asp Cys Glu Ala Lys
1 5 10 15
Pro Ala Ser Thr Leu Pro Ala Phe Gly Phe Ala Phe Asn Ala Ser Ala
20 25 30
Pro Gln Phe Ala Ser Leu Phe Thr Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val Ser
35 40 45
Pro Asn Pro Asn Ile Thr Val Pro Val Ile Asn Asp Thr Val Ser Val
50 55 60
Gly Asp Gly Ile Arg Ile Leu Arg Ala Gly Ile Tyr Gln Ile Ser Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Pro Val Ala Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Arg Phe Phe Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ala Asn Ile Ile Pro Gly Ser
100 105 110
Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Val Ile Gly Thr Gly Glu Val Asp Val
115 120 125
Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Asn Leu Asn Pro Gly Asp Leu Ile Arg
130 135 140
Ile Val Pro Val Glu Leu Ile Gly Thr Val Asp Ile Arg Ala Ala Ala
145 150 155 160
Leu Thr Val Ala Gln Ile Ser
165
<210> 74
<211> 156
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 74
Met Ser Cys Asn Cys Asn Glu Asp His His His His Asp Cys Asp Phe
1 5 10 15
Asn Cys Val Ser Asn Val Val Arg Phe Ile His Glu Leu Gln Glu Cys
20 25 30
Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ser Gly Cys Glu Val Pro Phe Leu Gly Ala
35 40 45
His Asn Ser Ala Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr
50 55 60
Lys Ala Gly Ala Pro Phe Glu Ala Phe Ala Pro Ser Ala Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ser Cys Arg Ser Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Ile Asp Asp Asp Asp
85 90 95
Cys Ala Val Leu Arg Val Leu Ser Val Val Leu Gly Asp Thr Ser Pro
100 105 110
Val Pro Pro Thr Asp Asp Pro Ile Cys Thr Phe Leu Ala Val Pro Asn
115 120 125
Ala Arg Leu Ile Ser Thr Asn Thr Cys Leu Thr Val Asp Leu Ser Cys
130 135 140
Phe Cys Ala Ile Gln Cys Leu Arg Asp Val Thr Ile
145 150 155
<210> 75
<211> 182
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 75
Met Glu Val Gly Gly Thr Ser Val Lys Asn Lys Asn Lys Ser Ser Thr
1 5 10 15
Val Gly Lys Pro Leu Leu Tyr Ile Ala Gln Val Ser Leu Glu Leu Ala
20 25 30
Ala Pro Lys Thr Lys Arg Ile Ile Leu Thr Asn Phe Glu Asn Glu Asp
35 40 45
Arg Lys Glu Glu Ser Asn Arg Asn Glu Asn Val Val Ser Ser Ala Val
50 55 60
Glu Glu Val Ile Glu Gln Glu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Glu Gln Glu
65 70 75 80
Gln Glu Glu Gln Val Glu Glu Lys Thr Glu Glu Glu Glu Gln Val Gln
85 90 95
Glu Gln Gln Glu Pro Val Arg Thr Val Pro Tyr Asn Lys Ser Phe Lys
100 105 110
Asp Met Asn Asn Glu Glu Lys Ile His Phe Leu Leu Asn Arg Pro His
115 120 125
Tyr Ile Pro Lys Val Arg Cys Arg Ile Lys Thr Ala Thr Ile Ser Tyr
130 135 140
Val Gly Ser Ile Ile Ser Tyr Arg Asn Gly Ile Val Ala Ile Met Pro
145 150 155 160
Pro Asn Ser Met Arg Asp Ile Arg Leu Ser Ile Glu Glu Ile Lys Ser
165 170 175
Ile Asp Met Ala Gly Phe
180
<210> 76
<211> 174
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 76
Met Lys Glu Arg Ser Glu Asn Met Arg Ser Ser Ser Arg Lys Leu Thr
1 5 10 15
Asn Phe Asn Cys Arg Ala Gln Ala Pro Ser Thr Leu Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Phe Ala Phe Asn Ala Thr Ser Pro Gln Phe Ala Thr Leu Phe Thr Pro
35 40 45
Leu Leu Leu Pro Ser Thr Gly Pro Asn Pro Asn Ile Thr Val Pro Val
50 55 60
Ile Asn Asp Thr Ile Ser Thr Gly Thr Gly Ile Arg Ile Gln Val Ala
65 70 75 80
Gly Ile Tyr Gln Ile Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Leu Asp Asn Val
85 90 95
Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala Arg Phe Phe Leu Thr Leu Asn Ser Ser
100 105 110
Thr Asn Ile Ile Ala Gly Ser Gly Thr Ala Val Arg Ser Asn Ile Ile
115 120 125
Gly Thr Gly Glu Val Asp Val Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Asn Leu
130 135 140
Asn Pro Gly Asp Leu Ile Gln Ile Val Pro Val Glu Val Ile Gly Thr
145 150 155 160
Val Asp Ile Arg Ser Ala Ala Leu Thr Val Ala Gln Ile Arg
165 170
<210> 77
<211> 796
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 77
Met Ser Lys Lys Pro Phe Lys Val Leu Ser Ser Ile Ala Leu Thr Ala
1 5 10 15
Val Leu Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Gln Ser Ala Tyr Ala Glu
20 25 30
Thr Pro Val Asn Lys Thr Ala Thr Ser Pro Val Asp Asp His Leu Ile
35 40 45
Pro Glu Glu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Lys Lys Arg Gly Val Ile Asp
50 55 60
Ser Lys Ala Ser Glu Thr Glu Thr Lys Lys Ala Val Glu Lys Tyr Val
65 70 75 80
Glu Asn Lys Lys Gly Glu Asn Pro Gly Lys Glu Ala Ala Asn Gly Asp
85 90 95
Gln Leu Thr Lys Asp Ala Ser Asp Phe Leu Lys Lys Val Lys Asp Ala
100 105 110
Lys Ala Asp Thr Lys Glu Lys Leu Asn Gln Pro Ala Thr Gly Thr Pro
115 120 125
Ala Ala Thr Gly Pro Val Lys Gly Gly Leu Asn Gly Lys Val Pro Thr
130 135 140
Ser Pro Ala Lys Gln Lys Asp Tyr Asn Gly Glu Val Arg Lys Asp Lys
145 150 155 160
Val Leu Val Leu Leu Val Glu Tyr Ala Asp Phe Lys His Asn Asn Ile
165 170 175
Asp Lys Glu Pro Gly Tyr Met Tyr Ser Asn Asp Phe Asn Lys Glu His
180 185 190
Tyr Glu Lys Met Leu Phe Gly Asn Glu Pro Phe Thr Leu Asp Asp Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Glu Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu Glu Gln Ser Gly Gly
210 215 220
Ser Tyr Thr Val Asp Gly Thr Val Thr Lys Trp Leu Thr Val Pro Gly
225 230 235 240
Lys Ala Ala Asp Tyr Gly Ala Asp Ala Pro Gly Gly Gly His Asp Asn
245 250 255
Lys Gly Pro Lys Gly Pro Arg Asp Leu Val Lys Asp Ala Leu Lys Ala
260 265 270
Ala Val Asp Ser Gly Ile Asp Leu Ser Glu Phe Asp Gln Phe Asp Gln
275 280 285
Tyr Asp Val Asn Gly Asp Gly Asn Lys Asn Gln Pro Asp Gly Leu Ile
290 295 300
Asp His Leu Met Ile Ile His Ala Gly Val Gly Gln Glu Ala Gly Gly
305 310 315 320
Gly Lys Leu Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Trp Thr Val Gly
325 330 335
Pro Lys Pro Phe Pro Ile Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Pro Tyr Trp
340 345 350
Gly Gly Lys Met Ala Ala Phe Asp Tyr Thr Ile Glu Pro Glu Asp Gly
355 360 365
Ala Val Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asp Leu Gly Leu Pro
370 375 380
Asp Glu Tyr Asp Thr Gln Tyr Ser Gly Gln Gly Glu Pro Ile Glu Ala
385 390 395 400
Trp Ser Ile Met Ser Gly Gly Ser Trp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Thr
405 410 415
Thr Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Glu Phe Phe Gln Lys Thr
420 425 430
Ile Gly Gly Asn Trp Ala Asn Ile Val Glu Val Asp Tyr Glu Lys Leu
435 440 445
Asn Lys Gly Ile Gly Leu Ala Thr Tyr Leu Asp Gln Ser Val Thr Lys
450 455 460
Ser Ala Arg Pro Gly Met Ile Arg Val Asn Leu Pro Asp Lys Asp Val
465 470 475 480
Lys Thr Ile Glu Pro Ala Phe Gly Lys Gln Tyr Tyr Tyr Ser Thr Lys
485 490 495
Gly Asp Asp Leu His Thr Lys Met Glu Thr Pro Leu Phe Asp Leu Thr
500 505 510
Asn Ala Thr Ser Ala Lys Phe Asp Phe Lys Ser Leu Tyr Glu Ile Glu
515 520 525
Ala Gly Tyr Asp Phe Leu Glu Val His Ala Val Thr Glu Asp Gly Lys
530 535 540
Gln Thr Leu Ile Glu Arg Leu Gly Glu Lys Ala Asn Ser Gly Asn Ala
545 550 555 560
Asp Ser Thr Asn Gly Lys Trp Ile Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ser Gln
565 570 575
Phe Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Thr Phe Asp Tyr Ile Thr Asp Gly
580 585 590
Gly Leu Ala Leu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Asn Ala Ser Leu Thr Val
595 600 605
Asp Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly Thr Pro Gln Leu
610 615 620
Lys Leu Asp Gly Phe Val Val Ser Asn Gly Thr Glu Lys Lys Lys His
625 630 635 640
Asn Tyr Tyr Val Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ala Asp Asn Ala Leu
645 650 655
Lys Phe Ala Arg Gly Pro Val Phe Asn Thr Gly Met Val Val Trp Tyr
660 665 670
Ala Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Asn Trp Val Gly Val His Pro Gly His
675 680 685
Gly Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala Ile Val Gly Thr
690 695 700
Leu Asn Gly Lys Pro Thr Val Lys Ser Ser Thr Arg Phe Gln Ile Ala
705 710 715 720
Asp Ala Ala Phe Ser Phe Asp Lys Thr Pro Ala Trp Lys Val Val Ser
725 730 735
Pro Thr Arg Gly Thr Phe Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Gly Val Pro Lys
740 745 750
Phe Asp Asp Ser Lys Thr Tyr Ile Asn Gln Gln Ile Pro Asp Ala Gly
755 760 765
Arg Ile Leu Pro Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Val Val Gly Gln Ala
770 775 780
Asp Asp Asn Ser Ala Gly Ala Val Arg Leu Tyr Arg
785 790 795
<210> 78
<211> 430
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 78
Met Lys His Asn Asp Cys Phe Asp His Asn Asn Cys Asn Pro Ile Val
1 5 10 15
Phe Ser Ala Asp Cys Cys Lys Asn Pro Gln Ser Val Pro Ile Thr Arg
20 25 30
Glu Gln Leu Ser Gln Leu Ile Thr Leu Leu Asn Ser Leu Val Ser Ala
35 40 45
Ile Ser Ala Phe Phe Ala Asn Pro Ser Asn Ala Asn Arg Leu Val Leu
50 55 60
Leu Asp Leu Phe Asn Gln Phe Leu Ile Phe Leu Asn Ser Leu Leu Pro
65 70 75 80
Ser Pro Glu Val Asn Phe Leu Lys Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ile Val
85 90 95
Leu Leu Gln Ser Pro Ala Pro Asn Leu Gly Gln Leu Ser Thr Leu Leu
100 105 110
Gln Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Gln Phe Phe Phe Ala Leu Asp Leu
115 120 125
Ile Pro Ile Ser Cys Asn Ser Asn Val Asp Ser Ala Thr Leu Gln Leu
130 135 140
Leu Phe Asn Leu Leu Ile Gln Leu Ile Asn Ala Thr Pro Gly Ala Thr
145 150 155 160
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly
165 170 175
Thr Gly Ala Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
180 185 190
Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala
195 200 205
Thr Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr
210 215 220
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ile Ile
260 265 270
Pro Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ser Ala Leu Val Asn Ala Leu Val
275 280 285
Ala Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe Gly Phe Ser Gln Pro Gly Val
290 295 300
Ala Leu Thr Gly Gly Thr Ser Ile Thr Leu Ala Leu Gly Val Gly Asp
305 310 315 320
Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Ala Gly Thr Ile Thr Ser Leu Ala Gly
325 330 335
Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val Gln Val
340 345 350
Gln Ile Gln Ile Leu Thr Ala Pro Ala Ala Ser Asn Thr Phe Thr Val
355 360 365
Gln Gly Ala Pro Leu Leu Leu Thr Pro Ala Phe Ala Ala Ile Ala Ile
370 375 380
Gly Ser Thr Ala Ser Gly Ile Ile Ala Glu Ala Ile Pro Val Ala Ala
385 390 395 400
Gly Asp Lys Ile Leu Leu Tyr Val Ser Leu Thr Ala Ala Ser Pro Ile
405 410 415
Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala Gly Ile Asn Ile Val
420 425 430
<210> 79
<211> 437
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 79
Met Lys His Asn Asp Cys Phe Gly His Asn Asn Cys Asn Asn Pro Ile
1 5 10 15
Val Phe Thr Pro Asp Cys Cys Asn Asn Pro Gln Thr Val Pro Ile Thr
20 25 30
Ser Glu Gln Leu Gly Arg Leu Ile Thr Leu Leu Asn Ser Leu Ile Ala
35 40 45
Ala Ile Ala Ala Phe Phe Ala Asn Pro Ser Asp Ala Asn Arg Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Asn Leu Phe Thr Gln Leu Leu Asn Leu Leu Asn Glu Leu Ala
65 70 75 80
Pro Ser Pro Glu Gly Asn Phe Leu Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile Ile
85 90 95
Asn Leu Leu Gln Ser Pro Asn Pro Asn Leu Gly Gln Leu Leu Ser Leu
100 105 110
Leu Gln Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Pro Phe Phe Phe Ser Leu Ile
115 120 125
Leu Asp Pro Ala Ser Leu Gln Leu Leu Leu Asn Leu Leu Ala Gln Leu
130 135 140
Ile Gly Val Thr Pro Gly Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr
145 150 155 160
Gly Pro Gly Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gly
165 170 175
Gly Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr
180 185 190
Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly
195 200 205
Val Ala Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Leu
210 215 220
Ala Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Ala Gly Ala Thr Gly
245 250 255
Pro Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Gly Ala Ile Ile Pro Phe Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Ala Leu Val Asn Ala Leu Ile Ala Asn Thr Gly Thr Leu Leu Gly Phe
290 295 300
Gly Phe Ser Gln Pro Gly Ile Gly Leu Ala Gly Gly Thr Ser Ile Thr
305 310 315 320
Leu Ala Leu Gly Val Gly Asp Tyr Ala Phe Val Ala Pro Arg Asp Gly
325 330 335
Val Ile Thr Ser Leu Ala Gly Phe Phe Ser Ala Thr Ala Ala Leu Ser
340 345 350
Pro Leu Ser Pro Val Gln Val Gln Ile Gln Ile Leu Thr Ala Pro Ala
355 360 365
Ala Ser Asn Thr Phe Thr Val Gln Gly Ala Pro Leu Leu Leu Thr Pro
370 375 380
Ala Phe Ala Ala Ile Ala Ile Gly Ser Thr Ala Ser Gly Ile Ile Pro
385 390 395 400
Glu Ala Ile Pro Val Val Ala Gly Asp Lys Ile Leu Leu Tyr Val Ser
405 410 415
Leu Thr Ala Ala Ser Pro Ile Ala Ala Val Ala Gly Phe Val Ser Ala
420 425 430
Gly Ile Asn Ile Val
435
<210> 80
<211> 119
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 80
Met Leu Phe Thr Ser Trp Leu Leu Phe Phe Ile Phe Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Phe Arg Leu Thr Arg Leu Ile Val Tyr Asp Lys Ile Thr Gly Phe Leu
20 25 30
Arg Arg Pro Phe Ile Asp Glu Leu Glu Ile Thr Glu Pro Asp Gly Ser
35 40 45
Val Ser Thr Phe Thr Lys Val Lys Gly Lys Gly Leu Arg Lys Trp Ile
50 55 60
Gly Glu Leu Leu Ser Cys Tyr Trp Cys Thr Gly Val Trp Val Ser Ala
65 70 75 80
Phe Leu Leu Val Leu Tyr Asn Trp Ile Pro Ile Val Ala Glu Pro Leu
85 90 95
Leu Ala Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ile Glu Thr Ile
100 105 110
Thr Gly Tyr Phe Met Gly Glu
115
<210> 81
<211> 61
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 81
Met Phe Ala Val Ser Asn Asn Pro Arg Gln Asn Ser Tyr Asp Leu Gln
1 5 10 15
Gln Trp Tyr His Met Gln Gln Gln His Gln Ala Gln Gln Gln Ala Tyr
20 25 30
Gln Glu Gln Leu Gln Gln Gln Gly Phe Val Lys Lys Lys Gly Cys Asn
35 40 45
Cys Gly Lys Lys Lys Ser Thr Ile Lys His Tyr Glu Glu
50 55 60
<210> 82
<211> 481
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 82
Met Ser Arg Tyr Asp Asp Ser Gln Asn Lys Phe Ser Lys Pro Cys Phe
1 5 10 15
Pro Ser Ser Ala Gly Arg Ile Pro Asn Thr Pro Ser Ile Pro Val Thr
20 25 30
Lys Ala Gln Leu Arg Thr Phe Arg Ala Ile Ile Ile Asp Leu Thr Lys
35 40 45
Ile Ile Pro Lys Leu Phe Ala Asn Pro Ser Pro Gln Asn Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Ile Asp Thr Leu Asn Leu Leu Ser Lys Phe Ile Cys Ser Leu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Ile Ile Lys Asn Leu
85 90 95
Ile Thr Ile Leu Lys Asn Pro Thr Phe Val Ala Ser Ala Val Phe Ile
100 105 110
Glu Leu Gln Asn Leu Ile Asn Tyr Leu Leu Ser Ile Thr Lys Leu Phe
115 120 125
Arg Ile Asp Pro Cys Thr Leu Gln Glu Leu Leu Lys Leu Ile Ala Ala
130 135 140
Leu Gln Thr Ala Leu Val Asn Ser Ala Ser Phe Ile Gln Gly Pro Thr
145 150 155 160
Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly
165 170 175
Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala
180 185 190
Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr
195 200 205
Gly Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
210 215 220
Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro
225 230 235 240
Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln
245 250 255
Gly Val Gln Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ile Gly Val Thr Gly Pro
260 265 270
Thr Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Pro
275 280 285
Gln Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Ile Gln Gly Pro Ala
290 295 300
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly
305 310 315 320
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Pro Thr Gly Ala
325 330 335
Thr Gly Ile Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ser Phe
340 345 350
Pro Val Ala Thr Ile Val Val Thr Asn Asn Ile Gln Gln Thr Val Leu
355 360 365
Gln Phe Asn Asn Phe Ile Phe Asn Thr Ala Ile Asn Val Asn Asn Ile
370 375 380
Ile Phe Asn Gly Thr Asp Thr Val Thr Val Ile Asn Ala Gly Ile Tyr
385 390 395 400
Val Ile Ser Val Ser Ile Ser Thr Thr Ala Pro Gly Cys Ala Pro Leu
405 410 415
Gly Val Gly Ile Ser Ile Asn Gly Ala Val Ala Thr Asp Asn Phe Ser
420 425 430
Ser Asn Leu Ile Gly Asp Ser Leu Ser Phe Thr Thr Ile Glu Thr Leu
435 440 445
Thr Ala Gly Ala Asn Ile Ser Val Gln Ser Thr Leu Asn Glu Ile Thr
450 455 460
Ile Pro Ala Thr Gly Asn Thr Asn Ile Arg Leu Thr Val Phe Arg Ile
465 470 475 480
Ala
<210> 83
<211> 275
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 83
Met Lys Met Lys Arg Gly Ile Thr Thr Leu Leu Ser Val Ala Val Leu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Ile Thr Glu Lys Thr Val Ala
20 25 30
Lys Glu Glu Lys Val Lys Leu Thr Asp Gln Gln Leu Met Ala Asp Leu
35 40 45
Trp Tyr Gln Thr Ala Gly Glu Met Lys Ala Leu Tyr Tyr Gln Gly Tyr
50 55 60
Asn Ile Gly Gln Leu Lys Leu Asp Ala Val Leu Ala Lys Gly Thr Glu
65 70 75 80
Lys Lys Pro Ala Ile Val Leu Asp Leu Asp Glu Thr Val Leu Asp Asn
85 90 95
Ser Pro His Gln Ala Met Ser Val Lys Thr Gly Lys Gly Tyr Pro Tyr
100 105 110
Lys Trp Asp Asp Trp Ile Asn Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Pro Gly
115 120 125
Ala Ile Asp Phe Leu Lys Tyr Thr Glu Ser Lys Gly Val Asp Ile Tyr
130 135 140
Tyr Ile Ser Asn Arg Lys Thr Asn Gln Leu Asp Ala Thr Ile Lys Asn
145 150 155 160
Leu Glu Arg Val Gly Ala Pro Gln Ala Thr Lys Glu His Ile Leu Leu
165 170 175
Gln Asp Pro Lys Glu Lys Gly Lys Glu Lys Arg Arg Glu Leu Val Ser
180 185 190
Gln Thr His Asp Ile Val Leu Phe Phe Gly Asp Asn Leu Ser Asp Phe
195 200 205
Thr Gly Phe Asp Gly Lys Ser Val Lys Asp Arg Asn Gln Ala Val Ala
210 215 220
Asp Ser Lys Ala Gln Phe Gly Glu Lys Phe Ile Ile Phe Pro Asn Pro
225 230 235 240
Met Tyr Gly Asp Trp Glu Gly Ala Leu Tyr Asp Tyr Asp Phe Lys Lys
245 250 255
Ser Asp Ala Glu Lys Asp Lys Ile Arg Arg Asp Asn Leu Lys Ser Phe
260 265 270
Asp Thr Lys
275
<210> 84
<211> 795
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 84
Met Lys Lys Lys Lys Lys Leu Lys Pro Leu Ala Val Leu Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ala Val Leu Ser Ser Thr Phe Ala Phe Gly Gly His Ala Ala Tyr Ala
20 25 30
Glu Thr Pro Thr Ser Ser Leu Pro Ile Asp Glu His Leu Ile Pro Glu
35 40 45
Glu Arg Leu Ala Glu Ala Leu Lys Gln Arg Gly Val Ile Asp Gln Ser
50 55 60
Ala Ser Gln Ala Glu Thr Ser Lys Ala Val Glu Lys Tyr Val Glu Lys
65 70 75 80
Lys Lys Gly Glu Asn Pro Gly Lys Glu Ile Leu Thr Gly Asp Ser Leu
85 90 95
Thr Gln Glu Ala Ser Asp Phe Met Lys Lys Val Lys Asp Ala Lys Met
100 105 110
Arg Glu Asn Glu Gln Ala Gln Gln Pro Glu Val Gly Pro Val Ala Gly
115 120 125
Gln Gly Ala Ala Leu Asn Pro Gly Lys Leu Asn Gly Lys Val Pro Thr
130 135 140
Thr Ser Ala Lys Gln Glu Glu Tyr Asn Gly Ala Val Arg Lys Asp Lys
145 150 155 160
Val Leu Val Leu Leu Val Glu Phe Ser Asp Phe Lys His Asn Asn Ile
165 170 175
Asp Gln Glu Pro Gly Tyr Met Tyr Ser Lys Asp Phe Asn Arg Glu His
180 185 190
Tyr Gln Lys Met Leu Phe Gly Asp Glu Pro Phe Thr Leu Phe Asp Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Asn Thr Phe Lys Gln Tyr Tyr Glu Glu Gln Ser Gly Gly
210 215 220
Ser Tyr Thr Val Asp Gly Thr Val Thr Glu Trp Leu Thr Val Pro Gly
225 230 235 240
Lys Ala Ser Asp Tyr Gly Ala Asp Ala Gly Thr Gly His Asp Asn Lys
245 250 255
Gly Pro Leu Gly Pro Lys Asp Leu Val Lys Glu Ala Leu Lys Ala Ala
260 265 270
Val Ala Lys Gly Ile Asn Leu Ala Asp Phe Asp Gln Tyr Asp Gln Tyr
275 280 285
Asp Gln Asn Gly Asn Gly Asn Lys Asn Glu Pro Asp Gly Ile Ile Asp
290 295 300
His Leu Met Val Val His Ala Gly Val Gly Gln Glu Ala Gly Gly Gly
305 310 315 320
Lys Leu Lys Asp Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Ser Lys Leu Gly Ser
325 330 335
Lys Pro Tyr Ala Ile Asp Gly Thr Lys Ser Ser Val Ser Asn Trp Gly
340 345 350
Gly Lys Met Ala Ala Tyr Asp Tyr Thr Ile Glu Pro Glu Asp Gly Ala
355 360 365
Val Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asp Leu Gly Leu Pro Asp
370 375 380
Glu Tyr Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Gln Gly Glu Pro Val Glu Ser Trp
385 390 395 400
Ser Ile Met Ser Gly Gly Ser Trp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Thr Glu
405 410 415
Pro Thr Ser Phe Ser Pro Gln Asn Lys Glu Phe Phe Gln Lys Asn Met
420 425 430
Lys Gly Asn Trp Ala Asn Ile Leu Glu Val Asp Tyr Asp Lys Leu Ser
435 440 445
Lys Gly Ile Gly Val Ala Thr Tyr Val Asp Gln Ser Thr Thr Lys Ser
450 455 460
Lys Arg Pro Gly Ile Val Arg Val Asn Leu Pro Asp Lys Asp Ile Lys
465 470 475 480
Asn Ile Glu Ser Ala Phe Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Ser Thr Lys Gly
485 490 495
Asn Asp Ile His Thr Thr Leu Glu Thr Pro Val Phe Asp Leu Thr Asn
500 505 510
Ala Lys Asp Ala Lys Phe Asp Tyr Lys Ala Phe Tyr Glu Leu Glu Ala
515 520 525
Lys Tyr Asp Phe Leu Asp Val Tyr Ala Ile Ala Glu Asp Gly Thr Lys
530 535 540
Thr Arg Ile Asp Arg Met Gly Glu Lys Asp Ile Lys Gly Gly Ala Asp
545 550 555 560
Thr Thr Asp Gly Lys Trp Val Asp Lys Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Phe
565 570 575
Lys Gly Lys Lys Val Lys Leu Gln Phe Glu Tyr Leu Thr Asp Ile Ala
580 585 590
Val Ala Tyr Lys Gly Phe Ala Leu Asp Asn Ala Ala Leu Thr Val Asp
595 600 605
Gly Lys Val Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly Gln Pro Ala Met Thr
610 615 620
Leu Lys Gly Phe Thr Val Ser Asn Gly Phe Glu Gln Lys Lys His Asn
625 630 635 640
Tyr Tyr Val Glu Trp Arg Asn Tyr Ala Gly Ser Asp Thr Ala Leu Gln
645 650 655
Tyr Ala Arg Gly Pro Val Phe Asn Thr Gly Met Val Val Trp Tyr Ala
660 665 670
Asp Gln Ser Phe Thr Asp Asn Trp Val Gly Val His Pro Gly Glu Gly
675 680 685
Phe Leu Gly Val Val Asp Ser His Pro Glu Ala Ile Val Gly Thr Leu
690 695 700
Asn Gly Gln Pro Thr Val Lys Ser Ser Thr Arg Tyr Gln Ile Ala Asp
705 710 715 720
Ala Ala Phe Ser Phe Asp Gln Thr Pro Ala Trp Lys Val Asn Ser Pro
725 730 735
Thr Arg Gly Ile Phe Asp Tyr Lys Gly Leu Pro Gly Val Ala Lys Phe
740 745 750
Asp Asp Ser Lys Gln Tyr Ile Asn Ser Val Ile Pro Asp Ala Gly Arg
755 760 765
Lys Leu Pro Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Val Val Gly Gln Ala Glu
770 775 780
Asp Lys Ser Ala Gly Ala Val Trp Leu His Arg
785 790 795
<210> 85
<211> 169
<212> ДНК
<213> Bacillus anthracis
<400> 85
taatcaccct cttccaaatc aatcatatgt tatacatata ctaaactttc cattttttta
60
aattgttcaa gtagtttaag atttcttttc aataattcaa atgtccgtgt cattttcttt
120
cggttttgca tctactatat aatgaacgct ttatggaggt gaatttatg
169
<210> 86
<211> 303
<212> ДНК
<213> Bacillus anthracis
<400> 86
atttatttca ttcaattttt cctatttagt acctaccgca ctcacaaaaa gcacctctca
60
ttaatttata ttatagtcat tgaaatctaa tttaatgaaa tcatcatact atatgtttta
120
taagaagtaa aggtaccata cttaattaat acatatctat acacttcaat atcacagcat
180
gcagttgaat tatatccaac tttcatttca aattaaataa gtgcctccgc tattgtgaat
240
gtcatttact ctccctacta catttaataa ttatgacaag caatcatagg aggttactac
300
atg
303
<210> 87
<211> 173
<212> ДНК
<213> Bacillus anthracis
<400> 87
aattacataa caagaactac attagggagc aagcagtcta gcgaaagcta actgcttttt
60
tattaaataa ctattttatt aaatttcata tatacaatcg cttgtccatt tcatttggct
120
ctacccacgc atttactatt agtaatatga atttttcaga ggtggatttt att
173
<210> 88
<211> 124
<212> ДНК
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 88
ctatgattta agatacacaa tagcaaaaga gaaacatatt atataacgat aaatgaaact
60
tatgtatatg tatggtaact gtatatatta ctacaataca gtatactcat aggaggtagg
120
tatg
124
<210> 89
<211> 376
<212> ДНК
<213> Bacillus weihenstephensis
<400> 89
ggtaggtaga tttgaaatat gatgaagaaa aggaataact aaaaggagtc gatatccgac
60
tccttttagt tataaataat gtggaattag agtataattt tatataggta tattgtatta
120
gatgaacgct ttatccttta attgtgatta atgatggatt gtaagagaag gggcttacag
180
tccttttttt atggtgttct ataagccttt ttaaaagggg taccacccca cacccaaaaa
240
cagggggggt tataactaca tattggatgt tttgtaacgt acaagaatcg gtattaatta
300
ccctgtaaat aagttatgtg tatataaggt aactttatat attctcctac aataaaataa
360
aggaggtaat aaagtg
376
<210> 90
<211> 225
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 90
aacccttaat gcattggtta aacattgtaa agtctaaagc atggataatg ggcgagaagt
60
aagtagattg ttaacaccct gggtcaaaaa ttgatattta gtaaaattag ttgcactttg
120
tgcatttttt cataagatga gtcatatgtt ttaaattgta gtaatgaaaa acagtattat
180
atcataatga attggtatct taataaaaga gatggaggta actta
225
<210> 91
<211> 125
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 91
taattccacc ttcccttatc ctctttcgcc tatttaaaaa aaggtcttga gattgtgacc
60
aaatctcctc aactccaata tcttattaat gtaaatacaa acaagaagat aaggagtgac
120
attaa
125
<210> 92
<211> 144
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 92
aggatgtctt tttttatatt gtattatgta catccctact atataaattc cctgctttta
60
tcgtaagaat taacgtaata tcaaccatat cccgttcata ttgtagtagt gtatgtcaga
120
actcacgaga aggagtgaac ataa
144
<210> 93
<211> 126
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 93
ttaatgtcac tccttatctt cttgtttgta tttacattaa taagatattg gagttgagga
60
gatttggtca caatctcaag accttttttt taaataggcg aaagaggata agggaaggtg
120
gaatta
126
<210> 94
<211> 103
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 94
atatattttc ataatacgag aaaaagcgga gtttaaaaga atgagggaac ggaaataaag
60
agttgttcat atagtaaata gacagaattg acagtagagg aga
103
<210> 95
<211> 169
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 95
aaactaaata atgagctaag catggattgg gtggcagaat tatctgccac ccaatccatg
60
cttaacgagt attattatgt aaatttctta aaattgggaa cttgtctaga acatagaacc
120
tgtccttttc attaactgaa agtagaaaca gataaaggag tgaaaaaca
169
<210> 96
<211> 111
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 96
attcactaca acggggatga gtttgatgcg gatacatatg agaagtaccg gaaagtgttt
60
gtagaacatt acaaagatat attatctcca tcataaagga gagatgcaaa g
111
<210> 97
<211> 273
<212> ДНК
<213> Bacillus anthracis
<400> 97
cgcgcaccac ttcgtcgtac aacaacgcaa gaagaagttg gggatacagc agtattctta
60
ttcagtgatt tagcacgcgg cgtaacagga gaaaacattc acgttgattc agggtatcat
120
atcttaggat aaatataata ttaattttaa aggacaatct ctacatgttg agattgtcct
180
ttttatttgt tcttagaaag aacgattttt aacgaaagtt cttaccacgt tatgaatata
240
agtataatag tacacgattt attcagctac gta
273
<210> 98
<211> 303
<212> ДНК
<213> Bacillus anthracis
<400> 98
tgaagtatct agagctaatt tacgcaaagg aatctcagga caacactttc gcaacaccta
60
tattttaaat ttaataaaaa aagagactcc ggagtcagaa attataaagc tagctgggtt
120
caaatcaaaa atttcactaa aacgatatta tcaatacgca gaaaatggaa aaaacgcctt
180
atcataaggc gttttttcca ttttttcttc aaacaaacga ttttactatg accatttaac
240
taatttttgc atctactatg atgagtttca ttcacattct cattagaaag gagagattta
300
atg
303
<210> 99
<211> 240
<212> ДНК
<213> Bacillus anthracis
<400> 99
tatatcatat gtaaaattag ttcttattcc cacatatcat atagaatcgc catattatac
60
atgcagaaaa ctaagtatgg tattattctt aaattgttta gcaccttcta atattacaga
120
tagaatccgt cattttcaac agtgaacatg gatttcttct gaacacaact ctttttcttt
180
ccttatttcc aaaaagaaaa gcagcccatt ttaaaatacg gctgcttgta atgtacatta
240
<210> 100
<211> 267
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 100
tatcacataa ctctttattt ttaatatttc gacataaagt gaaactttaa tcagtggggg
60
ctttgttcat ccccccactg attattaatt gaaccaaggg ataaaaagat agagggtctg
120
accagaaaac tggagggcat gattctataa caaaaagctt aatgtttata gaattatgtc
180
tttttatata gggagggtag taaacagaga tttggacaaa aatgcaccga tttatctgaa
240
ttttaagttt tataaagggg agaaatg
267
<210> 101
<211> 124
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 101
attttttact tagcagtaaa actgatatca gttttactgc tttttcattt ttaaattcaa
60
tcattaaatc ttccttttct acatagtcat aatgttgtat gacattccgt aggaggcact
120
tata
124
<210> 102
<211> 170
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 102
acataaattc acctccataa agcgttcatt atatagtaga tgcaaaaccg aaagaaaatg
60
acacggacat ttgaattatt gaaaagaaat cttaaactac ttgaacaatt taaaaaaatg
120
gaaagtttag tatatgtata acatatgatt gatttggaag agggtgatta
170
<210> 103
<211> 212
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 103
ttctattttc caacataaca tgctacgatt aaatggtttt ttgcaaatgc cttcttggga
60
agaaggatta gagcgttttt ttatagaaac caaaagtcat taacaatttt aagttaatga
120
cttttttgtt tgcctttaag aggttttatg ttactataat tatagtatca ggtactaata
180
acaagtataa gtatttctgg gaggatatat ca
212
<210> 104
<211> 717
<212> ДНК
<213> Bacillus mycoides
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 104
gtctgangga ncacgccgcg tgagtgatga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta
60
gggaagaaca agtgctagtt gaataagctg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca
120
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta
180
ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac
240
cgtggagggt cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg
300
tgtagcggtg aaatgcgtag agatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt
360
ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag
420
tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgaagt
480
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg
540
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt
600
accaggtctt gacatcctct gacaacccta gagatagggc ttccccttcg ggggcagagt
660
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccg
717
<210> 105
<211> 711
<212> ДНК
<213> Bacillus mycoides
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 105
ggagcacgcc gcgtgagtgn ngaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttagggaaga
60
acaagtgcta gttgaataag ctggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa
120
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg
180
taaagcgcgc gcaggtggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag
240
ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc atgtgtagcg
300
gtgaaatgcg tagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac
360
tgacactgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc
420
cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga agttaacgca
480
ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg
540
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt
600
cttgacatcc tctgaaaact ctagagatag agcttctcct tcgggagcag agtgacaggt
660
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg c
711
<210> 106
<211> 719
<212> ДНК
<213> Bacillus mycoides
<220>
<221> misc_feature
<222> (630)..(630)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (640)..(642)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 106
aaagtctgac ggagcacgcc gcgtgagtga tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg
60
ttagggaaga acaagtgcta gttgaataag ctggcacctt gacggtacct aaccagaaag
120
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa
180
ttattgggcg taaagcgcgc gcaggtggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc
240
aaccgtggag ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc
300
atgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct
360
ggtctgtaac tgacactgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg
420
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga
480
agttaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa
540
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac
600
cttaccaggt cttgacatcc tctgaaaacn ctagagatan nncttctcct tcgggagcag
660
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtccc
719
<210> 107
<211> 709
<212> ДНК
<213> Bacillus mycoides
<400> 107
ggagcacgcc gcgtgagtga tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttagggaaga
60
acaagtgcta gttgaataag ctggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa
120
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg
180
taaagcgcgc gcaggtggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag
240
ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc atgtgtagcg
300
gtgaaatgcg tagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac
360
tgacactgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc
420
cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga agttaacgca
480
ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg
540
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt
600
cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggcttcccct tcgggggcag agtgacaggt
660
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtccc
709
<210> 108
<211> 713
<212> ДНК
<213> Представитель семейства Bacillus cereus
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (697)..(697)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 108
ggancaacgc cgcgtgagtg angaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag
60
aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta
120
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc
180
gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga
240
gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc
300
ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa
360
ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg
420
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc
480
attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg
540
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg
600
tcttgacatc ctctgaaaac tctagagata gagcttctcc ttcgggagca gagtgacagg
660
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgntgg gttaagtccc gca
713
<210> 109
<211> 876
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 109
tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta
60
gggaagaaca agtgctagtt gaataagctg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca
120
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta
180
ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac
240
cgtggagggt cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg
300
tgtagcggtg aaatgcgtag agatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt
360
ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag
420
tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgaagt
480
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg
540
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt
600
accaggtctt gacatcctct gaaaacccta gagatagggc ttctccttcg ggagcagagt
660
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa
720
cgagcgcaac ccttgatctt agttgccatc attaagttgg gcactctaag gtgactgccg
780
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc
840
tacacacgtg ctacaatgga cggtacaaag agctgc
876
<210> 110
<211> 686
<212> ДНК
<213> Представитель семейства Bacillus cereus
<400> 110
aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac aagtgctagt tgaataagct
60
ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta
120
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggtggtttc
180
ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctgggagact
240
tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gagatatgga
300
ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acactgaggc gcgaaagcgt
360
ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg
420
ttagagggtt tccgcccttt agtgctgaag ttaacgcatt aagcactccg cctggggagt
480
acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg
540
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgaaaaccct
600
agagataggg cttctccttc gggagcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc
660
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcc
686
<210> 111
<211> 717
<212> ДНК
<213> Bacillus aryabhattai
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 111
ggnncaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag
60
aacaagtacg agagtaactg ctcgtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa
120
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg
180
taaagcgcgc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag
240
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagagaaaa gcggaattcc acgtgtagcg
300
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcggcttttt ggtctgtaac
360
tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc
420
cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agctaacgca
480
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg
540
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt
600
cttgacatcc tctgacaact ctagagatag agcgttcccc ttcgggggac agagtgacag
660
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacg
717
<210> 112
<211> 718
<212> ДНК
<213> Bacillus aryabhattai
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 112
tctganggnn cacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag
60
ggaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg
120
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt
180
gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg
240
tggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga gaaaagcgga attccacgtg
300
tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcggc tttttggtct
360
gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc
420
cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt gctgcagcta
480
acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac
540
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac
600
caggtcttga catcctctga caactctaga gatagagcgt tccccttcgg gggacagagt
660
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgc
718
<210> 113
<211> 716
<212> ДНК
<213> Bacillus flexus
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 113
ggancaacgc cgcgtgagtg angaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag
60
aacaagtaca agagtaactg cttgtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa
120
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg
180
taaagcgcgc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag
240
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagagaaaa gcggaattcc acgtgtagcg
300
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcggcttttt ggtctgtaac
360
tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc
420
cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agctaacgca
480
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg
540
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt
600
cttgacatcc tctgacaact ctagagatag agcgttcccc ttcgggggac agagtgacag
660
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaac
716
<210> 114
<211> 676
<212> ДНК
<213> Paracoccus kondratievae
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 114
gccgcgtgag tgnnnaagnc cctagggttg taaagctctt tcanctggga agataatgac
60
tgtaccagca gaagaagccc cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg
120
gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggaccgg aaagttgggg
180
gtgaaatccc ggggctcaac cccggaactg ccttcaaaac tatcggtctg gagttcgaga
240
gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt
300
ggcgaaggcg gctcactggc tcgatactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac
360
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgccagtcgt cgggcagcat
420
gctgttcggt gacacaccta acggattaag cattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat
480
taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga
540
agcaacgcgc agaaccttac caacccttga catcccagga cagcccgaga gatcgggtct
600
ccacttcggt ggcctggaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg
660
ttcggttaag tccggc
676
<210> 115
<211> 728
<212> ДНК
<213> Enterobacter cloacae
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (719)..(719)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (721)..(722)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 115
ctgnngcagc cntgccgcgt gtatgaagaa ggncttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg
60
ggaggaaggt gttgtggtta ataaccacag caattgacgt tacccgcaga agaagcaccg
120
gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact
180
gggcgtaaag cgcacgcagg cggtctgtca agtcggatgt gaaatccccg ggctcaacct
240
gggaactgca ttcgaaactg gcaggctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg
300
tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca
360
aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc
420
cacgccgtaa acgatgtcga tttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa
480
cgcgttaaat cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg
540
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc
600
tggtcttgac atccacagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga actgtgagac
660
aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacna
720
nncgcaac
728
<210> 116
<211> 717
<212> ДНК
<213> Bacillus nealsonii
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 116
tgnngganca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaaactc tgttgttagg
60
gaagaacaag tacgagagta actgctcgta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg
120
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg
180
ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcctttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt
240
ggagggtcat tggaaactgg gggacttgag tgcagaagag aagagtggaa ttccacgtgt
300
agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctttggtctg
360
taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc
420
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagcaaa
480
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg
540
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc
600
aggtcttgac atctcctgac aatcctagag ataggacgtt ccccttcggg ggacaggatg
660
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgc
717
<210> 117
<211> 702
<212> ДНК
<213> Bacillus subtilis
<400> 117
cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt
60
gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt
120
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg
180
gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat
240
tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa
300
tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc
360
tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa
420
cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc
480
actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca
540
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac
600
atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca
660
tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cc
702
<210> 118
<211> 680
<212> ДНК
<213> Alcaligenes faecalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (262)..(264)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (272)..(273)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 118
cttcgggttg taaagtactt ttggcagaga agaaaaggta tctcctaata cgagatactg
60
ctgacggtat ctgcagaata agcaccggct aactacgtgc cancagccgc ggtaatacgt
120
agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt gtgtaggcgg ttcggaaaga
180
aagatgtgaa atcccagggc tcaaccttgg aactgcattt ttaactgccg agctagagta
240
tgtcagaggg gggtagaatt cnnntgtagc anngaaatgc gtagatatgt ggaggaatac
300
cgatggcgaa ggcagccccc tgggataata ctgacgctca gacacgaaag cgtggggagc
360
aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccctaaacga tgtcaactag ctgttggggc
420
cgttaggcct tagtagcgca gctaacgcgt gaagttgacc gcctggggag tacggtcgca
480
agattaaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc ggtggatgat gtggattaat
540
tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctaccc ttgacatgtc tggaaagccg aagagatttg
600
gccgtgctcg caagagaacc ggaacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt
660
gagatgttgg gttaagtccc
680
<210> 119
<211> 640
<212> ДНК
<213> Paenibacillus massiliensis
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(17)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(67)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (121)..(121)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (162)..(162)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (164)..(164)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (185)..(185)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (189)..(190)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (193)..(193)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (210)..(211)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (217)..(217)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (229)..(229)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (232)..(232)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (234)..(234)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (240)..(240)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (242)..(242)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (251)..(251)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (256)..(256)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (259)..(259)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (262)..(262)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (284)..(284)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (289)..(289)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (292)..(292)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (314)..(314)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (320)..(320)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (332)..(332)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (341)..(341)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (344)..(344)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (347)..(347)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (350)..(350)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (352)..(352)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (364)..(365)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (373)..(373)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (383)..(383)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (388)..(388)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (391)..(391)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (404)..(404)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (417)..(418)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (420)..(420)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (424)..(424)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (428)..(428)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (432)..(432)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (434)..(434)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (443)..(444)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (446)..(446)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (450)..(450)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (455)..(455)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (471)..(472)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (475)..(475)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (477)..(477)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (490)..(490)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (492)..(496)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (501)..(501)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (503)..(503)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (506)..(506)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (509)..(509)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (516)..(517)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (519)..(519)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (530)..(530)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (538)..(538)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (540)..(540)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (544)..(544)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (546)..(546)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (551)..(551)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (562)..(562)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (564)..(564)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (571)..(572)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (589)..(589)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (594)..(594)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (597)..(598)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (602)..(602)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (607)..(608)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (610)..(610)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (624)..(624)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (633)..(633)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (635)..(635)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (637)..(640)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 119
cttanngnnt gannnnnctt gnnaanaaag ccccggctaa ctacntgcca ncanccgcgg
60
taatacntan ggngcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggtc
120
ntttaagtct ggtgtttaag cccggggctc aaccccggat cncncgggaa actggatgac
180
ttgantgcnn aanaagagag tggaattccn ngtgtancgg tgaaatgcnt ananatgtgn
240
angaacacca ntggcnaang cnactctctg ggctgtaact gacnctgang cncgaaagcg
300
tggggagcaa acangattan ataccctggt antccacgcc ntanacnatn antgctaggt
360
gttnngggtt tcnataccct tgntgccnaa nttaacacat taancactcc gcctggnnan
420
tacngtcnca anantgaaac tcnnangaan tgacngggac ccgcacaagc nntgnantat
480
gtggtttaan tnnnnncaac ncnaanaanc ttaccnngnc ttgacatctn aatgaccngn
540
gcananatgt ncctttcctt cngnacattc nngacaggtg gtgcatggnt gtcntcnnct
600
cntgtcnngn gatgttgggt taantccccg cancnannnn
640
<210> 120
<211> 678
<212> ДНК
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> misc_feature
<222> (425)..(425)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (548)..(548)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (640)..(640)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (661)..(661)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 120
aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc
60
taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc
120
gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa
180
gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag
240
agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa
300
ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt
360
agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc
420
cttantgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa
480
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca
540
acgcgaanaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc
600
ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcan ctcgtgtcgt gagatgttgg
660
nttaagtccc gcaacgag
678
<210> 121
<211> 743
<212> ДНК
<213> Bacillus megaterium
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (689)..(691)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (693)..(708)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (712)..(712)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (716)..(717)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (720)..(720)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (727)..(727)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (729)..(730)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (734)..(734)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<220>
<221> misc_feature
<222> (740)..(741)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 121
aagnctttcg gnncgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac aagtacgaga gtaactgctc
60
gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa
120
tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtttct
180
taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tggggaactt
240
gagtgcagaa gagaaaagcg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag
300
gaacaccagt ggcgaaggcg gctttttggt ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg
360
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt
420
tagagggttt ccgcccttta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta
480
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt
540
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaactcta
600
gagatagagc gttccccttc gggggacaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct
660
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccnn ncnnnnnnnn nnnnnnnntc tnaganncgn
720
gctgacnann ccangcaccn ngg
743
<210> 122
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 122
actcctacgg gaggcagcag t
21
<210> 123
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 123
gggttgcgct cgttgc
16
<210> 124
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 124
gggttgcgct cgttac
16
<---
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу защиты растения от патогена, включающему введение рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus, экспрессирующей гибридный белок, в растительную ростовую среду или применение рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus, экспрессирующей гибридный белок, к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растения, к рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus для защиты растения от патогена, экспрессирующей гибридный белок, а также к препарату, содержащему вышеуказанную бактерию. Также раскрыто семя растения, покрытое препаратом для покрытия семян, содержащим рекомбинантную бактерию группы Bacillus cereus и сельскохозяйственно приемлемый носитель. Изобретение эффективно для защиты растения от патогена. 7 н. и 29 з.п. ф-лы, 2 ил., 31 табл., 39 пр.
1. Способ защиты растения от патогена, включающий введение рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus, экспрессирующей гибридный белок, в растительную ростовую среду или применение рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus, экспрессирующей гибридный белок, к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растения, где гибридный белок содержит:
а) по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает гарпин, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин, пептид флагеллина, бактериоцин, лизоцим, пептид лизоцима, сидерофор, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина, TasA, инсектицидный бактериальный токсин, эндотоксин, Cry токсин, белок или пептид - ингибитор протеазы, хитиназу, протеазу, лактоназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозиназу, хитиназу, хитозиназоподобный фермент, литиказу, пептидазу, протеиназу, мутанолизин и стафолисин, и
b) сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, где сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория выбирают из группы, состоящей из:
(a) сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 43% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере примерно 54%;
(b) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(c) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(d) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 1;
(e) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 2;
(f) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(g) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(h) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 3;
(i) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 4;
(j) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(k) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 23–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(l) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 5;
(m) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 6;
(n) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(o) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 13–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(p) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 7;
(q) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 8;
(r) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(s) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(t) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 9;
(u) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 10;
(v) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(w) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(x) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 11;
(y) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 12;
(z) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(aa) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(ab) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 13;
(ac) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 14;
(ad) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(ae) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(af) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 15;
(ag) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 16;
(ah) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(ai) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(aj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 17;
(ak) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 18;
(al) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(am) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(an) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 19;
(ao) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 20;
(ap) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(aq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(ar) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 21;
(as) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 22;
(at) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(au) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(av) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 23;
(aw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 24;
(ax) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(ay) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(az) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 25;
(ba) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 26;
(bb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 27;
(be) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 28;
(bf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 29;
(bi) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 30;
(bj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bk) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 31;
(bm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 32;
(bn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–15 последовательности SEQ ID NO: 33;
(bo) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 33;
(bp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 34;
(bq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–16 последовательности SEQ ID NO: 35;
(br) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 35;
(bs) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 36;
(bt) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bu) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bv) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 43;
(bw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 44;
(bx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(by) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(bz) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 45;
(ca) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 46;
(cb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 47;
(ce) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 48;
(cf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(cg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 17–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(ch) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 49;
(ci) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 50;
(cj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(ck) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(cl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 51;
(cm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 52;
(cn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(co) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(cp) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 53;
(cq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 54;
(cr) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(cs) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(ct) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 55;
(cu) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 56;
(cv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 115–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cx) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 57;
(cy) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 58;
(cz) фрагмента белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 59;
(da) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 60;
(db) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 61;
(dc) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 62;
(dd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 63;
(de) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 64;
(df) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 65;
(dg) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 66;
(dh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 67;
(di) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 68;
(dj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 69;
(dk) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 70;
(dl) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 71;
(dm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 72;
(dn) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 73;
(do) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 74;
(dp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 76;
(dq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 77;
(dr) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 80;
(ds) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 81;
(dt) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 83;
(du) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 84;
(dv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–33 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dy) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–23 последовательности SEQ ID NO: 3;
(dz) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–25 последовательности SEQ ID NO: 3; или
(ea) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–23 последовательности SEQ ID NO: 3.
2. Семя растения, покрытое препаратом для покрытия семян, содержащим рекомбинантную бактерию группы Bacillus cereus и сельскохозяйственно приемлемый носитель, где указанное семя служит для получения растения, имеющего повышенную защиту от патогена по сравнению с растением, выращенным из семени, не покрытого препаратом для покрытия семян, и где рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus содержит вектор или модифицированную хромосомную ДНК, кодирующую гибридный белок, где рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus экспрессирует гибридный белок, и гибридный белок содержит:
а) по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает гарпин, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин, пептид флагеллина, бактериоцин, лизоцим, пептид лизоцима, сидерофор, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина, TasA, инсектицидный бактериальный токсин, эндотоксин, Cry токсин, белок или пептид - ингибитор протеазы, хитиназу, протеазу, лактоназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозиназу, хитиназу, хитозиназоподобный фермент, литиказу, пептидазу, протеиназу, мутанолизин и стафолисин, и
b) сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, где сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория выбирают из группы, состоящей из:
(a) сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 43% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере примерно 54%;
(b) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(c) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(d) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 1;
(e) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 2;
(f) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(g) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(h) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 3;
(i) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 4;
(j) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(k) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 23–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(l) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 5;
(m) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 6;
(n) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(o) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 13–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(p) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 7;
(q) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 8;
(r) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(s) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(t) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 9;
(u) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 10;
(v) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(w) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(x) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 11;
(y) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 12;
(z) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(aa) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(ab) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 13;
(ac) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 14;
(ad) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(ae) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(af) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 15;
(ag) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 16;
(ah) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(ai) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(aj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 17;
(ak) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 18;
(al) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(am) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(an) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 19;
(ao) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 20;
(ap) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(aq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(ar) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 21;
(as) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 22;
(at) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(au) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(av) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 23;
(aw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 24;
(ax) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(ay) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(az) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 25;
(ba) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 26;
(bb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 27;
(be) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 28;
(bf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 29;
(bi) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 30;
(bj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bk) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 31;
(bm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 32;
(bn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–15 последовательности SEQ ID NO: 33;
(bo) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 33;
(bp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 34;
(bq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–16 последовательности SEQ ID NO: 35;
(br) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 35;
(bs) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 36;
(bt) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bu) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bv) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 43;
(bw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 44;
(bx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(by) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(bz) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 45;
(ca) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 46;
(cb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 47;
(ce) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 48;
(cf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(cg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 17–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(ch) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 49;
(ci) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 50;
(cj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(ck) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(cl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 51;
(cm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 52;
(cn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(co) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(cp) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 53;
(cq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 54;
(cr) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(cs) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(ct) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 55;
(cu) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 56;
(cv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 115–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cx) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 57;
(cy) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 58;
(cz) фрагмента белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 59;
(da) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 60;
(db) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 61;
(dc) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 62;
(dd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 63;
(de) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 64;
(df) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 65;
(dg) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 66;
(dh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 67;
(di) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 68;
(dj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 69;
(dk) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 70;
(dl) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 71;
(dm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 72;
(dn) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 73;
(do) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 74;
(dp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 76;
(dq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 77;
(dr) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 80;
(ds) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 81;
(dt) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 83;
(du) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 84;
(dv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–33 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dy) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–23 последовательности SEQ ID NO: 3;
(dz) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–25 последовательности SEQ ID NO: 3; или
(ea) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–23 последовательности SEQ ID NO: 3.
3. Рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus для защиты растения от патогена, которая экспрессирует гибридный белок, где рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus содержит вектор или модифицированную хромосомную ДНК, кодирующую гибридный белок, где рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus экспрессирует гибридный белок, и гибридный белок содержит:
а) по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает гарпин, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин, пептид флагеллина, бактериоцин, лизоцим, пептид лизоцима, сидерофор, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина, TasA, инсектицидный бактериальный токсин, эндотоксин, Cry токсин, белок или пептид - ингибитор протеазы, хитиназу, протеазу, лактоназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозиназу, хитиназу, хитозиназоподобный фермент, литиказу, пептидазу, протеиназу, мутанолизин и стафолисин, и
b) сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, где сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория выбирают из группы, состоящей из:
(a) сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 43% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере примерно 54%;
(b) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(c) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(d) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 1;
(e) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 2;
(f) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(g) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(h) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 3;
(i) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 4;
(j) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(k) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 23–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(l) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 5;
(m) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 6;
(n) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(o) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 13–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(p) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 7;
(q) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 8;
(r) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(s) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(t) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 9;
(u) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 10;
(v) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(w) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(x) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 11;
(y) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 12;
(z) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(aa) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(ab) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 13;
(ac) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 14;
(ad) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(ae) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(af) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 15;
(ag) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 16;
(ah) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(ai) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(aj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 17;
(ak) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 18;
(al) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(am) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(an) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 19;
(ao) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 20;
(ap) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(aq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(ar) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 21;
(as) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 22;
(at) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(au) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(av) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 23;
(aw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 24;
(ax) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(ay) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(az) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 25;
(ba) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 26;
(bb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 27;
(be) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 28;
(bf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 29;
(bi) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 30;
(bj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bk) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 31;
(bm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 32;
(bn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–15 последовательности SEQ ID NO: 33;
(bo) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 33;
(bp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 34;
(bq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–16 последовательности SEQ ID NO: 35;
(br) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 35;
(bs) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 36;
(bt) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bu) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bv) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 43;
(bw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 44;
(bx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(by) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(bz) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 45;
(ca) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 46;
(cb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 47;
(ce) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 48;
(cf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(cg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 17–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(ch) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 49;
(ci) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 50;
(cj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(ck) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(cl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 51;
(cm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 52;
(cn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(co) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(cp) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 53;
(cq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 54;
(cr) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(cs) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(ct) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 55;
(cu) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 56;
(cv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 115–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cx) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 57;
(cy) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 58;
(cz) фрагмента белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 59;
(da) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 60;
(db) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 61;
(dc) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 62;
(dd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 63;
(de) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 64;
(df) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 65;
(dg) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 66;
(dh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 67;
(di) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 68;
(dj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 69;
(dk) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 70;
(dl) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 71;
(dm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 72;
(dn) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 73;
(do) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 74;
(dp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 76;
(dq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 77;
(dr) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 80;
(ds) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 81;
(dt) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 83;
(du) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 84;
(dv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–33 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dy) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–23 последовательности SEQ ID NO: 3;
(dz) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–25 последовательности SEQ ID NO: 3; или
(ea) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–23 последовательности SEQ ID NO: 3.
4. Гибридный белок для защиты растения от патогена, где гибридный белок содержит:
а) по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает гарпин, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланин аммиак-лиазу, элиситин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин, пептид флагеллина, бактериоцин, лизоцим, пептид лизоцима, сидерофор, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина, TasA, инсектицидный бактериальный токсин, эндотоксин, Cry токсин, белок или пептид - ингибитор протеазы, хитиназу, протеазу, лактоназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозиназу, хитиназу, хитозиназоподобный фермент, литиказу, пептидазу, протеиназу, мутанолизин и стафолисин, и
b) сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, где сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория выбирают из группы, состоящей из:
(a) сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 43% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере примерно 54%;
(b) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(c) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(d) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 1;
(e) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 2;
(f) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(g) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(h) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 3;
(i) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 4;
(j) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(k) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 23–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(l) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 5;
(m) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 6;
(n) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(o) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 13–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(p) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 7;
(q) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 8;
(r) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(s) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(t) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 9;
(u) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 10;
(v) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(w) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(x) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 11;
(y) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 12;
(z) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(aa) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(ab) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 13;
(ac) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 14;
(ad) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(ae) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(af) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 15;
(ag) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 16;
(ah) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(ai) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(aj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 17;
(ak) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 18;
(al) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(am) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(an) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 19;
(ao) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 20;
(ap) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(aq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(ar) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 21;
(as) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 22;
(at) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(au) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(av) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 23;
(aw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 24;
(ax) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(ay) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(az) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO:25;
(ba) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 26;
(bb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 27;
(be) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 28;
(bf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 29;
(bi) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 30;
(bj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bk) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 31;
(bm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 32;
(bn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–15 последовательности SEQ ID NO: 33;
(bo) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 33;
(bp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 34;
(bq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–16 последовательности SEQ ID NO: 35;
(br) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 35;
(bs) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 36;
(bt) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bu) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bv) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 43;
(bw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 44;
(bx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(by) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(bz) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 45;
(ca) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 46;
(cb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 47;
(ce) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 48;
(cf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(cg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 17–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(ch) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 49;
(ci) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 50;
(cj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(ck) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(cl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 51;
(cm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 52;
(cn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(co) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(cp) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 53;
(cq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 54;
(cr) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(cs) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(ct) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 55;
(cu) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 56;
(cv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 115–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cx) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 57;
(cy) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 58;
(cz) фрагмента белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 59;
(da) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 60;
(db) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 61;
(dc) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 62;
(dd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 63;
(de) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 64;
(df) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 65;
(dg) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 66;
(dh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 67;
(di) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 68;
(dj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 69;
(dk) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 70;
(dl) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 71;
(dm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 72;
(dn) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 73;
(do) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 74;
(dp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 76;
(dq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 77;
(dr) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 80;
(ds) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 81;
(dt) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 83;
(du) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 84;
(dv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–33 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dy) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–23 последовательности SEQ ID NO: 3;
(dz) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–25 последовательности SEQ ID NO: 3; или
(ea) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–23 последовательности SEQ ID NO: 3.
5. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3 или гибридный белок по п. 4, где сигнальная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 62% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере 72%.
6. Способ, семя растения, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus или гибридный белок по п. 5, где сигнальная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 81% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере 90%.
7. Способ, семя растения, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus или гибридный белок по п. 6, где сигнальная последовательность состоит из:
(a) аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и имеющей по меньшей мере 43% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере 54%;
(b) аминокислот 1–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(c) аминокислот 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(d) SEQ ID NO: 1; или
(e) SEQ ID NO: 60.
8. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3 или гибридный белок по п. 4, где гибридный белок содержит белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84.
9. Гибридный белок по п. 8, содержащий белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84; или фрагмент белка экзоспория, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 59.
10. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3 или гибридный белок по п. 4, где гибридный белок содержит аминокислотный линкер между сигнальной последовательностью или белком экзоспория и по меньшей мере одним белком или пептидом, который защищает растение от патогена, где линкер необязательно включает полиаланиновый линкер, полиглициновый линкер или линкер, содержащий смесь остатков аланина и глицина; и/или сайт распознавания протеазой.
11. Способ, семя растения, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus или гибридный белок по п. 10, где линкер включает:
полиаланиновый линкер, полиглициновый линкер или линкер, содержащий смесь остатков аланина и глицина; и/или
сайт распознавания протеазой.
12. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3 или гибридный белок по п. 4, где пептид флагеллина включает flg22.
13. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3 или гибридный белок по п. 4, где пептид лизоцима включает LysM или где пептид лактоферрина включает LfcinB.
14. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3 или гибридный белок по п. 4, причем белок или пептид, защищающий растение от патогена, включает инсектицидный бактериальный токсин, эндотоксин, Cry токсин, белок или пептид - ингибитор протеазы, цистеиновую протеазу или хитиназу.
15. Способ, семя растения, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus или гибридный белок по п. 14, причем белок или пептид, защищающий растение от патогена, включает инсектицидный бактериальный токсин и инсектицидный бактериальный токсин включает инсектицидный токсин VIP; где белок или пептид, защищающий растение от патогена, включает белок или пептид - ингибитор протеазы и белок или пептид - ингибитор протеазы включает ингибитор трипсина или стреловидный ингибитор протеазы; или где белок или пептид, защищающий растение от патогена, включает Cry токсин и Cry токсин включает Cry токсин из Bacillus thuringiensis.
16. Способ, семя растения, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus или гибридный белок по п. 15, где Cry токсин включает Cry токсин из Bacillus thuringiensis и Cry токсин, включающий Cry токсин из Bacillus thuringiensis, включает Cry5B белок или Cry21A белок.
17. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по. 3 или гибридный белок по п. 4, где гибридный белок включает протеазу или лактоназу.
18. Способ, семя растения, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus или гибридный белок по п. 17, где лактоназа включает 1,4-лактоназу, 2-пирон-4,6-дикарбоксилат-лактоназу, 3-оксоадипат-енол-лактоназу, актиномицин-лактоназу, дезоксилимонат-А-кольцевую-лактоназу, глюконолактоназу, L-рамноно-1,4-лактоназу, лимонин-D-кольцевую-лактоназу, стероид-лактоназу, триацетат-лактоназу или ксилоно-1,4-лактоназу.
19. Способ по п. 1, семя растения по п. 2, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3 или гибридный белок по п. 4, где гибридный белок включает β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозиназу, хитиназу, хитозиназоподобный фермент, литиказу, пептидазу, протеиназу, протеазу, мутанолизин, стафолисин или лизоцим.
20. Способ, семя растения, рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus или гибридный белок по п. 19, где протеаза включает щелочную протеазу, кислую протеазу или нейтральную протеазу.
21. Рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus, которая коэкспрессирует по меньшей мере один гибридный белок, содержащий по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена, по п. 4 или 9 и по меньшей мере один гибридный белок, содержащий:
a) белок или пептид, связывающийся с растением, где белок или пептид, связывающийся с растением включает адгезин, флагеллин, омпин, лектин, экспансин, структурный белок биопленки белок пилуса, белок curlus, интимин, инвазин, агглютинин или нефимбриальный белок; и
b) сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, где сигнальную последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория выбирают из группы, состоящей из:
(a) сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 43% идентичность аминокислотам 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислотам 25–35 составляет по меньшей мере примерно 54%;
(b) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(c) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 1;
(d) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 1;
(e) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 2;
(f) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(g) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 3;
(h) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 3;
(i) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 4;
(j) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(k) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 23–38 последовательности SEQ ID NO: 5;
(l) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 5;
(m) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 6;
(n) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(o) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 13–28 последовательности SEQ ID NO: 7;
(p) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 7;
(q) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 8;
(r) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(s) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 9;
(t) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 9;
(u) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 10;
(v) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(w) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 11;
(x) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 11;
(y) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 12;
(z) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(aa) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 13;
(ab) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 13;
(ac) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 14;
(ad) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(ae) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 15;
(af) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 15;
(ag) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 16;
(ah) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(ai) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–27 последовательности SEQ ID NO: 17;
(aj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 17;
(ak) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 18;
(al) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(am) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 19;
(an) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 19;
(ao) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 20;
(ap) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(aq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 21;
(ar) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 21;
(as) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 22;
(at) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(au) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 23;
(av) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 23;
(aw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 24;
(ax) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(ay) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 25;
(az) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 25;
(ba) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 26;
(bb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 27;
(bd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 27;
(be) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 28;
(bf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 29;
(bh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 29;
(bi) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 30;
(bj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bk) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 9–24 последовательности SEQ ID NO: 31;
(bl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 31;
(bm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 32;
(bn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–15 последовательности SEQ ID NO: 33;
(bo) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 33;
(bp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 34;
(bq) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–16 последовательности SEQ ID NO: 35;
(br) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 35;
(bs) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 36;
(bt) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bu) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–29 последовательности SEQ ID NO: 43;
(bv) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 43;
(bw) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 44;
(bx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(by) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–35 последовательности SEQ ID NO: 45;
(bz) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 45;
(ca) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 46;
(cb) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cc) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 28–43 последовательности SEQ ID NO: 47;
(cd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 47;
(ce) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 48;
(cf) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(cg) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 17–32 последовательности SEQ ID NO: 49;
(ch) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 49;
(ci) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 50;
(cj) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(ck) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 51;
(cl) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 51;
(cm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 52;
(cn) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(co) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 18–33 последовательности SEQ ID NO: 53;
(cp) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 53;
(cq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 54;
(cr) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(cs) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 15–30 последовательности SEQ ID NO: 55;
(ct) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 55;
(cu) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 56;
(cv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 1–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 115–130 последовательности SEQ ID NO: 57;
(cx) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 57;
(cy) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 58;
(cz) фрагмента белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 59;
(da) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 60;
(db) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 61;
(dc) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 62;
(dd) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 63;
(de) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 64;
(df) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 65;
(dg) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 66;
(dh) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 67;
(di) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 68;
(dj) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 69;
(dk) сигнальной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 70;
(dl) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 71;
(dm) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 72;
(dn) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 73;
(do) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 74;
(dp) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 76;
(dq) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 77;
(dr) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 80;
(ds) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 81;
(dt) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 83;
(du) белка экзоспория, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность SEQ ID NO: 84;
(dv) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dw) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 22–33 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dx) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 20–31 последовательности SEQ ID NO: 1;
(dy) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–23 последовательности SEQ ID NO: 3;
(dz) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 14–25 последовательности SEQ ID NO: 3; или
(ea) сигнальной последовательности, содержащей аминокислоты 12–23 последовательности SEQ ID NO: 3.
22. Рекомбинантная бактерия группы по п. 21, где белок или пептид, связывающийся с растением, включает адгезин, где адгезин включает необязательно рикфлагелин, флагеллин, омпин, лектин, экспансин, структурный белок биопленки, где структурный белок включает необязательно TasA или YuaB, белок пилуса, белок curlus, интимин, инвазин, агглютинин или нефимбриальный белок.
23. Способ по п. 1, семя растения по п. 2 или рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3, где рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus включает Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis или их комбинацию.
24. Способ по п. 1, семя растения по п. 2 или рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3, где рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus включает штамм бактерий, стимулирующий рост растения, где штамм бактерий, стимулирующий рост растения, необязательно: продуцирует инсектицидный токсин, продуцирует фунгицидное соединение, где указанное соединение необязательно включает β-1,3-глюканазу, хитозиназу, литиказу или их комбинацию, продуцирует нематоцидное соединение, продуцирует бактерицидное соединение, является устойчивым к одному или более антибиотикам, содержит одну или более самостоятельно реплицирующихся плазмид, прикрепляется к корням растений, колонизирует корни растений, формирует биопленки, растворяет питательные вещества, секретирует органические кислоты или их комбинации.
25. Способ по п. 1, семя растения по п. 2 или рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3, где рекомбинантная бактерия группы Bacillus включает:
Bacillus mycoides BT155 с номером NRRL No. B-50921,
Bacillus mycoides EE118 с номером NRRL No. B-50918,
Bacillus mycoides EE141 с номером NRRL No. B-50916,
Bacillus mycoides BT46-3 с номером NRRL No. B-50922,
Bacillus sp. EE128 с номером NRRL No. B-50917,
Bacillus thuringiensis BT013A с номером NRRL No. B-50924 или
Bacillus sp. EE349 с номером NRRL No. B-50928.
26. Рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus, семя растения или способ по п. 25, где гибридный белок содержит сигнальную последовательность SEQ ID NO: 60.
27. Способ по п. 1, семя растения по п. 2 или рекомбинантная бактерия группы Bacillus cereus по п. 3, где гибридный белок экспрессируется под контролем споруляционного промотора, нативного по отношению к сигнальной последовательности, белку экзоспория в гибридном белке, и/или где гибридный белок экспрессируется под контролем сильного споруляционного промотора; причем сильный споруляционный промотор необязательно включает промоторную последовательность сигма-K, специфическую для полимеразы споруляции, промоторную последовательность или последовательности сигма-K, специфические для полимеразы споруляции, необязательно имеющие 100% идентичности с соответствующими нуклеотидами из SEQ ID NO: 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 или 103; и/или промотор споруляции необязательно включает нуклеотидную последоваительность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью любой из SEQ ID NO: 85–103.
28. Препарат для защиты растения от патогена, содержащий рекомбинантную бактерию группы Bacillus cereus по п. 3 и сельскохозяйственно приемлемый носитель, причем:
сельскохозяйственно приемлемый носитель необязательно включает диспергирующее вещество, сурфактант, где сурфактант необязательно включает тяжелое нефтяное масло, тяжелый нефтяной дистиллят, сложный эфир полиола жирной кислоты, полиэтоксилированный эфир жирной кислоты, арилалкил полиоксиэтиленгликоля, алкиламин ацетат, алкиларилсульфонат, многоатомный спирт, алкилфосфат или их комбинацию, примесь, где примесь необязательно включает масло, камедь, смолу, глину, полиоксиэтиленгликоль, терпен, вязкую органику, сложный эфир жирной кислоты, сульфатированный спирт, алкилсульфонат, нефтяной сульфонат, сульфат спирта, алкил бутан диамат натрия, полиэфир тиобутандиоата натрия, производное бензол-ацетонитрила, белковый материал или их комбинацию, воду, загуститель, где загуститель необязательно включает алкилсульфонат с длинной цепью полиэтиленгликоля, полиоксиэтиленолеат или их комбинацию, противослеживающий агент, где указанный агент необязательно включает соль натрия, карбонат кальция, диатомит или их комбинацию, противоосадочное вещество, компостирующий препарат, гранулированную подкормку, диатомит, масло, краситель, стабилизатор, консервант, полимер, пленку или их комбинацию;
данный преперат необязательно включает препарат для покрытия семян, где указанный препарат необязательно включает раствор на водной или масляной основе, применяемый для семян, или порошок, или гранулированный препарат, применяемый для семян, жидкий препарат, применяемый для растений или для растительных ростовых сред, где указанная среда необязательно включает концентрированный препарат или препарат, готовый для использования, или твердый препарат, применяемый для растений или для растительных ростовых сред, где среда необязательно включает гранулированный препарат или порошковое вещество;
данный препарат необязательно дополнительно включает удобрение, материал микроэлементов удобрения, инсектицид, гербицид, вещество, улучшающее рост растений, фунгицид, инсектицид, моллюскоцид, альгицид, бактериальный инокулянт, грибковый инокулянт или их комбинацию; и/или
сельскохозяйственно приемлемый носитель включает вермикулит, древесный уголь, отходы сатурационного пресса сахарного завода, рисовую шелуху, карбоксиметилцеллюлозу, торф, перлит, мелкий песок, карбонат кальция, муку, квасцы, крахмал, тальк, поливинилпирролидон или их комбинацию.
29. Препарат по п. 28, где бактериальный инокулянт включает штамм бактерий, стимулирующий рост растения, причем штамм бактерий, стимулирующий рост растения, необязательно: продуцирует инсектицидный токсин, продуцирует фунгицидное соединение, где указанное соединение необязательно включает β-1,3-глюканазу, хитозиназу, литиказу или их комбинацию, продуцирует нематоцидное соединение, продуцирует бактерицидное соединение, является устойчивым к одному или более антибиотикам, содержит одну или более самостоятельно реплицирующихся плазмид, прикрепляется к корням растений, колонизирует корни растений, формирует биопленки, растворяет питательные вещества, секретирует органические кислоты или их комбинации.
30. Препарат по п. 29, где штамм бактерий, стимулирующий рост растения, включает:
Bacillus aryabhattai CAP53 с номером NRRL No. B-50819,
Bacillus aryabhattai CAP56 с номером NRRL No. B-50817,
Bacillus flexus BT054 с номером NRRL No. B-50816,
Paracoccus kondratievae NC35 с номером NRRL No. B-50820,
Bacillus mycoides BT155 с номером NRRL No. B-50921,
Enterobacter cloacae CAP12 с номером NRRL No. B-50822,
Bacillus nealsonii BOBA57 с номером NRRL No. B-50821,
Bacillus mycoides EE118 с номером NRRL No. B-50918,
Bacillus subtilis EE148 с номером NRRL No. B-50927,
Alcaligenes faecalis EE107 с номером NRRL No. B-50920,
Bacillus mycoides EE141 с номером NRRL No. B-50916,
Bacillus mycoides BT46-3 с номером NRRL No. B-50922,
Bacillus cereus sp. EE128 с номером NRRL No. B-50917,
Bacillus thuringiensis BT013A с номером NRRL No. B-50924,
Paenibacillus massiliensis BT23 с номером NRRL No. B-50923,
Bacillus cereus sp. EE349 с номером NRRL No. B-50928,
Bacillus subtilis EE218 с номером NRRL No. B-50926,
Bacillus megaterium EE281 с номером NRRL No. B-50925 или
их комбинацию.
31. Способ защиты растения от патогена, включающий:
введение в среду для роста растений рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus по п. 3 или препарата по п. 28; или
применение к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растения, рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus по п. 3 или препарата по п. 28;
где гибридный белок содержит по меньшей мере один белок или пептид, который защищает растение от патогена.
32. Способ по п. 1, дополнительно включающий инактивацию рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus до введения в среду для роста растений или применения к растению, семени растения или области, окружающей растение или семя растения; причем рекомбинантная бактерия Bacillus cereus необязательно инактивируется термической обработкой; гамма-облучением; рентгеновским облучением; УФ-А облучением; УФ-В облучением; обработкой глютаровым альдегидом, формальдегидом, перекисью водорода, уксусной кислотой, отбеливателем или их комбинацией.
33. Способ по п. 1, включающий покрытие семян рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus или препаратом, содержащим рекомбинантную бактерию группы Bacillus cereus, до посадки.
34. Способ п. 1, включающий применение рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus или препарата, содержащего рекомбинантную бактерию группы Bacillus cereus, к надземной части растения.
35. Способ по п. 1, где введение рекомбинантной бактерии группы Bacillus cereus в среду для роста растений включает применение жидкого или твердого препарата, содержащего рекомбинантную бактерию группы Bacillus cereus, для среды.
36. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного агрохимиката в среду для роста растений или применение по меньшей мере одного агрохимиката к растениям или семенам, причем агрохимикат включает удобрение, материал микроэлементов удобрения, инсектицид, гербицид, фунгицид, моллюскоцид, альгицид, вещество, улучшающее рост растений, бактериальный инокулянт, грибковый инокулянт или их комбинацию, причем:
удобрение включает жидкое удобрение;
материал микроэлементов удобрения включает борную кислоту, борат, борную фритту, сульфат меди, медную фритту, хелат меди, декагидрат тетрабората натрия, сульфат железа, оксид железа, сульфат железа-аммония, железную фритту, хелат железа, сульфат марганца, оксид марганца, хелат марганца, хлорид марганца, марганцевую фритту, молибдат натрия, молибденовую кислоту, сульфат цинка, оксид цинка, карбонат цинка, цинковую фритту, фосфат цинка, хелат цинка или их комбинацию;
инсектицид включает органофосфат, карбамат, пиретроид, акарицид, алкил-фталат, борную кислоту, борат, фторид, серу, мочевину, замещенную ароматическим галоидом, эфир насыщенного спирта, инсектицид на биологической основе или их комбинацию;
гербицид включает хлорфенокси соединение, нитрофенольное соединение, соединение нитрокрезола, соединение дипиридила, ацетамид, алифатическую кислоту, анилид, бензамид, бензойную кислоту, производное бензойной кислоты, анисовую кислоту, производное анисовой кислоты, бензонитрил, бензотиадиазинона диоксид, тиокарбамат, карбамат, карбанилат, хлорпиридинил, производное циклогексенона, производное динитроаминобензола, соединение фтор-динитро-толуидин, изоксазолидинон, никотиновую кислоту, изопропиламин, производные изопропиламина, оксадиазолинон, фосфат, фталат, соединение пиколиновой кислоты, триазин, триазол, урацил, производное мочевины, эндотал, хлорат натрия или их комбинацию;
фунгицид включает замещенный бензол, тиокарбамат, этилен-бис-дитиокарбамат, тиофталид амид, соединение меди, ртутьорганическое соединение, оловоорганическое соединение, соединение кадмия, анилазин, беномил, циклогексамид, додин, этридиазол, ипродион, металаксил, тиамимефон, трифорин или их комбинацию;
грибковый инокулянт включает грибковый инокулянт из семейства Glomeraceae, грибковый инокулянт из семейства Claroidoglomeraceae, грибковый инокулянт из семейства Gigasporaceae, грибковый инокулянт из семейства Acaulosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Sacculosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Entrophosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Pacidsporaceae, грибковый инокулянт из семейства Diversisporaceae, грибковый инокулянт из семейства Paraglomeraceae, грибковый инокулянт из семейства Archaeosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Geosiphonaceae, грибковый инокулянт из семейства Ambisporaceae, грибковый инокулянт из семейства Scutellosporaceae, грибковый инокулянт из семейства Dentiscultataceae, грибковый инокулянт из семейства Racocetraceae, грибковый инокулянт из типа Basidiomycota, грибковый инокулянт из типа Ascomycota, грибковый инокулянт из типа Zygomycota или их комбинацию;
бактериальный инокулянт включает бактериальный инокулянт из рода Rhizobium, бактериальный инокулянт из рода Bradyrhizobium, бактериальный инокулянт из рода Mesorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Azorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Allorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Sinorhizobium, бактериальный инокулянт из рода Kluyvera, бактериальный инокулянт из рода Azotobacter, бактериальный инокулянт из рода Pseudomonas, бактериальный инокулянт из рода Azospirillium, бактериальный инокулянт из рода Bacillus, бактериальный инокулянт из рода Streptomyces, бактериальный инокулянт из рода Paenibacillus, бактериальный инокулянт из рода Paracoccus, бактериальный инокулянт из рода Enterobacter, бактериальный инокулянт из рода Alcaligenes, бактериальный инокулянт из рода Mycobacterium, бактериальный инокулянт из рода Trichoderma, бактериальный инокулянт из рода Gliocladium, бактериальный инокулянт из рода Glomus, бактериальный инокулянт из рода Klebsiella или их комбинацию; и/или
удобрение включает сульфат аммония, нитрат аммония, сульфат-нитрат аммония, хлорид аммония, бисульфат аммония, полисульфид аммония, тиосульфат аммония, водный раствор аммиака, безводный аммиак, полифосфат аммония, сульфат алюминия, нитрат кальция, известково-аммиачную селитру, сульфат кальция, обожжённый магнезит, кальцитовый известняк, оксид кальция, нитрат кальция, доломитовый известняк, гашеную известь, карбонат кальция, диаммонийфосфат, моноаммонийфосфат, нитрат магния, сульфат магния, нитрат калия, хлорид калия, сульфат калия-магния, сульфат калия, нитраты натрия, магнезиальный известняк, оксид магния, мочевину, карбамидоформальдегидные смолы, мочевино-аммониевый нитрат, покрытую серой мочевину, мочевину с полимерным покрытием, изобутилиден димочевину, K2SO4–2MgSO4, каинит, сильвинит, кизерит, эпсомскую соль, элементарную серу, мергель, измельченные устричные раковины, рыбную муку, жмыхи, рыбный тук, кровяную муку, фосфорит, суперфосфат, шлак, костную муку, древесную золу, навоз, гуано летучих мышей, торф, компост, зеленый песок, муку из семян хлопчатника, муку из перьев, муку из крабов, рыбную эмульсию, гуминовую кислоту или их комбинацию.
| US 6333302 B1, 25.12.2001 | |||
| ЕМКОСТНЫЙ ВЛАГОМЕР С ДАТЧИКОМ ДВУСТОРОННЕГО КОНТАКТА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ВЛАЖНОСТИ ЛИСТОВЫХМАТЕРИАЛОВ | 0 |
|
SU200232A1 |
| WO 2006012366 A2, 02.02.2006 | |||
| РЕГУЛИРУЮЩИЙ ВЫСОТУ РАСТЕНИЙ ГЕН И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2008 |
|
RU2458132C2 |
