Устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам Российский патент 2024 года по МПК G01N27/02 G01N33/569 G01N33/483 

Изобретение относится к устройствам, которые можно применять в экспериментальной медицине и биотехнологии при определении эффективных мер лечения хронических инфекционных заболеваний человека в условиях моделирования в доклинических экспериментах с использованием модулированных электромагнитных полей.

Наиболее близким, к предлагаемому, является устройство идентификации водного раствора, содержащем контейнер с фиксированным объемом тестируемого водного раствора (Пат. RU 122488, 2006). В устройство введены индуктивный датчик, генератор импульсов затухающих периодических колебаний, амплитудно-цифровой преобразователь, процессор, кроме того в контейнере жестко и герметично закреплены электроды, на расстоянии друг от друга и ниже верхнего уровня раствора, при этом индуктивный датчик жестко и герметично закреплен в контейнере в средней точке между электродами на одинаковом с ними уровне водного раствора, выходы генератора импульсов подключены к соответствующим электродам, а выход индуктивного датчика подключен к входу АЦП, выход которого подключен к информационному входу процессора. Кроме того, генератор импульсов затухающих периодических колебаний содержит генератор прямоугольных импульсов, параллельную RC-цепь с переменным резистором, подвижный контакт которого заземлен, и два последовательно соединенных тиристора, при этом выход генератора прямоугольных импульсов подключен к управляющему входу первого тиристора и, через линию задержки, - к управляющему входу второго тиристора, RC-цепь одной точкой соединения заземлена, а второй точкой соединения подключена между тиристорами, при этом выход второго тиристора является выходом генератора импульсов затухающих периодических колебаний.

Генератор импульсов формирует на выходе низкочастотную последовательность импульсов, каждый из которых возбуждает в LC-контуре затухающие периодические колебания. При этом катушка контура формирует вокруг себя импульсное ЭМП, каждый импульс которого также имеет вид затухающих периодических колебаний. Электромагнитное поле возбудителя наводит ЭДС в передающих катушках в виде затухающих периодических колебаний. Так как катушки в совокупности с подключенными к ним параллельно конденсаторами образуют параллельные колебательные контура, то катушки контуров индуцируют низкочастотное сложно модулированное ЭМП с параметрами, определяемыми параметрами образованных колебательных контуров. В измерительных катушках через пространство взаимодействия с передающими катушками и посредством общих сердечников также в виде затухающих периодических колебаний. Регистрируют параметры сложно модулированного электромагнитного поля, сформированного передающими катушками без идентифицируемого вещества и с ним. Усилитель сравнивает оба сигнала и формирует на своем выходе разностный сигнал, который и используют для идентификации вещества. Для чего соответствующими измерительными приборами анализируют спектральный состав разностного сигнала, измеряют нелинейные искажения и фазу. Для идентификации используют эталонную базу данных.

Недостаток известного устройства состоит, в первую очередь, в сложности использования для управления чувствительностью клеточных культур (КК) к вирусам, поскольку не позволяет осуществить широкополосную регуляцию частотно-амплитудных модуляций ИСМ ЭМП НЧУД в рамках заданной экспозиции воздействия из-за отсутствия модулирующего генератора. Кроме того, устройство с помощью индуктивного датчика фиксирует только искажения, сложно модулированного ЭМП при взаимодействии с тестируемым веществом, связанные с электродной поляризацией в растворе, соответственно не имеет возможности регистрировать изменение импеданса и поляризацию КК при взаимодействии с вирусами в контейнере-пробирке, а параметры таких изменений являются критериями обратной связи, определяющими чувствительность КК к вирусам и соответственно могут являться элементами управления. В этом случае мы имеем общую, суммарную картину, формируемую всеми составляющими водного раствора при взаимодействии с тестируемым электромагнитным полем, что не позволяет посредством известного устройства определить в растворе присутствие конкретных составляющих и снижает чувствительность и информативность известного устройства.

Поставленная задача - создание простого в использовании устройства для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам.

Сущность изобретения заключается в том, что в устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам, содержащее контейнер-пробирку с фиксированным объемом тестируемой клеточной культуры, индуктивный датчик, генератор импульсов затухающих периодических колебаний, процессор, введены второй генератор импульсов и таймер, задающий временной интервал воздействия электромагнитного поля, подключенный через процессор к блоку управления, а выход индуктивного датчика подключен к информационному входу процессора, через блок управления и одновременно к регистратору данных, получаемых от индуктивного датчика, обеспечивающего измерение значений импеданса и поляризации методом бесконтактной импедансометрии. Кроме того, к первому и второму генераторам импульсов затухающих периодических колебаний подсоединены две взаимно ориентированные плоские силовые индуктивности, при этом частотно-амплитудные модуляции формируемого силовыми индуктивностями электромагнитного поля определяются процессором в соответствии с данными зарегистрированными индуктивным датчиком, а время воздействия задается таймером, контейнер-пробирка с фиксированным объемом тестируемой клеточной культуры помещается между силовыми индуктивностями и индуктивным датчиком, таким образом, чтобы электромагнитное поле проходило через контейнер-пробирку к индуктивному датчику, при этом пространство между силовыми индуктивностями и индуктивным датчиком и контейнером-пробиркой заполняется контактным гелем.

Технический результат заключается в упрощении и в возможности осуществления управления чувствительностью клеточных культур к вирусам, за счет определения значений импеданса в объеме КК при воздействии вируса и соответствующего изменения поляризации конкретных составляющих раствора.

Признаки изобретения: «Устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам, содержащее контейнер-пробирку с фиксированным объемом тестируемой клеточной культуры, индуктивный датчик,., обеспечивающего измерение значений импеданса и поляризации методом бесконтактной импедансометрии... два генератора импульсов затухающих периодических колебаний... две взаимно ориентированные плоские силовые индуктивности, при этом частотно-амплитудные модуляции формируемого силовыми индуктивностями электромагнитного поля определяются процессором в соответствии с данными зарегистрированными индуктивным датчиком,...» являются неотъемлемой частью заявленного устройства и обеспечивают его работоспособность, а следовательно, обеспечивают достижение заявленного технического результата.

Вирусологические исследования с использованием клеточных культур (КК) широко применяются как в диагностических и научных исследованиях, так и при производстве биологических препаратов и диагностических систем [1, 10, 13, 14, 15]. Теоретическая основа предлагаемой технологии воздействия на КК и вирусы основывается на следующих положениях. Известно, что строение вирусных частиц отражают общепринятые представления преимущественно об их структурной организации, но не раскрывают всех функциональных особенностей строения по следующим причинам:

- строение вирионов рассматривается с позиций их структурной организации, тогда как их функциональной биофизической организации должного внимания не уделяется;

- абсолютизация структурной организации вирионов, основанная на принципах симметрии икосаэдра, больше подходит для описания статических структур;

- образование симметричных конструкций возможно в абсолютно однородной среде, а содержимое живых клеток, формирующих вирусные частицы, таковым не является;

- за исключением абстрактных математических представлений, полной симметрии в природе не существует. Всюду симметрии сопутствует асимметрия [5].

С позиции электронно-микроскопических исследований, структурно-функциональные особенности строения вирусных частиц визуально характеризуются наличием в структуре вирионов, независимо от типа вируса, одновременно позитивно и негативно заряженных участков поверхности. Из анализа данных электронной микроскопии следует заключение, что наблюдаемое размежевание противоположно заряженных групп в биосистеме вирионов свидетельствует о наличии в их структуре полярных свойств или признаков асимметрии, т.е. имеет место наличие существенной поляризации [2].

Следует отметить, что естественная электрическая поляризация живых систем является не только одним из фундаментальных свойств их организации, но, главным образом, указывает на то, что наряду с морфологической структурой в живых системах (включая бактерии, вирусы) существует электрическая структура, проявляющаяся при их взаимодействии с макроскопическими электрическими полями и токами. Электрические поля живых организмов получили название биоэлектрических полей, хотя они не отличаются от физических полей других источников [2, 4]. Для получения эффекта воздействия на КК и вирусы необходимо также иметь триггерный фактор, позволяющий изменять уровень поляризации в необходимых заданных пределах. Такими свойствами обладают импульсные сложно модулированные электромагнитные поля низкочастотной части ультразвукового диапазона (ИСМ ЭМП НЧУД) [1, 3, 6], формируемые индуктивностями.

Известно, что коэффициент поляризации связан с жизнеспособностью тканей, клеток, микроорганизмов и вирусы не являются исключением, т.е. любое изменение поляризации может привести или к усилению активации вируса или его инактивации при определенных режимах воздействия ультразвукового диапазона [3, 8, 10].

На воздействие ультразвука на биологические ткани обращали пристальное внимание многие исследователи. Прежде всего, с тем, что при ультразвуковом облучении биологических объектов возникают разнообразные явления (кавитация, диспергирование, термическое и окислительное действие), которые оказывают влияние на живые организмы в целом и на отдельные клетки [7, 11, 12]. Ультразвуковые низкочастотные поля ускоряют процессы диффузии, повышают проницаемость клеточных оболочек. В результате увеличивается выход белков [9]. В этих исследованиях используют излучатели-генераторы и датчики ультразвука, основанные на пьезоэлементах (пьезокристаллах), способные не только излучать ультразвуковые колебания, но и воспринимать их в диапазоне ультразвука. Недостатком этих способов применения ультразвука для управляющего воздействия на микроорганизмы и вирусы имеют существенные ограничения в применении и носят в большей степени вспомогательный характер и не имеют возможности управления воздействием по принципу обратной связи, т.е. не имеют диагностического параметра, учитывающего динамику морфофункционального состояния клеточных культур (КК), микроорганизмов, бактерий, вирусов. В предлагаемом устройстве для формирования ИСМ ЭМП НЧУД с ультразвуковым диапазоном применяются плоские индуктивности, которые не имеют вышеперечисленных недостатков.

Таким образом, предлагаемое устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам, при осуществлении обеспечивает достижение заявляемого технического результата, а именно упрощение и возможность осуществления управления чувствительностью клеточных культур к вирусам, за счет определения значений импеданса в объеме КК при воздействии вируса и соответствующего изменения поляризации конкретных составляющих раствора. На Фиг. 1 изображена блок-схема заявленного устройства.

Устройство содержит модулирующий генератор 1; модулируемый генератор 2; бесконтактный регистратор импеданса БИМ 3; процессор 4 (ПЭВМ); блок управления установкой 5; таймер 6; индуктивный датчик БИМ 7; пробирку-контейнер с КК 8; две взаимно ориентированные плоские силовые индуктивности, излучающие ИСМ ЭМП НЧУД 9. Выходы генераторов 1,2 подсоединены через процессор 4 и блок управления установкой 5 к двум взаимно ориентированным плоским силовым индуктивностям 9, при этом сам процессор 4 соединен с управляющими входами генераторов 1,2. Таймер 6 с фиксированным временем воздействия (1, 3, 6 минут) соединен с процессором 4. Результаты воздействия ИСМ ЭМП НЧУД на КК с вирусами в пробирке-контейнере 8, которая помещена над силовыми индуктивностями 9, регистрируются индуктивным датчиком БИМ 7, заданного объема (2 см³) клеточной культуры, при этом полученные значения импеданса и поляризации после обработки процессором 4 через блок управления установкой 5 индицируются на табло регистратора импеданса БИМ 3.

Заявленное устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам работает следующим образом. В начале проводятся тестовые настроечные измерения с использованием дистиллированной воды и физраствора для калибровки измерительного процесса. Пробирку-контейнер 8 заполняют фиксированным объемом (2 см³) тестируемого раствора и помещают между силовыми индуктивностями 9 и индуктивным датчиком БИМ 7, располагаемые на лабораторном столике. Пространство между пробиркой-контейнером 8 и индуктивностями 9 заполняют контактным гелем. После включения напряжения питания, генераторы импульсов 1, 2 формируют на своем выходе последовательность импульсов тока в виде затухающих модулированных периодических колебаний, в которой, например, базовая частота модулируемого сигнала составляет 1 МГц, а частота модулирующего сигнала 10-30 кГц. Сигнал поступает на две взаимно ориентированные плоские силовые индуктивности 9, излучающие ИСМ ЭМП НЧУД. Временные параметры тестирующего импульса, а именно: период затухающих колебаний, частота следования импульсов - определяется быстродействием части устройства, регистрирующей ответный сигнал, с помощью индуктивного датчика БИМ 7. Для получения колибровачных тестирующих сигналов в контейнер-пробирку наливают последовательно физиологический раствор и дистиллированную воду, а формируемые в виде значений импеданса ответные сигналы, поступают и фиксируются в процессоре 4, и одновременно индицируются на табло регистратора импеданса БИМ 3. Далее в пробирку-контейнер помещают КК, что приводит к изменению значений импеданса и преобразованию ответного сигнала в цифровой сигнал от процессора 4, который используется для управления генераторами 1, 2 (по принципу обратной связи). Время воздействия задается дискретно таймером 6. Далее выполняют воздействие ИСМ ЭМП НЧУД на пробирку-контейнер с КК 8. Полученные значения ответного сигнала поступают в процессор 4 и регистрируются в виде изменяемой величины импеданса (соответственно поляризации) на табло регистратора импеданса БИМ, что позволяет характеризовать реакцию КК на воздействующие вирусы.

Результаты тестовых исследований представлены в виде таблицы. В тестовых исследованиях использовали перевиваемую КК почки собаки (MDCK) при инфицировании вирусом гриппа A(H1N1), диплоидную КК легкого эмбриона человека (ЛЭЧ-81) при инфицировании ВПГ-1, и отдельно вируссодержащие суспензии с соответствующими контрольными измерениями параметров ИСМ ЭМП НЧУД. Тестирование и настройку установки осуществляли с использованием физиологического раствора и дистиллированной воды. Проводили оценку гемагглютинирующего титра вируса для вируса гриппа А в двукратных разведениях (n=6), титра в тканевых цитопатических дозах (ТЦД_50/0,2 см³) для ВПГ-1 (n=6) в трех циклах измерений после воздействия ИСМ ЭМП НЧУД. Расчет титра проводили по методу Спирмена-Кербера.

Результаты: Выявлена реакция клеточных культур MDCK и ЛЭЧ до внесения вируссодержащего материала в виде изменения импеданса и поляризации раствора в пробирке, которая проявлялась в виде активации при К_n=0,36. Результаты предлагаемой технологии по повышению чувствительности КК к вирусу гриппа А и ВПГ-1 показали, что гемагглютинирующие титры вируса для гриппа А повышались максимум в 2 раза, титр ВПГ-1 в ТЦД₅₀/0,2 см³ повышался на 1,5-1,75 ТЦЦ₅₀/0,2 см³ после 6 минутного воздействия ИСМ ЭМП НЧУД, а коэффициент поляризации составил К_n<1(0,03), что указывало на повышение чувствительности к данным вирусам КК при определенных режимах ИСМ ЭМП НЧУД. Таким образом, заявленное устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам просто в использовании и осуществляет процесс управления чувствительностью клеточных культур к воздействующему вирусу не опосредованно, как в прототипе, а путем определения в растворе конкретных значений БИМ и поляризации КК подверженных воздействию вирусов, которые используются для управляющего воздействия ИСМ ЭМП НЧУД, что в свою очередь по принципу обратной связи позволяет управлять чувствительностью КК к вирусам. Заявленное устройство обладает высокой чувствительностью и информативностью при определении эффективных мер лечения хронических инфекционных заболеваний человека в условиях моделирования в доклинических экспериментах с использованием модулированных электромагнитных полей.

Использованная литература:

1. Антушева Т.И. Некоторые особенности влияния ультразвука на микроорганизмы// Живые и бескосные системы. - Вып.№4, эл. № ФС 77-68501 от 27.01.2017.

2. Баньков В.И. Вода электромагнитные поля и жизнь человека. LAMBERT Academic Publishing, Beau-Bassin, 2017,234 с- ISBN 978-620-2-00339-1.

3. Бесконтактная импедансометрия (диагностика, лечение, практика): Монография / В. И. Баньков; ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России. -Екатеринбург: «ИИЦ «Знак качества», 2021. - 208 с.: ил., табл.; 21 см. -ISBN 978-5-89895-961-6.

4. Каплуненко В.Г., Косинов Н.В., Скальный А.В. Уязвимые электрически заряженные места SARS-CoV-2; электрическая модель вируса и роль микроэлементов в его инактивации// Микроэлементы в медицине. - 2021-Т.22(1), С.3-20.

5. Конформационные изменения в структуре вирионов вируса ящура при воздействии некоторых физических и биологических факторов [Электронный ресурс]. Электрон, дан. URL:http://zoovet.info/vet-knigi/110-klindiafflrostika/elekfro-mikjoskopiya/11251-konformatsionnye-izmeneniya-v-strukturte-virionov-virusa-yashchura-pri-biologicheskikh-faktorov (дата обращения 11.04.20).

6. Мукашева Е.А, Колобухина Л.В., Меркулова Л.В., Кистенева Л.Б., и др. Серодиагностика в надзоре за циркуляцией вирусов гриппа в период пандемии, вызванной A(H1N1)pdm09// Вопросы вирусологии 2015, 60 (6) С.19-24.

7. Современные подходы к лечению вирусных инфекций [Электронный ресурс].Электрон, дан. URL:https://mypresentotion.ru/presentation/sovremennye-podxody-k-profilaktike-i-lecheniyu-virusnyx-infekcij (дата обращения 12.04.20).

8. Сологуб Т.В., Ледванов М.Ю., Малый В.П., Стукова Н.Ю., Романцов М.Г., Бизенкова М.Н., Полякова Т.Д. Иммунный ответ при вирусных инфекциях// Успехи современного естествознания. - 2009. - №12. - С.29-33; URL:https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=14061 (дата обращения: 13.03.2022).

9. Сорока С.А. Влияние акустических колебаний на биологические объекты// Вибрация в технике и технологиях, 2005.-№1.-С.39-41.

10. Устюжанин В.А. Основы электроимпедансной спектрометрии. - Чита: Изд-во ЗабГУ,2012. - 187 с.

И. Филоненко Е.А., Хохлова В.А. Моделирование тепловых процессов в биологических тканях при воздействии сфокусированным ультразвуком// Вестник Московского университета, серия 3. Физика астрономия, 1999. - №6. - С.29-30.

12. Хмелев В.Н., Савин И.И. Повышение эффективности ультразвукового воздействия на обрабатываемые среды за счет оптимизации электрического согласования в ультразвуковом технологическом аппарате// Электронный журнал "Техническая акустика". - 2005. - №36. - 15 с. http://eita.org

13. Asaoka N., Tanaka Y., Sakai Т., Fujii Y., et al. Low growth ability of recent influenza clinical isolates in MDCK cells is due to their low receptor binding affinities// Microbes Infect. 2006; 8:511-519.

14. Dolskiy A.A.. Grishchenko IV. Yudkin D.V. Cell Cultures for Virology: Usability, Advantages, and Prospects// Int J Mol Sci. 2020 Oct 27;21(21):7978.

15. Lombardo Т., Dotti S., Renzi S., Ferrari M. Susceptibility of different cell lines to Avian and Swine Influenza viruses// J. Virol. Methods. 2012;185:82-88.

Устройство может быть использовано в экспериментальной медицине и биотехнологии при определении эффективных мер лечения хронических инфекционных заболеваний человека в условиях моделирования в доклинических экспериментах с использованием модулированных электромагнитных полей. Устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам содержит контейнер-пробирку с фиксированным объемом тестируемой клеточной культуры, индуктивный датчик, генератор импульсов затухающих периодических колебаний, процессор, второй генератор импульсов и таймер, задающий временной интервал воздействия электромагнитного поля, подключенный через процессор к блоку управления. Выход индуктивного датчика подключен к информационному входу процессора через блок управления и одновременно к регистратору данных, получаемых от индуктивного датчика. Устройство просто в использовании, позволяет осуществлять процесс управления чувствительностью клеточных культур к вирусам за счет определения значений импеданса в объеме КК при воздействии вируса и соответствующего изменения поляризации конкретных составляющих раствора. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам, содержащее контейнер-пробирку с фиксированным объемом тестируемой клеточной культуры, индуктивный датчик, генератор импульсов затухающих периодических колебаний, процессор, отличающееся тем, что в устройство введены второй генератор импульсов и таймер, задающий временной интервал воздействия электромагнитного поля, подключенный через процессор к блоку управления, а выход индуктивного датчика подключен к информационному входу процессора через блок управления и одновременно к регистратору данных, получаемых от индуктивного датчика.

2. Устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам по п. 1, отличающееся тем, что к первому и второму генераторам импульсов затухающих периодических колебаний подсоединены две взаимно ориентированные плоские силовые индуктивности таким образом, чтобы частотно-амплитудные модуляции формируемого силовыми индуктивностями электромагнитного поля определялись процессором в соответствии с данными, зарегистрированными индуктивным датчиком, обеспечивающим измерение значений импеданса и поляризации методом бесконтактной импедансометрии.

3. Устройство для управления чувствительностью клеточных культур к вирусам по п. 1, отличающееся тем, что контейнер-пробирка с фиксированным объемом тестируемой клеточной культуры закреплена между силовыми индуктивностями и индуктивным датчиком таким образом, чтобы электромагнитное поле проходило через контейнер-пробирку к индуктивному датчику, а пространство между силовыми индуктивностями и индуктивным датчиком и контейнером-пробиркой заполнено контактным гелем.