Способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам Российский патент 2024 года по МПК C12N13/00 C12N1/36 C12M1/42 C12M3/00 

Изобретение относится к способам повышения чувствительности клеточных культур к вирусам и может быть использовано в биотехнологии и медицине.

Известен способ идентификации водных растворов, заключающийся в том, что генерируют тестирующий сигнал, который взаимодействует с идентифицируемым водным раствором, результат взаимодействия сравнивают с эталоном и по результатам сравнения идентифицируют водный раствор. В качестве тестируемого сигнала используют последовательность импульсов тока в виде затухающих периодических колебаний, в которых начальная амплитуда последующего импульса больше предыдущего. Тестирующий сигнал подают на два электрода, закрепленные в контейнере с фиксированным объемом тестируемого водного раствора на расстоянии друг от друга и ниже верхнего уровня раствора. Ответный сигнал регистрируют посредством индуктивного датчика в средней точке между электродами на одинаковом с ними уровне водного раствора. Выполняют воздействие на водный раствор последовательностью тестирующих импульсов и регистрируют ответный сигнал от каждого тестирующего импульса до получения установившегося значения ответного сигнала. Совокупность ответных сигналов, сгруппированных в полученной последовательности, сравнивают с эталонным и по результатам сравнения идентифицируют тестируемый водный раствор (патент РФ №2498291, G01N 27/83, опубл. 10.11.2013).

Недостаток известного устройства состоит, в первую очередь, в сложности использования для повышения чувствительности клеточных культур (КК) к вирусам, поскольку не позволяет осуществить широкополосную регуляцию частотно-амплитудных модуляций ИСМ ЭМП НЧУД в рамках заданной экспозиции воздействия из-за отсутствия модулирующего генератора. Кроме того, устройство, с помощью индуктивного датчика фиксирует только искажения, сложно модулированного ЭМП при взаимодействии с тестируемым веществом, связанные с электродной поляризацией в растворе, соответственно не имеет возможности регистрировать изменение импеданса и поляризацию КК при взаимодействии с вирусами в контейнере-пробирке, а параметры таких изменений являются критериями обратной связи, определяющими чувствительность КК к вирусам и соответственно могут являться элементами управления.

Известен способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат, чувствительных к репродукции вирусов (патент РФ №2520868, МПК C12N 5/00, опубл. 27.06.2014 г.). В качестве доноров первичной культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста. Клетки подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°С в течение 30-40 минут, осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с рН 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7⋅10⁵ клеток/см³, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл, определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл.

Однако получение культур клеток с высокой чувствительностью к вирусам достигается за счет многовариантного перебора различных культур клеток, проведения процессов культивирования на них вирусов и выбор наиболее чувствительных к вирусам культур клеток, что является дорогостоящим и длительным процессом. В данном патенте-аналоге за счет существенного снижения возраста новорожденных крольчат, используемых в качестве доноров первичной культуры клеток, привело к повышению чувствительности культур клеток к вирусам и выходу вирусной биомассы.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам (патент Китая №CN107129964, МПК C12N 5/071, C12N 7/00, опубл. 05.09.2017 г.). Способ включает использование оригинальной питательной среды для культивирования клеточной культуры ST (Swine Testis), содержащей 1000 мл деионизированной воды, порошок DMEM 9-12 г, хлорид калия 100-300 мг, хлорид натрия 1-6 г, трансферрина 1-3 мл, основной фактор роста фибробластов bFGF 0,8-4 мл, пируват натрия 10-40 мг, витамины С 10-100 мг, полисахарид такахоэ 10-20 мг, цитрат железа 20-80 мг. Культивирование клеток ST в суспензии на микроносителях в количестве 2-8 г/мл осуществляли при начальной плотности инокулята 1-3×10⁵/мл клеток ST, которые высевали в биореактор с указанной средой для культивирования клеток ST объемом 1-5 л. Контроль насыщения растворенным кислородом около 50%, скорость перемешивания 20-50 об/мин, рН регулируется в пределах 7,0-7,4, и культивирование проводят при температуре 37°С в течение 48-72 часа. Вирусную жидкость PRV (респираторно-синцитиальный вирус) с кратностью инфицирования MOI 0,005-0,5 вводят в культуру микроносителя ST-клеток, а затем культивируют 80-96 часов, пока не будет достигнут цитопатический эффект более 75% собранного вирусного раствора. Полученная культура клеток ST на оригинальной питательной среде повышает рост указанных клеток и их чувствительность к инфекции PRV и увеличивает содержание вируса.

Однако такой способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам имеет узкое назначение (не позволяет управлять функциональным состоянием клеточных культур при воздействии на них вирусов), усложняет технологию их получения, требует дорогостоящих компонентов, добавляемых в питательную среду.

Техническим результатом является упрощение способа повышения чувствительности клеточных культур к вирусам.

Указанный технический результат достигается тем, что способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам включает воздействие на клеточную культуру с питательной средой, расположенную в контейнере-пробирке, импульсным сложно модулированным электромагнитным полем низкочастотной части ультразвукового диапазона (ИСМ ЭМП УЗД) при базовой частоте воздействия модулируемого сигнала составляющей 320-1000 кГц и частоте модулирующего сигнала 10-30 кГц формируемого под клеточной культурой двумя взаимно ориентированными по вертикальной составляющей (один под другим) плоскими силовыми индукторами индуктивности, нагруженными на модулирующий и модулируемый генераторы, и характеризующегося связанными между собой параметрами импеданса (Z), уровень поляризации (П) и коэффициента поляризации (Кп), в течение времени достаточном для повышения чувствительности культуры клеток к вирусам. Коэффициент поляризации Кп имеет величину менее ≤0,3, которая является нижней границей жизнеспособности клеточной культуры, электрический импеданс (Z) составляет ≤639,2±64,9 Ом, величина поляризации (П) составляет ≤8,2±3,4. Воздействие на клеточную культуру импульсным сложно модулированным электромагнитным полем низкочастотной части ультразвукового диапазона осуществляют в течение 1-6 мин.

Уровень поляризации (П) определяется как отношение низкочастотных гармонических колебаний к высокочастотным гармоническим колебаниям (Бесконтактная импедансометрия (диагностика, лечение, практика): Монография / В.И. Баньков; ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России. - Екатеринбург: «ИИЦ «Знак качества», 2021. - стр. 12-20 [7].

В предлагаемом способе измеряют два значения импеданса: 1) на низкой частоте (Z_НЧ); 2) на высокой частоте (Z_ВЧ); затем определяют коэффициент поляризации Кп=Z_НЧ/Z_ВЧ. Жизнеспособная клетка имеет высокие значения при Кп>1.

Теоретическая основа предлагаемой технологии воздействия вирусов на КК основывается на следующих положениях.

Известно, что строение вирусных частиц отражают общепринятые представления преимущественно об их структурной организации, но не раскрывают всех функциональных особенностей строения по следующим причинам:

- строение вирионов рассматривается с позиций их структурной организации, тогда как их функциональной биофизической организации должного внимания не уделяется;

- абсолютизация структурной организации вирионов, основанная на принципах симметрии икосаэдра, больше подходит для описания статических структур;

образование симметричных конструкций возможно в абсолютно однородной среде, а содержимое живых клеток, формирующих вирусные частицы, таковым не является;

- за исключением абстрактных математических представлений, полной симметрии в природе не существует. Всюду симметрии сопутствует асимметрия [1, 2, 5].

С позиции электронно-микроскопических исследований, структурно-функциональные особенности строения вирусных частиц визуально характеризуются наличием в структуре вирионов, независимо от типа вируса, одновременно позитивно и негативно заряженных участков поверхности. Из анализа данных электронной микроскопии следует заключение, что наблюдаемое размежевание противоположно заряженных групп в биосистеме вирионов свидетельствует о наличии в их структуре полярных свойств или признаков асимметрии, т.е. имеет место наличие существенной поляризации [2,5,7].

Следует отметить, что естественная электрическая поляризация живых систем является не только одним из фундаментальных свойств их организации, но, главным образом, указывает на то, что наряду с морфологической структурой в живых системах (включая бактерии, вирусы) существует электрическая структура, проявляющаяся при их взаимодействии с макроскопическими электрическими полями и токами. Электрические поля живых организмов получили название биоэлектрических полей, хотя они не отличаются от физических полей других источников [2,3].

Для получения эффекта воздействия на КК и вирусы необходимо также иметь триггерный фактор, позволяющий изменять уровень поляризации в необходимых заданных пределах. Такими свойствами обладают импульсные сложно модулированные электромагнитные поля низкочастотной части ультразвукового диапазона (ИСМ ЭМП НЧУД) формируемые индуктивностями [2,7,6].

Известно, что коэффициент поляризации связан с жизнеспособностью тканей, клеток, микроорганизмов и вирусы не являются исключением, т.е. любое изменение поляризации может привести или к усилению активации вируса или его инактивации при определенных режимах воздействия ультразвукового диапазона [5,6,7].

На воздействие ультразвука на биологические ткани обращали пристальное внимание многие исследователи. Прежде всего, с тем что при ультразвуковом облучении биологических объектов возникают разнообразные явления (кавитация, диспергирование, термическое и окислительное действие), которые оказывают влияние на живые организмы в целом и на отдельные клетки [6,7]. Ультразвуковые низкочастотные поля ускоряют процессы диффузии, повышают проницаемость клеточных оболочек. В результате увеличивается выход белков [8,9]. В этих исследованиях используют излучатели-генераторы и датчики ультразвука, основанные на пьезоэлементах (пьезокристаллах), способные не только излучать ультразвуковые колебания, но и воспринимать их в диапазоне ультразвука. Недостатком этих способов применения ультразвука для управляющего воздействия на микроорганизмы и вирусы имеют существенные ограничения в применении и носят в большей степени вспомогательный характер и не имеют возможности управления воздействием по принципу обратной связи, т.е. не имеют диагностического параметра учитывающего динамику морфофункционального состояния клеточных культур (КК), микроорганизмов, бактерий, вирусов. В предлагаемом устройстве для формирования ИСМ ЭМП НЧУД с ультразвуковым диапазоном применяются плоские индуктивности, которые не имеют вышеперечисленных недостатков.

Таким образом, предлагаемый способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам при его осуществлении обеспечивает достижение заявляемого технического результата, а именно упрощение технологии и возможность осуществления управления чувствительностью клеточных культур к вирусам, за счет определения значений импеданса в объеме КК при воздействии вируса и соответствующего изменения поляризации конкретных составляющих раствора.

На фиг. 1 изображено устройство для реализации заявленного способа повышения чувствительности клеточных культур к вирусам.

Пример 1. Описание устройства, реализующего заявляемый способ.

Устройство для реализации заявленного способа повышения чувствительности клеточных культур к вирусам содержит модулирующий 1 и модулируемый 2 генераторы, два взаимно ориентированных по вертикальной составляющей (один под другим) плоских силовых индуктора 3 индуктивности, обеспечивающих формирование импульсного сложно модулированного электромагнитного поля низкочастотной части ультразвукового диапазона (ИСМ ЭМП УЗД) и имеющих на верхней поверхности участок 4 для размещения пробирки-контейнера 5 с клеточной культурой (КК) заданного объема 2 см³, индуктивный датчик 6 поляризации и бесконтактного измерения импеданса (БИМ), расположенный рядом с индукторами 3 индуктивности и пробиркой-контейнером 5 с КК, процессор 7 в виде ПЭВМ с таймером 8 с фиксированным временем воздействия 1, 3, 6 минут, блок 9 управления устройством и бесконтактный регистратор 10 импеданса (БИМ). Причем выходы генераторов 1, 2 подсоединены через процессор 7 и блок 9 управления устройством к индукторам 3 индуктивности. Процессор 7 соединен с управляющими входами генераторов 1, 2. Таймер 8 соединен с процессором 7, а датчик 6 БИМ и регистратор 10 БИМ связаны с блоком 9 управления устройством.

Перед началом реализации заявляемого способа пространство (зазор) между пробиркой-контейнером 5, верхней поверхностью участка 4 индукторов 3 индуктивности и датчиком 6 БИМ заполняют контактным гелем.

Результаты воздействия ИСМ ЭМП НЧУД на КК с вирусами в пробирке-контейнере 5 заданного объема (2 см³) клеточной культуры, которая помещена над силовыми индукторами 3, регистрируются индуктивным датчиком 6 БИМ. Полученные значения импеданса и поляризации после обработки процессором 7 через блок 9 управления устройством индицируются на табло регистратора 10 импеданса БИМ.

Пример 2. Описание способа повышения чувствительности КК к вирусам на конкретном примере. Заявленный способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам осуществляют следующим образом. Вначале проводятся тестовые настроечные измерения с использованием дистиллированной воды и физраствора для калибровки измерительного процесса. Пробирку-контейнер 5 заполняют фиксированным объемом (2 см³) тестируемого раствора и помещают между силовыми индукторами 3 индуктивности и индуктивным датчиком 6 БИМ, располагаемые на лабораторном столике. Пространство между пробиркой-контейнером 5 и индукторами 3 индуктивности заполняют контактным гелем, например, токопроводящий контактный гель Mesomatrix Professional Contact Ultra Machine Gel для аппаратных процедур (https://irecommend.ru/content/tokoprovodyashchii-kontaktnyi-gel-mesomatrix-professional-contact-ultra-machine-gel-dlya-app). После включения напряжения питания, генераторы импульсов 1, 2 формируют на своем выходе последовательность импульсов тока в виде затухающих модулированных периодических колебаний, в которой базовая частота модулируемого сигнала составляет в диапазоне 320-1000 кГц, а частота модулирующего сигнала 10-30 кГц. Сигнал поступает на два взаимно ориентированных по вертикальной составляющей плоских силовых индуктора 3 индуктивности, излучающие ИСМ ЭМП НЧУД. Временные параметры тестирующего импульса, а именно: период затухающих колебаний, частота следования импульсов - определяется быстродействием части устройства, регистрирующей ответный сигнал, с помощью индуктивного датчика 6 БИМ. Для получения калибровочных тестирующих сигналов в контейнер-пробирку 5 наливают последовательно физиологический раствор и дистиллированную воду, а формируемые в виде значений импеданса ответные сигналы, поступают и фиксируются в процессоре 7, и одновременно индицируются на табло регистратора 10 импеданса БИМ.

Далее в пробирку-контейнер 5 помещают КК, что приводит к изменению значений импеданса и преобразованию ответного сигнала в цифровой сигнал от процессора 7, который используется для управления генераторами 1, 2 (по принципу обратной связи). Время воздействия задается дискретно таймером 8. Полученные значения ответного сигнала поступают в процессор 4 и регистрируются в виде изменяемой величины импеданса (соответственно поляризации) на табло регистратора 10 импеданса БИМ, что позволяет контролировать процесс воздействия ИСМ ЭМП НЧУД на культуру клеток. Далее выполняют воздействие ИСМ ЭМП НЧУД на пробирку-контейнер 5 с КК и вирусом. Время воздействия также задается дискретно таймером 8. Полученные значения ответного сигнала поступают в процессор 4 и регистрируются в виде изменяемой величины импеданса (соответственно поляризации) на табло регистратора 10 импеданса БИМ, что позволяет характеризовать реакцию культуры клеток на воздействие вируса. Результаты тестовых исследований представлены ниже в таблице.

В тестовых исследованиях использовали перевиваемую КК почки собаки (MDCK) при инфицировании вирусом гриппа A(H1N1), диплоидную КК легкого эмбриона человека (ЛЭЧ-81) при инфицировании вирусом простого герпеса 1 (ВПГ-1), и отдельно вируссодержащие суспензии с соответствующими контрольными измерениями параметров ИСМ ЭМП НЧУД. Тестирование и настройку установки осуществляли с использованием физиологического раствора и дистиллированной воды. Проводили оценку гемагглютинирующего титра для вируса гриппа А в двукратных разведениях (n=6), титра в тканевых цитопатических дозах (ТЦД₅₀/0,2 см³) для ВПГ-1 (n=6) в трех циклах измерений после воздействия ИСМ ЭМП НЧУД. Расчет титра проводили по методу Спирмена-Кербера.

Выявлена реакция клеточных культур MDCK и ЛЭЧ до внесения вируссодержащего материала в виде изменения импеданса и поляризации раствора в пробирке, которая проявлялась в виде активации при Кп ≤0,3.

Результаты предлагаемой технологии по определению чувствительности КК к вирусу гриппа А и ВПГ-1 показали, что для MDCK, при обработке ИСМ ЭМП НЧУД на первой минуте в диапазоне частоты 1Hz, Кп равнялся 1,13 при котором жизнеспособность тканей считалась высокой (Кп >1). При увеличении частоты излучения и экспозиции времени она снижалась до значений Кп ≤0,3, когда жизнеспособность КК отсутствовала. На 6-й минуте и при частоте 1000Hz Кп составил 0,16. Инфекционная активность вируса гриппа А после его культивирования в обработанных ИСМ ЭМП НЧУД культурах клеток повышался с 1:16 до 1:32.

Для клеточной культуры ЛЭЧ до внесения вируссодержащего материала, при обработке ИСМ ЭМП НЧУД частотой 1 000 Hz, Кп составил 0,12 на 6-й минуте экспозиции. Инфекционная активность ВПГ-1 после его культивирования в обработанных ИСМ ЭМП НЧУД культурах клеток повышалось с 6,0 до 7,75 lg ТЦД₅₀/0,2 см³.

Таким образом, заявленный способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам по сравнению с прототипом более прост в использовании и может осуществлять процесс управления чувствительностью клеточных культур к воздействующему вирусу не опосредованно, как в прототипе, а путем определения в растворе конкретных значений БИМ и поляризации КК подверженных воздействию вирусов, которые используются для управляющего воздействия ИСМ ЭМП НЧУД, что в свою очередь по принципу обратной связи позволяет управлять чувствительностью КК к вирусам. Заявленный способ обладает высокой чувствительностью и информативностью при определении эффективных мер лечения хронических инфекционных заболеваний человека в условиях моделирования в доклинических экспериментах с использованием модулированных электромагнитных полей.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Конформационные изменения в структуре вирионов вируса ящура при воздействии некоторых физических и биологических факторов [Электронный ресурс]. Электрон, дан. URL:http://zoovet.info/vet-knigi/110-klindiagnostika/elektro-mikroskopiya/11251-konformatsionnye-izmeneniya-v-strukture-virionov-virusa-yashchura-pri-vozdejstvii-nekotorykh-fizicheskikh-i-biologicheskikh-faktorov (дата обращения 11.04.20).

2. Баньков В.И. Вода, электромагнитные поля и жизнь человека. LAMBERT Academic Publishing, Beau-Bassin, 2017, 234 с- ISBN 978-620-2-00339-1.

3. Каплуненко В.Г., Косинов Н.В., Скальный А.В. Уязвимые электрически заряженные места SARS-CoV-2; электрическая модель вируса и роль микроэлементов в его инактивации // Микроэлементы в медицине. – 2021 - Т.22(1), с.3-20.

5. Конформационные изменения в структуре вирионов вируса ящура при воздействии некоторых физических и биологических факторов [Электронный ресурс]. Электрон, дан. URL:http://zoovet.info/vet-kriigi/110-klindiagnostika/elektro-mikroskopiya/11251 -konformatsionnye-izmeneniya-v-strukture-virionov-virusa-yashchura-pri-vozdeistvii-nekotorykh-fizicheskikh-i-biologicheskikh-faktorov (дата обращения 11.04.20).

6. Антушева Т.И. Некоторые особенности влияния ультразвука на микроорганизмы// Живые и бескосные системы. - Вып.№4, эл.№ФС77-68501 от 27.01.2017.

7. Бесконтактная импедансометрия (диагностика, лечение, практика): Монография / В.И. Баньков; ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России. - Екатеринбург: «ИИЦ «Знак качества», 2021. - 208 с.: ил., табл.; 21 см. - ISBN 978-5-89895-961-6.

8. Сологуб Т.В., Ледванов М.Ю., Малый В.П., Стукова Н.Ю., Романцов М.Г., Бизенкова М.Н., Полякова Т.Д. Иммунный ответ при вирусных инфекциях // Успехи современного естествознания. - 2009. - №12. - С.29-33; URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=14061 (дата обращения: 13.03.2022).

9. Сорока С.А. Влияние акустических колебаний на биологические объекты// Вибрация в технике и технологиях, 2005.- №1. - С.39-41.

10. Патент РФ №2498291, G01N 27/83, опубл. 10.11.2013 г.

11. Патент РФ №2520868, МПК C12N 5/00, опубл. 27.06.2014 г.

12. Патент Китая №CN107129964, МПК C12N 5/071, C12N 7/00, опубл. 05.09.2017 г., (прототип).

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам, характеризующийся тем, что на клеточную культуру с питательной средой, расположенную в контейнере-пробирке, воздействуют импульсным сложно модулированным электромагнитным полем низкочастотной части ультразвукового диапазона. Техническим результатом является упрощение способа повышения чувствительности клеточных культур к вирусам. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ повышения чувствительности клеточных культур к вирусам, характеризующийся тем, что на клеточную культуру с питательной средой, расположенную в контейнере-пробирке, воздействуют импульсным сложно модулированным электромагнитным полем низкочастотной части ультразвукового диапазона при частоте воздействия модулируемого сигнала, составляющей 320-1000 кГц, и частоте модулирующего сигнала до 10-30 кГц, формируемым под клеточной культурой двумя взаимно ориентированными один под другим плоскими силовыми индукторами индуктивности, соединенными с модулирующим и модулируемым генераторами через процессор и блок управления, и имеющим связанные между собой параметры электрического импеданса Z, уровня поляризации П и коэффициента поляризации Кп, в течение времени, достаточном для повышения чувствительности культуры клеток к вирусам, причем коэффициент поляризации Кп имеет величину менее 0,3, являющуюся нижней границей жизнеспособности клеточной культуры, электрический импеданс Z составляет 574,3-704,1 Ом, уровень поляризации П составляет более чем 4,8.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воздействие на клеточную культуру импульсным сложно модулированным электромагнитным полем низкочастотной части ультразвукового диапазона осуществляют в течение 1-6 мин.