СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОЩЕЛОЧНОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ ПРИРОДНОГО ГИДРОКСИАПАТИТА ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/32 A61K6/00 A61L27/36 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, биотехнологии и материаловедения, а именно к способу получения низкощелочного материала, состоящего из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани.

Предпосылки изобретения

В настоящее время костнозамещающие материалы нашли широкое применение в стоматологии, парадонтологии, челюстно-лицевой хирургии и ортопедии с целью восстановления костной ткани в области её дефектов. Наибольшее распространение получили биорезобируемые материалы на основе природных и синтетических соединений кальция. Синтетические материалы, состоящие из гидроксиапатита и родственных фосфатов кальция наиболее просты в получении и обеспечении производственной иммунобиологической безопасности, обладают определенной клинической эффективностью. Тем не менее в литературе имеется уверенный консенсус, что биологическая эффективность медицинских изделий на основе синтетической биокерамики в отношении стимуляции репаративной регенерации костной ткани имеет ряд ограничений. Данные ограничения обусловлены главным образом неспособностью таких материалов воспроизводить состав и структуру минерального матрикса костной ткани. Так, гидроксиапатит, входящий в состав костной ткани, не является стехиометрическим (в отличие от синтетического гидроксиапатита, молярное соотношение кальция к фосфору превышает 1,67), что обусловлено частичным замещением фосфат-анионов карбонат-анионами в анионной подрешетке вещества. Также в природном гидроксиапатите из костной ткани возможно частичное замещение гидроксильных групп хлором или фтором, а ионы кальция могут замещаться магнием, натрием, калием или же целым рядом следовых элементов, включающих стронций, свинец, цинк, медь и железо (Sobczak-Kupiec A., Wzorek Z., Kijkowska R., Kowalski Z. Effect of calcination conditions of pork bone sludge on behaviour of hydroxyapatite in simulated body fluid. Bull. Mater. Sci. 2013, v. 36, № 4, pp. 755-764.). Показано, что присутствие карбонат-ионов в структуре гидроксиапатита приводит к снижению его кристалличности и увеличивает его способность к биодеградации. Кроме того, следовые элементы в природном гидроксиапатите оказывают влияние на активность различных ферментов, выделяемых клетками костной ткани (Figueiredo M., Fernandes A., Martins G., Freitas J., Judas F., Figueiredo H. Effect of the calcination temperature on the composition and microstructure of hydroxyapatite derived from human and animal bone. Ceramics Int. 2010 v. 36, № 8, pp. 2383-2393). Таким образом, применение костнозамещающих материалов на основе гидроксиапатита природного происхождения является более предпочтительным в клинической практике.

В связи с невозможностью полного воссоздания состава и структуры природного гидроксиапатита методами химического синтеза, его получение проводят из сырья биологического происхождения методами удаления всех органических компонентов кости, приводящими к очистке минерального матрикса, полностью состоящего из природного гидроксиапатита, повторяющего макроархитектонику исходной костной ткани. Полученный материал может быть формован или измельчен с целью придания ему необходимой для клинического применения формы (как правило формы блоков или крошки).

Существует два основных методических подхода к процессу очистки костного минерального матрикса от органических веществ. Наиболее простым является высокотемпературная обработка сухим жаром, проводимая, как правило, в муфельных печах или аналогичном оборудовании. Из опубликованных данных известно, что обработка кости, предварительно очищенной от других тканей при температуре 700°С и выше в течение нескольких часов приводит к полному разложению всех органических веществ в материале за счет процессов пиролиза (Manalu J.L., Soegijono B., Indrani D.J. Characterization of Hydroxyapatite Derived from Bovine Bone. Asian Journal of Applied Sciences. 2015, v. 3, № 4, pp. 758-765). Однако, при такой обработке происходит существенное изменение природной структуры минерального матрикса, выражающееся в увеличении кристалличности, а также существенном снижении количества карбонат-ионов в кристаллической решетке, вызванном их разложением с выделением CO₂.

Другим известным способом очистки природного минерального матрикса от органических компонентов является кипячение в водном растворе сильного основания. Как правило с этой целью применяют водный раствор 1,2-диаминоэтана (Williams J.B., Irvine J.W. Preparation of the inorganic matrix of bone. Science. 1954, v. 119, № 3100, pp. 771-772). Длительная обработка предварительно очищенной костной ткани в таких условиях позволяет значительно снизить долю органических компонентов, сохраняя при этом природную организацию костного минерального матрикса. Тем не менее, данный метод, к сожалению, не позволяет воспроизводимо получать полностью депротеинизированный материал, что делает его промышленно неприменимым.

Из уровня техники известны способы получения материала, состоящего из гидроксиапатита природного происхождения, комбинирующие последовательную обработку костной ткани водным раствором основания при кипячении, а затем - обработку сухим жаром. Так, например, патент US5167961A описывает метод получения высокоочищенного минерального компонента костной ткани, при котором органическое вещество разрушается при нагревании в присутствии аммиака или первичного амина, продукты его деградации вымываются током воды при температуре менее 60°С, а на заключительном этапе материал подвергается температурной обработке в атмосфере воздуха при температуре от 250°С до 600°С. При применении температур сухожаровой обработки, не вызывающей кристаллизацию гидроксиапатита (менее 500°С) (Manalu J.L., Soegijono B., Indrani D.J. Characterization of Hydroxyapatite Derived from Bovine Bone. Asian Journal of Applied Sciences. 2015, v. 3, № 4, pp. 758-765), данный подход исключает недостатки описанных выше методических подходов, что делает его оптимальным для получения костнозамещающих материалов, сохраняющих свойства природного гидроксиапатита.

Результаты наших исследований показали, что материал, получаемый из предварительно очищенной костной ткани последовательной обработкой водным раствором 1,2-диаминоэтана или аммиака при кипячении и сухим жаром в атмосфере окружающего воздуха в муфельной печи при температурах в диапазоне 250-500°С, состоит из аморфного (некристалличного) гидроксиапатита, характеризуется отсутствием органических компонентов, а также сохранением карбонатных групп в кристаллической решетке, что свидетельствует о наличии у него нативной структуры костного минерального матрикса.

В то же время, анализируя этот материал, мы обнаружили, что происходит его защелачивание при получении указанным методом. Так ионометрический анализ водных экстрактов материала (или экстрактов, приготовленных на незабуференных водных растворах) показал, что значения их рН находились в щелочных диапазонах (более 8,5), тогда как значения водородного показателя аналогичных экстрактов исходного материала до обработки были близки к нейтральным (7,2-7,6).

Ранее был описан процесс защелачивания материала на основе гидроксиапатита при его изготовлении методом высокотемпературной (более 700°С) обработки сухим жаром, обусловленный образованием оксидов щелочноземельных металлов при температурной декомпозиции карбонат-ионов в присутствии кислорода (Harbeko K., Bucko M.M. Mozgawa W., Pyda A., Brzezinska-Miecznika J., Carpentier J. Behaviour of bone origin hydroxyapatite at elevated temperatures and in O₂ and CO₂ atmospheres. Ceramics Int. 2009, v. 35, № 6, pp. 2537-2540).

Вероятно, незначительная декомпозиция карбонат-ионов может происходить и при обработке в условиях более низких температур, что обуславливает наблюдаемый эффект защелачивания. Тем не менее, результат протекания данного процесса, как и присутствие инородных фаз в составе получаемого материала, не обнаруживается широко применяемыми методами анализа неорганических материалов, такими как инфракрасная спектроскопия и рентгеновская дифрактометрия. Также защелачивание полученного в таких условиях материала не выявляется при инкубировании в буферных растворах, имитирующих внутренние среды организма.

Возможное неконтролируемое высвобождение гидроксид-ионов из защелочённых костнозамещающих материалов является крайне нежелательным при их имплантации в ткани организма, поскольку может локально приводить к созданию неблагоприятного микроокружения для клеток, участвующих в процессе регенерации костной ткани, а также препятствовать процессу их адгезии на материал за счет изменения его заряда. Кроме того, данный процесс может затруднять иммобилизацию на природном гидроксиапатите различных биологически активных веществ и фармацевтических субстанций при создании композитных материалов нового поколения. В связи с вышеизложенным существует необходимость разработки способов получения низкощелочных костнопластических материалов с сохраненными свойствами природного минерального матрикса.

Из уровня техники известен подход к предотвращению защелачивания природного гидроксиапатита при его получении с применением высокотемпературной обработки сухим жаром (Harbeko K., Bucko M.M. Mozgawa W., Pyda A., Brzezinska-Miecznika J., Carpentier J. Behaviour of bone origin hydroxyapatite at elevated temperatures and in O2 and CO2 atmospheres. Ceramics Int. 2009, v. 35, № 6, pp. 2537-2540), заключающийся в том, что данную обработку проводят в контролируемой атмосфере углекислого газа. Несмотря на высокую эффективность по отношению к возникновению в материале примесей оксидов щелочноземельных металлов, данный метод имеет ряд существенных недостатков. Так, для проведения температурной обработки в таких условиях требуется дорогостоящее специализированное оборудование, а именно герметичные печи для термообработки. К данному оборудованию необходимо подсоединение баллонов с газом, находящихся под давлением, что создает дополнительные сложности в обеспечении безопасности производственного процесса. Кроме того, термическую обработку материала при температурах, не вызывающих кристаллизацию природного гидроксиапатита, более предпочтительно проводить в атмосфере, обладающей окислительными свойствами, поскольку часть органических молекул в данном температурном диапазоне разрушается посредством их окисления.

Другим известным из уровня техники методом дещелачивания материалов на основе природного гидроксиапатита является длительная промывка деминерализованной водой. Так, например, в патенте US5776843A длительная промывка деминерализованной водой используется для вымывания негашеной извести из очищенного от органических компонентов костного минерального матрикса, который на следующем этапе подвергается высокотемпературному спеканию с формированием губчатой керамики. Однако данный подход имеет ограниченную эффективность при изготовлении костнопластических материалов на основе природного гидроксиапатита, что связано с недостаточной растворимостью продуктов взаимодействия оксидов щелочноземельных металлов с водой. Так, для достижения существенного удаления примесей оксидов щелочноземельных металлов из материала требуется промывка водой в течение нескольких суток, при этом pH его водных экстрактов как правило не достигает значений, близких к нейтральным.

В связи с вышеизложенным в настоящее время сохраняется необходимость разработки новых доступных и эффективных способов получения низкощелочных материалов на основе природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани.

Краткое изложение сущности изобретения

Поставленная задача решена в результате разработки способа получения низкощелочного материала, состоящего из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, характеризующегося значениями водородного показателя водных вытяжек не более 7,9, включающего последовательно проводимые стадии предварительной очистки костной ткани от компонентов других тканей, депротеинизации костной ткани кипячением в растворе 1,2-диаминоэтана или аммиака с последующей промывкой, обработки сухим жаром в неконтролируемой атмосфере окружающего воздуха при температуре, не взывающей кристаллизацию природного гидроксиапатита, находящейся в диапазоне 250-500°С, дещелачивания полученного на предыдущих стадиях материала обработкой водой, затем обработкой водным раствором аммиака до достижения значения рН 11,0-12,5, затем обработкой водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту в количестве не менее 0,15 ммоль в расчете на 1 г обрабатываемого материала и аммиак до значения pH 10-12, отмывкой водой и высушиванием.

В конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения обработку водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту и аммиак, на стадии дещелачивания проводят в течение не менее чем одной минуты, наиболее предпочтительно в течение 24-48 часов

В другом конкретном варианте воплощения настоящего изобретения обработку водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту и аммиак, на стадии дещелачивания проводят при комнатной температуре.

В других конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения для получения материала используют костную ткань аллогенного или ксеногенного происхождения.

В другом конкретном варианте воплощения настоящего изобретения для получения материала используют губчатую костную ткань эпифизов трубчатых костей.

В другом конкретном варианте воплощения настоящего изобретения костную ткань обрабатывают в виде фрагментов костей кубической или параллелепипедальной формы.

В другом конкретном варианте воплощения настоящего изобретения обработку сухим жаром проводят в муфельной печи.

В другом конкретном варианте воплощения настоящего изобретения полученный низкощелочной материал измельчают до мелкодисперсного состояния и фракционируют, получая частицы определенного размера.

В другом конкретном варианте воплощения настоящего изобретения полученный низкощелочной материал упаковывают в герметичную упаковку и подвергают стерилизации.

Технический результат, проявляющийся при осуществлении вышеописанного способа согласно изобретению, заключается в быстроте и эффективности получения низкощелочного материала, состоящего из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, уже при применении кратковременной обработки в процессе дещелачивания в течение не менее 1 минуты, достигая наибольшей эффективности при обработке в течение не менее 24 часов.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 показан репрезентативный ИК-спектр, характерный для всех образцов материалов на основе природного гидроксиапатита, полученных после проведения дещелачивания в Примере 1.

На Фиг. 2 показаны репрезентативная дифрактограмма, характерная для всех образцов материалов на основе природного гидроксиапатита, полученных после проведения дещелачивания в Примере 1 (сверху), а также дифрактограмма стандартного образца гидроксиапатита, прокаленного при 1000°С в течение 15 часов (снизу).

На Фиг. 3 показан репрезентативный ИК-спектр материала на основе природного гидроксиапатита, полученного после проведения дещелачивания, измельчения и стерилизации в Примере 2.

На Фиг. 4 показана репрезентативная дифрактограмма образца материала на основе природного гидроксиапатита, полученного после проведения дещелачивания, измельчения и стерилизации в Примере 2.

Подробное описание изобретения

Описанный в настоящем изобретении материал, состоящий из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, характеризующийся значениями водородного показателя не более 7,9 для водных вытяжек, полученных при массовом соотношении материала и воды, не превышающем 1:10, может быть получен из костной ткани аллогенного или ксеногенного происхождения. Использование в качестве сырья ксеногенной костной ткани, как правило является более предпочтительным в силу её большей доступности, меньшего риска передачи инфекционных заболеваний персоналу, задействованному в производстве, и пациентам, а также в связи с отсутствием существенных различий в структуре костного минерального матрикса между человеком и животными. Наилучшим образом для изготовления материала подходят участки костей, содержащие большое количество губчатой костной ткани, такие как эпифизы трубчатых костей (например, бедренной кости). В то же время, использование костной ткани из костей, контактирующих с органами центральной нервной системы (позвонки, кости черепа) не желательно в связи с риском контаминации прионными инфекционными агентами в случае наличия не выявленного ранее заболевания животного. Сырье биологического происхождение должно поступать от здоровых животных или здоровых доноров, что в свою очередь должно подтверждаться сопроводительной документацией, согласно действующему законодательству. При получении сырья от животных, подверженных заболеваниям, вызываемым белковыми инфекционными агентами (прионами), должен проводиться контроль отбора, сбора и обработки сырья, а также исследование возможностей производственного процесса инактивировать прионы в соответствии с действующей нормативной документацией.

Для дальнейшего удобства в работе исходное сырье в виде костей может быть измельчено на фрагменты. Наиболее удобны для получения и последующей обработки фрагменты близкой к кубической форме, с линейными размерами по длине ширине и высоте не превышающими 0,5 см.

На первом этапе изготовления материала костная ткань должна быть очищена от компонентов других тканей, которые могут затруднять проведение последующего процесса депротеинизации. В основном, таковыми тканями являются красный костный мозг и жировая ткань. Для этой цели могут быть использованы различные известные из уровня техники методы очистки костей, а также комбинации таких методов. Так, например, для удаления пигментов крови и частичного обезжиривания возможна обработка водными растворами пероксида водорода, для удаления клеточных компонентов посторонних тканей - водными растворами ионогенных или неионогенных поверхностно-активных веществ (ПАВ), а для обезжиривания материала -органическими растворителями или же водными растворами ПАВ. Эффективность проведения очистки по её окончанию может быть проконтролирована визуально на предмет отсутствия различимых фрагментов посторонних тканей и пигментов. Также могут быть использованы известные методы оценки содержания клеточных компонентов (например, содержание двухцепочечной ДНК) и жиров (например, количество жира, экстрагируемого смесью органических растворителей).

На следующем этапе очищенные от посторонних тканей кости или их фрагменты подвергают процессу химической депротеинизации, основанной на обработке материала водным раствором 1,2-диаминоэтана или аммиака при нагревании. Предпочтительно использовать 1,2-диаминоэтан в виде водных растворов в концентрации 50-99%. Также для этой цели возможно использование водных растворов аммиака. Однако, последнее является значительно менее удобным и менее безопасным с точки зрения охраны труда при производстве, вследствие его высокой летучести. Использование водных растворов других оснований является нежелательным, вследствие возможного изменения структуры материала. Обработку депротеинизирующим раствором следует проводить, используя подходящее промышленное или лабораторное оборудование, позволяющее проводить нагрев до температуры кипения водного раствора используемого основания в течение длительного времени. Так, для этого подходят промышленные или лабораторные термостатируемые реакторы. Для обработки небольших количеств материала можно использовать колбы с обратным холодильником, помещенные на нагревательную плитку. При обработке материал должен быть полностью покрыт депротеинизирующим раствором. Для проведения депротеинизации раствор доводят до кипения и выдерживают материал в течение времени, необходимого для удаления не менее 60% органических веществ костной ткани (может быть оценено по изменению сухой массы материала после депротеинизации или биохимическими методами, опубликованными в литературе). Время обработки зависит от источника обрабатываемой костной ткани, а также от степени его предварительного измельчения и составляет, как правило, не менее 15 часов. Для проведения более эффективной депротеинизации возможно чередование циклов кипячения и отмывки материала известными из уровня техники методами, например диализом или отмывкой проточной водой. По окончании депротеинизации материал может быть высушен в сухожаровом шкафу с целью последующего хранения или же сразу подвергнут обработке сухим жаром на следующей стадии.

На следующем этапе очистки депротеинизированного материала от органических компонентов его подвергают высокотемпературной обработке сухим жаром в неконтролируемой атмосфере окружающего воздуха. В качестве оборудования для проведения данного технологического этапа наиболее удобны муфельные печи (например, ЭКПС-50 СПУ, Смоленское СКТБ СПУ, Россия). Также могут быть использованы сухожаровые шкафы, осуществляющие нагрев в необходимом диапазоне температур. Обработку сухим жаром следует проводить при температуре, не вызывающей процесса кристаллизации апатита, не превышающей 500°С. Обработка костной ткани при температурах, превышающих 500°С, в неконтролируемой атмосфере окружающего воздуха приводит к существенной декомпозиции карбонатных групп в кристаллической структуре гидроксиапатита, выявляемой методами ИК-спектроскопии, и сопутствующему сильному защелачиванию материала. При этом степень защелачивания не позволяет получить материал с pH водных экстрактов (при массовом соотношении материала и воды, не превышающем 1:10) менее и равным 7,9 при применении метода дещелачивания, используемого в настоящем изобретении. Для наиболее эффективного удаления из материала остаточных органических компонентов время обработки сухим жаром должно составлять не менее 10 часов. По завершении обработки сухим жаром материал может быть охарактеризован гравиметрически (так, например, при полном удалении органических компонентов из костей крупного рогатого скота, потеря их массы составляет около 40%) и при помощи ИК-спектроскопии. Также перед последующей стадией дещелачивания рекомендуется проведение оценки величин pH водных экстрактов материала.

Подготовленный и депротеинизированный описанным выше образом материал подвергают отличительной для настоящего изобретения стадии обработки - дещелачиванию в водном растворе ортофосфорной кислоты. Обработку на этой стадии возможно проводить в различных подходящих для этой цели по объему емкостях из пластика или стекла с крышкой. Желательно проведение постоянного перемешивания жидкостей, в которые помещен материал. В связи с этим при обработке небольших количеств материала емкость может быть размещена на лабораторном шейкере. При больших объемах обрабатываемого материала для перемешивания могут быть использованы промышленные универсальные перемешивающие устройства различной конструкции. Перед началом обработки материал заливают дистиллированной или деионизованной водой таким образом, чтобы весь материал был покрыт жидкостью. Наиболее предпочтительное соотношение массы обрабатываемого материала к массе жидкости составляет 1:10. Если депротеинизированный материал был предварительно высушен, то желательно выдержать его в воде в течение не менее 20-и минут. Затем в воду, покрывающую материал, вносят водный раствор аммиака в количестве, необходимом для достижения pH интервала значений 11,0-12,5. Для этой цели подходит коммерчески доступный 25% водный раствор аммиака. Как правило, для достижения значения pH в необходимом диапазоне достаточно на каждые 1000 мл внести 40-60 мл 25% водного раствора аммиака. После водного раствора аммиака в реакционную емкость вносят ортофосфорную кислоту в количестве не менее 0,15 ммоль на 1 г обрабатываемого материала. При этом вносимое количество ортофосфорной кислоты, должно быть таковым, чтобы pH реакционного раствора после её внесения находился в диапазоне 10-12. Предпочтительное количество ортофосфорной кислоты, позволяющее достигать наиболее близких к нейтральному значений pH водных экстрактов, составляет от 0,5 до 1,1 ммоль на 1 г материала. Ортофосфорная кислота может вноситься в реакционную емкость в виде водных растворов различных концентраций, например, 0,5-2,0 М. Ортофосфорную кислоту следует вносить в реакционную емкость по каплям или небольшими порциями. При внесении кислоты желательно проведение перемешивания жидкости в реакционной емкости. Материал выдерживают в приготовленном растворе. Предпочтительное время обработки, позволяющее достигать наиболее близких к нейтральному значений pH водных экстрактов материала, составляет 20-36 часов. Однако, эффективное дещелачивание происходит и при краткосрочной обработке в течение не менее чем 1 минуты. Обработку предпочтительно проводить при температурах близких к комнатной (20-25°С), поскольку при повышении температуры может происходить понижение растворимости гидроксидов щелочноземельных металлов, образующихся в материале при взаимодействии с водой. По окончанию обработки реакционный раствор удаляют или же переносят материал в другую емкость. После этого материал отмывают водой с целью удаления из него непрореагировавшей ортофосфорной кислоты и аммиака. Желательно проведение отмывки до достижения величины pH промывных вод значений менее 7,0. На заключительном этапе материал высушивают для удаления остаточных количеств аммиака, возможности его последующего хранения и стерилизации. Наилучшим образом для этой цели подходит метод высушивания в сухожаровом шкафу при температурах 105-150°С, поскольку при такой обработке происходит уничтожение вегетативных форм микроорганизмов, что важно для обеспечения микробиологической чистоты.

Степень дещелачивания материала по завершению обработки должна быть оценена в результате анализа pH водных экстрактов методом ионометрии или же другим методом, известным из уровня техники. Для проведения анализа измельченный образец материала помещают в ёмкость и заливают дистиллированной водой. Наиболее предпочтительно использовать массовое соотношение материала к объему воды 1 г на 8-10 мл. Для приготовления водного экстракта материал выдерживают в воде при перемешивании. Как правило, стабильное значение pH экстракта достигается в течение нескольких минут, однако, для получения воспроизводимых результатов желательно инкубировать материал в воде не менее 60 минут. По окончании экстракции воду сливают и измеряют значение величины pH, например, погружая в неё электрод pH-метра. pH водного экстракта полученного дещелаченого материала должен составлять не более 7,9.

Полученный низкощелочной материал, состоящий из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, может быть охарактеризован различными физико-химическими методами, применяемыми в научной литературе или описанными в нормативной документации для анализа подобных материалов. Так, например, подлинность вещества может быть охарактеризована методом ИК-спектроскопии: ИК спектр должен соответствовать спектру гидроксиапатита, не содержать полос, характерных для белка и других органических веществ. О сохранности карбонатных групп в составе анионной подрешетки материала свидетельствует наличие и выраженность полос поглощения в ИК спектре при 1410-1450 см^-1 и 873 см^-1 (Manalu J.L., Soegijono B., Indrani D.J. Characterization of Hydroxyapatite Derived from Bovine Bone. Asian Journal of Applied Sciences. 2015, v. 3, № 4, pp. 758-765). Кристалличность полученного материала может быть качественно или количественно оценена при помощи метода рентгенофазового анализа. При анализе данным методом материала, состоящего из низкокристаллического гидроксиапатита, характерные для вещества пики на рентгенограмме имеют слабую интенсивность и высокую ширину. Кристаллизованный апатит, в свою очередь характеризуется узкими пиками с высокой интенсивностью (Figueiredo M., Henriques J., Martins G., Guerra F., Judas F., Figueiredo H. Physicochemical characterization of biomaterials commonly used in dentistry as bone substitutes - comparison with human bone. J. Biomed. Mater. Res. 2010, v. 92, № 2, pp. 409-419). Дополнительно, микроструктура материала может быть проанализирована методом сканирующей электронной микроскопии.

Описанные выше стадии получения низкощелочного материала, состоящего из гидроксиапатита костной ткани, могут быть легко масштабированы и валидированы для использования на производстве продукции медицинского назначения. Для промышленного изготовления данного материала следует использовать сертифицированное оборудование, прошедшее квалификацию монтажа (IQ) и функционирования (OQ).

Низкощелочной материал, состоящий из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, полученный способом, описанным в настоящем изобретении, может быть обработан с целью придания ему формы, необходимой для клинического применения. Например, он может быть измельчен на мельнице или вручную с последующим проведением разделения частиц по размерам методом ситования для изготовления гранулированного костнозамещающего материала. Также материал может быть формован при помощи скальпеля или другого режущего инструмента для изготовления кубических или параллелепипедальных блоков или же объемных конструкций другой формы, применяемых для регенерации крупных дефектов костей. Измельченный до мелкодисперсного состояния материал может быть нанесен на металлические изделия имплантируемые в костную ткань для улучшения их биосовместимости. Кроме того, материал может являться основой для конструирования новых костных заменителей с повышенной остеоиндуктивностью, содержащих природный гидроксиапатит и депонированные на нем вещества, стимулирующие формирование костной ткани в области повреждения, такие как, например, костные морфогенетические белки (BMP), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а также генотерапевтические конструкции, кодирующие эти факторы.

Для обеспечения стерильности низкощелочной материал, состоящий из гидроксиапатита природного происхождения, полученный способом, описанным в настоящем изобретении, и медицинские изделия на его основе могут быть подвергнуты процессу стерилизации в конечной упаковке. Предпочтительными методами стерилизации являются стерилизация радиацией или обработкой оксидом этилена. Проведение паровой стерилизации не желательно вследствие трудности высушивания материала после обработки водяным паром.

Область применения

Низкощелочной материал, состоящий из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, полученный способом, описанным в настоящем изобретении, может быть применен в области:

(1) изготовления медицинских изделий, предназначенных для заполнения дефектов костной ткани и стимуляции регенерации костной ткани;

(2) изготовления лекарственных средств, содержащих фармацевтические субстанции, ускоряющие процессы регенерации костной ткани;

(3) научных исследований, например, с целью использования в качестве субстрата для культивирования остеогенных клеток-предшественников;

(4) клеточной терапии с целью использования в качестве субстрата для трансплантации остеогенных клеток-предшественников;

(5) изготовления костных протезов и имплантатов с целью покрытия поверхности для улучшения биосовместимости.

Пример 1

В качестве сырья для изготовления дещелаченного материала, состоящего из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, использовали бедренные кости крупного рогатого скота, полученные с предприятия, осуществляющего убой животных с целью получения продуктов для пищевого производства. Партия сырья сопровождалась ветеринарным свидетельством, подтверждающим его биологическую безопасность. Сырье перед началом работ хранили в морозильной камере при -20°С.

Кости извлекали из морозильной камеры, отделяли эпифизы (головки) костей при помощи электрической ленточной пилы (La Minerva, Италия). Затем на этом же оборудовании эпифизы разделяли на кубические фрагменты с длинной сторон 1,0-1,5 см. Фрагменты отмывали проточной водой в течение 30-и минут.

На следующем этапе губчатую костную ткань в полученных фрагментах очищали от тканей красного и желтого костного мозга. Для этого их помещали в пластиковую емкость с крышкой и обрабатывали последовательно растворами пероксида водорода, гидроксида натрия и Tween 80 на ультразвуковой бане. Массовое соотношение обрабатываемого материала к растворам составляло 1 к 5. После этого материал отмывали дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу в течение 12 часов при 120°С. Визуальный контроль не выявил наличия фрагментов тканей и пигментированных включений в полученном материале. Содержание двухцепочечной ДНК в материале составило 0,3±0,1 нг на мг сухой массы, что свидетельствует об эффективном удалении клеточных компонентов.

Далее фрагменты очищенной костной ткани подвергали химической депротеинизации. Для этого обрабатываемый материал помещали в стеклянную колбу и заливали 70% водным раствором 1,2-диаминоэтана. На колбу устанавливали обратный холодильник и помещали её на электрическую мешалку с подогревом MSH-300 (Biosan, Латвия). Раствор в колбе доводили до умеренного кипения. Выдерживали материал в таких условиях в течение 6 часов. Затем раствор сливали. Материал промывали несколько раз дистиллированной водой и оставляли в ней на ночь для удаления продуктов химического гидролиза органических веществ. Описанный выше цикл обработки 1,2-диаминоэтаном и водой повторяли. После этого материал высушивали в сушильном шкафу в течение 12 часов при 120°С.

Депротеинизированную костную ткань обрабатывали сухим жаром для окончательного удаления органических компонентов. Для этого материал помещали в фарфоровых тиглях в муфельную печь ЭКПС-10 (Смоленское СКТБ СПУ, Россия). Устанавливали температуру в камере печи 250°С. После достижения заданной температуры выдерживали материал в течение 15 часов.

Полученный в результате описанной выше обработки очищенный минеральный матрикс костной ткани, состоящий из природного гидроксиапатита, в виде фрагментов губчатой формы, сохранивших трабекулярную структуру губчатой костной ткани, характеризовали по показателю величины pH водного экстракта. Образцы материала измельчали в ступке. Навески величиной 1 г помещали в пробирки и добавляли к ним 9 мл дистиллированной воды. Образцы экстрагировали на лабораторном шейкере в течение 1 часа, после чего при помощи pH-метра ST3100-F (Ohaus, США) определяли величину pH полученных экстрактов. В результате измерений величина pH составила 11,08±0,01.

На заключительном этапе обработки произведенный материал разделяли на равные навески по 150 г и производили его дещелачивание, варьируя количества добавляемой ортофосфорной кислоты. Для осуществления этой цели навески материала помещали в отдельные полипропиленовые емкости с крышкой и заливали их дистиллированной водой в количестве 1500 мл. Материал выдерживали в воде в течение 30 минут. После этого в каждую емкость за исключением контрольной вносили 75 мл 25% водного раствора аммиака и измеряли значения pH образцов жидкости, которые по результатам измерения находились в диапазоне 11,11-11,17. Затем в те же емкости медленно по каплям добавляли ортофосфорную кислоту в виде её 1М раствора в различных количествах: 0,01, 0,05, 0,1, 0,15, 0,3 и 0,6 мл в расчете на 1 г материала, что соответствовало количеству вносимой ортофосфорной кислоты 0,01, 0,05, 0,1, 0,15, 0,3 и 0,6 ммоль на 1 г, соответственно. Определили pH образцов реакционных жидкостей, которые составили 11,31, 11,20, 10,84, 10,56, 10,36, 10,01, соответственно. Материал инкубировали в жидкостях в течение 24-х часов при постоянном перемешивании на лабораторном шейкере при комнатной температуре. По завершении инкубации жидкость сливали из емкостей и отмывали материал в 10 сменах дистиллированной воды по 30 минут при массовом соотношении материала к жидкости 1 к 10. Значения pH последней промывной воды находились у всех образцов в диапазоне 6,35-6,50. Контрольный образец отмывали дистиллированной водой по схеме обработки опытных образцов, не проводя внесения в неё других реактивов. Полученные материалы высушивали в сушильном шкафу в течение 12 часов при 120°С.

Для оценки физико-химической структуры полученных образцов проводили их анализ методами ИК-Фурье спектроскопии и рентгенофазового анализа. Для исследования материал измельчали до мелкодисперсного состояния в агатовой ступке. Затем, на инфракрасном Фурье-спектрометре Spectrum Two (PerkinElmer, США) с использованием приставки UATR Two с кристаллом из ZnSe регистрировали спектр отражения (450 см^-1-400 см^-1). На рентгеновском дифрактометре XRD 6000 (Shimadzu, Япония) регистрировали дифрактограммы образцов при следующих условиях: излучение CuKα, диапазон 2θ = 10-60°, шаг съемки 0,02°/мин, напряжение на трубке - 40кВ, сила тока - 20 мА. Идентификацию проводили с использованием базы данных ICDD-JCPDS. В качестве контроля использовали стандарт синтетического гидроксиапатита, предварительно прокаленный при 1000°С в течение 15 часов.

Для оценки эффективности дещелачивания материала, образцы измельчали в ступке. Навески величиной 1 г помещали в пробирки, добавляли к ним 9 мл дистиллированной воды и экстрагировали на лабораторном шейкере в течение 1 часа. Используя pH-метр ST3100-F (Ohaus, США) определяли значение pH полученных экстрактов.

Результаты проведенных анализов показали, что ИК-спектры всех исследованных образцов были идентичны и соответствовали спектрам природного гидроксиапатита (Фиг.1): присутствовали характеристические сигналы - линии 560, 600, 960 и 1020 см^-1, характерные для фосфатных групп, линия при 1095 см^-1 была плохо разрешена, что характерно для аморфного гидроксиапатита; также присутствовали линии в интервалах 870-880 см^-1 и 1410-1453 см^-1, свидетельствующие о наличии карбонатных групп в анионной подрешетке вещества (Захаров Н.А., Сенцов М.Ю., Демина Л.И., Захарова Т.В., Калинников В.Т. Синтетический гидроксиапатит кальция и его природные аналоги. Сорбционные и хроматографические процессы. 2010, т. 10. вып. 6, с. 879-886); в ИК-спектрах отсутствовали сигналы, характерные для азотсодержащих органических соединений в диапазонах 1500-1650 и 2800-3000 см^-1, что свидетельствует об эффективной очистке костного минерального матрикса от органических веществ.

Дифрактограммы образцов, подвергнутых различным вариантам обработки, также были идентичны и соотвестовали гидроксиапатиту по положению пиков и их относительной интенсивности (Фиг. 2). В то же время полученные материалы на дифрактограммах характеризовались широкими пиками с относительно слабой интенсивностью, а также низким соотношением сигнал/шум, что свидетельствует об их низкой кристалличности.

Полученные методами ИК-Фурье спектроскопии и рентгенофазового анализа данные подтверждают, что изготовленные материалы состоят из низкокристаллического апатита природного происхождения, характеризующегося сохранностью карбонат-ионов в кристаллической решетке вещества.

Анализ степени дещелачивания материалов методом оценки pH водных экстрактов показал, что обработка в дистиллированной воде (контроль) не приводит к существенному снижению величины водородного показателя (таблица 1). Обработка материала раствором, содержащем ортофосфорную кислоту в количествах 0,01, 0,05 и 0,1 ммоль на г материала, имеющем pH в диапазоне 10-12, доведенным водным раствором аммиака, не приводила к достижению значений pH водного экстракта близких к целевым (≤ 7,9) и находилось в щелочном диапазоне (таблица 1). В то же время при повышении количества вносимой кислоты до 0,15 ммоль на г происходило эффективное дещелачивание материала, значение pH водного экстракта достигало среднего значения pH 7,8 (таблица 1). При большем увеличении количества добавляемой ортофосфорной кислоты значения водородного показателя в большей степени приближались к нейтральным значениям, существенно не различаясь в образцах, обрабатываемых при добавлении 0,3 и 0,6 ммоль ортофосфорной кислоты на г (таблица 1).

Таблица 1. Значения pH водных экстрактов материала на основе природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, полученного в результате обработки растворами с различным содержанием ортофосфорной кислоты. Количество внесённой ортофосфорной кислоты, ммоль на г материала 0 (контроль) 0,01 0,05 0,1 0,15 0,3 0,6 pH водного экстракта 10,08±0,01 9,89±0,01 9,38±0,02 8,61±0,04 7,80±0,03 7,50±0,01 7,51±0,01

Полученные результаты свидетельствуют о том, что материал на основе природного гидроксиапатита, полученный из костной ткани в результате химической депротеинизации и последующей обработки сухим жаром в атмосфере окружающего воздуха при температуре, не вызывающей кристаллизацию природного гидроксиапатита, может быть дещелачен до уровня достижения pH водных экстрактов не более 7,9 в результате обработки водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту в количестве не менее 0,15 ммоль в расчете на 1 г обрабатываемого материала при значении pH в диапазоне 10-12, доведенным водным раствором аммиака.

Пример 2

Очищенную губчатую костную ткань эпифизов бедренных костей крупного рогатого скота подготавливали и очищали по методике идентичной изложенной в Примере 1.

Для депротеинизации кубические фрагменты очищенной костной ткани массой 400 г помещали в стеклянный реактор объемом 10 литров, оснащенный термостатируемой рубашкой, подключенной к циркуляционному термостату HBC 5 (IKA, Германия). К материалу добавляли 1,6 литра 12,5% водного раствора аммиака. На термостате устанавливали значение нагрева теплопроводящей жидкости в 100°С и запускали её циркуляцию в термостатируемой рубашке реактора. По достижению начала кипения раствора в реакторе засекали время начала обработки. Материал выдерживали при таких условия в течение 5 часов. После этого отработанный раствор аммиака сливали, материал ополаскивали проточной водой, а затем отмывали дистиллированной водой и оставляли в дистиллированной воде на ночь.

Идентичную обработку в кипящем растворе аммиака повторяли и сразу переносили материал в муфельную печь для обработки сухим жаром. Массовый выход депротеинизированной костной ткани в расчете на сухую массу на данном этапе составил 296 г.

На следующем этапе депротеинизированную костную ткань обрабатывали сухим жаром в муфельной печи ЭКПС-10 (Смоленское СКТБ СПУ, Россия) при 500°С в течение 12 часов. Массовый выход полученного очищенного от органических компонентов костного минерального матрикса составил 236 г (59% от исходной массы костной ткани до депротеинизации. Величина pH водных экстрактов полученного материала, измеренная по методике, описанной в Примере 1, составила 8,60±0,01.

Далее проводили дещелачивание материала. Для этого его в количестве 200 г помещали в реактор из полимерного пластика объемом 9 литров и заливали дистиллированной водой. Материал выдерживали в воде в течение 20 минут. После этого в реактор добавляли 200 мл 25% водного раствора аммиака и измеряли pH полученной жидкости. Измеренное значение водородного показателя составило 11,20. Затем в реакционную жидкость вносили 1М водный раствор ортофосфорной кислоты в количестве 60 мл, что соответствовало количеству вносимой кислоты 0,3 ммоль в расчете на 1 г обрабатываемого материала. Значение pH реакционной жидкости после внесения кислоты составило 10,61. Реактор помещали на универсальное перемешивающее устройство СМУ-60 (НПО Агромаш, Россия) и запускали перемешивание. Во время обработки через различные промежутки времени (1 мин, 10 мин 1 ч, 2,5 ч, 6 ч, 24 ч) отбирали образцы материала по 2-3 г с целью последующего анализа динамики процесса дещелачивания во времени. Оставшийся после отбора проб материал обрабатывали в течение 48 часов. В качестве контроля использовали материал, которые обрабатывали в дистиллированной воде в течение 48 часов по той же схеме без внесения водных растворов аммиака и ортофосфорной кислоты.

После извлечения из реактора образцы материала помещали в пластиковые емкости с крышкой и отмывали в дистиллированной воде до достижения pH промывной воды значения менее 7,0. Затем образцы высушивали в сушильном шкафу в течение 12 часов при 120°С.

Анализировали значения pH водных экстрактов полученных образцов по методике, описанной в Примере 1. Было выявлено, что даже кратковременная обработка реакционной жидкостью в течение 1 минуты вызывало снижение величины pH водных экстрактов материала до значения ниже 7,9 (таблица 2). Тогда как наиболее близкие к нейтральным значения данного показателя были обнаружены в образцах, обработанных в течение 12 и 48 часов (таблица 2).

Таблица 2. Значения pH водных экстрактов материала на основе природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, полученного при различной длительности обработки раствором, содержащем ортофосфорную кислоту. Длительность обработки раствором, содержащем ортофосфорную кислоту Контроль (обработка водой) 1 мин 10 мин 1 час 2,5 часа 6 часов 12 часов 48 часов pH водного экстракта 8,19±0,03 7,88±0,02 7,74±0,02 7,78±0,02 7,72±0,01 7,64±0,01 7,24±0,01 7,24±0,01

На следующем этапе материал, дещелаченный в течение 48 часов, измельчали при помощи мельницы-ступки Pulverisette 2 (Fritsch, Германия), подвергали ситованию на виброгрохоте Analysette 3 (Fritsch, Германия), разделяя на фракции 0,25-1,00 мм и 1,00-2,00 мм. Фракционированный материал фасовали по 1 г в стеклянные флаконы, закрывали резиновой пробкой и укупоривали алюминиевым колпачком с быстросъемной пластиковой крышкой, а затем подвергали радиационной стерилизации дозой 14,2 кГр, получая таким образом его форму, подготовленную для биомедицинского применения.

Проводили анализ структуры полученного материала методами ИК-спектроскопии и рентгенофазового анализа. Также повторно анализировали значения pH водного экстракта материала. Кроме того, для дополнительного контроля очистки оценивали содержание в материале 4-гидроксипролина, как маркера остаточного содержания коллагена.

В ходе анализа было показано, что ИК-спектры и рентгеновские дифрактограммы материала соответствовали низкокристаллическому гидроксиапатиту природного происхождения, характеризующегося сохранностью карбонат-ионов в кристаллической решетке вещества (Фиг. 3, 4). На ИК-спектрах отсутствовали сигналы, характерные для азотсодержащих органических соединений, также в образцах аналитическим методом не обнаруживался 4-гидроксипролин, что свидетельствует об эффективной очистке полученного минерального матрикса костной ткани. Значение pH водного экстракта материала составило 7,24±0,02, что говорит об отсутствии влияния подготовки материала и проведенной стерилизации на данный показатель.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что использованный метод дещелачивания материала на основе природного гидроксиапатита, полученного из костной ткани в результате химической депротеинизации и последующей обработки сухим жаром в атмосфере окружающего воздуха при температуре, не вызывающей кристаллизацию природного гидроксиапатита, эффективен уже при применении кратковременной обработки в течение не менее 1 минуты, достигая наибольшей эффективности при обработке в течение не менее 24 часов. Подготовка материала для создания его формы, пригодной для биомедицинского применения, не оказывает влияния на значение показателя pH водных экстрактов, достигнутого в результате дещелачивания, что свидетельствует в пользу промышленной применимости использованного метода.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения низкощелочного материала, состоящего из природного гидроксиапатита. Способ получения низкощелочного материала, состоящего из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, характеризующегося значениями водородного показателя водных вытяжек не более 7,9, включающий последовательно проводимые стадии предварительной очистки костной ткани от компонентов других тканей, депротеинизации костной ткани кипячением в растворе 1,2-диаминоэтана или аммиака с последующей промывкой, обработки сухим жаром в неконтролируемой атмосфере окружающего воздуха при температуре, не вызывающей кристаллизацию природного гидроксиапатита, находящейся в диапазоне 250-500°С, дещелачивания полученного на предыдущих стадиях материала обработкой водой, затем обработкой водным раствором аммиака до достижения значения рН 11,0-12,5, затем обработкой водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту в количестве не менее 0,15 ммоль в расчете на 1 г обрабатываемого материала и аммиак до значения pH 10-12, отмывкой водой и высушиванием. Использование изобретения позволяет быстро и эффективно получить низкощелочной материал, состоящий из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, уже при применении кратковременной обработки в процессе дещелачивания в течение не менее 1 минуты, достигая наибольшей эффективности при обработке в течение не менее 24 часов. 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Способ получения низкощелочного материала, состоящего из природного гидроксиапатита, происходящего из костной ткани, характеризующегося значениями водородного показателя водных вытяжек не более 7,9, включающий последовательно проводимые стадии

предварительной очистки костной ткани от компонентов других тканей,

депротеинизации костной ткани кипячением в растворе 1,2-диаминоэтана или аммиака с последующей промывкой,

обработки сухим жаром в неконтролируемой атмосфере окружающего воздуха при температуре, не вызывающей кристаллизацию природного гидроксиапатита, находящейся в диапазоне 250-500°С,

дещелачивания полученного на предыдущих стадиях материала обработкой водой, затем обработкой водным раствором аммиака до достижения значения рН 11,0-12,5, затем обработкой водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту в количестве не менее 0,15 ммоль в расчете на 1 г обрабатываемого материала и аммиак до значения pH 10-12, отмывкой водой и высушиванием.

2. Способ по п.1, где обработку водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту и аммиак, на стадии дещелачивания проводят в течение не менее чем одной минуты, наиболее предпочтительно в течение 24-48 часов.

3. Способ по п. 1, где обработку водным раствором, содержащим ортофосфорную кислоту и аммиак, на стадии дещелачивания проводят при комнатной температуре.

4. Способ по п. 1, в котором для получения материала используют костную ткань аллогенного или ксеногенного происхождения.

5. Способ по п. 1, в котором для получения материала используют губчатую костную ткань эпифизов трубчатых костей.

6. Способ по п. 1, в котором костную ткань обрабатывают в виде фрагментов костей кубической или параллелепипедальной формы.

7. Способ по п. 1, в котором обработку сухим жаром проводят в муфельной печи.

8. Способ по п. 1, в котором полученный низкощелочной материал измельчают до мелкодисперсного состояния и фракционируют, получая частицы определенного размера.

9. Способ по п. 1, в котором полученный низкощелочной материал упаковывают в герметичную упаковку и подвергают стерилизации.