Способ получения наноразмерного гидроксиапатита Российский патент 2020 года по МПК C01B25/32 B82B3/00 B82Y30/00 C01F11/18 A61L27/12 

Заявляемое техническое решение относится к области медицины и созданию новых биоматериалов медицинского назначения, конкретно к способу получения наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, который может быть использован для производства медицинских материалов, стимулирующих восстановление дефектов костной ткани, в том числе в ортопедии и стоматологии.

Терминология, используемая в рамках данной заявки

Биомиметические материалы, или биомиметики (англ. biomimetic materials или biomimetics, bioinspired materials), материалы, создаваемые на основе принципов, уже существующих в живой природе. Это макро-, микро- и наноразмерные синтетические структуры, которые представляют собой аналоги фрагментов тканей, органов или биологически активных продуктов метаболизма, повторяющих свойства живых систем;

ГАП – гидроксиапатит;

допирование (англ. doping) – внедрение небольших количеств примесей в структуру гидроксиапатита;

биорезорбция – способность растворения при контакте с межтканевыми жидкостями в организме;

остеоиндукция – стимулирующее действие при новообразовании костной ткани;

CTAB – (англ. cetyltrimethylammonium bromide) цетилтриметиламмоний бромид;

БМГАП – биомиметический гидроксиапатит;

ТЭОС – тетраэтоксисилан;

остеоинтеграция — один из видов интеграции имплантата в костную ткань. При остеоинтеграции имеется непосредственный контакт и функциональная связь между имплантатом и костной тканью, на которую осуществляется нагрузка.

модельный SBF-раствор (англ. Simulated Body Fluid) — это раствор, который аналогичен по своему химическому составу и концентрации ионов человеческой межтканевой жидкости или плазме крови человека.

В настоящее время, гидроксиапатит Са_1 0(PO₄)₆(ОН)₂ (далее ГАП) и материалы на его основе широко используются в медицинских целях: в стоматологии, реконструктивной хирургии костной ткани, ортопедии в качестве заменяющего материала для поврежденных зубов и костей, поскольку он является главной минеральной составляющей костной ткани человека и животных [Elliott J. C. Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates // ELSEVIER: Amsterdam - London - New York – Tokyo.1994. 404 p.; Dorozhkin S. V. Calcium orthophosphates in nature, biology and medicine //Materials. 2009. Vol. 2. P.399-498]. Подобные материалы обладают преимущественно высокой биосовместимостью, не вызывают аллергических реакций и для них характерно отсутствие токсического воздействия на организм. Однако существенными недостатками препаратов на основе ГАП, применяемых в настоящее время в медицинской практике, являются их неоптимальная биорезорбция и слабая остеоиндукция. Известно, что биоактивность и соответственно скорость биорезорбции гидроксиапатита можно регулировать величиной удельной поверхности за счет уменьшения размера частиц и химическим модифицированием структуры биосовместимыми ионами. Показано, что биоапатит в костях человека и животных соответствует химической формуле

Ca_10-d(HPO₄)_x(PO₄)_6-x-y-z(CO₃)_y(SiO₄)_z(OH)_2+x+y-z-2d.nH₂O

[Данильченко С. Н. Структура и свойства апатитов кальция с точки зрения биоминералогии и биоматериаловедения // Вісник Сумського державного університету. Серія Фізика, математика, механіка. 2007. №2. С. 33-59, Самусев Р. П., Селин Ю. М. Анатомия человека. Медицина. Москва, 1990. 479 с], то есть является кальций дефицитным и содержащим в своей структуре определенное количество силикат- и карбонат-анионов. По своей морфологии частицы, формирующие природный ГАП, являются наноразмерными и преимущественно сферической формы.

В последнее время большой интерес представляют исследования, направленные на синтез биомиметического гидроксиапатита (далее БМГАП), структура которого максимально приближенного к биоапатиту.

Известно, что карбонат-ионы содержатся в кости человека и животных в наибольшем количестве от 2 до 8% масс. [Баринов С. М., Комлев В. С. Биокерамика на основе фосфатов кальция. -М.: Наука, 2005. 204 с]. Замещение фосфат-ионов карбонат-анионами приводит к изменению степени кристалличности ГАП и уменьшению размера его кристаллов, а также повышает скорость биорезорбции [Frank-Kamenetskaya O., Kol’tsov A. Ion substitutions and non-stoichiometry of carbonated apatite-(CaOH) synthesized by precipitation and hydrothermal methods // J. of Molecular Structure. 2011. Vol. 9. P. 9-18].

Наряду с карбонат-анионами, другими широко распространенными замещенными анионами являются силикат-ионы, которые, как было обнаружено, играют немаловажную роль в физиологических процессах живых организмов. Имеются данные, что кремний связывают с процессом минерализации костей и остеопороза, синтеза коллагена [European Food Safety Authority. Opinion of the scientific panel on dietetic products, nutrition and allergies on a request from the commission related to the tolerable upper intake level of silicon // The EFSA Journal. 2004. Vol. 60. P. 1–11]. В последних исследованиях [Putlayev V., Veresov A., Pulkin M. et al. Silicon-substituted hydroxyapatite ceramics (Si-HAp): densification and grain growth through the prism of sintering theories // Mat. -wiss. u. Werkstofftech. 2006. Vol. 37, № 6. P. 416–421; Zheng Y., Dong G., Dengn C. Effect of silicon content on the surface morphology of silicon substituted hydroxyapatite bio-ceramics treated by a hydrothermal vapor method // Ceramics International. 2014. Vol. 40. P. 14661–14667] установлено, что добавление кремния в структуру ГАП способствует ускорению процесса остеоинтеграции, повышает скорость остеогенеза in vivo при имплантации кремнийсодержащей керамики.

В связи с вышеизложенным синтез наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами медицинского назначения является весьма актуальным.

Авторами Yang H., Wang Y. описан способ получения гидроксиапатита гидротермальным методом при взаимодействии водных растворов 0,13М Ca(NO₃)₂ и 0,06М (NH₄)₂HPO₄. В качестве стабилизаторов с целью синергетического регулирования нуклеации и роста кристаллов гидроксиапатита использовали цитрат натрия Na₃C₆H₅O₇ и цетилтриметиламмоний бромид CH₃(CH₂)₁₅N(Br)(CH₃)₃ (далее CTAB). [Yang H., Wang Y. Morphology control of hydroxyapatite microcrystals: Synergistic effects of citrate and CTAB // Mater. Sci. Eng. C. 2016. Vol. 62. P. 160–165]

Способ включает приготовление и перемешивание водных растворов А и Б.

Раствор А: 0,805г цитрата натрия Na₃C₆H₅O₇ и 0,47г нитрата кальция Ca(NO₃)₂×4H₂O растворили в 15мл деионизированной воды, перемешивали в течение 12ч.

Раствор Б: 0,2 г CTAB и 0,16 г (NH₄)₂HPO₄ растворили в 20мл деионизированной воды, pH доводили до 5 за счет добавления раствора 2М HNO₃ ().

Далее раствор А по каплям вводили в раствор Б при интенсивном перемешивании с использованием магнитной мешалки. Молярное соотношение компонентов следующее: цитрат/CTAB/Ca/P = 5/1/3,07/1,846. После чего реакционную смесь переносили в тефлоновую колбу объемом 100 см³, помещали в автоклав из нержавеющей стали, затем герметизировали и выдерживали при 180°С в течение 24 часов. После естественного охлаждения автоклава до комнатной температуры выпавший осадок промывали деионизированной водой и этанолом 3 раза соответственно, а затем центрифугировали и сушили вымораживанием. Полученный материал представляет собой микросферические частицы ГАП, и эти микросферы диаметром около 4 мкм, были составлены из наностержней, морфология продуктов была однородной.

Недостатками известного способа являются:

1. Высокие временные и трудовые затраты, связанные с многостадийностью и сложностью процесса получения ГАП. Это значительно затрудняет получение продукта в больших количествах;

2. Полученные частицы ГАП имеют большой размер диаметром около 4 мкм и, следовательно, не пригоден для использования в медицинской практике.

3. Кроме того, в качестве добавок при синтезе использовали цитрат натрия, при этом может происходить дополнительное замещение ионов Na⁺ в структуре гидроксиапатита.

Известен также способ получения гидроксиапатита путем смешения водных растворов кальция и фосфатов [Королева М. Ю., Фадеева Е. Ю., Шкинев В. М., Катасонова О. Н., Юртов Е. В. Синтез наночастиц гидроксиапатита методом контролируемого осаждения в водной фазе // Журнал неорганической химии. 2016. Т. 61, № 6, с. 710-716], где в качестве прекурсоров ионов кальция и фосфатов использовали двухводный хлористый кальций CaCl₂×2H₂O и безводный двухзамещенный фосфат аммония (NH₄)₂HPO₄, а источником цитрат-ионов был выбран цитрат натрия. Процесс синтеза ГАП осуществляли следующим образом: реакционный сосуд, содержащий 0,05М водного раствора CaCl₂ и цитрат натрия, нагревали до 40°С. Затем при постоянном перемешивании в реакционную смесь добавляли 0,06М водного раствора (NH₄)H₂PO₄ с помощью перистальтического насоса (1мл/мин), рН поддерживали постоянным 9,0 ± 0,1 добавлением раствора NH₄OH. Полученную суспензию подвергали старению в течение 24 часов при комнатной температуре. Далее полученный осадок фильтровали, хорошо промывали дистиллированной водой и сушили. Данный способ позволяет получить наноразмерный гидроксиапатит и благодаря варьированию концентрации цитрата натрия, можно целенаправленно получить пластинчатые гидроксиапатиты размером от 10 до 25нм и наностержни гидроксиапатита длиной 280нм и менее.

Недостаток известного метода состоит в том, что вместе с силикатом- и карбонат-анионами в кристаллической решетке гидроксиапатита идет нежелательное примесное замещение катионов Na⁺ за счёт использования цитрата натрия в качестве добавки.

Наиболее близким к заявляемому способу, выбранным за прототип, является способ, описанный в патенте РФ №2555337 опубл. 10.07.2015. Указанный способ получения нанокристаллического силикатзамещенного карбонатгидроксиапатита (далее КГА), включающий смешение растворов содержащих ионы кальция, фосфата и силиката, отстаивание, фильтрование, промывку от маточного раствора и сушку, где для синтеза КГА смешивают водные растворы, содержащие четырехводный нитрат кальция Са(NO₃)₂×4H₂O, безводный двухзамещенный фосфат аммония (NH₄)H₂PO₄ и пятиводный метасиликат натрия Na₂SiO₃×5 H₂O при рН на уровне 9,00 ÷12,00, а источник карбонат-ионов – из атмосферы воздуха. Процесс синтеза нанокристаллического КГА осуществляют методом осаждения: в реакционный сосуд, содержащий водный раствор Са(NO₃)₂ с добавкой 5мл концентрированного раствора аммиака, добавляют расчетное количество фосфатно-силикатной смеси ((NH₄)H₂PO₄+ Na₂SiO₃) с помощью делительной воронки со скоростью 4,5÷5,0 мл/мин. Причем реагенты вводятся в реакционный сосуд при условии обеспечения соотношения концентрации реагентов Ca/(P+Si), равном 1,70, и доле силикат-ионов в общем количестве осадкообразующих анионов, составляющей не более 30 мол. %. После полного смешения реагентов рН реакционной среды доводят до 9÷12 и полученную суспензию подвергают старению в течение 2 суток. Вся реакцию проводят при комнатной температуре. Далее полученный осадок фильтруют, промывают дистиллированной водой 5÷8 раз и высушивают в тонком слое при температуре порядка 80°С для обеспечения постепенного обезвоживания синтетической массы. После этого полученные образцы КГА измельчают до порошкообразного состояния. Данный способ позволяет получить порошок нанокристаллического КГА, содержащий до 7.36 масс. % силикат-анионов и до 7.34 масс. % карбонат-ионов, который может быть использован для формирования кальциево-фосфатных покрытий на металлических имплантантах, а также создания новых керамических композиционных материалов для травматологии, ортопедии и челюстно-лицевой хирургии.

Недостатки известного способа заключаются в том, что:

- используют метасиликат натрия Na₂SiO₃в качестве прекурсоров силикат-анионов в ходе синтеза КГА, при этом может происходить нежелательное примесное замещение катионов Na⁺ в кристаллической решетке гидроксиапатита;

- источником карбонат-ионов является CO₂ из атмосферы воздуха, что затрудняет точный контроль коэффициента замещения фосфат-ионов карбонат-анионами в структуре ГАП. Следовательно кристаллическая формула полученного КГА не соответствует биомиметическому материалу подобного биоапатиту.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения однофазного наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, максимально приближенного по химическому составу и структуре костям человека и животных.

Технический результат заключается в осуществлении поставленной задачи, а именно, реализация предполагаемого изобретения обеспечивает получение БМГАП, допированного силикат- и карбонат-анионами с регулируемой растворимостью, дисперсностью и биоактивностью формулы

Ca_10-d(HPO₄)_x(PO₄)_6-x-y-z(CO₃)_y(SiO₄)_z(OH)_2+x+y-z-2d.nH₂O,

где d - степень дефицитности ионов Ca²⁺;

y – коэффициент или степень замещения фосфат ионов карбонат-анионами,

z - коэффициент или степень замещения фосфат ионов силикат-анионами.

Продукт, полученный предложенным способом, максимально близок по химическому составу и структуре костям человека и животных, в том числе за счет того, что молярное соотношение, средний размер кристаллов от 12нм до 65нм, удельная поверхность от 132,60 до 193,50 м²/г, что обеспечивает регулируемую биоактивность готового продукта;

- частицы которого имеют преимущественно сферическую форму, что является наиболее предпочтительным для предотвращения инициации провоспалительной реакции.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения однофазного наноразмерного биомиметического гидроксиапатита допированного силикат- и карбонат-анионами формулы

Ca_10-d(HPO₄)_x(PO₄)_6-x-y-z(CO₃)_y(SiO₄)_z(OH)_2+x+y-z-2d.nH₂O,

где d - степень дефицитности Ca2+; y – коэффициент или степень замещения фосфат ионов карбонат-анионами, z - коэффициент или степень замещения фосфат ионов силикат-анионами, включающий смешение растворов содержащих ионы кальция, фосфата и силиката, отстаивание при комнатной температуре, фильтрование, промывку от маточного раствора и сушку, включает следующие новые признаки:

- к раствору нитрата кальция при перемешивании добавляют раствор лимонной кислоты по молярному соотношению 10:1 и с помощью раствора гидроксида аммония рН данной системы доводят до 10 – 11;

- продолжая перемешивание осуществляют допирование силикат- и карбонат-анионами для получения готового продукта со степенью замещения карбоната и кремния y = z = 1 , для чего последовательно добавляют расчетные количества сначала ТЭОС, затем карбоната аммония (NH₄)₂CO₃ и интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут,

- затем в эту композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин раствор гидрофосфата аммония (NH₄)₂HPO₄, для получения готового продукта с молярным соотношением в диапазоне от 1,50 до 1,60, поддерживая постоянным рН реакционной смеси с помощью гидроксида аммония, и перемешивают в течение 30 минут;

- отстаивают в течение 24 часов при комнатной температуре для завершения процесса фазообразования;

- после отделения и промывки осадка его сушат при 100 - 120°С до постоянной массы и измельчают.

Присутствие лимонной кислоты в качестве добавки в ходе синтеза БМГАП способствует ингибированию роста и агрегации кристаллов ГАП. Было обнаружено, что адсорбция цитрат-ионов на межфазовой поверхности растущих частиц ГАП обеспечивает электростатическую стабилизацию и приводит к снижению размеров частиц синтезируемого БМГАП.

Допирование силикат- и карбонат-анионами позволяет получить биомиметический гидроксиапатит, который максимально приближен по химическому составу и структуре природному биоапатиту костной ткани, что обеспечивает возможность регулировать биологическую активность продукта. При этом, в качестве поставщика карбонат-анионов использовали карбонат аммония (NH₄)₂CO₃, что позволяет более точно контролировать содержание данных ионов в полученном продукте.

Предложенный способ характеризуют следующие фигуры

Фиг. 1. Дифрактограмма РФА образца БМГАП с молярным соотношением равным 1,5 , полученного при степени дефицитности ионов Ca²⁺ d=1 и коэффициентах замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1 или 6,73 и 2,85 масс.% карбоната и кремния соответственно, в случае когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,48 масс. %. Рентгенофазовый анализ (РФА) исследуемых образцов БМГАП осуществляли на дифрактометре Rigaku Ultima IV с использованием СuКα - излучения (длина волны λ =1,54Å). Параметры съемки рентгенограмм: интервал углов 2θ=20-70°, шаг сканирования по 2θ - 0,02°, скорость регистрации спектров 3°/мин. Обработка данных результатов осуществляли с помощью программы PDXL Qualitative Analysis.

Фиг. 2. ИК-спектр образца БМГАП с молярным соотношениемравным 1,5 , полученного при степени дефицитности ионов Ca²⁺ d=1 и коэффициентах замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1 или 6,73 и 2,85 масс. % карбоната и кремния соответственно, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,48 масс. %. ИК-спектры поглощения полученных порошков регистрировали на Фурье-спектрометре «IRPrestige-21» (Shimadzu, Япония) в интервале волновых чисел от 400 до 4000 см−1. Образцы готовили таблетированием с KBr;

Фиг. 3. ПЭМ-изображение образца БМГАП с молярным соотношением равным 1,5, полученного при степени дефицитности ионов Ca²⁺ d=1 и коэффициентах замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1 или 6,73 и 2,85 масс. % карбоната и кремния соответственно, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,48 масс. %.;

Фиг. 4. СЭМ-микрофотография порошка БМГАП с молярным соотношением равным 1,5, полученного при степени дефицитности ионов Ca²⁺ d=1 и коэффициентах замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1 или 6,73 и 2,85 масс. % карбоната и кремния соответственно, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,48 масс. %.;

Фиг. 5. Выход ионов кальция исследуемых образцов БМГАП по примерам 3-5 в SBF-раствор в зависимости от времени экспозиции.

Морфология и размеры частиц гидродисперсий были охарактеризованы методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на приборе JEM-2100 (JEOL Ltd., Япония). Параметры работы: ускоряющее напряжение электронной пушки U=200 кВ, разрешение δ= 0,19 нм, увеличение до х800000. В качестве подложки применяли углеродную пленку и медную сетку с круглыми отверстиями диаметром 0,1мм. Образцы в виде суспензий предварительно подвергли обработке в ультразвуковой ванне в течение 10-15 мин.

Измерение удельной поверхности (S_уд), объема и среднего размера пор полученных порошков осуществляли методом Брюнера-Эммета-Теллера на установке TriStar II 3020 («Micromeritics», США). Образцы выдерживали в инертной атмосфере азота с одновременным обеспечением нагрева при температуре 350°С. Величина удельной поверхности определена по изотерме низкотемпературной адсорбции паров азота по одноточечному методу БЭТ в точке P/P_o= 0,299869104, а объем пор при P/P_o = 0.983956169.

Биорезорбируемость исследуемых материалов изучали по международной стандартной методике в модельном SBF растворе. Образцы БМГАП помещали и выдерживали в SBF-растворе при 37°С в термостате в течение 14 суток. Через заданные промежутки времени определяли концентрацию ионов кальция, переходящих в раствор, методом комплексонометрического титрования. Биорезорбируемость, согласно методике, оценивали по количественному выходу ионов Са²⁺ (Фиг.5).

Заявляемый способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Синтез наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами с молярным соотношением равным 1,5 (БМГАП 1,50), степенью дефицитности ионов Ca²⁺ d=1 и коэффициентами замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1, что соответствуют 6,73 масс. % карбоната и 3,14 масс. % кремния, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,048 масс. %.

Навеску 11,807г сухого кристаллогидрата Са(NO₃)₂×4H₂O растворяют в реакторе, оборудованном верхнеприводной мешалкой в 100 мл дистиллированной воды. К этому раствору добавляют 1 мл 0,5М раствора лимонной кислоты, рН смеси доводят до 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Далее к этой композиции при постоянном перемешивании добавляют 1,23 мл ТЭОС (1,155г, ρ=0,94 г/см³), затем добавляют 0,533г (NH₄)₂CO₃ и реакционную смесь интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут.

Навеску 2,933г сухого (NH₄)₂HPO₄ растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор помещают в делительную воронку и добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин в водный раствор, содержащий композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония. При этом рН реакционной смеси поддерживается постоянным на уровне 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут, а затем отстаивают в течение 24 часов для завершения процесса фазообразования. Весь синтез проводят при комнатной температуре.

Полученный осадок отделяют с помощью воронки Бюхнера, с использованием фильтровальной бумаги и вакуумного насоса. Затем осадок тщательно промывают от маточного раствора дистиллированной водой и сушат при 100 - 120°С в сушильном шкафу до постоянной массы. После этого образцы БМГАП измельчают в мелкий порошок с использованием ступки и пестика.

Пример 2

Синтез наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами с молярным соотношением равным 1,5 (БМГАП 1,50), степенью дефицитности ионов Ca²⁺ d=1 и коэффициентами замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1, что соответствуют 6,73 и 3,14 масс. % карбоната и кремния, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,24 масс. %.

Навеску 11,807г сухого кристаллогидрата Са(NO₃)₂×4H₂O растворяют в реакторе, оборудованном верхнеприводной мешалкой в 100 мл дистиллированной воды. К этому раствору добавляют 5 мл 0,5М раствора лимонной кислоты, рН смеси доводят до 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Далее к этой композиции при постоянном перемешивании добавляют 1,23 мл ТЭОС (1,155г, ρ=0,94 г/см³), затем добавляют 0,533г (NH₄)₂CO₃ и реакционную смесь интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут.

Навеску 2,933г сухого (NH₄)₂HPO₄ растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор помещают в делительную воронку и добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин в водный раствор, содержащий композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония. При этом рН реакционной смеси поддерживается постоянным на уровне 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут, а затем отстаивают в течение 24 часов для завершения процесса фазообразования. Весь синтез проводят при комнатной температуре.

Полученный осадок отделяют с помощью воронки Бюхнера, с использованием фильтровальной бумаги и вакуумного насоса. Затем осадок тщательно промывают от маточного раствора дистиллированной водой и сушат при 100 - 120°С в сушильном шкафу до постоянной массы. После этого образцы БМГАП измельчают в мелкий порошок с использованием ступки и пестика.

Пример 3

Синтез наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами с молярным соотношением равным 1,5 (БМГАП 1,50), степенью дефицитности ионов Ca²⁺ d=1 и коэффициентами замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1, что соответствуют 6,73 и 3,14 масс. % карбоната и кремния, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,48 масс. %.

Навеску 11,807г сухого кристаллогидрата Са(NO₃)₂×4H₂O растворяют в реакторе, оборудованном верхнеприводной мешалкой в 100 мл дистиллированной воды. К этому раствору добавляют 10 мл 0,5М раствора лимонной кислоты, рН смеси доводят до 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Далее к этой композиции при постоянном перемешивании добавляют 1,23 мл ТЭОС (1,155г, ρ=0,94 г/см³), затем добавляют 0,533г (NH₄)₂CO₃ и реакционную смесь интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут.

Навеску 2,933г сухого (NH₄)₂HPO₄ растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор помещают в делительную воронку и добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин в водный раствор, содержащий композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония. При этом рН реакционной смеси поддерживается постоянным на уровне 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут, а затем отстаивают в течение 24 часов для завершения процесса фазообразования. Весь синтез проводят при комнатной температуре.

Полученный осадок отделяют с помощью воронки Бюхнера, с использованием фильтровальной бумаги и вакуумного насоса. Затем осадок тщательно промывают от маточного раствора дистиллированной водой и сушат при 100 - 120°С в сушильном шкафу до постоянной массы. После этого образцы БМГАП измельчают в мелкий порошок с использованием ступки и пестика.

Пример 4

Синтез наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами в присутствии цитрат-ионов с молярным соотношением

равным 1,55 (БМГАП 1,55), степенью дефицитности ионов Ca²⁺ d=0,7 и коэффициентами замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1, что соответствуют 6,55 и 3,06 масс. % карбоната и кремния, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,48 масс. %.

Навеску 11,807г сухого кристаллогидрата Са(NO₃)₂×4H₂O растворяют в реакторе, оборудованном верхнеприводной мешалкой в 100 мл дистиллированной воды. К этому раствору добавляют 10 мл 0,5М раствора лимонной кислоты, рН смеси доводят до 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Далее к этой композиции добавляют 1,19 мл ТЭОС (1,118г, ρ=0,94г/см³), затем добавляют 0,516г (NH₄)₂CO₃ и реакционную смесь интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут.

Навеску 2,838г сухого (NH₄)₂HPO₄ растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор помещают в делительную воронку и добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин в водный раствор, содержащий композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония. При этом рН реакционной смеси поддерживается постоянным на уровне 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут, а затем отстаивают в течение 24 часов для завершения процесса фазообразования. Весь синтез проводят при комнатной температуре.

Полученный осадок отделяют с помощью воронки Бюхнера, с использованием фильтровальной бумаги и вакуумного насоса. Затем осадок тщательно промывают от маточного раствора дистиллированной водой и сушат при 100 - 120°С в сушильном шкафу до постоянной массы. После этого образцы БМГАП измельчают в мелкий порошок с использованием ступки и пестика.

Пример 5

Синтез наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами в присутствии цитрат-ионов с молярным соотношением равным 1,60 (БМГАП 1,60), степенью дефицитности ионов Ca²⁺ d=0,4 и коэффициентами замещения фосфат ионов карбонат- и силикат-анионами y=z=1, что соответствуют 6,41 и 2,99 масс. % карбоната и кремния, в случае, когда соотношение компонента лимонной кислоты составляет 0,48 масс. %.

Навеску 11,807г сухого кристаллогидрата Са(NO₃)₂×4H₂O растворяют в реакторе, оборудованном верхнеприводной мешалкой в 100 мл дистиллированной воды. К этому раствору добавляют 10 мл 0,5М раствора лимонной кислоты, рН смеси доводят до 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Далее к этой композиции добавляют 1,15 мл ТЭОС (1,083г, ρ=0,94г/см³), затем добавляют 0,516г (NH₄)₂CO₃ и реакционную смесь интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут.

Навеску 2,750г сухого (NH₄)₂HPO₄ растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор помещают в делительную воронку и добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин в водный раствор, содержащий композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония. При этом рН реакционной смеси поддерживается постоянным на уровне 10-11 за счет добавления 25 масс. % NH₄OH. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут, а затем отстаивают в течение 24 часов для завершения процесса фазообразования. Весь синтез проводят при комнатной температуре.

Полученный осадок отделяют с помощью воронки Бюхнера, с использованием фильтровальной бумаги и вакуумного насоса. Затем осадок тщательно промывают от маточного раствора дистиллированной водой и сушат при 100 - 120°С в сушильном шкафу до постоянной массы. После этого образцы БМГАП измельчают в мелкий порошок с использованием ступки и пестика.

Физико-химические характеристики и текстурные характеристики образцов, полученных по примерам 1-5 приведены в табл. 1-2.

Таблица 1

Физико-химические характеристики образцов, полученных по примерам 1-5

Таблица 2

Текстурные характеристики образцов, полученных по примерам 1-5

Средний размер кристаллитов определяли по формуле Селякова-Шеррера:

где D – размер кристаллита; n – коэффициент, зависящий от формы частицы и близкий к 1; л – длина волны излучения; в – полуширина дифракционной линии; и – дифракционный угол [Cullity B. D., Weymouth J. W.Elements of X-Ray Diffraction // Am. J. Phys. 1957. Vol. 25. P. 394–395]. Степень кристалличности X_s синтезированных образцов рассчитывали по данным рентгеновской дифрактограммы с использованием формулы:

где - интегрированная площадь под всеми пиками кристаллов и- общая интегрированная площадь под всеми пиками дифракции рентгеновских лучей при 2θ = 20 ÷ 70° [Singh G., Singh S., Prakash S. Surface characterization of plasma sprayed pure and reinforced hydroxyapatite coating on Ti6Al4V alloy // Surf. Coat. Technol. 2011. Vol. 205. P. 4814-4820].

Известно, что форма микроразмерных частиц ГАП также является важной для инициации провоспалительной реакции, и игольчатая форма кристаллов ГАП является наименее биосовместимой [Laquerriere P., Grandjean-Laquerriere A., Addadi-Rebbah S. et al. MMP-2, MMP-9 and their inhibitors TIMP-2 and TIMP-1 production by human monocytes in vitro in the presence of different forms of hydroxyapatite particles // Biomaterials. 2004. Vol. 25, № 13. P. 2515-24]. Также известно, что игольчатая форма кристаллов ГАП (размер 0,1–20 мкм) инициирует активацию NLRP3 инфламасомы и выраженную секрецию IL-1β макрофагами и дендритными клетками костного мозга мышей in vitro, а при внутрибрюшинной инъекции микроразмерного и субмикронного ГАП воспалительный ответ не развивался при введении частиц ГАП сравнимого размера, но гладкой сферической формы [Lebre F., Sridharan R., Sawkins M.J. et al. The shape and size of hydroxyapatite particles dictate inflammatory responses following implantation. Sci. Rep. 2017; 7(1): 2922].

Предложенный способ позволяет получать наноразмерные частицы сферической формы размером от 12 до 65нм (фиг. 3), которые согласно [Lebre F., Sridharan R., Sawkins M.J. et al. The shape and size of hydroxyapatite particles dictate inflammatory responses following implantation // Sci. Rep. 2017. Vol. 7, № 1: P. 2922] являются наиболее биосовместимыми для внутрибрюшинной инъекции.

По примерам 1-3, представленным в таблице 2 видно, что увеличение концентрации цитрат-ионов, вводимых в ходе синтеза БМГАП приводит к уменьшению размера частиц готового продукта, и как следствие, способствует повышению удельной поверхности с 132,60 до 192,50 м²/г, что позволяет успешно регулировать биосовместимость и биорезорбируемость синтезированного материала.

Таким образом, поставленная задача по созданию способа получения наноразмерного БМГАП, структура и состав которого максимально приближен по химическому составу и структуре костям человека и животных, решена, и при реализации предложенного способа достигнут заявленный технический результат, заключающийся в том, что получен БМГАП формулы Ca_10-d(HPO₄)_x(PO₄)_6-x-y-z(CO₃)_y(SiO₄)_z(OH)_2+x+y-z-2d.nH₂O, где d - степень дефицитности ионов Ca²⁺; y – коэффициент или степень замещения фосфат ионов карбонат-анионами, z - коэффициент или степень замещения фосфат ионов силикат-анионами, со средним размером кристаллов от 12 до 65нм, удельной поверхностью 132,60 - 193,50 м²/г и обладающий хорошей биосовместимостью, регулируемой биорезорбцией, за счет того, что частицы БМГАП имеют сферическую форму, которая обладает лучшей биосовместимостью для предупреждения инициации провоспалительной реакции в организме.

Предожен способ получения однофазного наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами формулы Ca_10-d(НРО₄)×(РО₄)_6-x-y-z(СО₃)_y(SiO₄)_z(ОН)_2+x+y-z-2d. nH₂O, где d - степень дефицитности Са²⁺; у - коэффициент или степень замещения фосфат ионов карбонат-анионами, z - коэффициент или степень замещения фосфат ионов силикат-анионами и молярном соотношении , включающий приготовление композиции из нитрата кальция/лимонной кислоты/тетраэтоксисилан/карбоната аммония, для чего к раствору нитрата кальция при перемешивании добавляют раствор лимонной кислоты по молярному соотношению 10:1 и с помощью раствора гидроксида аммония рН данной системы доводят до 10-11, продолжая перемешивание, осуществляют допирование силикат- и карбонат-анионами для получения готового продукта со степенью замещения карбоната и кремния у=z=1, для чего последовательно добавляют расчетные количества сначала тетраэтоксисилана, затем карбоната аммония (NH₄)₂CO₃ и интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут, затем в композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин раствор гидрофосфата аммония (NH₄)₂HPO₄ для получения готового продукта с молярным соотношением в диапазоне от 1,50 до 1,60, поддерживая рН реакционной смеси равным 10-11 с помощью гидроксида аммония, и перемешивают в течение 30 минут, отстаивают в течение 24 часов при комнатной температуре, после чего осадок отделяют, промывают и сушат при 100 - 120°С до постоянной массы с последующим измельчением. Технический результат - реализация предполагаемого изобретения обеспечивает получение БМГАП, максимально приближенного по химическому составу и структуре костям человека и животных, допированного силикат- и карбонат-анионами с регулируемой растворимостью, дисперсностью и биоактивностью формулы Ca_10-d(HPO₄)_x(PO₄)_6-x-y-z(CO₃)_y(SiO₄)_z(OH)_2+x+y-z-2d.nH₂O, где d - степень дефицитности ионов Ca²⁺; y – коэффициент или степень замещения фосфат ионов карбонат-анионами, z - коэффициент или степень замещения фосфат ионов силикат-анионами. 2 табл., 5 пр., 5 ил.

Способ получения однофазного наноразмерного биомиметического гидроксиапатита, допированного силикат- и карбонат-анионами формулы Ca_10-d(НРО₄)×(РО₄)_6-x-y-z(СО₃)_y(SiO₄)_z(ОН)_2+x+y-z-2d. nH₂O, где d - степень дефицитности Са²⁺; у - коэффициент или степень замещения фосфат ионов карбонат-анионами, z - коэффициент или степень замещения фосфат ионов силикат-анионами и молярном соотношении , включающий приготовление композиции из нитрата кальция/лимонной кислоты/тетраэтоксисилан/карбоната аммония, для чего к раствору нитрата кальция при перемешивании добавляют раствор лимонной кислоты по молярному соотношению 10:1 и с помощью раствора гидроксида аммония рН данной системы доводят до 10-11, продолжая перемешивание, осуществляют допирование силикат- и карбонат-анионами для получения готового продукта со степенью замещения карбоната и кремния у=z=1, для чего последовательно добавляют расчетные количества сначала тетраэтоксисилана, затем карбоната аммония (NH₄)₂CO₃ и интенсивно перемешивают в течение 5-10 минут, затем в композицию из нитрата кальция/лимонной кислоты/ТЭОС/карбоната аммония добавляют по каплям со скоростью 4÷5 мл/мин раствор гидрофосфата аммония (NH₄)₂HPO₄ для получения готового продукта с молярным соотношением в диапазоне от 1,50 до 1,60, поддерживая рН реакционной смеси равным 10-11 с помощью гидроксида аммония, и перемешивают в течение 30 минут, отстаивают в течение 24 часов при комнатной температуре, после чего осадок отделяют, промывают и сушат при 100 - 120°С до постоянной массы с последующим измельчением.