ШТАММ Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ B-14606 - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ И УКСУСНОЙ КИСЛОТ ДЛЯ СИЛОСОВАНИЯ КОРМОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Lactiplantibacillus plantarum, обладающего способностью продуцировать молочную и уксусную кислоты, для получения микробной биомассы для силосования кормов. Бактерии штамма эффективно размножаются в силосуемой зеленой массе, сбраживают редуцирующие сахара с показателем конверсии до 93% и проявляют фунгистатическое действие.

Уровень техники

Известен штамм бактерий Lactobacillus plantarum 60 ВНИИСХМ N 78Д для силосования кормов (см. патент РФ №2168909 по кл. МПК А23К 3/02, опуб. 20.06.2001). Штамм Lactobacillus plantarum 60 обладает высокой активностью размножения и способностью в более короткие сроки по сравнению с другими известными штаммами бактерий (например, Streptococcus faecium 500, Lactobacillus plantarum 52) образовывать преимущественно молочную кислоту, а также обладает по сравнению с ними более выраженными антагонистическими свойствами по отношению к гнилостным бактериям, встречающимися в силосе, таким как Bacillus megatherium, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides. Препарат для силосования корма на основе данного штамма представляет собой жидкость светло-коричневого цвета с осадком питательной среды и содержит молочнокислые бактерии в количестве 900-1100 млн/мл. Активность молочнокислых бактерий (кислотность по Тернеру) - 25-30°Т. Препарат используют в виде жидкой закваски.

Известен также штамм Lactobacillus buchneri 600 (см. патент РФ №2243999 по кл. МПК A23K 3/00, опуб. 10.01.2005). Штамм обеспечивает эффективное размножение штамма в силосуемой зеленой массе кукурузы и консервирование плющеного зерна с повышенным образованием молочной кислоты и подавлением гнилостной микрофлоры по сравнению со штаммом Lactobacillus plantarum 60.

Однако, описанные штаммы при культивировании позволяют получать концентрацию клеток в количестве 9×10⁸ - 1,1×10⁹ кое/мл, что ограничивает эффективное размножение клеток в питательном субстрате. Также штаммы Lactobacillus buchneri 600 и Lactobacillus plantarum 60 нуждаются в дорогостоящих стимуляторах роста (биотин).

Известна молочнокислая бактерия, принадлежащая к роду Lactococcus, представляющая собой штамм SBS-0001 Lactococcus lactis (NITE BP-1107) для производства силоса и молочнокислая бактерия, принадлежащая к роду Lactococcus, представляющая собой штамм SBS-0002 Lactococcus lactis (NITE BP-1108) для производства силоса (см. патент РФ №2598270 по кл. МПК C12N 1/20, опуб. 20.09.2016). Указанные штаммы способны подавлять маслянокислое брожение в сырье для силоса или ферментированного корма, имеющем низкое содержание сахара, и не отличающемся достаточным качеством брожения при использовании обычной молочнокислой бактерии. Молочнокислая бактерия проявляет высокую низин-продуцирующую активность в травяной бульонной питательной среде, по сравнению с известными продуцирующими низин штаммами молочнокислых бактерий. На основе данных штаммов разработан препарат, обеспечивающий брожение сырья при температуре от 5 до 30°C в течение 1 недели и более. Для получения ферментированного корма возможно также использование штамма Chikuso-1 Lactobacillus plantarum.

Однако, использование штаммов SBS-0001 Lactococcus lactis (NITE BP-1107) и SBS-0002 Lactococcus lactis (NITE BP-1108) оправдано для сырья с низким качеством брожения, когда риск влияния продукции низина на естественные процессы пищеварения животного при скармливании и, как следствие, снижения усвояемости готового корма ниже, чем потеря общей питательности силосуемой массы за счет развития маслянокислого брожения. Вместе с тем, низин продуцирующие штаммы не обладают фунгистатической активностью против дрожжей в процессе силосования.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Lactobacillus brevis ТАК 124-1 NCIMB42149 для силосования кормов (см. евразийский патент №033289 по кл. МПК C12R 1/24, опуб. 20.09.2016). Указанный штамм используют для приготовления препарата для силосования кормов. Бактерии штамма улучшают сбраживание корма, синтезируют молочную и уксусную кислоту и подавляют действие патогенов. Авторами заявлено присутствие у штамма ферментов для преобразования следующих веществ: L-арабиноза, рибоза, D-ксилоза, D-глюкоза, D-фруктоза, мальтоза, гентибиоза, 5-кетоглюконат натрия.

Для получения препарата на основе данного штамма микроорганизм Lactobacillus brevis TAK 124-1 NCIMB42149 добавляют к корму при брожении. Данный штамм добавляют к корму со скоростью 1×10⁵-10×10⁶ КОЕ/г сброженного корма.

Однако, способность к конверсии сахаров в кислоты, на основании приведенных данных, составляет 71,8 %. В процессе заготовки трудносилосуемых трав происходит недостаточно глубокое закисление корма.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой заявляемого изобретения является получение нового штамма бактерий Lactiplantibacillus plantarum, обладающего высокой продуцирующей способностью в отношении молочной и уксусной кислот, для получения микробной биомассы, обеспечивающей быстрое и эффективное силосование растительных кормов для животных.

Технический результат заключается в способности штамма Lactiplantibacillus plantarum сбраживать широкий ряд углеводов, интенсивно размножаться и быстро закислять силосуемый корм, а также обеспечивать высокую фунгистатическую активность по отношению к часто встречающимся дрожжевым представителям: Candida lamlica, Pichia strasburgensia, Hansenula anomala.

Для решения технической проблемы и достижения технического результата сконструирован штамм Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) В-38, депонированный 22.11.2023 г. во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» под номером B-14606 в качестве штамма продуцента молочной и уксусной кислот.

Продукт, образуемый штаммом - биопрепарат, представляющий собой микробную массу живых клеток, способных к размножению и синтезу молочной и уксусной кислот на питательных субстратах.

Область применения штамма - использование биомассы для силосования кормов с/х животных.

Штамм Lactiplantibacillus plantarum B-14606 был выделен из рубцового содержимого крупного рогатого скота. Для выделенного штамма были проведены таксономические исследования с целью идентификации, в результате которой на основании анализа 16S РНК от 30.03.2023 г. было выявлено, что тестируемый штамм наиболее близок к виду Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum).

При ферментации штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606 на жидкой питательной среде MRS получена концентрация микробных клеток в культуральной жидкости 2,7×10⁹ КОЕ/мл; а при сублимационном высушивании - концентрация 2×10¹¹ КОЕ/г.

Штамм охарактеризован следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками: клетки имеют форму палочек разной длины с закругленными концами, расположенных одиночно, парами, короткими цепочками. Грамположительные, неподвижные, спор не образуют.

Факультативный аэроб. На плотной питательной среде MRS клетки штамма образуют колонии мелкие белые округлой формы, диаметром 1-2 мм. При добавлении в питательную среду мела образуют характерные колонии с зоной растворения мела. Оптимальная температура для роста - 28-37°С. При температуре менее 25°С и более 40°С рост замедляется. Растет в присутствии 2% NaCl.

Рост культуры Lactiplantibacillus plantarum B-14606 происходит при pH от 3,9-7,5. Оптимальное значение pH среды -5,5.

Функциональные характеристики штамма.

Штамм Lactiplantibacillus plantarum B-14606 имеет следующий профиль брожения углеводов: сбраживает глюкозу, раффинозу, арабинозу, сахарозу, рамнозу, мальтозу, крахмал, сорбит, лактозу, маннит. Способность штамма ферментировать раффинозу и крахмал свидетельствует о наличии гликозидазной активности.

Штамм Lactiplantibacillus plantarum B-14606 способен интенсивно размножаться и быстро закислять среду обитания, что обеспечивает его эффективность при использовании в качестве биопрепарата при заготовке растительных кормов для животных.

Осуществление изобретения

Пример 1. Конструирование штамма осуществляли следующим образом.

Из фильтрата пробы жидкости рубцового содержимого коровы были приготовлены ряды последовательных десятикратных разведений в физиологическом растворе. Образцы со степенью разведения в 10^-3, 10^-4, 10^-5 раз высевали на чашки Петри с агаризованной селективной питательной средой MRS. Культивирование проводили при температуре 30°С в течение 72 часов. Выросшие колонии характеризовали по следующим морфолого-культуральным признакам: способностью на питательной среде образовывать мелкие округлые колонии молочного, молочно-белого цвета, которые давали положительный результат в тесте на окрашивание по Граму и при микрокопировании образовывать палочки разной длины. На основе собранных данных было отобрано 14 штаммов бактерий.

Отобранные клетки штаммов были выращены на скошенной агаризованной среде MRS, после чего содержимое суспендировали в 5 мл физиологического раствора. Полученные суспензии переносили в колбы с жидкой питательной средой MRS, объемом 95 мл. Культивирование проводили при постоянном перемешивании со скоростью 200 об/мин при 30°С в течение 24 часов. В полученных культуральных жидкостях были определены концентрации жизнеспособных клеток путем высева десятикратных разведений на чашки Петри со средой MRS. Концентрация клеток штаммов в образцах культуральной жидкости составила 1×10⁹ - 2,7×10⁹ КОЕ/мл.

Дальнейший скрининг был направлен на выявление у выделенных штаммов фунгистатических свойств в отношении типичных (по литературным данным) дрожжевых представителей силосов: Candida lamlica, Pichia strasburgensia, Hansenula anomala методом диффузионных агаровых лунок. На чашки Петри с агаризованной средой MRS были сделаны высевы штаммов дрожжей из суспензии клеток с концентрацией 1×10⁶ КОЕ/мл в физиологическом растворе. В лунки, сделанные в агаре после посева, вносили культуральную жидкость штаммов исследуемых бактерий, предварительно разведенную в физиологическом растворе до концентрации 1×10⁵ - 3×10⁵ КОЕ/мл. Чашки инкубировали при 30°С в течение 24 часов. Критерием оценки возможного наличия противогрибковой активности у отобранных штаммов бактерий служил факт отсутствия роста дрожжей на лунке или вокруг нее.

В результате этапа выделения для штамма с характерным ингибированием развития дрожжей на лунках были проведены таксономические исследования на базе БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» с целью идентификации, в результате которых было выявлено, что тестируемый штамм наиболее близок к виду Lactiplantibacillus plantarum.

Для того, чтобы определить концентрацию клеток и количество синтезируемых кислот, штамм Lactiplantibacillus plantarum B-14606 был выращен на агаризованной среде MRS, затем содержимое суспендировали в физиологическом растворе до концентрации клеток 1×10⁹ КОЕ/мл и 0,5 мл содержимого засевали в 4,65 мл жидкой питательной среды PYG (пептон-2 г/л, дрожжевой экстракт-2 г/л, глюкоза-2 г/л). Культивирование проводили в течение 48 часов при 30°С при постоянном перемешивании со скоростью 200 об/мин. Количество синтезируемых органических кислот определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, отличительной особенностью штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606 является увеличение массовой доли уксусной кислоты среди суммарного количества продуцируемых кислот до 17,9 %, что выше на 5,7 % результата, полученного со штаммом-прототипом. Конверсия углеводного компонента питательной среды составляет 92,3 %, что на 20,5% выше при сравнении с прототипом.

Таблица 1. Показатели концентраций и соотношений молочной и уксусной кислот после культивирования в жидкой питательной среде в течение 48 часов.

Название штамма Концентрация кислот, г/л Соотношение кислот, % Молочная Уксусная Молочная Уксусная Lactobacillus brevis TAK 124-1 1,26 0,17 87,87 12,13 Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ
B-14606 1,52 0,33 82,14 17,86

Как известно, в созревании силосов участвует сообщество микроорганизмов, состоящее из двух противоположных групп по характеру воздействия на растительный материал: вредные (нежелательные) и полезные (желательные) группы. Количественный и качественный состав на поверхности силосуемой зеленой массы зависит от вида и возраста растений и почвенно-климатических условий. Численность микроорганизмов на 1 г зеленой массы составляет от 1,5×10³ до 9×10⁶ КОЕ, где содержание гнилостных бактерий - от 1,4×10³ до 1,9×10⁴ КОЕ. Для регулирования процесса консервирования зеленой массы, в том числе для подавления развития нежелательных бактерий, применяют биопрепараты на основе молочнокислых бактерий, введение которых должно обеспечивать присутствие полезных бактерий в силосе в концентрации, заведомо превышающей количество гнилостных бактерий в нем, для возможности активного развития в условиях конкуренции за ростовой субстрат. Таким образом, добавление биопрепарата должно способствовать введению молочнокислых бактерий в концентрации от 2,0×10⁴ до 1×10⁶ КОЕ на 1 г свежей зеленой консервируемой растительной массы.

Пример 2. Изготовление биопрепарата для силосования кормов на основе штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606.

В ферментере готовили жидкую питательную среду MRS, после чего в нее вносили 5% от объема предварительно выращенного посевного материала с клетками штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606. Культивирование осуществляли при 30°С в течение 24 часов, при избыточном давлении 0,5 атм., без аэрации и при непрерывном перемешивании мешалкой со скоростью 200 об/мин. Биомассу после отделения центрифугированием от культуральной жидкости отправляли на лиофилизацию для получения сухих клеток штамма. Лиофилизат представлял собой порошок светло коричневого цвета с концентрацией клеток 2,0×10¹¹ КОЕ/г. Высушенная биомасса, разбавленная водопроводной водой, может быть использована в качестве биопрепарата для силосования кормов.

Пример 3. Применение биопрепарата на основе штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606.

В качестве примера использования штамма как бактериальной закваски был проведен модельный эксперимент по силосованию свежей зеленой массы люцерны в лабораторных условиях. Концентрация общего редуцирующего сахара в силосуемой зеленой массе была определена по реакции с 3,5-динитросалициловой кислотой и составляла 16,25 г/кг. В сосуд закладывали 100 г измельченной зеленой массы люцерны с бактериальными клетками штамма. 5 г сухой лиофильно высушенной биомассы клеток Lactiplantibacillus plantarum B-14606, разводили в водопроводной воде до концентрации 2×10⁶ КОЕ/мл, затем вносили 1 мл клеточной суспензии в 100 г зеленой массы люцерны. Массу тщательно перемешивали, утрамбовывали и плотно закрывали. Показатели оценки качества силоса определяли через 30 суток. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Показатели качества корма модельного эксперимента по силосованию зеленой массы люцерны штаммом Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ B-14606.

При сбраживании травы биопрепаратом на основе штамма Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ B-14606 конвертирование редуцирующих сахаров в кислоты составило 93%. Полученные экспериментальные данные схожи с данными по конверсии углеводов при культивировании штамма на жидкой питательной среде из примера 1, которая содержала только гексозы. Однако, доля продукции уксусной кислоты среди общей концентрации синтезируемых кислот при сбраживании люцерны увеличивается за счет включения у штамма метаболического пути брожения пятиатомных углеводов, содержащихся в зеленой массе. Из литературных источников известно, что увеличение количества уксусной кислоты относительно молочной в процессе силосования повышает аэробную стабильность корма.

Пример 4. Для силосования кормов может быть использован комплексный биопрепарат, представляющий собой композицию из биомассы штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606 в сочетании с высушенными клетками других штаммов молочнокислых бактериий, в частности - Pediococcus pentosaceus B-3123 и Lentilactobacillus buchneri B-14607.

Для получения входящих в комплексный биопрепарат высушенных клеток штаммов Pediococcus pentosaceus B-3123 и Lentilactobacillus buchneri B-14607 процессы культивирования проводили аналогично описанному в примере 2, т.е. как для штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606.

Лиофилизаты высушенных клеток смешивали в сухом виде и разводили водопроводной водой для использования в качестве биопрепарата для силосования. Разбавление проводили непосредственно перед применением так, чтобы при внесении суспензии в растительное сырье общее количество клеток составляло не менее 1×10⁵ КОЕ/г зеленой массы.

Пример 5. Определение фунгистатической активности штамма Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ B-14606.

Фунгистатическую активность определяли в отношении часто встречающихся дрожжевых представителей: Candida lamlica, Pichia strasburgensia, Hansenula anomala. Использовали метод агаровых слоев по Грациа. Противогрибковое действие определяли также у отдельных штаммов молочнокислых бактерий, используемых для приготовления комплексного биопрепарата из примера 4.

Предварительно выращенные культуральные жидкости молочнокислых бактерий Pediococcus pentosaceus B-3123 и Lentilactobacillus buchneri B-14607 высевали по капле на поверхности плотной питательной среды MRS и инкубировали при температуре 30°С в течение 48 часов. Далее чашки Петри с выращенными колониями молочнокислых бактерий покрывали новым слоем агаризованной среды MRS, доведенной до температуры 40°С, с содержанием клеток дрожжей в концентрации 1×10⁵ - 3×10⁵ КОЕ/мл. Покрытые чашки Петри инкубировали при 30°С в течение 48 часов. Затем проверяли на наличие зон ингибирования роста дрожжей вокруг исследуемого штамма. В качестве контроля роста для каждого вида дрожжей были приготовлены чашки Петри без тестируемого штамма. Результаты эксперимента интерпретировали следующим образом: «-» - отсутствие ингибирования роста дрожжей; «число» - отсутствие роста дрожжей вокруг капли на указанном расстоянии в мм.

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Оценка противогрибковой активности штаммов при анализе в верхнем слое

Название штамма дрожжей Оценка противогрибковой активности, мм Контроль (без молочнокислых бактерий) Pediococcus pentosaceus B-3123 Lentilactobacillus buchneri B-14607 Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ B-14606 Candida lamlica - 3 2 8 Pichia strasburgensia - 3 3 10 Hansenula anomala - - 2 7

Как видно из таблицы, на контрольных чашках Петри происходил активный, равномерный рост клеток дрожжей. На чашках с бактериями штамма Lentilactobacillus buchneri B-14607 и Pediococcus pentosaceus B-3123 наблюдалась слабая противогрибковая активность по сравнению со штаммом Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ B-14606.

Пример 6. Доказательства повышения эффективности силосования с использованием биопрепарата на основе штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606 в чистом виде, описанного в примере 2, и с использованием биопрепарата с добавлением композиции, описанной в примере 4.

Повышение качества брожения силоса осуществлялось при помощи добавления в силосную массу биопрепарата, содержащего бактерии штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606 в чистом виде и в композиции с Pediococcus pentosaceus B-3123, Lentilactobacillus buchneri B-14607. Экспериментальное силосование было проведено в отношении трудносилосуемой зеленой массы люцерны. Полученные данные сравнивали с данными о показателях качества силоса из красного клевера с использованием бактерий штамма Lactobacillus brevis ТАК 124-1 NCIMB42149 для силосования кормов (см. евразийский патент №033289 по кл. МПК C12R 1/24, опуб. 20.09.2016).

Способ силосования включал в себя измельчение зеленой массы травы и внесение в нее биологического препарата, включающего штамм Lactiplantibacillus plantarum B-14606 в одном случае и комплексного биопрепарата из примера 4, включающего 3 вида штаммов, в том числе штамм Lactiplantibacillus plantarum B-14606, с одинаковой общей концентрацией клеток, приходящейся на 1 г заготовляемого корма. После орошения суспензией биопрепарата зеленую массу утрамбовывали и изолировали от доступа воздуха. Биопрепарат предварительно разводили в воде так, чтобы при внесении количество клеток, приходящееся на 1 г зеленой массы, составляло не менее 1×10⁵ КОЕ.

Анализ готового силоса, законсервированного с добавлением биопрепаратов на основе штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606, представлен в таблице 4. Значимым преимуществом использования бактериального препарата на основе патентуемого штамма Lactiplantibacillus plantarum B-14606 является факт наличия продукции молочной и уксусной кислот, достаточной для закисления корма до значения рН=4,6, в условии отсутствия в составе дополнительной химической добавки на основе муравьиной кислоты в отличии от препарата, включающего штамм-прототип Lactobacillus brevis ТАК 124-1 NCIMB42149. Применение муравьиной кислоты при кормозаготовке оправдано высокой степенью вероятности тотальной порчи существенного объема корма.

Таблица 4. Анализ показателей силоса при добавлении бактерий штамма Lactiplantibacillus plantarum ВКПМ B-14606

Показатель Силос из красного клевера с клетками штамма Lactobacillus brevis ТАК 124-1 NCIMB42149 Силос из красного клевера с химической добавкой и клетками штамма Lactobacillus brevis ТАК 124-1 NCIMB42149 Силос из люцерны с добавлением биопрепарата, содержащего клетки штамма Lactobacillus plantarum
B-14606 Силос из люцерны с добавлением комплексного биопрепарата, в том числе клетки штамма Lactobacillus plantarum B-14606 Сухое вещество, г/кг 176,6 182,7 383 419 Сырой протеин, г/кг СВ 228,9 234,1 149 192 Сырая зола, г/кг СВ 117,4 111,9 114 118 Сырая клетчатка, г/кг СВ 226,1 204,4 245 289 Безазотистые экстрактивные вещества, г/кг СВ 388,8 410,2 320 355 Обменная энергия МДж/кг СВ 9,4 9,4 9,4 9,6 Метаболизируемый протеин, % 84,7 86,0 63 67 Уксусная кислота, г/кг СВ 22,9 24,1 16 15 Молочная кислота, г/кг СВ 44,4 73,3 55 65 pH 5,5 4,8 4,6 4,6 NH₃-N/общий N, % 9,0 7,1 8,5 9,0

Таким образом, заявляемый штамм обладает высокой продуцирующей способностью в отношении молочной и уксусной кислот, позволяет сбраживать широкий ряд углеводов, эффективно размножаться в силосуемом корме, проявляет фунгистатическую активность к часто встречающимся среди естественной микрофлоры силосуемой растительной массы дрожжевым представителям: Candida lamlica, Pichia strasburgensia, Hansenula anomala, может являться основой для получения биопрепарата, эффективного при силосовании трудносилосуемых растений.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Lactiplantibacillus plantarum, обладающего способностью продуцировать молочную и уксусную кислоты, для получения микробной биомассы для силосования кормов. Изобретение представляет собой штамм Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) В-38, депонированный 22.11.2023 г. во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» под номером B-14606 в качестве штамма продуцента молочной и уксусной кислот. 4 табл., 6 пр.

Штамм Lactiplantibacillus plantarum B-14606 – продуцент молочной и уксусной кислот для силосования кормов, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт».