"Биологический препарат "МикроЛайф" Российский патент 2024 года по МПК A23K30/18 C12R1/25 C12R1/125 C12N1/00 

Изобретение относится к области производства кормов для сельскохозяйственных животных, а именно к бактериальным закваскам для консервирования растительного кормового сырья с применением определенных видов и штаммов микроорганизмов, и может быть использовано в технологических процессах по производству сенажа, силоса и силажа из провяленных трав.

Биотехнологические процессы производства сенажа, силоса и силажа идентичны между собой и отличаются только степенью провяливания, т.е. содержания сухого вещества (СВ). Так, влажность сенажа из провяленных трав по ГОСТ 55452-2021 составляет 40-55%, влажность силоса по ГОСТ 55986-2022 составляет более 70%. Силаж представляет собой подвяленный силос или сенаж с повышенной влажностью. Согласно ГОСТ 55986-2014 силажом называют силос с влажностью 60-70%.

Основными сочными кормами для крупного рогатого скота при традиционной технологии кормления в зимне-стойловый период и тем более при современной круглогодовой однотипной системе содержания и кормления являются сенаж, провяленный травяной силос и силос из кукурузы, при заготовке которых допускаются значительные потери питательных веществ, образование в корме вредных и ядовитых соединений, обусловливающих снижение их качества [Теория и практика производства и использования объемистых кормов / Ш.К. Шакиров, О.Л. Шайтанов, Е.О. Крупин, Р.П. Идиатуллина и [и др.] // 2-е издание, доработанное и дополненное. - Казань: «ФЭН» АН РТ. - 2021. - 291 с.]. Это приводит к существенному недобору животноводческой продукции, поэтому разработка новых эффективных технологий консервирования зеленых трав в целях повышения сохранности и качества полученного из них корма по-прежнему остается актуальной [Технология приготовления кормов / С.Я. Зафрен. - М.: Колос. - 1977. - 240 с.; Приготовление силоса и сенажа с применением отечественных биологических препаратов / В.А. Бондарев, В.М. Косолапов, В.П. Клименко, А.Н. Кричевский. - М.: ФГБНУ ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса. - 2016. - 212 с.].

В настоящее время основным сырьем для заготовки сенажа и силоса из провяленной массы растений является люцерна. Люцерна плохо силосуется традиционным способом, поскольку содержит много воды, протеина, калия, кальция и других оказывающих подщелачивающее действие веществ и мало сахаров. По мере старения травостоя его питательная ценность быстро снижается. При силосовании зеленой массы люцерны без добавок в силосе продолжается деятельность маслянокислых и гнилостных бактерий даже после того, как израсходованы имевшиеся сахара. Продолжается также нежелательный распад протеина. Одновременно увеличивается содержание аминного азота, что приводит к порче силоса при его хранении. Вместе с выделяющимся соком теряются ценные углеводы и часть уже образовавшейся молочной кислоты. Сенаж из люцерны заслуживает особого внимания потому, что в нем отмечается наиболее благоприятное брожение [Микробиологические и биохимические процессы при силосовании люцерны с разным уровнем сухого вещества / И.И. Филатов, Т.Т. Кузнецова, Л.Г. Сафронова // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 1978. - №5. - С. 44-47], сопровождающееся невысокими потерями питательных веществ, вполне сопоставимыми с потерями, возникающими при искусственной сушке [Сенаж или силаж? Особенности консервирования бобовых и злаковых трав / Ю.А. Победнов // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2016. - № 2. - С. 42-54]. Однако успешность силосования провяленной массы зависит, прежде всего, от неконтролируемого фактора - высокой численности эпифитных молочнокислых бактерий, поскольку их численность на растительных покровах во многом определяет их качественный состав. Имеющиеся данные показывают [Fehrmann E. Jaresverlauf des epiphytischen Mikrobenbesatzes auf einen Graslandstandort / E. Fehrmann, Th. Müller // Das Wirtschaftseigene Futter. - 1990. - Bd. 36. - H. 1. - P.66-78], что если при численности эпифитных молочнокислых бактерий ≤ 10³ КОЕ/г зеленой массы они обычно представлены 3-4 малоактивными кокковыми формами, то при численности ≥ 10⁵ КОЕ/г - лишь единой высокоактивной палочкой Lactobacillus plantarum. По мнению Е.И. Квасникова и И.В. Щелоковой [Новое в микробиологии силосования кормов / Е.И. Квасников, И.Ф. Щелокова // Изв. АН СССР, серия биологическая. - 1968. - №4. - С. 543-556] в силосе с повышенным содержанием сухого вещества у Lactobacillus plantarum отмечается тенденция опережать в росте другие молочнокислые бактерии, что свидетельствует об ее улучшенной приспособленности к условиям брожения на провяленной массе.

Известно, что люцерна даже в провяленном до содержания сухого вещества 40-45% и более отличается от других кормовых культур повышенным содержанием свободносвязанной воды, высокой буферной емкостью и дефицитом сахара, при котором максимальное подкисление корма достигается только через 15 суток. В течение этого срока клостридии еще проявляют свою активность [Теоретические аспекты силосования провяленных трав / Ю.А. Победнов // Кормопроизводство. - 1998. - № 8. С. 21-25]. Это создает предпосылки для маслянокислого брожения, в то время как другие виды нежелательной микрофлоры не получают заметного развития [Теоретические предпосылки и способы консервирования кукурузы и трав на основе регулирования микробиологических процессов: метод. указания / Ю.А. Победнов. - СПб.: ООО «Биотроф». - 2017. - 52 с.]. Исходя из этого, принцип консервирования люцерны основывается на биологических особенностях маслянокислых бактерий. Дело в том, что в отличие от молочнокислых бактерий, маслянокислые бактерии присутствуют на растениях в виде спор, для прорастания которых требуются вода. Следовательно, чем меньше будет содержать растение доступной для микробов влаги, тем медленнее будут прорастать споры маслянокислых бактерий.

Для получения свободной от накопления масляной кислоты при сенажировании и силосовании провяленной массы люцерны следует быстро провяливать в поле до содержания сухого вещества ≥ 40%, тщательно ее герметизировать в хранилище, а также необходимо принять меры, направленные на ускорение процесса понижения рН до значения - 4,6-4,7 - критичного для маслянокислых бактерий. Вместе с тем устранение маслянокислого брожения отнюдь не существенная задача, которую следует решать при заготовке силоса из провяленных трав. Не менее важно устранить жизнедеятельность и других нежелательных при силосовании микроорганизмов, основными из которых являются энтеробактерии и дрожжи. Именно из-за медлительности их спонтанного подкисления количество энтеробактерий может достигать значительной величины, практически не уступающей в начале силосования численности молочнокислых бактерий [Role of microflora in forage conservation / G. Pahlow // Landbauforschung-Völkenrode. - 1991. - Sonderheft 123. - Р. 26-36].

Таким образом, при спонтанном подкислении провяленных трав, как и при медленном заквашивании свежескошенной массы, устранить нежелательные продукты брожения зачастую не удается. Однако при ускорении подкисления такой массы, например, с помощью бактериальных препаратов, это обеспечивает ферментативные процессы практически в любом случае [Теоретические аспекты силосования провяленных трав / Ю.А. Победнов // Кормопроизводство. - 1998. - № 8. - С. 21-25].

Разработки биологических консервантов, ускоряющих бродильные процессы на основе молочнокислых бактерий при консервировании зеленых трав, ведутся более 100 лет. Теоретические предпосылки их использования основывались на представлении о более полном и быстром сбраживании сахара, содержащегося в силосуемой массе, в молочную кислоту с помощью внесенных молочнокислых бактерий. Образовавшаяся молочная кислота в анаэробной среде способствует устранению развития нежелательных микроорганизмов, прежде всего, энтеробактерий и маслянокислых бактерий. В настоящее время это положение является основой при разработке новых бактериальных препаратов [Приготовление силоса и сенажа с применением отечественных биологических препаратов / В.А. Бондарев, В.М. Косолапов, В.П. Клименко, А.Н. Кричевский. - М.: ФГБНУ ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса. - 2016. - 212 с.].

Впервые препарат с молочнокислыми бактериями для консервирования зеленых кормов был предложен А.А. Гардером еще в 1932 году [Научные основы консервирования зеленых кормов / А.А. Зубрилин. - М.: Огиз-сельхозгиз. - 1947. - 391 с.]. В дальнейшем разработаны и предложены в производство свыше 50 различных бактериальных препаратов, предназначенных в основном для силосования кукурузы и свежескошенных трав. В начале 80-х годов прошлого столетия учеными ВНИИ биотехнологии на основе молочнокислых бактерий предложены «Биосил» и «Литосил». Первый препарат состоял из двух культур палочковидных и двух стрептококковых форм молочнокислых бактерий. Второй препарат «Литосил» - из двух культур палочковидных и одной стрептококковой формы молочнокислых бактерий. Основной недостаток предложенных бактериальных препаратов заключается в слабом противостоянии эпифитной микрофлоры, а также в недостатке сахара в большинстве видов многолетних трав для образования молочной кислоты в количестве, необходимом для подкисления массы до рН 4,2-4,3. Поэтому при использовании предложенных препаратов результаты силосования трав, в большинстве случаев, были отрицательными.

Предпосылкой для создания бактериальных препаратов нового поколения, состоящих преимущественно из осмотолерантных молочнокислых бактерий, способных активно функционировать на массе с высоким содержанием сухого вещества, послужили данные о том, что значительная часть эпифитных молочнокислых бактерий проявляют свою активность только в условиях высокой влажности силосуемого сырья и, вследствие этого, мало пригодна для развития в провяленных травах [Новое в использовании молочнокислых бактерий при силосовании трав / Ю.А. Победнов, Ф. Вайсбах, Г. Палов // Кормопроизводство. - 1997. - № 8. - С. 24-28]. Эффективность указанных препаратов проявляется при силосовании трав с содержанием сухого вещества не менее 25%. Поэтому эффект от использования бактериологических препаратов, содержащих такие штаммы молочнокислых бактерий, бывает многократно больше.

В связи с этим исследования по совершенствованию биологических препаратов на основе бактериальных культур направлены на селектирование молочнокислых бактерий повышенной осмотолерантности, использующих для своего питания не только сахара, но и олигосахариды. В этом отношении известен препарат «Биотроф» [RU 2168909, 20.06.2001], состоящий из одновидовых молочнокислых бактерий палочковидной формы Lactobacillus plantarum ВНИИСХМ 78 Д. Препарат оказался надежным только при консервировании легко- и трудносилосующихся трав, провяленных до влажности 60-70 %.

Известны также использования биологических препаратов для силосования трав, как палочковидной формы Lactobacillus plantarum 8Р-А3 [RU 2011138042 А, 20.03.2013], Lactobacillus plantarum ВКПМ 5337 [SU 1784641, 30.12.1992] и кокковой формы Streptococcus faecium №500 [SU 1514766, 15.10.1989], Enterococcus

durans ВКПМ В 10093 водной вытяжкой растения стевии [RU 2555596 С2, 10.07.2015], так и в комплексе с другими штаммами бактерий палочковидной формы Lactobacillus plantarum - 38 ВКПМА-4174, Lactobacillus casei М 76 ВКПМ В-34389, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus - 298 ВКПМ B-2455, Lactococcus lactis «t» ВКПМ B-5284 [RU2268299 C2, 20.01.2006]. Однако результаты исследований, проведенных с использованием таких препаратов на свежескошенных трудносилосующихся травах, оказались значительно ниже ожидаемых из-за интенсивного развития в первые 2-3 суток нежелательных аэробных бактерий, также использующих сахара для своего питания. Они совершенно неэффективны при силосовании свежескошенных и провяленных высокобелковых бобовых трав, относящихся к несилосущимся растениям из-за недостатка сахара [Приготовление силоса и сенажа с применением отечественных биологических препаратов / Бондарев В.А., Косолапов В.М., Клименко В.П., Кричевский А.Н. М.: ФГБНУ ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса. - 2016. - 212 с.]. Препараты оказались надежными только при консервировании легко- и трудносилосующихся трав, провяленных до влажности 60-70%. Кроме того, в провяленных травах в начале их силосования из-за содержания большого остатка воздуха, молочнокислое брожение в основном идет по гетероферментативному типу, обуславливая увеличение потерь питательных веществ от газообразования и снижение качества корма по продуктам брожения [Role of microflora in forage conservation / G. Pahlow // Landbauforschung-Volkenrode. - 1991. - Sonderheft 123. - P. 26-36].

Известны препараты для консервирования зеленых кормов с применением комплексных штаммов палочковидных молочнокислых бактерий и коковых форм, представителями таких препаратов являются «Биосиб» и «Биоамид-3», в состав которых входят соответственно Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum и Propionibacterium freudenreichii [htts://ru.calameo.com/read/ 0055096144690fblde67c] и Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ B-3123, Lactobacillus plantarum ВКПМ - 10965, Propionobacterium sp. ВКПМ B-6085 [Инструкция по применению кормовой добавки «Биоамид-3» для силосования и сенажирования кормов. Утвержден заместителем начальника руководителя Россельхознадзора от 19.04.2016].

Разработана также бактериальная закваска [SU 1091549 А1, 10.06.1997] для силосования кормов, состоящая из молочнокислых бактерий палочковидной формы Lactobacterium pentoaceticum, кокковой формы ПМБ Streptococcus lactis diastaticus АМК и пропионовокислых бактерий Propionobacterium shermanii ПКБ.

Назначение палочковидных молочнокислых и пропионовокислых бактерий - ускорить молочнокислое брожение, бактерии кокковой формы должны ограничить деятельность дрожжей и стимулировать тем самым молочнокислое брожение. Кроме того, известно, что гомоферментативные бактерии палочковидной формы, являясь самыми мощными продуцентами молочной кислоты, не могут развиваться при pH 5,5-7,0. Поэтому в состав консерванта включают коковые формы бактерий, особенно Enterococcus faecium, которые в этом процессе выполняют особую «стартовую» роль, такие бактерии быстро размножаются и способствуют началу активной ферментации [Hughes, A. D. (1969). The non-protein nitrogen composition of grass silages. I. The estimation of the basic amino acids and non-volatile amines by chrom atography on a weak cation exchange resin. J. agric. Sci., Camb. 72, 459 р.]. Показатель pH при этом снижается до 5,0. Далее ферментацию продолжают молочнокислые бактерии Lactobacillus plantarum и др., снижая значение pH до 4,0, и это положение сохраняется на протяжении всего периода консервирования. Такое взаимодополнение в процессах ферментации используют при создании как отечественных, так и зарубежных биопрепаратов [Силостан-Россия, FaedtechTM Silage F-10 - Чехия, Biostabil plus - Австрия и др.].

Также используют бактерии с амилолитической и целлюлозолитической активностью при силосовании трудносилосующихся культур. Некоторые штаммы, такие как лактобацилл и стрептококки способны гидролизовать крахмал [Биология молочнокислых бактерий / Е. Квасников // Акад. наук УзССР. Ин-т ботаники. - Ташкент: АН УзССР. - 1960. - 351 с.; Микробиология / Е.Н. Мишустин, В.Т. Емцев. - М.: Агропромиздат. - 1985. - 270 с.]. Эти штаммы Lactobacillus plantarum и Streptococcus lactis subsp. diastaticus обнаружены в клеверном сенаже, и их применяют при силосовании люцерны. Численность амилолитических бактерий зависит как от вида, закладываемого на силос растительного сырья, так и от стадии его созревания. В свежескошенных растениях они представлены в основном кокковыми формами, численность которых составляет 5-10% от общего количества молочнокислых бактерий (МКБ). Пик размножения молочнокислых бактерий происходит на 1-3 сутки после закладки силоса, а наибольшее количество амилолитических микроорганизмов обнаружено в период от 3 до 15 суток. Содержание амилолитических молочнокислых бактерий (АМКБ) в кукурузном силосе не превышает 5×10⁵ КОЕ/г, и активность их постепенно уменьшается. В то же время в силосах из рапса и люцерны число амилотических молочнокислых бактерий достигает 5×10⁶ КОЕ/г [Микрофлора силоса амилолитических и молочнокислых бактерий / Т.Н. Голович, Н.К. Коваленко // Микробиологический журнал. - 1994. - Т.56 (2). - С. 3-7]. Очевидно, что при силосовании любых кормов преимущество получают штаммы молочнокислых бактерий, усваивающие простые углеводы, а не гидролизующие крахмал. АМКБ, продуцируя внеклеточные амилизы, обеспечивают простыми углеводами не только себя, но и другие штаммы, что является основой соотношения МКБ и АМКБ в сообществе микроорганизмов.

Использование препаратов, содержащих амилолитические молочнокислые бактерии, имеют и ряд недостатков: препараты не обладают достаточной антагонистической активностью в отношении плесневых грибов и патогенных бактерий, мало или совсем неэффективны при силосовании свежескошенных трав, а также кукурузы и других силосных культур с избыточным содержанием сахара, не дают желаемого результата при силосовании провяленных трав, относящихся к группе несилосующихся растений [Мамаев А.А. Эффективность консервирования трав культурой Bacillus subtilis и использование полученного корма в рационах крупного рогатого скота: Дис. канд. с.-х. наук: 06.02.02 / А.А. Мамаев. - Москва. - 2005. - 133 с.]. Кроме того, в природе штаммы молочнокислых бактерий с амилолитической активностью наблюдаются редко. Поэтому исследователи пытаются получить такие штаммы с помощью методов генной инженерии [Cloning and expression of cellulase and xylanase genes in Lactobacillus plantarum / T. Scheirlinck, J.De Meutter, G. Arnaut, H. Joos, M. Claeyssens and F.Michiels // Applied Microbiology and Biotechnology. - 1990. - No 33. - Р. 534-541].

Погодные условия в период заготовки сочных кормов оказывают существенное влияние на качественное состояние силосуемой массы и, следовательно, на качество готового корма и его продуктивного действия. Так, по мнению Г.И. Домрачевой и др. [Влияние пропионовокислых бактерий на качество

силоса, рост и развитие молодняка животных / Г.И. Домрачева, Ю.В. Кононов, А.Э. Майданович // Научн. тр. Сиб. Научно-иссл. ин-та с.-х. животных. Омск. 1970. №15. С. 173-177] в условиях повышенной влажности целесообразно применять закваски на основе пропионовокислых бактерий, способных снизить закисление конечного продукта, а, следовательно, уменьшить потери в нем питательных веществ. В засушливые годы, напротив, предпочтительнее применение молочнокислых бактерий по сравнению с пропионовокислыми бактериями.

Данная проблема решается с применением закваски [RU 2265655 С2, 10.12.2005] для силосования кормов, состоящей из 8-ми культур, предусматривающая выращивание молочнокислых и пропионовокислых бактерий, смешивание полученных культур в различных соотношениях и высушивание, где в качестве молочнокислых бактерий используют ассоциацию штаммов Lactobacillus salivarius - ЛТ1, ЛТ2, ЛТ3, ЛТ5, Enterococcus durans - ЛТ4, ЛТ6, Lactobacillus plantarum - ЛТ7 и штамма пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii - ЛТ8. Общими недостатками таких препаратов являются технологические сложности в производстве, их дороговизна и отсутствие гарантии высокой эффективности из-за сильной внутрипопуляционной конкуренции микроорганизмов.

Для повышения эффективности силосования трудно- и несилосуемых культур предложено использование как отдельных полиферментных препаратов, так и в комплексе с бактериальными культурами для глубокого гидролиза труднопереваримых углеводов (целлюлозы, гемицеллюлозы, пентозанов и пектиновых веществ) в целях обеспечения силосуемой массы необходимым количеством сахара для оптимизации бродильных процессов, устранения жизнедеятельности нежелательных микроорганизмов, а также повышения энергетической ценности корма.

Необходимость совместного использования разнотипных ферментов при силосовании многолетних трав приводит D.R. Seal [Bacteria and enzymes as product to improve silage preservation / D.R. Seal // Developments in Silage. 1987. P. 47-61]. Автор отмечает, что наиболее целесообразно создать комплекс ферментов из пектиназ, амилаз, гемицеллюлаз и целлюлаз, чтобы обеспечить силосуемую массу необходимым количеством сахара при гидролизе сложных углеводов в первые двое суток ее силосования.

Известно применение отечественного ферментного препарата «Феркон» для силосования провяленных многолетних трав, созданный на основе комплекса гидролитических и лиазных ферментов: целлюлазы и ксиланазы. В гидролизе сложных углеводов образуется достаточное количество сахара, при котором появляются благоприятные условия для развития молочнокислых бактерий [Эффективность технологии силосования люцерны с новым биологическим препаратом «Феркон» / A.A. Анисимов // Ваш сельский консультант. - 2006. - № 4. - С. 28-30]. Недостатком является то, что препарат, содержащий только ферменты для узконаправленного гидролиза сложных углеводов, рассчитан на наличие в силосуемой растительной массе в достаточном количестве естественных эпифитных молочнокислых бактерий, способных производить оптимальное количество молочной кислоты для устранения маслянокислого и гнилостного брожения. Кроме того, препарат «Феркон» является довольно дорогостоящим.

Известен препарат биологической консервации Sil-All (США), содержащий набор ферментов (целлюлаза, гемицеллюлаза, пентоназа, амилаза) в комплексе с палочковидными и кокковыми формами молочнокислых бактерий Lactococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus salivarius. Использование биоконсерванта Sil-All при заготовке силоса приводит к повышению сохранности сухого вещества, сырого протеина, безазотистых экстрактивных веществ (БЭВ) и энергетической ценности в целом. При этом снижается содержание сырой клетчатки на 16,5% [Эффективность применения биологической добавки Сил-Олл при заготовке силоса / Н.В. Пристач, А.А. Цой // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2007. - №6. - С. 73-78]. Однако силос, заготовленный с использованием биопрепарата Sil-All, имеет высокую себестоимость готового корма.

Известен препарат биологической консервации Feedtech™ Silage F18 (Чехия) для консервирования бобовых и злаковых культур, состоящий из двух видов молочнокислых бактерий Pediococcus acidilactici, Lactobacillus plantarum, и фермента Cellulose-xylanase. При введении данного препарата в злако-бобовую смесь трав наблюдают повышение сохранности сырого протеина, суммы сахаров и обменной энергии по сравнению с силосом при спонтанном подкислении [Влияние биоконсервантов на сохранность питательных веществ в силосе / В.В. Михалёв, И.Д. Арнаутовский, В.Н. Кондратьев // Кормление сельскохозяйственных животных и кормопроизводство. - 2012. - № 4. - С. 3-8]. Использование биоконсерванта в зеленой массе кукурузы по уровню сохранности сырого протеина уступает биоконсервантам «БиоСил» и «Сила-Прайм» [Эффективность использования биологических консервантов при силосовании зеленой массы кукурузы / Е.Г. Артемук, В.А. Сатишур //Веснiк Брэсцкага ўнiверсiтэта. Серыя 5 Хiмiя. Бiялогiя. Навукi об зямлi. - 2016. - № 1. - С. 13-16]. Недостатком препарата является его высокая рыночная стоимость, которая сказывается на себестоимости готового корма и животноводческой продукции.

В этом направлении активно ведут исследования по разработке комплексных препаратов фирмой Lallemand под общей маркой «Биотал». Биологический препарат Biotal Axcool Gold также используют при заготовке силоса и сенажа из провяленных многолетних трав, который состоит из трех ферментов - амилазы, β-глюканазы и ксиланазы, и двух видов бактерий Lactobacillus buchneri и Pediococcus pentosacius. Однако, по мнению В.А. Бондарева и др., [Приготовление силоса и сенажа с применением отечественных биологических препаратов / В.А. Бондарев, В.М. Косолапов В.П. Клименко, А.Н. Кричевский - М.: ФГБНУ ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса. - 2016. - 212 с.] при силосовании люцерны с применением препарата Biotal Axcool Gold силос слабо подкисляется, в результате в нем обнаруживают следы масляной кислоты и достаточно много аммиака (0,31%) в сухом веществе. Интенсивность гидролиза сложных углеводов была недостаточной и не оказала влияния на повышение качества корма.

Применение препаратов на основе молочнокислых бактерий, использующих для своего питания сложные углеводы, пока не завершилось положительными результатами, поскольку из известных форм этих микроорганизмов ни один штамм не сбраживает крахмал - весьма доступное соединение для других бактерий. В связи с этим внимание исследователей переключено на подбор бактерий других родов, способных участвовать в сбраживании сложных углеводов [Сенаж или силаж? Особенности консервирования бобовых и злаковых трав / Ю.А. Победнов // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2016. - № 2. - С. 42-54]. Кроме того, для гарантированного повышения сохранности и качества силоса практически из любого растительного сырья необходимо использовать биологический препарат, обладающий, наряду с бактерицидным, и хорошо выраженным фунгицидным действием. Эта цель может быть достигнута путем создания препаратов на основе культур рода Bacillus subtilis [Мамаев А.А. Эффективность консервирования трав культурой Bacillus subtilis и использование полученного корма в рационах крупного рогатого скота: Дис. ... канд. с.-х. наук: 06.02.02 / А.А. Мамаев. - Москва. - 2005. - 133 с.].

Известно, что, несмотря на то, что бактерии Bacillus subtilis относятся к группе аэробов, они всегда проявляют склонность к анаэробиозу [Бактерии группы сенной и картофельной палочек / В.А. Мирзоева. - М.: АН СССР. - 1959. - 175 с.]. При этом их принадлежность к группе аэробов позволяет быстро расходовать содержащийся в массе кислород, создавая в ней анаэробные условия, а склонность к анаэробиозу способствует длительному функционированию бактерий в анаэробных условиях, приводя к сбраживанию углеводов по гомоферментативному молочнокислому типу, не разрушая белок корма до его конечных продуктов, то есть до аммиака [Брожение углеводов и родственных соединений / У. Вуд // Метаболизм бактерий. - М.: Изд-во иностр. лит. - 1963. - С. 9-62]. Кроме того, в отличие от молочнокислых бактерий, микроорганизмы вида Bacillus subtilis образуют экзофермент амилазу, расщепляющий крахмал до глюкозы, мальтозы и олигоглюкозидов, с последующим сбраживанием их в органические кислоты [Мир микробов. В трех томах / Р. Стейниер, Э. Эдельберг, Дж. Ингрэм. - М.: Мир. - 1979. - Том 2. - 334 с.], что позволяет успешно использовать эту культуру при заготовке силоса из трудно- и даже несилосующихся трав. Bacillus subtilis синтезирует целый ряд антибиотиков, активных как в отношении бактерий, включая маслянокислые, так и грибов, включая плесени и дрожжи, а также синтезирует аминокислоты и витамины [Gegen Pilze wirksame antibiotika der Bacillus subtilis Gruppe / W. Loeffler, W. Katzer, S. Kremer et al. // Forum Microbiol. - 1990. - V. 13. - P. 156-163], что обеспечивает высокую сохранность и качество корма независимо от степени его подкисления.

Известно применение двухкомпонентного препарата [RU 2204911 С2, 27.05.2003] для силосования и консервирования провяленных трав, созданного на основе осмотолерантных штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum в смеси с бактериями вида Bacillus subtilis, который способствует сохранению потерь питательных веществ, повышению качества и энергетической питательности силоса. Между тем бактерии вида Bacillus subtilis и без сочетания с осмотолерантными штаммами молочнокислых бактерий способны обеспечить высокий консервирующий эффект и, по сравнению с последующими, имеют ряд заметных преимуществ [RU 2012126499 А, 20.12.2013]. Эти бактерии очень хорошо адаптированы для консервации зеленой массы. Они малотребовательны к влажности сырья, могут консервировать не только провяленные (до 30-40% СВ) трудносилосуемые растения, но и другие растения, независимо как от их сахаро-буферного отношения, а также от того, к какой группе относится свежескошенная масса, - к группе трудносилосующихся и легкосилосующихся культур [Эффективность консервирования провяленных трав препаратом «Биотроф» и использования полученного корма в рационах крупного рогатого скота / Ю.А. Победнов, А.А. Мамаев // Актуальные проблемы технологии приготовления кормов и кормления сельскохозяйственных животных. - Дубровицы. - 2006. - С. 22-24]. В процессе консервации ими выделяются особые вещества - бактероцины, которые непосредственно действуют на вредоносную микрофлору [Лаптев Г.Ю. Разработка биологических препаратов для повышения питательности и эффективности использования кормов: дисс. ... док. биол. наук: 03.00.23, 06.02.02 / Г.Ю. Лаптев. - Санкт-Петербург. - 2009. - 352 с.].

Известен препарат, содержащий штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-11353 [RU 2539762 С1, 27.01.2015] для консервирования зеленых трав. Также известны многокомпонентные жидкие биологические препараты, например, «Силостан», состоящий из штаммов бактерий Bacillus subtilis в сочетании с двумя молочнокислыми бактериям палочковидной формы Lactobacillus plantarum и Lactobacillus casei [Эффективность микробиологической закваски «Силостан» с описанием механизма действия отселектированных бактерий при силосовании корма // Эффективное животноводство. - 2015. - № 5 (114). - С. 48-49], «Лактис» в сочетании с двумя молочнокислыми бактериями палочковидной формы Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, четырьмя - кокковой формы Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Streptococcus lactis и двумя пропионовокислыми бактериями Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acidipropionici [Влияние биоконсервантов «Лактифит» и «Лактис» на сохранность кукурузного силоса / А.Д. Прудников, А.Н. Никитин, А.А. Пузик, Л.А. Демьянова // Международный научно-исследовательский журнал. - 2017. - №. 12-3 (66). - С. 130-133].

Известен многокомпонентный сухой биоконсервант «Sila-Prime» совместного производства Израиля и США, который состоит из семи микроорганизмов: взаимодополняющих палочковидных молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Lactobacillus casei, Streptococcus lactis и Bacillus subtillis [Сравнение эффективности жидких и сухих биоконсервантов при заготовке силоса кукурузного / А.Ю. Марченко, Н.В. Быченко, Н.Н. Забашта, Е.Н. Головко // Сборник научных Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. - 2020. - Т. 9. №2. - С. 105-108].

Общими недостатками описанных выше препаратов является то, что если при комбинированном использовании двух-трехкомпонентных препаратов, например, молочнокислых и пропионовокислых бактерий с бактериями Bacillus subtillis для оптимизации бродильных процессов, происходит снижение потерь питательных веществ, что приводит к биоразнообразию взаимодополняющего консорциума, то при поликомпонентных вариантах с 7 и 8 бактериями, из-за сильной внутрипопуляционной конкуренции микроорганизмов эффективность их использования при консервировании трав, даже кукурузы, снижается по сравнению с другими консервантами. Кроме того, такие препараты значительно повышают себестоимость готового корма.

В связи с вышеизложенным актуальным является разработка эффективного и доступного жидкого биологического препарата для любых трудно- и несилосующихся трав с более широкими функциональными свойствами, связанными с микроорганизмами Bacillus subtilis, обеспечивающего гарантированную хорошую кормовую ценность и сохранность готового корма.

Преимущество жидкого биологического препарата по сравнению с сухими препаратами заключается в быстром введении микроорганизмов в процесс

ферментации, что ускоряет начало процесса, недостаток - в коротком сроке хранения препарата.

Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является расширение арсенала препаратов для консервирования растительного сырья, обеспечивающих высокую сохранность и качество готового корма из трудносилосуемых культур (люцерны), сокращения срока готовности и улучшения его сохранности.

Технический результат заявленного изобретения заключается в специально подобранной поликомпонентной композиции штаммов палочковидной и кокковой форм бактерий (консорциум), которая является слаженным взаимодополняющим механизмом, охватывающим все фазы процессов ферментации сырья. Консорциум эффективно и быстро снижает уровень рН, предотвращая нежелательные потери питательных веществ и гарантирует аэробную стабильность готового корма.

Консорциум штаммов обладает высокой энергией кислотообразования за счет накопления молочной кислоты, способен к быстрому расщеплению моно- и дисахаридов и полисахаридов, антогонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, что обуславливает положительное влияние биологического препарата (консерванта, закваски) на микробиологические процессы при силосовании (консервировании) трудносилосующихся растений, и на оптимизацию микрофлоры пищеварительной системы крупного рогатого скота.

Техническая проблема решается, и указанный технический результат достигается заявленной композицией для консервирования люцерны для производства корма для сельскохозяйственных животных, характеризующаяся тем, что состоит из штаммов, при следующих концентрациях КОЕ/мл: палочковидной формы Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5337 - до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл и кокковой формы Lactococcus lactis В-4989 - до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл, Enterococcus faecium В-4489 - до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii В-9653 - до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, а также Bacillus subtillis В-4506 - до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, взятых в равных объемных долях.

Биологический препарат «МикроЛайф» - это специально подобранный поликомпонентный консорциум штаммов палочковидных и кокковых форм различных микроорганизмов, является слаженным взаимодополняющим механизмом, охватывающим все фазы процессов ферментации сырья, который оптимизирует их направление, эффективно и быстро снижает уровень рН, предотвращая нежелательные потери питательных веществ, и гарантирует стабильность готового корма.

Биологический препарат «МикроЛайф» состоит из штаммов молочнокислых бактерий при следующих концентрациях (КОЕ/мл):

палочковидной формы Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5337 - до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл и кокковой формы Lactococcus lactis В-4989 - до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл, Enterococcus faecium В-4489 - до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, депонированных в коллекции ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии» (ФГБНУ «ВНИИФ»),

пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii В-9653 - до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, а также Bacillus subtillis В-4506 - до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, депонированных в коллекции ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»).

Для получения биологического препарата «МикроЛайф» предварительно проводят выращивание каждого штамма.

Штаммы Propionibacterium freudenreichii ВКПМ В-9653 и Enterococcus faecium ВКПМ В-4489 выращивают в течение 48 часов при температуре +37°С в MRS-бульоне до концентрации штаммов свыше 1,0×10¹⁰ КОЕ/мл, MRS-бульон содержит (г/л):

глюкозу - 20,0;

пептон из казеина - 10,0;

мясной экстракт - 8,0;

дрожжевой экстракт - 4,0;

ацетат натрия - 5,0;

фосфат калия двузамещенный - 2,0;

аммоний лимоннокислый двузамещенный - 2,0;

твин-80 - 1,0;

сульфат магния - 0,2 и

сульфат марганца - 0,04.

Отделение бактериальных клеток от среды культивирования осуществляют с помощью центрифугирования при 8000 об/мин в течение 5 минут при 12°С в стерильных условиях. Осадок клеток дважды отмывают физиологическим раствором (с внесением фосфатов натрия двух- и однозамещенных, которые смешаны в количествах, необходимых для создания рН 7,2) при тех же условиях, ресуспендируют их и готовят бактериальную суспензию с титром каждого штамма по 1,0×10¹⁰ КОЕ/мл.

Штаммы Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5337 и Lactococcus lactis ВКПМ В-4989 выращивают в течение 24-48 часов при температуре +37°С в MRS-бульоне вышеуказанного состава до концентрации свыше 3,5×10¹⁰ КОЕ/мл. Отделение бактериальных клеток штамма проводят аналогично вышеуказанному способу. Титр каждого штамма составляет по 3,5×10¹⁰ КОЕ/мл.

Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-4506 с концентрацией 1,0×10¹¹ КОЕ/мл выращивают в течение 24 часов при температуре +37°С в бульоне Лурия-Бертони следующего состава: (г/л):

триптон - 10,0;

дрожжевой экстракт - 5,0;

натрий хлорид - 5,0.

Отделение бактериальных клеток штамма проводят аналогично вышеуказанному способу. Концентрация штамма составляет 1,0×10¹¹ КОЕ/мл. Для получения жидкого биологического препарата «МикроЛайф» смешивают между собой полученные бактериальные суспензии, включающие штаммы Enterococcus faecium ВКПМ В-4489, Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5337, Lactococcus lactis ВКПМ В-4989, Propionibacterium freudenreichii ВКПМ В-9653 и Bacillus subtilis ВКПМ В-4506, в равных объемных соотношениях и вносят в среду, содержащую свекловичную мелассу, соевый гидролизат, хлористый натрий, нипагин и воду, интенсивно перемешивают и выдерживают. Суммарная концентрация всех бактерий в биологическом препарате «МикроЛайф» должна быть не менее 1*10¹¹ КОЕ/мл, и достигается в течение 3-х суток при температуре +37°С (концентрация контролируется в соответствии с требованиями по работе с патогенами 3-4 группы патогенности по СП 1.3.2322-08). Контроль концентрации выделенных культур микроорганизмов осуществляют визуальным микроскопическим методом в соответствии с аккредитацией (аттестат аккредитации RA.RU.21ПУ48). Подсчет клеток микроорганизмов проводят под микроскопом в камере Горяева (МиниМед, Россия) по А.И. Нетрусова [Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов. - М.: Академия, 2005. - 608 с.]. При несоответствии объявленным критериям качества препарат «МикроЛайф» выбраковывается и не допускается для работы.

Внешний вид консорциума - прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета с опалесценцией, с характерным запахом. Допускается наличие беловатого осадка, разбивающегося при взбалтывании. Готовый препарат хранят в чистом сухом и защищенным от света помещении при температуре от +4 до 20°С в течение 3-х месяцев с момента производства.

Внесение биологического препарата «МикроЛайф» осуществляют в количестве не менее 2,5 мл на 1 тонну фитомассы (биомассы). На практике дозу внесения препарата рассчитывают, исходя из концентрации бактерий (титр) на 1 г консервируемой биомассы. Титр 250 тыс. КОЕ/г зеленой биомассы - это соответствует 2,5 мл/т биомассы. Концентрацию 250 тыс. КОЕ/г биомассы выбирают как среднее арифметическое значение количества внесения известных биоконсервантов на 1 г консервируемой биомассы - на основании анализа титра существующих отечественных и зарубежных биоконсервантов (более 50 наименований), применяемых в Российской Федерации при заготовке кормов [Молодкин В. Кормовые консерванты. Тенденции рынка // 03.04.2016. Электронный ресурс: https://www.tsenovik.ru/articles/obzory-i-prognozy/kormovye-konservanty-tendentsii-rynka/, дата обращения: 07.07.2022 г.], многие препараты имеют титр в основном в пределах 200-300 тыс. КОЕ/г зелёной массы, но не менее 100 тыс. КОЕ/г [В. Молодкин, 2016].

Биологический препарат «МикроЛайф» вносят в биомассу путем распыления (разбрызгивания). Для равномерного распределения препарата по всей биомассе препарат преимущественно разбавляют водой в количестве, которое позволило равномерно распылить раствор по биомассе, но при этом не повышать влажность провяленной биомассы. Оптимальное количество воды 3 л на 1 тонну биомассы.

Незначительные изменения температуры при консервировании (ниже 8°С и выше 18°С) не приводят к существенному нарушению химического состава и питательности люцернового сенажа.

Известно, что основная (главная) фаза ферментации при заготовке консервируемых кормов заканчивается через 21 день [Митрик Т. Силосование. Иллюстрированное практическое руководство / Т. Митрик. 2012. - 81 с.], и это состояние стабильности (консервации) продолжается до вскрытия траншеи. Для лабораторных исследований срок консервации выдерживают в пределах 30-45 суток, а для полупроизводственных [Методические рекомендации по изучению в лабораторных условиях консервирующих свойств химических препаратов, используемых при силосовании кормов / М.Т. Таранов, В.Л. Владимиров, П.А. Науменко и др. - ВИЖ, Дубровицы. - 1983. - 25 с.] требуется до 45-60 суток.

Для оценки эффективности заявляемого препарата для консервирования люцерны сравнивают показатели сенажа, полученного с применением заявляемого биологического препарата «МикроЛайф», - опытный образец, с показателями сенажа, полученного консервированием люцерны без применения заквасок (консервантов), - контрольный образец, и с показателями сенажа, полученного консервированием люцерны известным на рынке отечественным препаратом «Биоамид-3» (БИОАМИД, г. Саратов) - образец сравнения.

Консервирование осуществляют в лабораторных и полупроизводственных условиях. Показатели сенажей, полученных с использованием сравниваемых препаратов (консервантов) в лабораторных и полупроизводственных условиях, определяют в соответствии с [Методические рекомендации по изучению в лабораторных условиях консервирующих свойств химических препаратов, используемых при силосовании кормов / М.Т. Таранов, В.Л. Владимиров, П.А. Науменко и др. - ВИЖ, Дубровицы. - 1983. - 25 с.].

Определение сухого вещества (влажности) в лабораторных и полупроизводственных условиях производят в микроволновой печи по методике, описанной в книге [Л. Дурст и М. Виттман. Кормление сельскохозяйственных животных. Пер. с немец. под ред. и с предисл. Ибатуллина И.И., Проватопова Г.В. - Винница, Нова книга, 2003. - 384 с.].

Зоотехнический анализ проводят согласно методикам, описанным [Зоотехнический анализ кормов: 2-е изд., доп. перераб. / Е.А. Петухова. - М.: Агропромиздат. - 1989. - 239 с.] с использованием автоматизированного комплекта приборов фирмы «VELP Scientific» (Италия).

Микробиологический анализ проводят согласно методикам, описанным Е.З. Теппером [Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. - М.: Колос. - 1993. - 175 с.].

Органолептическую оценку проводят согласно требованиям ГОСТ [ГОСТР 55452-2021. Сено и сенаж. Общие технические условия. - М.: Стандартинформ. - 2021. - 12 с.].

Пример 1

Исследования в лабораторных условиях осуществляют в Татарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства - обособленного структурного подразделения Федерального исследовательского центра Казанского научного центра Российской академии наук (далее ТатНИИСХ - ОСП ФИЦ КазНЦ РАН) в соответствии с [Методическое руководство по химическому консервированию кормов и испытание их на животных / К.М. Солнцев и др. - М.: Колос. - 1980. - 24 с.].

Сырьем (зеленой массой) является скошенная, провяленная в соответствии с требованиями ГОСТ 55452-2021 до содержания 45-55% сухого вещества сенажируемой массы люцерны сорта Гюзель второго года использования, выращенная в условиях пригородного хозяйства СХПК «Племенной завод им. Ленина» Атнинского района Республики Татарстан.

Зелёную массу скашивают в сухую погоду с помощью самоходной косилки-плющилки Class disco 9300 (Германия) и провяливают до достижения 45-55% сухого вещества (влажность 55-45%). Определяют содержание сухого вещества в биомассе % по методике [Л. Дурст и М. Виттман. Кормление сельскохозяйственных животных. Пер. с немец. под ред. и с предисл. Ибатуллина И.И., Проватопова Г.В. - Винница, Нова книга, 2003. - 384 с.]. Провяленную массу подбирают с помощью самоходного кормоуборочного комбайна «Ягуар 850» (Германия) с измельчением 2-3 см. Затем биомассу делят на три равные части по 12 кг из расчета, что проводится трехкратная повторность для каждого сравниваемого опыта в динамике на 3, 7, 15 и 30-е сутки выдерживания. В условиях зооветеринарной лаборатории хозяйства на механических весах ВТ 8908-50Н (ИВЗ, Россия) взвешивают по 12 кг провяленной биомассы люцерны и расстилают тонким слоем на столе.

В лабораторных условиях для равномерного распределения препаратов по всей биомассе необходимую дозу препарата смешивают с рассчитанным количеством дистиллированной воды в мерном стакане. Раствор тщательно перемешивают и с помощью медицинского шприца производят равномерное опрыскивание. На 12 кг провяленной биомассы люцерны распыляют 36 мл дистиллированной воды из расчёта 3 л воды на 1 тонну биомассы.

В одну часть биомассы вносят препарат «МикроЛайф», для чего в стакан приливают 36 мл дистиллированной воды и прикапывают необходимую дозу препарата из расчёта 2,5 мл на 1 тонну биомассы - 30 мкл. Затем раствор перемешивают, наполняют шприц и распыляют на биомассу.

Во вторую часть биомассы вносят распылением водный раствор препарата «Биоамид-3» в количестве согласно инструкции по применению [https://bioamid.com/netcat_f1les/l8/54/h_b94e3alf27410d4add3169b4e0213129, дата обращения 18.01.2023], для чего в 36 мл дистиллированной воды растворяют 18 мг препарата из расчета 1,5 г на 1 тонну биомассы.

Третья часть биомассы выступает в качестве контроля, в нее вносят дистиллированную воду в количестве 36 мл на 12 кг биомассы.

Всю биомассу тщательно вручную перемешивают, разделяют по 1 кг и упаковывают с помощью вакуумного упаковщика «Redmond rvs-m 020» (Китай) в герметические вакуумные пакеты («Redmond», Китай), поставляемые заводом-изготовителем («Redmond», Китай). Всего 36 пакетов - по 12 пакетов для сенажей, полученных с применением сравниваемых препаратов и без препарата. Запакованные пакеты выдерживают в специальных затемненных неотопливаемых полуподземных кубовых бетонированных ямах при температуре +8-18°С. Показатели качества сравниваемых сенажей в динамике определяют на 3, 7, 15 и 30-е сутки выдерживания, для этого пакеты открывают и сравниваемые сенажи подвергают анализу. Для математической достоверности результатов показатели образцов сенажей, полученных при применении сравниваемых препаратов, определяют, как среднее арифметическое значение показателей из трех пакетов (трехкратная повторность) для каждого сравниваемого препарата на 3, 7, 15 и 30-е сутки выдерживания. Усредненные показатели качества сравниваемых люцерновых сенажей, полученных в лабораторных условиях, представлены в таблицах 1 и 2 - кислотность (рН), общее количество органических кислот, а также количество молочной, уксусной и масляной кислот - в таблице 1, химический состав и питательность (обменная энергия и количество сахаров) на 1 кг сенажа - в таблице 2.

Органолептическая оценка сравниваемых образцов сенажей демонстрирует, что все образцы обладают ярко выраженным запахом квашеных фруктов и овощей без признаков затхлости, имеют желто-зеленую окраску, без плесени. Структура стеблей и листьев сохранена, консистенция не мажущаяся. Установлено, что значительная разница по кислотности достигается (рН) с 7-го по 30-е сутки ферментации в образцах с использованием биологических препаратов и составляет соответственно 0,18-0,20 (на 7 сутки), 0,17-0,12 (на 15 сутки) и 0,26-0,28 (на 30 сутки) единиц по сравнению с контрольными значениями. Сумма органических кислот уже на 3-и сутки выдерживания достигает максимальной концентрации и составляет 7,97 абс.% для образца с использованием препарата «Биоамид-3», 7,95 абс.% для образца с использованием препарата «МикроЛайф», против 2,50 абс.% в контрольном образце. В процессе выдерживания концентрация органических кислот имеет тенденцию к снижению, и на 30-й сутки ферментации она составляет: для образца с использованием препарата «Биоамид-3» - 6,73 абс.%, для образца с использованием препарата «МикроЛайф» - 6,20 абс.%, и превышает значение для контрольного образца на 1,01 и 0,48 абс.% соответственно. Аналогичную закономерность наблюдают и по накоплению молочной кислоты в образцах сенажей.

При этом следует отметить, что концентрация уксусной кислоты во всех образцах с использованием препарата «МикроЛайф» с 3-го по 30-е сутки выдерживания выше на 0,23-0,42 абс.% по сравнению с контрольными образцами и на 0,08-0,38 абс.% по сравнению образцами с использованием препарата «Биоамид-3», что свидетельствует о высокой гарантии «аэробной стабильности» сенажей при их выемке.

Химический состав и питательность экспериментальных сенажей из люцерны в динамике в зависимости от применяемого препарата для консервирования представлены в таблице 2. Содержание сухих веществ в образцах, полученных с препаратом «МикроЛайф» превышают аналогичные значения контроля на 3-и сутки выдерживания на 1,71% (50,40), на 7-е сутки на 2,48% (50,48), на 15-е сутки на 2,34% (50,24) и на 30-е сутки на 2,74% (50,24). А по отношению к образцам, полученным с использованием препарата «Биоамид-3», превышение значений по сухому веществу в показателях составляет 0,63-1,36%, за исключением на 7-е сутки, где содержание по сухому веществу составляет 5,85% (50,81).

В процессе ферментации биологический препарат «МикроЛайф» способствует повышению сохранности сырого протеина в сенажах. Уровень сырого протеина на 7-е сутки для образца, полученного с использованием препарата «МикроЛайф», превышает значение контрольного образца на 0,62%. При более длительном выдерживании уровень сырого протеина в образцах с использованием препарата «МикроЛайф» превышает таковой как в контрольном образце, так и в образцах с использованием препарата «Биоамид-3» на 0,30-0,31% и 0,04-0,09% соответственно. Уровень сырой клетчатки за весь период выдерживания в опытных образцах сенажей выше контрольных значений, - для образцов с использованием препарата «Биоамид-3» на 0,18-0,55%, для образцов с использованием препарата «МикроЛайф» - на 0,06-0,85%.

Что касается содержания жира в полученных образцах сенажей, этот показатель на 3-и сутки выдерживания во всех сравниваемых образцах был практически одинаковым. Уровень сырого жира в контрольных образцах на 7-е, 15-е и 30-е сутки составил 1,62-1,63%. На 30-е сутки выдерживания по этому показателю преимущество было за опытным образцом (2,39%) и образцом сравнения (2,09%), разница составляет соответственно 0,47 и 0,77% по отношению к контролю.

Содержание безазотистых экстрактивных веществ (БЭВ) в сравниваемых образцах сенажей, заготовленных с биологическими препаратами, выше значений контрольных образцов. Для образцов, полученных с использованием препарата «МикроЛайф», такая разница в динамике составила: на 3-и сутки - 0,91%, 7-е сутки - 0,44%, 15-е сутки - 0,58% и на 30-е сутки - 3,28%, для образцов, полученных с использованием препарата «Биоамид-3» - 0,94; 0,03; 0,41 и 2,55% соответственно.

Уровень суммы сахаров в исследуемых образцах сенажей, характеризующийся как основной энергетический источник для жизнедеятельности микроорганизмов, имеет тенденцию к снижению в зависимости от продолжительности выдерживания и применяемого консервирующего препарата. В целом, максимальное содержание суммы сахаров выявляют на 3-и и 7-е сутки выдерживания в опытных вариантах, что составляет соответственно 28,71-25,44 мг/кг и 29,23-25,24 мг/кг против 26,78 мг/кг и 24,00 мг/кг в контроле, или выше контрольного значения на 7,21-6,00% и 9,52-5,17%.

Изменения химического состава сенажного сырья в процессе его созревания отразились и на величине обменной энергии. Так, если в опытных образцах с препаратом «МикроЛайф» за период с 3 по 30 сутки выдерживания показатели обменной энергии колебались в пределе 4,30-4,65 МДж/кг, то в образцах сравнения показатели оказались несколько ниже 4,25-4,56 МДж/кг, против 4,16-4,26 МДж/кг в контроле. При вскрытии сенажей на 30-е сутки выдерживания разница по этому показателю по сравнению с контролем (4,16 МДж/кг) оказалась максимальной - в образцах с препаратами «МикроЛайф» выше на 11,78% (4,65 МДж/кг), в образцах с препаратом «Биоамид-3» выше только на 9,62% (4,56 МДж/кг).

По показателю обменной энергии рассчитывают питательность корма, чем показатель выше, тем выше качество получаемого корма. С 15-х на 30-е сутки выдерживания показатели обменной энергии в опытных образцах - 4,36 и 4,65 МДж/кг превышает показатели образцов сравнения - 4,61-5,54% и контрольных образцов - 4,19-4,19%, что делает заявляемый препарат более эффективным по сравнению с препаратом «Биоамид-3» для консервирования люцерны и без использования заквасок.

Показатели качества сравниваемых сенажей в динамике, полученные при применении сравниваемых препаратов на 3-и, 7-е, 15-е и 30-е сутки, демонстрируют, что процесс ферментации сенажа с применением заявляемого препарата «МикроЛайф» протекает немного быстрее, чем с использованием препарата сравнения, и значительно быстрее в сравнении с контролем. Кроме того, время ферментации сенажа с препаратом «МикроЛайф» существенно меньше, чем указанное в рекомендациях, применяемых в настоящее время. Так, данные таблиц 1 и 2 демонстрируют, что характеристики сенажей, полученных после 7-и суток выдерживания, не сильно отличаются от характеристик сенажей, полученных после 15-и и 30-и суток выдерживания. Показатель кислотности (рН) на 30-е сутки по сравнению с показателем на 7-е сутки изменился незначительно - снизился на 0,27 ед. Показатели содержания молочной и уксусной кислот на 30-е сутки снизились всего на 0,4%, и на 0,08% соответственно по сравнению с показателями на 7-е сутки. Содержание сырого протеина на 30-е сутки уменьшилось на 0,39%, сырой клетчатки - на 0,32%, сырого жира - на 0,06%, БЭВ - на 2,6%, обменной энергии - на 0,35% по сравнению с показателями на 7-е сутки. Единственный показатель, который показывает существенное изменение, это сумма сахаров - 25,24 г/кг на 7-е, 19,62 г/кг на 15-е и 18,00 г/кг на 30-е сутки.

Процесс ферментации сенажа с препаратом «МикроЛайф» протекает интенсивнее, где уже через 7 суток выдерживания уровень кислотности составляет 4,79 ед. с достаточной концентрацией органических кислот для дальнейшего консервирования, что подтверждают результаты на 3, 7, 15 и 30-е сутки ферментации. Несмотря на то, что из приведенных данных можно сделать вывод, что применение заявляемого препарата «МикроЛайф» для консервирования люцерны уже через неделю ферментации позволяет получить сенаж с хорошими потенциальными характеристиками, но выдерживание сенажей осуществляют в течение не менее 30 суток после закладки согласно ГОСТ 55452-2021.

Пример 2

Для оценки эффективности заявляемого препарата для консервирования люцерны в полупроизводственных условиях сравнивают показатели сенажа, полученного заявляемым биологическим препаратом «МикроЛайф», - опытный образец, с показателями сенажа, полученного консервированием люцерны без применения заквасок (консервантов), - контрольный образец, и с показателями сенажа, полученного консервированием люцерны известными на рынке отечественными и зарубежными препаратами такими как: «Бонсилаж Альфа» (Schaumann Agri, г. Брун-ам-Гебирге, Австрия), «Биоамид-3» (БИОАМИД, г. Саратов), и «Лактис» (Институт Крымагротехнологии, г. Симферополь) - образцы сравнения.

В полупроизводственных условиях сравнение препаратов для консервирования люцерны осуществляют на базе ООО им. Тимирязева Балтасинского района Республики Татарстан.

Скашивают зелёную массу люцерны сорта Гюзель второго года использования в фазе начала бутонизации с помощью самоходной косилки-плющилки «Полесье КПР-9» (Беларусь), подбирают провяленную по ГОСТ 55452-2021 до сенажной влажности 45-55% массу, измельчают в длину 2-3 см кормоуборочным комбайном «Ягуар 830» (Германия). Влажность биомассы контролируют экспресс-методом [Л. Дурст и М. Виттман. Кормление сельскохозяйственных животных. Пер. с немец. под ред. и с предисл. Ибатуллина И.И., Проватопова Г.В. - Винница, Нова книга, 2003. - 384 с.]. Полученную сенажируемую массу распределяют на пять равных частей массой по 75 кг, взвешивая на механических весах ВТ 8908-50Н (ИВЗ, Россия) и распределяют тонким слоем на бетонированной площадке, застеленной плёнкой (например, полиэтиленовой).

В полупроизводственных условиях для равномерного распределения по всей биомассе сравниваемых препаратов осуществляют опрыскивание провяленной биомассы растворами препаратов с помощью универсального триггера для распыления жидкости SONAX ProfiLine 0,5 л (Германия). Для чего в емкости триггера смешивают дистиллированную воду с соответствующим препаратом в необходимом соотношении с учетом, что на 1 тонну провяленной биомассы люцерны оптимально 3 л воды (на 75 кг - 225 мл воды) тщательно перемешивают и равномерно распыляют растворы препаратов по биомассе.

В одну часть биомассы вносят раствор препарата «МикроЛайф», для чего в емкость триггера заливают 225 мл дистиллированной воды и прикапывают необходимую из расчёта 2,5 мл препарата «МикроЛайф» на 1 тонну биомассы дозу - 187,5 мкл. Емкость закрывают, раствор перемешивают и опрыскивают первую часть сенажируемой биомассы.

Во вторую части сенажируемой биомассы вносят раствор препарата «Бонсилаж Альфа», получаемого растворением 150 мг препарата в 225 мл воды. Количество вносимого препарата - 2 г препарата на 1 тонну биомассы согласно инструкции по применению [https://schaumann.ru/product/bonsilazh-alfa, дата обращения 18.01.2023].

Третью часть сенажируемой биомассы обрабатывают раствором препарата «Биоамид-3» (112,5 мг препарата в 225 мл воды). Количество вносимого препарата согласно инструкции по применению [https://bioamid.com/netcat_files/ 18/54/h_b94e3a1f27410d4add3169b4e0213129, дата обращения 18.01.2023] составляет 1,5 г препарата на 1 тонну биомассы.

Четвертую часть биомассы опрыскивают раствором препарата «Лактис» - 150 мкл препарата, 225 мл воды. Количество препарата - 2 мл на 1 тонну биомассы в соответствии с инструкцией по применению [https://www.lactis-agro.ru/index.php/2017-01-26-16-11-11/about-lactis/use, дата обращения 18.01.2023].

Пятая часть провяленной биомассы выступает в качестве контроля - в нее добавляют 225 мл воды без консерванта.

Каждую часть биомассы для равномерного распределения растворов препаратов/воды тщательно перемешивают и делят еще на 3 равные части. Для математической достоверности результатов показатели образцов сенажей, полученных с применением сравниваемых препаратов, определяют, как среднее арифметическое значение показателей из трех пакетов (трехкратная повторность) для каждого сравниваемого препарата. Всю биомассу закладывают в герметические сверхпрочные двухслойным полиэтиленовые пакеты с завязками Liberhaus praktischc producte (ООО «Биосфера Полимер, Россия) объемом 60 л (15 пакетов). После вытеснения воздуха, заполненные пакеты укладывают в ряд в сенажную траншею объемом 1000 т на глубину 1,5 м с целью создания условий ферментации, аналогичных производственным при среднемноголетней плюсовой температуре окружающей среды. После вскрытия траншеи через 45 суток выдерживания образцы сенажей подвергают зоотехническим и микробиологическим исследованиям.

Усредненные показатели качества сравниваемых люцерновых сенажей, полученных в полупроизводственных условиях, представлены в таблицах 3 и 4 - кислотность (рН), общее количество органических кислот, а также количество молочной, уксусной и масляной кислот - в таблице 3, химический состав и питательность (обменная энергия и количество сахаров) на 1 кг сенажа - в таблице 4. Данные свидетельствуют о том, что кислотность (рН) образцов сенажей, для опытных образцов и образцов сравнения между собой существенно не отличаются, и показатели рН составляют 4,73-4,78 ед. по сравнению с показателем 4,92 ед. в контрольном образце.

Максимальное накопление органических кислот в результате ферментативных процессов происходит в образцах сенажей, полученных с использованием препарата «Биоамид-3» и с использованием препарата «МикроЛайф», эти показатели составляют соответственно 6,06 и 5,70 абс.%, против 5,03 абс.% в контрольном образце. В образце сенажа, полученным с использованием препарата «Бонсилаж Альфа», содержание органических кислот составляет 4,49 абс.%, что ниже значения контрольного образца на 0,54 абс.%. Такие различия отразились и на концентрации молочной кислоты в сравниваемых образцах. Так, если в образцах сенажей с использованием препарата «Биоамид-3» и с использованием препарата «МикроЛайф» концентрация молочной кислоты составляет 5,57 и 5,06 абс.% соответственно, то образцах сенажей с использованием препарата «Бонсилаж Альфа» и с использованием препарата «Лактис» - 3,91 и 4,74 абс.% соответственно. Однако образцы сенажей с использованием препарата «Бонсилаж Альфа» и с использованием препарата «МикроЛайф» выделяются повышенным содержанием уксусной кислоты, - соответственно 0,57 и 0,64 абс.% против 0,40 абс.% в контрольном образце, с разницей на 0,17 и на 0,24 абс.% соответственно. Данный показатель свидетельствует о высокой «аэробной стабильности» образца при его выдерживании и выемке.

Консервирование люцерны с разными биологическими препаратами по-разному влияют на химический состав и питательность получаемых образцов сенажей. Показатели по химическому составу и питательности, представленные в таблице 4, демонстрируют, что больше всего сухого вещества при консервировании биомассы содержится в образцах сенажей, полученных с использованием препарата «Бонсилаж Альфа» и с использованием препарата «МикроЛайф», значения составляют 50,95 и 50,92% против 48,92% в контрольном образце с разницей 2,03 и 2,00% соответственно.

Аналогичную картину выявляют и по содержанию сырого протеина в образцах сенажей, полученных с использованием препарата «Бонсилаж Альфа» (9,68%) и с использованием препарата «МикроЛайф» (9,62%), где уровень протеина выше на 0,40 и 0,34% соответственно по сравнению с контрольным образцом (9,28%). Что касается содержания сырой клетчатки, то среди сравниваемых образцов существенных различий не установлено.

Уровень сырого жира за данный период выдерживания сенажей был выше в образцах сенажей, полученных с использованием препарата «Биоамид-3» (1,40%) на 0,09%, с использованием препарата «МикроЛайф» (1,58%) - на 0,27% по сравнению с контрольным образцом (1,31%).

В образцах сенажей, полученных с использованием препарата «Бонсилаж Альфа» и с использованием препарата «МикроЛайф», выявлено максимальное содержание БЭВ, которое составило 17,35 и 17,08%, что выше контрольного значения на 1,17 и 0,90% соответственно.

Проведенные на основании результатов фактического содержания питательных веществ расчеты энергетической ценности сенажей показывают, что максимальные значения обменной энергии в 1 кг натурального корма приходятся на образцы сенажей, полученных с использованием препарата «МикроЛайф» и с использованием препарата «Бонсилаж Альфа», которая составляет 4,47 и 4,44 МДж, что выше показателя контрольного образца на 5,2% и 4,5% соответственно. В образцах сенажей, полученных с использованием препарата «Биоамид-3» и с использованием препарата «Лактис», разница по этим показателям составила лишь 2,6 и 2,1% соответственно.

Достоверной разницы по сумме сахаров в процессе консервирования провяленной массы люцерны в опытном образце и в образцах сравнения не установлено (10,73-12,64), при этом эти показатели оказались ниже на 17,6-38,6% по сравнению с контрольным образцом (14,87). Сумма сахаров постепенно снижается. Это естественный процесс, так как при дополнительном внесении высокоактивных искусственно селектированных молочнокислых и других микроорганизмов в сенажируемую массу, для достижения оптимальной концентрации pH среды, они интенсивно используют для своей жизнедеятельности сахара корма в качестве энергетического источника питания, тем самым приводит к снижению его уровня в готовых сенажах.

Для вычисления концентрации бактерий различных физиологических групп используют [Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. - М.: Колос. - 1993. - 175 с.]. Концентрации различных физиологических групп микроорганизмов в люцерновом сенаже представлены в таблице 5. Максимальные значения по общему микробному числу (ОМЧ) - 9,20*10⁶ КОЕ/г и 10,03*10⁶ КОЕ/г выявлены в контрольном образце и в образце с использованием препарата «Лактис». В остальных образцах эти показатели ниже, чем для контрольного образца на 22,89-28,08%. По концентрации молочнокислых бактерий - наиболее необходимых для процессов ферментации биомассы сенажа из люцерны, отмечают, что концентрация молочнокислых бактерий существенно выше в опытном образце (3,16 раза), в образцах сравнения (2,14-2,97 раза) по сравнению с контрольным образцом. Наибольшая численность молочнокислых бактерий отмечена в сенажах с использованием препарата «МикроЛайф» и с использованием препарата «Бонсилаж Альфа», что выше в 3,16 и 2,97 раз соответственно по сравнению с контрольным образцом (17,66*10⁶ КОЕ/г).

Аналогичную картину наблюдают и в отношении численности пропионовокислых бактерий. Так, если в образцах, полученных с использованием препарата «МикроЛайф» и с использованием препарата «Бонсилаж Альфа», их численность составляет 6,00*10⁶ КОЕ/г и 5,20*10⁶ КОЕ/г, то с использованием препарата «Биоамид-3» и с использованием препарата «Лактис» - 4,33*10⁶ КОЕ/г и 4,67*10⁶ КОЕ/г, что выше контрольного образца в 2,03; 1,76; 1,46 и 1,58 раз соответственно.

Во всех сравниваемых образцах сенажей присутствуют нежелательные факультативно аэробные микроорганизмы - дрожжи. Наименьшим значением по этому показателю выделяются образцы сенажей с использованием препарата «МикроЛайф» и с использованием препарата «Бонсилаж Альфа» - 0,76*10⁴ КОЕ/г и 0,97*10⁴ КОЕ/г, что ниже контрольного образца на 80,51% и 75,13% соответственно. Для образцов сенажей с использованием препарата «Биоамид-3» и с использованием препарата «Лактис» эта разница составляет 63,33% и 49,49 % соответственно по сравнению с контрольным образцом (3,90*10⁴ КОЕ/г).

Оценку экономической эффективности сравниваемых препаратов для консервирования люцерны проводят сравнением представленных в таблице 6 показателей себестоимости сенажа, а также себестоимости показателей качества корма, таких как обменной энергии, сырого протеина и суммы сахаров.

Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что наиболее дорогостоящим является образец сенажа, полученного с использованием препарата «Бонсилаж Альфа», себестоимость 1 т которого составляет 1208 руб., что выше себестоимости контрольного образца (1058 руб.) на 14,2%.

Себестоимость единицы обменной энергии и сырого протеина также выше по сравнению с контрольным образцом для образцов сенажей, полученных с использованием препарата «Бонсилаж Альфа», на 9,2%, с использованием препарата «Лактис» - на 0,4% соответственно. В то же время указанный показатель опытного образца ниже на 3,6% показателя контрольного образца.

Аналогичную тенденцию наблюдают в отношении себестоимости 1 г сохранившихся сахаров. Так, если в образцах сенажей, полученных с использованием препарата «Бонсилаж Альфа» и с использованием препарата «Лактис», эти показатели составляют 0,113 и 0,093 руб., что выше показателя контрольного образца на 30,9% и 59,2% соответственно, то показатели сенажей, полученных с использованием препарата «Биоамид-3» и с использованием препарата «МикроЛайф» - 0,086 и 0,081 руб. соответственно, что выше показателя контрольного образца на 21,1% и 14,1%.

Таким образом, применение биологического препарата «МикроЛайф» для консервирования люцерны является наиболее эффективным по сравнению с использованием известных биологических препаратов.

Заявленный биологический препарат «МикроЛайф» для консервирования люцерны оказывает положительное влияние на общую питательность полученного сенажа, концентрацию и соотношение органических кислот, развитие желательных физиологических групп микроорганизмов в готовых кормах, а также их «аэробную стабильность» при выемке. При этом содержание сухого вещества выше на 2,0%, сырого протеина - на 0,34% и сырого жира - на 0,27% по сравнению с контролем. По энергетической ценности эта разница составила 0,22 МДж или 5,2%.

Себестоимость единицы обменной энергии и сырого протеина ниже на 3,6 и 1,8% соответственно по сравнению со значениями контрольного образца.

Таким образом, заявляемый биологический препарат «МикроЛайф» для консервирования люцерны обеспечивает высокое качество полученного корма в течение всего срока выдерживания с высокой энергетической и протеиновой ценностью, короткого срока готовности, а также гарантирует «аэробную стабильность» при его выемке и скармливании сельскохозяйственным животным.

Заявленный биологическим препаратом «МикроЛайф» для консервирования биомассы люцерны расширяет арсенал препаратов для консервирования трудносилосуемых культур и может активно использоваться в современном производстве консервированных кормов, молочном и мясном скотоводстве.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Композиция для консервирования люцерны для производства корма для сельскохозяйственных животных характеризуется тем, что состоит из штаммов, при следующих концентрациях КОЕ/мл: палочковидной формы Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5337 – до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл и кокковой формы Lactococcus lactis В-4989 – до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл, Enterococcus faecium В-4489 – до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii В-9653 – до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, а также Bacillus subtillis В-4506 – до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, взятых в равных объемных долях. Изобретение позволяет расширить арсенал препаратов для консервирования растительного сырья, обеспечивающих высокую сохранность и качество готового корма из люцерны. 6 табл., 2 пр.

Композиция для консервирования люцерны для производства корма для сельскохозяйственных животных, характеризующаяся тем, что состоит из штаммов, при следующих концентрациях КОЕ/мл: палочковидной формы Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5337 – до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл и кокковой формы Lactococcus lactis В-4989 – до 3,5*10¹⁰ КОЕ/мл, Enterococcus faecium В-4489 – до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii В-9653 – до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, а также Bacillus subtillis В-4506 – до 1*10¹⁰ КОЕ/мл, взятых в равных объемных долях.