Фотоколориметрический способ оценки дегидрогеназной активности белковых экстрактов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/32 C12N9/02 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для оценки дегидрогеназной активности белковых экстрактов, полученных из микроорганизмов, с помощью феррицианида калия. Белковые экстракты -новый тип биоэлектрокатализатора для биотопливных элементов. В состав белкового экстракта входит каскад ферментов и связанных с ними коферментных систем, осуществляющих окислительное и восстановительное превращения. При технологическом производстве белкового экстракта требуются методы оценки дегидрогеназной активности для контроля качества продукции.

В настоящее время существует ряд фотоколориметрических методов для определения дегидрогеназной активности биообъектов.

Фотоколориметрические методы с применением тетразолиевых солей основаны на способности дегидрогеназ отщеплять водород от различных субстратов (органических кислот, спиртов, углеводов и т.п.) и восстанавливать тетразолиевые соли до окрашенного формазана (патент RU 2 491137 C1 «Способ контроля эффективности рекультивации нарушенных тундровых почв различного гранулометрического состава посредством анализа активности дегидрогеназы», патент RU 2 387 996 C1 «Способ контроля очистки почв, загрязненных углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов посредством анализа активности дегидрогеназы», патент RU 2 199 211 С2 «Способ определения жизнеспособности коконов земляных червей», методические указания по санитарно микробиологическому исследованию почвы (утв. главным государственным санитарным врачом ссср 19.02.81 №2293-81 «Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов», Zhang, Xinying, et al. "Responses of Scirpus triqueter, soil enzymes and microbial community during phytoremediation of pyrene contaminated soil in simulated wetland." Journal of Hazardous Materials 193 (2011): 45-51).

Данные способы на основе тетразолиевых солей характеризуются следующими недостатками:

1. Длительность анализа;

2. Необходимость работать с летучим растворителем для формазана;

3. Невозможность определить дегидрогеназную активность биологического материала, содержащего медь, из-за негативного воздействие меди на абсорбцию продукта восстановления акцептора водорода тетразолиевых солей.

Фотоколориметрические способы с применением метиленового синего в качестве акцептора водорода (патент RU 2 476 598 С2 «Способ количественного определения дегидрогеназной активности микроорганизмов», Чекалов В.П. Определение с помощью метиленового синего сорбционной способности и дегидрогеназной активности донных отложений // Экология моря. - 2006. - Т. 72. - С. 103-109., Варакин Е. А. и др. Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов активного ила в процессе биологической очистки сточных вод //Биотехнологии в химико-лесном комплексе. - 2014. - С.99-104.) характеризуются следующим недостатком - необходимостью создания анаэробных условий для проведения измерений из-за окисления восстановленной формы окрашенного реагента кислородом воздуха.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа, позволяющего оперативно оценить дегидрогеназную активность и лишенного перечисленных выше недостатков.

Это достигается тем, что при количественном определении дегидрогеназной активности белковых экстрактов, предусматривающем их контакт с субстратом и акцептором водорода, в качестве акцептора водорода используют феррицианид калия, а активность определяют по скорости изменения концентрации феррицианида калия в линейной фазе ферментативной реакции.

В предлагаемом способе дегидрогеназную активность оценивают по уменьшению концентрации феррицианида калия, которую непрерывно регистрируют оптическим способом. Исследуемый образец белковых экстрактов вводят в измерительную термостатируемую ячейку, включающую систему регистрации сигнала (светодиод, фотодатчик), к экстракту добавляют субстратную смесь, которая готовится путем смешивания 15 мМ феррицианида калия в буферном растворе и 1 М глюкозы в буферном растворе в соотношении 1:1. Длительность эксперимента 10-15 минут.

Иллюстративный пример реализации заявляемого способа включает выполнение следующих действий: готовится рабочий раствор путем смешивания 100 μл определяемого белкового экстракта и 200 μл субстратной смеси, которая готовится путем смешивания 15 мМ феррицианида калия в буферном растворе и 1 М глюкозы в буферном растворе в соотношении 1:1. Затем рабочий раствор переносится в измерительный планшет и включали спектрофотометр, предварительно разогретый до 37°С. Спектрофотометр начинает фиксировать уменьшение концентрации феррицианида калия в ходе ферментативной реакции по оптической плотности рабочего раствора. В условиях избытка субстрата и акцептора водорода ход реакции линеен в течение примерно 300 секунд, по истечении которых процесс измерения останавливают. Полученные значения оптической плотности раствора переводили в концентрацию феррицианида по формуле C(FC)=OD/0,4824, где

C(FC) - концентрация феррицианида калия,

OD - полученные значения оптической плотности.

По рассчитанным значениям строится график C(FC) от t. Показания фотодатчика фиксируют один раз в 2 секунды, и аппроксимируют линейной зависимостью от времени (фиг. 1). У полученного графика определяют начальный линейный участок, для которого строят касательную, и находят тангенс угла наклона данной касательной (фиг. 1, кривая 2). Формула С=v*t позволяет найти v как угол наклона построенной касательной, таким образом находится скорость реакции v, характеризующая дегидрогеназную активность в качестве кинетического параметра. На примере фигуры 1, оцененная описанным способом дегидрогеназная активность составила 0.00159 ммоль/с.

Приборы для измерения оптической плотности известны специалисту в данной области техники. В том числе, может быть использован спектрофотометр, имеющий интерфейс ЭВМ, обладающий термостатируемой ячейкой и обеспечивающий перемешивание раствора. Предварительно должна быть произведена калибровка между оптической плотностью и концентрацией феррицианида калия в растворе (что очевидно для специалиста в данной области техники).

В таблице 1 представлено сравнение ДГА экстрактов, полученных из E.Coli, оцененное с использованием феррицианида и ТТХ

Как видно, активность, измеренная обоими методами, уменьшается от образца 1 к образцу 4. Таким образом, дегидрогеназная активность экстрактов, полученных из E.Coli, оцененная фотоколориметрическим методом с использованием феррицианида коррелируют с данными, полученными при помощи фотоколориметрического метода с использованием ТТХ.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ оценки дегидрогеназной активности белковых экстрактов, полученных из микроорганизмов, заключающийся в том, что в измерительную термостатируемую ячейку, включающую систему регистрации сигнала, вводят рабочий раствор, содержащий белковый экстракт, субстрат и феррицианид калия, а активность дегидрогеназ определяют по скорости изменения концентрации феррицианида калия в линейной фазе ферментативной реакции. Изобретение позволяет оперативно оценить дегидрогеназную активность. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ оценки дегидрогеназной активности белковых экстрактов, полученных из микроорганизмов, заключающийся в том, что в измерительную термостатируемую ячейку, включающую систему регистрации сигнала, вводят рабочий раствор, содержащий белковый экстракт, субстрат и феррицианид калия, а активность дегидрогеназ определяют по скорости изменения концентрации феррицианида калия в линейной фазе ферментативной реакции.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в измерительную термостатируемую ячейку вводят рабочий раствор, состоящий из 100-200 мкл белкового экстракта и 200-300 мкл субстратной смеси, которая готовится путем смешивания 15 мМ феррицианида калия в буферном растворе и 1 М глюкозы в буферном растворе в соотношении 1:1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве системы регистрации сигнала берут светодиод или фотодатчик.