Способ определения активностиНАдН- и НАдфН-гЕНЕРиРующиХ дЕгидРОгЕНАз Советский патент 1981 года по МПК C12D13/10 G01N33/48 

Это позволяет проводить спектрсфотометрический контроль дегидрог-еназнсй реакции на максимуме поглощения хянона. Легко осуществим также полярографический контроль скорости дегидрог&члзной реакции по поглощению кислорода, пошедшего на окисление аутоксидабельной дифенольной формы анилинолроиззодн -.1х, которая возаикает в системе при налитг.и дегидрогеназиой активности.

В силу высокой активности анилИ1;оироИЗВОД.НЫХ о-бензохинона их приме};яют в коПЦентрации в 10-100 раз ниже, чем л-бензохинон, что исключает побочные эффекты хипонов.

На фиг. I приведены кривые определения активности алкогольдегидрогеназы (а), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (б) и язо-ц.-тратдегидрогеназы (-в); па фиг. 2 - график зависимости скорости .потребления кислорода в среде от количества препарата изоцигратдегидрогеназы при измерении ее активности по предлагаемому способу.

Измерения активности изоцитратдегидрогеназы экстракта печени крысы по предлагаемому способу ,в сравпении с другимл способами приведены в таблице.

Сущность изобретения поясняется схемой;

(Дегидрогеназа)

Субстрат восстановленный +НАД(Ф) j;i +. Субстрат окисленный +НАД(Ф)Н + Н+ (Менадионредуктаза)

НАД (Ф) Н + Н+о-хинон -5-НАД (Ф) +

Н-о-дифенол(2)

На приведенной схеме о-хинон представляет одно из анилинопроизводных о-бензохинона, а о-дифенол - восстановленную форму этого хннояа. Реакция (1) проводится в оптимальных условиях для изучаемой дегидрогеназы. Скорость этой реакции лимитирует скорость реакции (2). Как видно из схемы, реакция (2) выступает как система, акцептирующая водород, появляющийся в основной дегидрогеназной реакции (1) ,в результате окисления конкретного субстрата. Физико-химические свойства анилинопроизводных о-бензохинона позволяют контролировать активность дегидрогеиазной реакции (1) по последовательной реакции (2), включающей аяилинопроизводные о-бензохинола.

Способ определения акти;знасти НАД (Ф) Н-генерирующих дегидрогеназ осуществляется следующим образом. Готовят среду, содержащую субстрат, НАД или НАДФ я другие компоненты, необходимые для проявления активности конкрет.1ой дегидрогеназы, в которую добавляют 4-анилино-5-метокси-1,2- бензохинон (АМОБХ) в количестве 1. мкмоль или какое-либо

другое анилинопроизводное о-бе.нзохино.на, а та|Кже препарат менадио.нредуктазы, взятой в относительном избытке с тем, чтобы ее активность не лимитировала а.кг.ивность изучаемой дегидрогеназы. Полную реакционную среду переносят в закрытую кювету спектрофотометра, предназначемного для автоматической записи результатов из.мерений, или в полярографическую ячейку.

В процессе измерений инкубадио.нную смесь принудительно перемешивают. В среду вносят исследуемый образец .и фиксируют кинетическую кривую активноеги дегидрогеназы (записывают изменение оптической ПЛОТНОСТИ на максимуме поглоще.ния анилиноироизводного о-бензохинона, или регистрируют кинетическую кривую поглощения кислорода в полярографических опытах).

При измерениях по оптической плотности из среды удаляют кислород пропусканием азота или дожидаются естесгвенного истощения кислорода в .кювете, что связано с быстрым окислением дифенольной

формы производных.

Актив.ность дегидрогеназ выражают в общепринятых единицах с учетом сгехиоМбтрии реакции.

Пример 1. Определение активности

алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1.).

Готовят реакционную среду следующего состава: этанол 60 ммоль, НАД 350 у)«л:.иолб, АМОБХ 15 мкмоль, менадионредуктаза 0,5 мг, фосфатный буфер 0,08 М, рН 7,6.

(1)

Среду переносят в полярографическую ячейку и автоматически регистрируют К|Инетическую кривую поглощения кислорода. Далее в полярографическую ячейку нводят 180 мкг очищенного препарата фермента,

продолжая измерение скорости поглощения кислорода (см. фиг. 1 а).

Пример 2. Определение активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (КФ 1.1.1.48).

В полярографическую ячейку вносят среду следующего состава: глюкозо-6-фосфат 550 мкмоль, НАДФ 360 мкмоль, АМОБХ 150 мкмоль, ЭДТА 3,3 ммоль, менадионредуктаза 0,5 мг, триэтаноламиновый буфер 33 ммоль, рН 7,6 и регистрируют поглощение кислорода .после введен.ия 25 мкг фермента (см. фиг. I б).

Пример 3. Определение активности изоцигратдигидрогепазы (КФ 1.1.1.27).

В полярограф.ическую ячейку вносят реакционную среду следующего состава: ДЛизоцитрат 6 ммоль, АМОБХ 150 мкжлль, НАДФ 300 мкмоль, менадионредуктаза 0,6 мг, трис-НС1 буфер 0,08 М, рН 7,6, поглощение к-ислорода регистрируют после введения 320 мкг фермента и 1 ммоль MnSO (см. ф.иг. 1 IB).

Внесение дегидрогеназы в полную реакционную среду приводит к установлению

стацио.нарного режима в системе, при кото;ром скорость поглощения кислорода постоянна и дегидрогеназная актпивяость олисывается кинетической кривой нулевого порядка. Цифры на линейных участках графиков соответствуют измеренным активностям дегидрогеназ.

Таблица Среднее ±S- Как видно из таблицы, определение активности изоцитратдегидрогеназы по нред.лагаемому способу в сравнении с другими независимыми способами дает оов падаю:щие результаты. На фиг. 2 приведен график, из которого следует, что при измерении активности дегидрогеназ (на примере изоцитратдегидрогеназы) по предлагаемому способу наблюдается линейная зависимость между количеством фермента и скоростью изменения окончательного параметра, которым в данном случае является кислород.

Таким образом, использование предлагаемого способа определения активности НАДН- и НАДФН-генерирующих дегидрогеназ позволяет в течение короткого периода времени получить точные данные об активности дегидрогеназ )В ходе самой реакции. Формула изобретения Способ определения активности НАДНи НАДФН-генерирующих дегидрогеназ, предусматривающий приготовление реакционной смеси, включающей хиноны в качестве акцептора водорода, инкубацию ее и определение остаточного количества акцептора, отличающийся тем, что, с пелью расщирения диапазона исследуемых объектов и осуществления непрерывного контроля скорости дегиДрогеназной реакции, в реакционную смесь дополнительно вводят менадионредуктазу, и в качестве акцептора водорода из ряда хинонов используют анилинопроизводные о-бензохинона. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1.Franke W. Thunberg - Methodik und Verwandte Acceptor - Methoden. - Handbuch der Physiologich- und Pathologish - Chemischen Analyse, 2 Bd, 1955, 339-340, Springer - Verlag. 2.Bertho A. and Grossman W. Laboratory Methods in Biochemistry. London, 1938, p. 166-169 (прототип).

0,20,O.S

. .()

препарата u.,c -rгf amдcгu Уcгeftaз (г.2