5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4-гидроксицитидин и его применение Российский патент 2024 года по МПК C07H19/67 C07D405/04 A61K31/506 A61K31/7068 A61P31/12 

Область техники

Группа изобретений относится к новому производному N4-гидроксицитидина содержащему заместитель, являющегося пролекарством N4-гидроксицитидина, а также к способу его получения и применению данного соединения для ингибирования репликации Коронавируса SARS-CoV-2.

Уровень техники

В настоящее время во всем мире происходят регулярные вспышки новой коронавирусной инфекции (COVID-19 или SARS-Cov-2). Несмотря на интенсивные контрмеры, принятые во всем мире, заболеваемость и смертность остаются высокими, и многие страны сталкиваются с новыми волнами инфекции. Вакцины являются важным инструментом в борьбе с COVID-19, но разработка противовирусных препаратов также является приоритетной задачей, особенно в связи с появлением вариантов, которые могут частично уклоняться от вакцин. Поэтому, в клинике остро необходим безопасный и эффективный препарат для профилактики и лечения новой коронавирусной инфекции. Исходя из того, что существующие противовирусные препараты имеют в большей или меньшей степени недостатки, создание противовирусных препаратов с лучшим лечебным эффектом является проблемой, требующей срочного решения в настоящее время.

Известны производные N4-гидроксицитидина, применяемые относительно лечения или профилактики вирусных инфекций, в частности, восточного, западного и венесуэльского энцефалита лошадей (EEE, WEE и VEE соответственно), лихорадки Чикунгунья (CHIK), лихорадки Эбола, гриппа, сезонных и пандемических коронавирусов (MERS и SARS), респираторно-синцитиального вируса (RSV) и вируса Зика [WO2019113462, WO2016106050, US20190022116]. Однако, для большинства производных N4-гидроксицитидина активность против новых вариантов SARS-CoV-2 остается неизвестной. Изучена активность некоторых пролекарств N4-гидроксицитидина против рекомбинатного SARS-CoV-2 [CN111548384A], а также 5'-изопропилового эфира β-D-N4-гидроксицитидина (препарат Lagevrio, Молнупиравир) ингибирующего репликацию SARS-CoV-2 и применяемого для лечения COVID-19 [10.1038/s41564-020-00835-2, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04405739, 10.3389/fimmu.2022.855496, 10.1056/NEJMoa2116044]. Основные недостатки данного препарата заключаются в невысокой антивирусной активности против SARS-CoV-2.

Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности и обеспечивает другие связанные с этим преимущества. Например, соединение по данному изобретению можно применять для ингибирования репликации SARS-CoV-2. Соединение обладает более высоким антивирусном эффектом.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является получение производного N4-гидроксицитидина обладающего высокой активностью против коронавируса SARS-CoV-2.

Указанный технический результат достигается тем, что создано сложноэфирное производное N4-гидроксицитидина с карбоновой кислотой (5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4- гидроксицитидин), которое представлено следующей структурной формулой:

или его фармацевтически приемлемая соль

Также разработано применение полученного соединения для ингибирования репликации SARS-CoV-2.

Также разработан способ получения соединения 5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4- гидроксицитидина, включающий:

(а) блокирование вицинальных 2' и 3' гидроксильных групп у N4-гидроксицитидина при помощи ацетонидной защиты с получением промежуточного соединения 2',3'-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина;

(б) блокирование гидроксильной группы в 4' положении N4-гидроксицитидина с помощью диметокситритильной защитной группы с получением промежуточного соединения N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина;

(в) реакцию N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина с 4-хлорфеноксиуксусной кислотой в присутствии 1,3-дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене с получением промежуточного соединения - 3 -фенилпропионовой кислоты 2,2-диметил-6-(2-оксо-4-тритилоксиамино-2Н-пиримидин-1-ил)-тетрагидро-фуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил метиловый эфира;

(г) кислотный гидролиз промежуточного соединения 3-фенилпропионовой кислоты 2,2-диметил-6-(2-оксо-4-тритилоксиамино-2Н-пиримидин-1-ил)-тетрагидро-фуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил метиловый эфира с образованием 5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4- гидроксицитидина.

В частном случае выполнения способа блокирование вицинальных 2' и 3' гидроксильных групп проводится путем добавления пара-толуолсульфокислоты к N4-гидроксицитидину в сухом ацетоне.

В частном случае выполнения способа блокирование гидроксильной группы в 4' положении N4-гидроксицитидина проводится путем добавления триэтиламина и 4-диметиламинопиридина к суспензии 2',3'-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина в дихлорметане, а затем добавления диметокситритилхлорида в дихлорметане.

В частном случае выполнения способа кислотный гидролиз проводится с муравьиной кислотой.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено получение N4-диметокситритилокси-2',3'-О- изопропилиденцитидина (3).

На фиг. 2 представлено получение 5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4- гидроксицитидина (5).

На фиг. 3 представлены дозозависимые кривые и значения IC₅₀ ингибирования СРЕ для различных вариантов SARS-CoV-2 помощью исследуемого соединения.

Осуществление изобретения

Получение производного N4-гидроксицитидина на основе карбоновой кислоты состоит из нескольких этапов. Первоначально, исходное соединение β-D-N4-гидроксицитидин (NHC), проводили блокирование вицинальных 2' и 3' гидроксильных групп при помощи ацетонидной защиты. В качестве оптимального метода использовали пара-толуолсульфокислоту (p-TSA) в качестве катализатора, реакция протекала в ацетоне при комнатной температуре в течение 2 ч. Следующим необходимым шагом было блокирование гидроксильной группы в 4 положении N4-гидроксицитидина. Для этих целей была выбрана диметокситритильная (DMTr) защитная группа, выбор обусловлен легкостью введения защиты, а также ее кислотолабильностью, что делает возможным деблокирование всех защитных групп в кислых условиях. Реакцию проводили в хлористом метилене действием диметокситритилхлорида (DMTr-Cl) в присутствии 4-диметиламинопиридина (DMAP) в качестве катализатора, а также триэтиламина.

Далее было получено сложноэфирное производные N4-гидроксицитидина с карбоновой кислотой - 4-хлорфеноксиуксусной кислотой. Для этого проводили реакцию N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина с карбоновой кислотой в присутствии 1,3-дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене, перемешивание осуществляли при комнатной температуре в течение 2 ч. Промежуточный продукт предочищали на силикагеле и без выделения в индивидуальном виде подвергали кислотному гидролизу действием 80%-ного водного раствора муравьиной кислоты, перемешивали при комнатной температуре 20 ч. Соединение выделяли флэш-хроматографией на силикагеле.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Получение 2',3'-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина (2)

К 1.7 г (6.56 ммоль) N4-гидроксицитидина в сухом ацетоне (240 мл) добавляли 3.7 г (19.69 ммоль) пара-толуолсульфокислоты, полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакцию нейтрализовывали добавлением триэтиламина, растворители отгоняли, остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле в системе хлороформ:метанол (5% метанола).

Выход соединения (2) 1.6 г (85%, крист) Rf 0.45

¹Н-ЯМР-спектр (CDCl₃), δ, м.д.): 1.32 (2c, 6H, 2CH₃), 2.00 (c, 1H, NHOH), 3.65-3.94 (м, 2Н, 5'-СН₂), 4.14-4.27 (м, 1Н, 4'-СН), 4.87-5.08 (м, 2Н, 2' и 3'-СН), 5.38 (д, J=2.6 Гц, 1Н, 1'-СН), 5.62 (д, J=7.8 Гц, 1Н, Н-5 Cyt), 6.65 (д, J=8.1 Гц, 1Н, Н-6 Cyt), 8.13 (c, 1H, NHOH)

Получение N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина (3)

К суспензии 1.6 г (5.37 ммоль) 2',3'-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина (2) в дихлорметане (100 мл) при перемешивании при комнатной температуре добавляли 1.1 мл (8.06 ммоль) триэтиламина и 7 мг (0.054 ммоль) 4-диметиламинопиридина, смесь перемешивали в течение 15 мин. Затем в реакционную колбу по каплям добавляли раствор 1.8 г (5.37 ммоль) диметокситритилхлорида в дихлорметане (50 мл), перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель отгоняли на роторном испарителе, остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле в градиенте систем - гексан:этилацетат:триэтиламин (7:3:0.25) с последующим элюированием системой хлороформ:триэтиламин (2.5% триэтиламина).

Выход соединения (3) 2.7 г (84.3%, аморфное) Rf 0.74

¹Н-ЯМР-спектр (CDCl₃, δ, м.д.): 1.47 (2c, 6H, 2CH₃), 3.81 (c, 6H, 2OCH₃), 3.66-3.99 (м, 2Н, 5'-СН₂), 4.12-4.25 (м, 1Н, 4'-СН), 4.89-5.11 (м, 2Н, 2' и 3'-СН), 5.34 (д, J=3.1 Гц, 1Н, 1'-СН), 5.51 (д, J=8.1 Гц, 1Н, Н-5 Cyt), 6.46 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Н-6 Cyt), 6.79-6.86, 7.16-7.25 , 7.28-7.33 (3м, 13Н в DMTr), 8.11-8.35 (c, 1H, NHOH).

Пример 2.

Получение 5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4- гидроксицитидина (5)

Раствор 180 мг (0.297 ммоль) N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина (3), 81 мг (0.441 ммоль) 4-хлорфеноксиуксусной кислоты и 108 мг (0.528 ммоль) 1,3-дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене (30 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную массу предочищали на силикагеле в системе хлороформ:гексан:триэтиламин (8:2:0.25). Промежуточный продукт (4) подвергали действию 80%-ного водного раствора муравьиной кислоты (15 мл), перемешивали при комнатной температуре 20 ч, упаривали и очищали флэш-хроматографией на силикагеле в смеси растворителей хлороформ:метанол (5% метанола).

Выход соединения 5 69 мг (56.1%, аморфное), R_f 0.35.

¹Н-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, δ, м.д.): 2.52 (c, 1H, NHOH), 3.96-4.05 (м, 2Н, 5'-СН₂), 4.19-4.35 (м, 1Н, 4'-СН), 4.85 (с, 2Н, СН₂-СО), 5.13-5.41 (м, 2Н, 2' и 3'-СН), 5.55 (д, J=8.1 Гц, 1Н, 1'-СН), 5.71 (д, J=5.6 Гц, 1Н, Н-5 Cyt), 6.83 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Н-6 Cyt), 6.94-7.36 (2м, 4Н, Ph), 9.55 (c, 1H, NHOH).

Пример 3.

Исследование антивирусного эффекта против SARS-CoV-2.

Клетки Vero E6 (ATCC CRL-1586) культивировали в ростовой среде DMEM (Gibco, USA), дополненной 5% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS; HyClone, USA), 1× антибиотик-антимикотик (Capricorn Scientific GmbH) и 1× GlutaMAX (Gibco, USA). Для изучения антивирусного действия соединения против SARS-CoV-2, использовали следующие вирусы: вариант «Ухань» B.1.1 (PMVL-4), «Омикрон» ВА.4.6 (PMVL-55), «Омикрон» BA.5 (PMVL-52) и «Омикрон» BA.5.2 (PMVL-54). Для исследования антивирусного эффекта, клетки Vero E6 (2×10⁴ клеток/лунка) высевали в 96-луночные планшеты в полной ростовой среде DMEM за день до эксперимента. Затем, к монослою клеток добавляли различные разведения исследуемого соединения и инкубировали в течение 1 ч при 37°С и 5% CO₂. После этого, производили заражение соответствующим вирусом при 100 TCID₅₀. Ингибирование вирус-индуцированного цитопатического эффекта (СРЕ) под действием соединения определяли как описано ранее [10.1007/s00018-021-03985-6].

Анализ антивирусного действия разработанного нами соединения (SN_12) против четырех вариантов вируса SARS-CoV-2 показал, что данное соединение обладает активностью в ~ 16-35 раза большей (Фиг. 3), чем производное N4-гидроксицитидина (EIDD-2801; β-D-N4-Hydroxycytidine-5′-isopropyl ester), которое является активным компонентом препарата Молнупиравир (Lagevrio) и одобрено для лечения COVID-19.

Таким образом, технический результат изобретения подтверждается тем, что заявляемое соединение - 5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4- гидроксицитидин отличается от известных прототипов производных N4-гидроксицитидина и проявляет более высокий антивирусный эффект против SARS-CoV-2.

Группа изобретений относится к новому производному 5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4-гидроксицитидину, а также к способу его получения и применению соединения для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2. Технический результат: получено новое соединение, обладающее высокой активностью против коронавируса SARS-CoV-2. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 пр., 3 ил.

1. Соединение, представляющее собой производное N4-гидроксицитидина и соответствующее формуле

,

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Применение соединения по п.1 для ингибирования репликации SARS-CoV-2.

3. Способ получения соединения по п.1, включающий:

(а) блокирование вицинальных 2'- и 3'-гидроксильных групп у N4-гидроксицитидина при помощи ацетонидной защиты с получением промежуточного соединения 2,3'-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина;

(б) блокирование гидроксильной группы в 4'-положении N4-гидроксицитидина с помощью диметокситритильной защитной группы с получением промежуточного соединения N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина;

(в) реакцию N4-диметокситритилокси-2',3'-О-изопропилиденцитидина с 4-хлорфеноксиуксусной кислотой в присутствии 1,3-дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене с получением промежуточного соединения - 3-фенилпропионовой кислоты 2,2-диметил-6-(2-оксо-4-тритилоксиамино-2Н-пиримидин-1-ил)-тетрагидро-фуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил метиловый эфира;

(г) кислотный гидролиз промежуточного соединения 3-фенилпропионовой кислоты 2,2-диметил-6-(2-оксо-4-тритилоксиамино-2Н-пиримидин-1-ил)-тетрагидро-фуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил метиловый эфира с образованием 5'-О-(4-хлорфеноксиацетил)-N4-гидроксицитидина.

4. Способ получения по п.3, где блокирование вицинальных 2'- и 3'-гидроксильных групп проводится путем добавления пара-толуолсульфокислоты к N4-гидроксицитидину в сухом ацетоне.

5. Способ получения по п.3, где блокирование гидроксильной группы в 4'-положении N4-гидроксицитидина проводится путем добавления триэтиламина и 4-диметиламинопиридина к суспензии 2',3'-О-изопропилиден-N4-гидроксицитидина в дихлорметане, а затем добавления диметокситритилхлорида в дихлорметане.

6. Способ получения по п.3, где кислотный гидролиз проводится с муравьиной кислотой.