Способ оценки проницаемости эпителиального барьера кишечника у больных, получающих лечение гемодиализом Российский патент 2024 года по МПК G01N33/66 G01N33/68 G01N33/573 G01N1/28 

Изобретение относится к области медицины, в частности к нефрологии, гастроэнтерологии, и может быть использовано для определения наличия и степени выраженности нарушений проницаемости эпителиального барьера кишечника у больных с терминальной стадией почечной недостаточности, получающих лечение программным гемодиализом.

Синдром повышенной эпителиальной проницаемости кишечника (в англоязычной литературе более известный как «Leaky Gut», или синдром «дырявой кишки») в настоящее время рассматривается в качестве важного механизма патогенеза многих заболеваний, включая различные нефропатии. Малоподвижный образ жизни, рацион со сниженным потреблением жидкости и пищевых волокон, расстройства моторики кишечника, необходимость в частом приеме антибактериальных средств, препаратов железа способствуют у больных хронической болезнью почек (ХБП) снижению количества бактерий, продуцирующих короткоцепочечные жирные кислоты, обладающих важными плейотропными эффектами, а также повышению содержания анаэробных протеолитических видов бактерии, синтезирующих уремические токсины (индоксил сульфат, р-крезил сульфат, триметиламин-N-оксид и др.). Кроме того, снижение экскреторной функции почек приводит к задержке в организме продуктов азотистого обмена, часть которых компенсаторно поступает в желудочно-кишечный тракт. Наиболее распространенным среди этих соединений является мочевина, которая в просвете кишечника гидролизуется микробной уреазой, образуя большое количество токсичного гидроксида аммония, что вызывает нарушение биохимической среды с повышением внутрипросветного рН, раздражение слизистой оболочки, развитие субклинического энтероколита, локальной лейкоцитарной инфильтрации и гиперпродукции цитокинов. Местное воспаление усиливает разрушение эпителиального барьера кишечника, вызывая активацию (фосфорилирование) киназы легкой цепи миозина, приводящей к реорганизации структуры плотных контактов между соседними энтероцитами. Наиболее выраженные изменения стеки кишечника наблюдаются у лиц с терминальной стадией ХБП, получающих лечение диализом, чему в значительной степени способствуют интрадиализная гипотензия, мезентериальная ишемия, кишечные микрокровоизлияния, вызванные системной антикоагулянтной терапией в сочетании с уремической дисфункцией тромбоцитов. Конечным результатом вышеперечисленных изменений является повышение трансэпителиальной кишечной проницаемости с неконтролируемой транслокацией в кровоток большого количества иммуногенных продуктов микробного происхождения, что приводит к хроническому системному воспалению, оксидативному стрессу, неблагоприятным сердечно-сосудистым исходам и прогрессированию почечной недостаточности [1].

Особый интерес к синдрому повышенной эпителиальной проницаемости кишечника, как важному модулятору течения и исходов ХБП, диктует необходимость располагать надежными способами его оценки. К настоящему времени разработано немало диагностических методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки (таблица 1). В каждом конкретном случае выбор зависит от целей исследования и определяется условиями проведения и доступностью биологического материала, а также научными и клиническими задачами исследования [2].

Высокоинформативными подходами при изучении проницаемости кишечного эпителия в экспериментальных исследованиях являются: регистрация электрофизиологических показателей тканей кишки и клеточных линий (Caco-2, HT-29, SK-CO15 и T84) в камере Уссинга, система «кишечной петли» на модельных животных, различные молекулярно-биологические методы (оценка экспрессии генов и содержание белков плотных контактов с использованием полимеразной цепной реакции, иммуногистохимия и вестерн-блоттинг и др.). Именно эти методики внесли наибольший вклад в имеющиеся на сегодняшний день знания об особенностях повреждения кишечного барьера при патологии почек [3]. Гистологическое исследование биопсийного материала используется для прижизненной оценки изменений стенки кишечника у человека, в том числе у больных ХБП. Однако без данных о функциональных изменениях, физиологическое значение выявленных структурных аномалий остается гипотетическим.

Наиболее распространенным методом оценки проницаемости кишечника in vivo являются прямые функциональные тесты, которые определяют фракционную экскрецию с мочой перорально введенных маркерных зондов. Методология подразумевает энтеральный прием неметаболизируемых веществ с определенным размером молекулы, которые свободно пересекают кишечный барьер, попадают в кровоток и могут быть обнаружены в моче после выведения почками. Чаще всего для этих целей используют различные сахариды (пентасахарозный тест) [4]. Лабораторный анализ образцов мочи обычно проводится с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, что, наряду с отсутствием стандартизированных протоколов, является существенным ограничением для более широкого внедрения данного метода в повседневную клиническую практику. Кроме того, вследствие измененного почечного клиренса сахарозных маркеров, сравнение проницаемости кишечника между испытуемыми с почечной недостаточностью и без нее с помощью этого метода некорректно.

Как ex vivo, in vitro, in situ, так и прямые тесты in vivo оценки проницаемости кишечника требуют много времени, дорогостоящего специализированного оборудования и поэтому недоступны в большинстве клинических лабораторий. В связи с этим постоянно сохраняется интерес к поиску надежных биомаркеров, определение которых будет свидетельствовать о нарушении целостности кишечного барьера. Данный подход основан на обнаружении в биологических средах (кровь, моча, кал и другие) бактерий и продуктов микробного происхождения, обычно присутствующих в просвете кишечника (эндотоксины, антитела к Core региону эндотоксина, липополисахарид-связывающий белок, короткоцепочечные жирные кислоты, D-лактат, фекальный бутират, бактериальный гемолизин и другие). В качестве биомаркеров повышенной проницаемости также рассматриваются повышенные уровни белков, которые являются компонентами кишечного барьера (зонулин, клаудин, интестинальный белок, связывающие жирные кислоты (I-FABP), цитруллин, глутатион S-трансфераза) и фекальные биомаркеры интестинального воспаления (кальпротектин, α1-антитрипсин) [5]. Важно понимать, что функция почек влияет на результаты большинства подобных тестов. Именно поэтому многие исследования, в которых оценивалась проницаемость кишечника, исключали пациентов с ХБП, чтобы избежать погрешностей в выводах, связанных со снижением скорости клубочковой фильтрации (СКФ). Таким образом, можно констатировать, что в настоящее время отсутствует объективный метод оценки барьерных свойств и проницаемости кишечной стенки у больных с тяжелым нарушением функции почек, особенно у тех, кто получает лечение диализом.

В качестве прототипа предлагаемого способа рассматриваются результаты ранее проведенных исследований, в которых изучалось содержание различных биомаркеров повышенной проницаемости кишечника у больных на разных стадиях ХБП, в том числе получающих лечение программным гемодиализом. Так, у больных с нарушением функции почек, особенно в терминальной стадии, было показано повышение уровня сывороточного зонулина [6], интестинальной фракции белка, связывающих жирные кислоты (I-FABP) [7], бета-D-глюкана [8], сывороточного и фекального бутирата [9], кальпротектина [10], альфа-1 антитрипсина [11]. Данные систематического обзора 15 исследований с использованием разнообразных неинвазивных методов оценки проницаемости кишечника в целом свидетельствуют о ее повышении у больных с прогрессирующей ХБП.

Определение бактериальной ДНК с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и оценка уровня D-лактата в крови, по заключению авторов данной работы, являются предпочтительными тестами у лиц с почечной недостаточностью, так как в наименьшей степени подвержены влиянию сниженной СКФ [12].

Среди недостатков прототипа можно отметить то, что ни один из биомаркеров не является достаточно специфичным для самостоятельной диагностики повышенной проницаемости кишечника, так как ранее не был валидирован в репрезентативной популяции пациентов с разными стадиями ХБП, в том числе получающих лечение диализом. Кроме того, отсутствуют стандартизированные протоколы лабораторных исследований и общепринятые референтные значения для каждого биомаркера. В то же время широкое применение оценки бактериальной транслокации (определение ДНК кишечных бактерий в крови и других экстраинтестинальных тканях) существенно ограничено сложностью, низкой доступностью и высокой стоимостью применяемых для этих целей технологий MALDI-TOF масс-спектрометрии и секвенирования с биоинформатическим анализом.

Цель изобретения – разработка информативного, неинвазивного и доступного в повседневной клинической практике способа оценки проницаемости эпителиального барьера кишечника у больных, получающих лечение гемодиализом.

Сущность способа заключается в определении у пациентов с нарушением функции почек уровней фекального зонулина, кальпротектина и сывороточного D-лактата. Определённое значение концентрации каждого из биомаркеров оценивается в баллах от 0 до 3 в зависимости от увеличения концентраций в соответствии с предлагаемыми диапазонами (таблица 2). Индекс проницаемости рассчитывается как сумма баллов по трем показателям. Значение индекса проницаемости равное 0 свидетельствует о нормальной проницаемости кишечника, 1-3 – о незначительно повышенной, 4-6 – умеренно повышенной, 7-9 – значительно повышенной проницаемости кишечника.

Технический результат предлагаемого способа заключается в одновременной оценке концентрации нескольких сывороточных и фекальных биомаркеров, на уровень которых не влияет снижение СКФ, на основании чего рассчитывается индекс, значение которого позволяет судить о наличии и степени выраженности повышенной проницаемости кишечника у больных с нарушением функции почек.

Способ осуществляется следующим образом.

У пациентов, получающих лечение гемодиализом, в междиализный день утром натощак до приема лекарственных препаратов производится забор венозной крови в вакуумные пробирки с активатором коагуляции и центрифугируются при 3000 об/мин в течение 15 мин. Концентрацию D-лактата в полученной сыворотке определяют методом иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией коммерческого набора Nanjing SenBeiJia Biological Technology (China).

Исследование образцов кала проводят после предварительной пробоподготовки. К клиническому материалу добавляют 5 мл буфера, тщательно суспендируют и центрифугируют 5 мин/2000g. Образовавшийся супернатант проб фекалий используют для последующего анализа сразу после его приготовления. Концентрацию зонулина в кале определяют методом иммуноферментного анализа по инструкции коммерческого набора BlueGene Biotech (China), кальпротектина – с использованием реактивов Bühlmann Laboratories (Switzerland).

Далее определённое значение концентрации каждого из биомаркеров оценивается в баллах от 0 до 3 в зависимости от увеличения концентраций в соответствии с предлагаемыми диапазонами (таблица 2). Индекс проницаемости рассчитывается как сумма баллов по трем показателям. Значение индекса проницаемости равное 0 свидетельствует об отсутствии нарушений проницаемости кишечника, 1-3 – о незначительно повышенной, 4-6 – умеренно повышенной, 7-9 – значительно повышенной проницаемости кишечника.

Таблица 2. Показатели для расчета индекса кишечной проницаемости

Биомаркер/
количество баллов 0 1 2 3 Сывороточный D-лактат, мкмоль/л <7,61 7,61-11,73 11,74-17,01 >17,01 Фекальный зонулин,
нг/мл <160,1 160,1-198,4 198,5-236,1 >236,1 Фекальный кальпротектин, мкг/г <25,2 25,2-63,0 63,1-92,7 >92,7

Предложенный способ оценки проницаемости эпителиального барьера кишечника у больных, получающих лечение гемодиализом, является новым и в доступной литературе ранее не описан. Комбинированное использование нескольких биомаркеров значительно повышает диагностическую ценность предлагаемого способа, что является наиболее существенным его отличием от прототипа. Кроме того, использование биомаркеров (фекального зонулина, кальпротектина и сывороточного D-лактата), на содержание которых не влияет нарушение функции почек и процедура гемодиализа, повышает специфичность предлагаемого способа. Заявляемый способ является неинвазивным, технически прост и может применяться в стандартной лаборатории с минимальным набором оборудования. Расчет интегрального индекса дает возможность оценить не только наличие, но и степень тяжести нарушения кишечной проницаемости, что может быть полезным при выборе дальнейшей тактики лечения об оценке эффективности проводимой терапии.

Работоспособность способа доказана путем комплексного обследования 155 больных с терминальной стадией почечной недостаточности (ТПН), получающих лечение гемодиализом не менее 6 месяцев. Медиана продолжительности диализной терапии составила 40 (19-97) месяцев. В группу сравнения вошли 30 пациентов с ХБП С3а-5 (СКФ<60 мл/мин/1,73 м²). Группа контроля была представлена 20 относительно здоровыми лицами со СКФ>60 мл/мин/1,73 м². Группы были сопоставимы по основным клинико-демографическим характеристикам (таблица 3). Критерии исключения: острые воспалительные и некомпенсированные хронические заболевания; энтеропатии (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, целиакия и другие).

У всех участников исследования утром натощак до приема лекарственных препаратов производится забор венозной крови в вакуумные пробирки для последующего лабораторного анализа в сертифицированной лаборатории. Концентрацию D-лактата в крови определяли методом иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией коммерческого набора Nanjing SenBeiJia Biological Technology (China). Уровень фекального зонулина был определен у 94 гемодиализных больных методом иммуноферментного анализа по инструкции коммерческого набора BlueGene Biotech (China). Концентрацию фекального кальпротектина определяли у 80 гемодиализных больных методом иммуноферментного анализа по инструкции коммерческого набора Bühlmann Laboratories (Switzerland). Содержание исследуемых биомаркеров повышенной проницаемости кишечника также было определено у всех пациентов групп сравнения и контроля.

Таблица 3. Основные клинико-демографические характеристики пациентов

Показатель Группа 1
ТПН
(гемодиализ)
n=155 Группа 2
СКФ˂60 мл/мин/1,73 м²
n=30 Группа 3
СКФ˃60 мл/мин/1,73 м²
n=20 р Возраст, лет 61(48-68) 55,5 (44-66) 55 (49,3-66,8) р=0,424^⁕ Пол (мужчины, %) 89(57,4) 17(56,7) 10(50) р=0,835^§ ИМТ, кг/м² 26,5(23,7-30,7) 26,8(23,9-29,4) 26,9(23,8-29,9) р=0,836^⁕ Злоупотребление курением, n (%) 28(18,1) 6(20) 5(25) р=0,79^§ этиологическая причина ХБП, n (%) - гломерулонефрит 50(32,3) 10(33,3) - р_1-2=1,0^µ - СД 2 типа 47(30,3) 7(23,3) 5(25) р=0,726^§ - СД 1 типа 11(7,1) 1(3,3) - р_1-2=0,694^µ - поликистозная болезнь почек 15(9,7) 2(6,7) 2(10) р=1,0^µ - тубулоинтерстициальный нефрит 11(7,1) 2(6,7) 3(15) р=0,397^µ - другие причины 21(13,5) 8(26,7) 10(50) р˂0,001^§ Гемоглобин, г/л 112 (100-123) 128,5 (119,5-138) 144 (138-152,8) р˂0,001^⁕ СОЭ, мм/час 27 (16-42) 14,5 (10-25,8) 9 (5-15,3) р˂0,001^⁕ Альбумин, г/л 36,8 (34,7-40,1) 38,7 (36,3-42,9) 42,7 (39,9-45,6) р˂0,001^⁕ Общий холестерин, ммоль/л 4,2 (3,5-5,3) 4,9 (3,8-5,3) 5,4 (4,9-6,4) р=0,001 Триглицериды, ммоль/л 1,4 (1,1-1,9) 1,4 (1,0-1,9) 1,8 (1,2-2,3) р=0,361^⁕ СКФ, мл/мин/1,73 м² - 33,5 (26,5-45) 78 (74,3-96,8) р_2-3˂0,001^γ Мочевая кислота, мкмоль/л 406,1 (347-467) 365,7 (308,5-453,7) 273,4 (259,4-314,2) р˂0,001^⁕ С-реактивный белок, мг/л 6,7 (3,2-11,7) 4,0 (2,5-6,4) 1,2 (0,3-2,2) р˂0,001^⁕ Фибриноген, г/л 5,1 (4,4-5,8) 4,4 (3,8-5,2) 3,6 (3,3-4,3) р˂0,001^⁕ D-лактат, мкмоль/л 11,7 (7,6-17) 7,8 (5,5-11,3) 4,8 (2,6-5,7) р˂0,001^⁕

Примечание: ^⁕ - критерий Краскела-Уоллиса; ^§ - Хи-квадрат Пирсона; ^µ - точный критерий Фишера;

^γ – критерий Манна-Уитни.

Лабораторные параметры обследованных больных характеризовались типичным для прогрессирования ХБП снижением СКФ, уровня гемоглобина, альбумина, бикарбоната, а также повышением мочевой кислоты и воспалительных биомаркеров (СОЭ, СРБ, фибриногена). Концентрация фекального зонулина и кальпротектина, а также сывороточного D-лактата значимо повышалась параллельно с усилением тяжести почечной недостаточности и достигала максимальных значений у гемодиализных больных (таблицы 3,4,5). При этом у пациентов на додиализных стадиях ХБП отсутствовала зависимость в содержании D-лактата и фекального зонулина от показателей, характеризующих функцию почек (креатинин и расчетная СКФ) (таблица 6). В группе пациентов со СКФ<60 мл/мин/1,73 м² уровень фекального кальпротектина значимо коррелировал со СКФ и креатинином. Между тем механизм образования кальпротектина (высвобождается во время активации или гибели нейтрофилов, моноцитов и макрофагов в просвете кишечника) аналогичным образом не предполагает влияние почечной недостаточности и процедуры диализа на его содержание в кале, а обнаруженная зависимость скорее является показателем патогенетической взаимосвязи повышенной проницаемости эпителиального барьера кишечника с нарушенной функцией почек.

Эти данные показывают, что фекальный зонулин, кальпротектин и сывороточный D-лактат могут использоваться в качестве биомаркеров повышенной эпителиальной проницаемости кишечника у лиц с нарушением функции почек, в том числе получающих лечение гемодиализом, так как их содержание не подвержено значимому влиянию сниженной СКФ.

Таблица 4. Уровень фекального зонулина в исследуемых группах

Показатель Группа 1
ТПН
(гемодиализ)
n=94 Группа 2
СКФ<60 мл/мин/1,73 м²
n=30 Группа 3
СКФ>60 мл/мин/1,73 м²
n=20 р Фекальный зонулин, нг/мл 198,5
(160,1-236,1) 157,2
(125,9-191,9) 117,5
(90,7-142,5) р˂0,001^⁕

Примечание: ^⁕ - критерий Краскела-Уоллиса для независимых выборок.

Таблица 5. Уровень фекального кальпротектина в исследуемых группах

Показатель Группа 1
ТПН
(гемодиализ)
n=80 Группа 2
СКФ˂60 мл/мин/1,73 м²
n=30 Группа 3
СКФ˃60 мл/мин/1,73 м²
n=20 р Фекальный кальпротектин, мкг/г 63,1(25,2-92,7) 32,5(22,3-74,6) 20,3(12,7-30,8) р˂0,001^⁕

Примечание: ^⁕ - критерий Краскела-Уоллиса для независимых выборок.

Таблица 6. Взаимосвязь уровня биомаркеров повышенной проницаемости кишечника с показателями, характеризующими функцию почек, у лиц с незначительно и умеренно сниженной СКФ

Фекальный зонулин Фекальный кальпротектин D-лактат Группа 2
СКФ˂60 мл/мин/1,73 м²
n=30 Креатинин r=-0,159; р=0,402 r=0,681; р˂0,001 r=-0,082; р=0,667 СКФ r=0,238; р=0,206 r=-0,735; р˂0,001 r=0,127; р=0,504 Группа 3
СКФ˃60 мл/мин/1,73 м²
n=20 Креатинин r=0,145; р=0,541 r=0,261; р=0,36 r=-0,153; р=0,52 СКФ r=0,192; р=0,418 r=-0,297; р=0,203 r=0,264; р=0,261

Примечание: направление и сила связи между показателями оценивались с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Далее в группе гемодиализных больных вариационные ряды значений сывороточного D-лактата, фекального зонулина и кальпротектина были разделены на квартили при помощи частотного анализа (таблица 7).

Таблица 7. Показатели биомаркеров гемодиализных больных в квартильных подгруппах

Показатель/квартиль Q1 Q2 Q3 Q4 Сывороточный
D-лактат, мкмоль/л 5,0
(2,6-6,6) 9,3
(8,6-11,0) 14,5
(13,3-15,8) 19,6
(18,3-21,8) Фекальный зонулин,
нг/мл 125,2
(99,1-146,9) 176
(168,4-188,5) 215,9
(206,4-225,1) 264,2
(255-286,3) Фекальный кальпротектин, мкг/г 9,6
(5,4-13,9) 50
(43,8-55,8) 79,7
(72,9-85,7) 140,8
(114,8-284,4)

При этом медианы первого квартиля D-лактата и фекального зонулина достоверно не превышали, а медиана первого квартиля фекального кальпротектина была значимо ниже аналогичных показателей лиц со СКФ>60 мл/мин/1,73 м², которые были приняты за условную норму (критерий Манна-Уитни р=0,002 для D-лактата; р=0,007 – для фекального зонулина, р<0,001 – для фекального кальпротектина). В то же время медианы второго-четвертого квартилей для всех биомаркеров были значительно выше, чем в группе контроля (р<0,001 для всех показателей). Таким образом, в случае если определенное значение какого-либо из исследуемых биомаркеров гемодиализных больных соответствовало диапазону Q1, оно расценивалось как норма и оценивалось 0 баллов. В свою очередь, значение, соответствующее диапазонам Q2, Q3 или Q4, трактовалось как повышенная проницаемость и соответственно оценивалась 1, 2 или 3 баллами в зависимости от степени повышения. Индекс проницаемости был рассчитан как сумма баллов по четырем квартилям трех показателей так, чтобы максимально возможный полученный балл был равен 9, что будет свидетельствовать о наиболее выраженных нарушениях кишечной проницаемости, а минимальный балл равен 0, что будет говорить об отсутствии нарушений проницаемости кишечника.

Оценка проницаемости эпителиального барьера кишечника с помощью предложенного способа среди 80 гемодиализных больных, у которых были определены значения всех трех биомаркеров, не выявила нарушений у 8 (10%) лиц. При этом 30 (37,5%) пациентов имели легкие, 20 (25%) – умеренно выраженные, 22 (27,5%) – тяжелые нарушения проницаемости эпителиального барьера кишечника. Медиана индекса проницаемости в исследуемой выборке составила 4 (1,25-8,5) и значимо коррелировала с уровнем С-реактивного белка (r=0,809; р<0,001). Это в очередной раз подтверждает гипотезу о том, что повышенная проницаемость кишечника с транслокацией бактерий и продуктов аномального микробного метаболизма в системный кровоток является одной из ведущих причин системного субклинического воспаления у больных с ХБП.

Таким образом, расчет индекса проницаемости на основании оценки содержания сразу трех биомаркеров, обеспечивает эффективную, неинвазивную, безопасную, быструю и доступную в повседневной клинической практике диагностику нарушений проницаемости кишечника у больных, получающих лечение гемодиализом. Хорошо известно, что модуляция нарушенной барьерной функции и проницаемости кишечника при помощи диетических вмешательств, цитопротективной терапии, различных стратегии манипулирования кишечной микробиоты, нормализации моторики кишечника и некоторых других подходов считается актуальной целью для новых методов лечения широкого круга патологий, включая заболевания почек. Следовательно, предлагаемый способ может лечь в основу профилактической и терапевтической стратегий улучшения исходов больных, получающих лечение гемодиализом.

Сущность способа поясняется примерами из клинической практики.

Клинический пример №1. Пациент Г., мужчина, 1972 года рождения. Основной диагноз: Сахарный диабет 1 типа, тяжелое течение, субкомпенсация. Диабетическая нефропатия. ХБП 5 стадии. Осложнения основного заболевания: терминальная почечная недостаточность, корригируемая программным гемодиализом с 07.07.1997 года. Анемия, смешанного генеза (вне обострения). Дисэлектролитемия. Вторичная артериальная гипертензия. Диабетическая полинейропатия. Вторичный гиперпаратиреоз, остеопороз. Формирование артерио-венозной фистулы на правом предплечье 01.07.1997 года. Сопутствующие заболевания: Закрытоугольная глаукома. Отслойка сетчатки, амавроз обоих глаз. Хронический эрозивный гастрит, ремиссия.

Госпитализирован в стационар в связи с ухудшением общего самочувствия. При поступлении предъявлял жалобы на общую слабость, повышенную утомляемость, периодическое повышение температуры тела до 37,5°С; периодические боли в околопупочной области, спастического характера, без иррадиации; на протяжение последнего месяца также отмечал неоформленный водянистый стул до 2-3 раз в день, чередующийся с эпизодами запоров.

Объективно без особенностей. Результаты лабораторного обследования: гемоглобин – 119 г/л, СОЭ – 28 мм/час, СРБ – 8,5 мг/л, креатинин – 799 мкмоль/л, мочевина – 19,4 ммоль/л, К – 6,5 ммоль/л, паратгормон – 581,5 пг/мл. Остальные показатели не изменены. УЗИ органов брюшной полости: диффузные изменения поджелудочной железы, двусторонний нефросклероз. ФГДС: поверхностный гастрит. По результатам рентгенографии органов грудной клетки, УЗИ малого таза, ФКС патологии не выявлено.

При комплексной оценке проницаемости эпителиального барьера кишечника уровень D-лактата составил 18,16 мкмоль/л, фекальный зонулин – 234,5 нг/мл, фекальный кальпротектин - 86,4 мкг/г. Согласно предложенному способу, расчетный индекс проницаемости – 7 баллов, на основании чего было сделано заключение о наличии у больного значительно выраженных нарушений проницаемости кишечника. Рекомендована терапия пробиотиками и ребамипидом. При повторном обследовании через 1 месяц на фоне рекомендованной терапии пациент отмечал улучшение общего самочувствия, отсутствие лихорадки, абдоминальный болевой синдром не беспокоил, нарушения стула не было. Уровень СРБ снизился до 4,8 мг/л, СОЭ – до 18 мм/час.

Клинический пример №2. Пациент И., женщина, 1960 года рождения. Основной диагноз: Аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек. Кисты печени. Хронический тубулоинтерстициальный нефрит. ХБП 5 стадии. Нефрэктомия слева в 1988 г. Терминальная ХПН, корригируемая хроническим гемодиализом с 27.11.2007 г. Артериовенозный протез правого плеча от 03.12.2020 г. Вторичный гиперпаратиреоз. ИБС: Атеросклеротическая болезнь сердца. Вторичная артериальная гипертензия. Риск ССО очень высокий. Ожирение 3 ст.

При ежемесячном скрининговом лабораторном обследовании выявлено повышение показателей системного воспаления: СОЭ – 65 мм/час, СРБ – 15,9 мг/л, фибриноген – 5,6 г/л при нормальном уровне лейкоцитов крови. Госпитализирована с целью уточнения диагноза.

Объективно: температура тела в норме; катаральный явлений слизистых нет; дыхание везикулярное, хрипов нет; живот мягкий безболезненный; диурез 300 мл/сут без дизурических расстройств; стул оформленный 1 раз/сут; место стояния АВ-протеза без признаков локального воспаления.

Результаты дополнительных лабораторных исследований, рентгенографии органов грудной клетки, придаточных пазух носа, ФГДС, УЗИ органов брюшной полости, малого таза, щитовидной железы, компьютерной томографии груди, живота, малого таза с контрастированием не выявили патологии, объясняющей повышение показателей системного воспаления. От проведения ФКС пациентка отказалась.

При комплексной оценке проницаемости эпителиального барьера кишечника уровень D-лактата составил 18,3 мкмоль/л, фекальный зонулин – 242,9 нг/мл, фекальный кальпротектин - 237,1 мкг/г. Согласно предложенному способу, расчетный индекс проницаемости – 9 баллов, на основании чего было сделано заключение о наличии у больного значительно выраженных нарушений проницаемости кишечника. Рекомендована терапия пробиотиками, препаратами инулина, масляной кислоты, ребамипидом.

При контрольной оценке проницаемости эпителиального барьера кишечника через месяц на фоне проводимой терапии отмечалось снижение индекса проницаемости до 4 (D-лактат – 14,91 мкмоль/л, фекальный зонулин – 194,6 нг/мл, фекальный кальпротектин – 52,97 мкг/г), сопровождающееся частичной нормализацией показателей воспаления (СОЭ – 36 мм/час, СРБ – 7,11 мг/л). Рекомендовано продолжить монотерапию пробиотиками в течение еще одного месяца. По окончанию лечения сохранялось незначительное повышение уровня СРБ до 5,2 мг/л при нормальном уровне СОЭ 15 мм/час. Нарушений проницаемости эпителиального барьера кишечника установлено не было (D-лактат – 6,55 мкмоль/л, фекальный зонулин – 144,5 нг/мл, фекальный кальпротектин – 13,93 мкг/г, индекс проницаемости – 0).

Список литературы

1. Vaziri N.D., Zhao Y.Y., Pahl M.V. Altered intestinal microbial flora and impaired epithelial barrier structure and function in CKD: the nature, mechanisms, consequences and potential treatment. Nephrol Dial Transplant. 2016;31(5):737-746. doi:10.1093/ndt/gfv095

2. Galipeau H.J., Verdu E.F. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterol Motil. 2016;28(7):957-965. doi:10.1111/nmo.12871

3. Пятченков М.О., Румянцев А.Ш., Щербаков Е.В. и др. Структурно-функциональные нарушения кишечного барьера и хроническая болезнь почек. Обзор литературы. Часть II // Нефрология. – 2022. – Т. 26, № 2. – С. 46–64. doi: 10.36485/1561-6274-2022-26-2-46-64

4. Grootjans J., Thuijls G., Verdam F. et al. Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut. World J Gastrointest Surg. 2010;2(3):61–69. https://doi.org/10.4240/wjgs.v2.i3.61

5. Schoultz I., Keita A. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 2020;9(8):1909. https://doi.org/10.3390/cells9081909.

6. Ficek J., Wyskida K., Ficek R., et al. Relationship between plasma levels of zonulin, bacterial lipopolysaccharides, D-lactate and markers of inflammation in haemodialysis patients. Int Urol Nephrol. 2017;49(4):717–725. DOI: 10.1007/s11255-016-1495-5

7. Sekino M., Okada K., Funaoka H. et al. Association between Enterocyte Injury and Mortality in Patients on Hemodialysis Who Underwent Cardiac Surgery: An Exploratory Study. J. Surg. Res. 2020;255:420–27. DOI: 10.1016/j.jss.2020.05.091

8. Swift O., Vilar E., Farrington K. Unexplained inflammation in end-stage kidney disease: Is the combination of enhanced gastrointestinal permeability and reticuloendothelial dysfunction its cause? Semin Dial. 2019;32(5):417-423. doi:10.1111/sdi.12810

9. Wang S., Lv D., Jiang S. et al. Quantitative reduction in short-chain fatty acids, especially butyrate, contributes to the progression of chronic kidney disease. Clin Sci (Lond) 2019;133(17):1857-1870. doi: 10.1042/CS20190171

10. Aquilani R., Bolasco P., Murtas S., et al. Effects of a Metabolic Mixture on Gut Inflammation and Permeability in Elderly Patients with Chronic Kidney Disease: A Proof-of-Concept Study. Metabolites. 2022;12(10):987. https://doi.org/10.3390/metabo12100987

11. Aguilera A., Bajo M.A., Espinoza M., et al. Gastrointestinal and pancreatic function in peritoneal dialysis patients: their relationship with malnutrition and peritoneal membrane abnormalities. Am J Kidney Dis. 2003;42(4):787-796. doi:10.1016/s0272-6386(03)00920-x

12. Terpstra M., Singh R., Geerlings S., Bemelman F. Measurement of the intestinal permeability in chronic kidney disease. World J Nephrol 2016;5(4):378-388. doi:10.5527/wjn.v5.i4.37

Таблица 1. Методы исследования барьерной функции и проницаемости кишечной стенки

Методика исследования Используемые средства Оцениваемый отдел ЖКТ Необходимый биологический образец Преимущества Недостатки Функциональные методы исследования кишечной проницаемости in vivo Энтеральное введение неметаболизируемых веществ различной молекулярной массы с последующей оценкой их содержания в моче/крови сахароза желудок моча/кровь - неинвазивная;
- прижизненная;
- размер зондовой молекулы позволяет предположить локализацию и механизм нарушений проницаемости - трудоемкая и времязатратная;
- сложность и малодоступность используемых методов (ВЭЖХ МС);
- отсутствуют стандартизированные протоколы;
- влияние множества сторонних факторов, затрудняющих интерпретацию результатов;
- радиоактивность для
⁵¹Cr-EDTA лактулоза/рамноза тонкая кишка моча/кровь сукралоза/эритритом толстая кишка моча/кровь полиэтиленгликоли с различной молекулярной массой 400-1000 Да все отделы кишечника моча/кровь овальбумин тонкая кишка кровь FITC-декстраны тонкая кишка кровь ⁵¹хром-этилендиаминтетрауксусной кислоты - ⁵¹Cr-EDTA все отделы кишечника моча/кровь Визуализирующие методы «Виртуальная биопсия» кишки конфокальная лазерная эндомикроскопия все отделы кишечника слизистая оболочка определенного отдела ЖКТ возможность оценки клеточной анатомии кишечного барьера в режиме реального времени - высокая стоимость оборудования Молекулярно-биологические исследования световая микроскопия
иммуногистохимия
иммунофлуоресценция
Вестерн-блот
ПЦР
электронная микроскопия все отделы кишечника биопсийный образец ткани кишки тканеспецифическая оценка клеточных и субклеточных (муцины, окклюдины, клаудины, белки zonula occludens и др.) структурных аномалий кишечного барьера - инвазивная Ex vivo/in vitro методы оценки кишечной проницаемости Оценка электрофизиологических характеристик тканей и проницаемости флуоресцентно меченых веществ камера Уссинга все отделы кишечника биопсийный образец ткани кишки,
клеточная культура - динамический мониторинг функциональных показателей,
- возможность оценки проницаемости для флуоресцентно-конъюгированных бактерии, токсинов и лекарственных средств - инвазивная;
- ограниченная жизнеспособность препарата кишки ex vivo;
- методики не отражают все сложности процессов, происходящих in vivo Клеточные культуры,
ко-культуры,
трехмерные 3D культуры Caco-2, HT29, Т84,
SK-CO15, кишечные органоиды клеточные линии, репрезентативные для эпителия тонкой и толстой кишки Биомаркеры барьерной функции и кишечной проницаемости Маркеры бактериальной транслокации Культуральные исследования и 16S секвенирование бактериальной рРНК все отделы кишечника кровь, лимфатические узлы, селезенка, печень, почки достоверный способ обнаружения аутофлоры, идентичной просветной, в других органах и тканях - инвазивная;
- сложность и малодоступность используемых методов (ПЦР) Маркеры микробного происхождения эндотоксин (ЛПС)
антитела с Core региону эндотоксина
ЛПС-связывающий белок;
КЦЖК (бутират);
D-лактат
бактериальный гемолизин
ТМАО, индоксил сульфат,
р-крезол сульфат и др. в большинстве случаев отсутствует специфичность для определенного отдела кишечника кровь
кровь
кровь/кал/моча
кровь
кал
кровь - быстрота и относительно невысокая стоимость в случае использования ИФА;
- хорошее дополнение к функциональным тестам - невысокая специфичность;
- отсутствуют стандартизация и общепринятые референсные значения;
- повышение ряда показателей характерно только для острых (мезентериальная ишемия) состояний;
- фекальные маркеры являются показателями воспаления и лишь косвенно характеризуют проницаемость;
- ряд показателей можно определить только с помощью ВЭЖХ МС Маркеры целостности эпителиальных клеток зонулин
клаудин 3
Белки, связывающие жирные кислоты (кишечная фракция, I-FABP)
цитруллин
глутатион S-трансфераза
глюкагоноподобный пептид GLP-2 кал/кровь
моча
кровь/моча
кровь
кровь/моча
кровь Другие биомаркеры альфа-1 антитрипсин
кальпротектин
липокалин 2
секреторный иммуноглобулин А (sIgA)
β-дефензин 2 кал/кровь
кал
кал
кровь
кал

Примечания: ВЭЖХ МС – высокоэффективная жидкостная хроматография масс-спекторометрия, ПЦР – полимеразная цепная реакция, ЛПС – липополисахарид, КЦЖК – короткоцепочечные жирные кислоты, ТМАО – триметиламин N-оксид.

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, гастроэнтерологии, и может быть использовано для оценки проницаемости эпителиального барьера кишечника у больных, получающих лечение гемодиализом. У пациентов в междиализный день утром натощак до приема лекарственных препаратов отбирают образцы венозной крови в пробирки с активатором коагуляции, которые оставляют на 2 часа при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Определяют концентрацию D-лактата, мкмоль/л, в полученной сыворотке методом иммуноферментного анализа. Производят исследование образцов кала после предварительной пробоподготовки. К клиническому материалу добавляют 5 мл буфера, тщательно суспендируют и центрифугируют 5 мин/2000 g. Образовавшийся супернатант проб фекалий используют для последующего анализа сразу после его приготовления. Определяют концентрацию зонулина, нг/мл, в кале методом иммуноферментного анализа, а также концентрацию кальпротектина, мкг/г. Затем оценивают значение концентрации каждого из биомаркеров в баллах от 0 до 3 в зависимости от увеличения концентраций в соответствии с таблицей 2, суммируют баллы и определяют индекс проницаемости. При значении индекса проницаемости, равном 0, определяют отсутствие нарушений проницаемости кишечника, 1-3 – незначительно повышенную проницаемость кишечника, 4-6 – умеренно повышенную проницаемость кишечника, 7-9 – значительно повышенную проницаемость кишечника. Способ обеспечивает возможность определения воспалительного процесса при калькулезном пиелонефрите после выполнения чрескожных вмешательств по удалению конкрементов в послеоперационном периоде за счет использования электрохимического исследования образца мочи, что позволяет исключить ложноположительные результаты, связанные с изменением цвета мочи после выполнения перкутанной нефролитотрипсии, не позволяющие определить форменные элементы крови в образце мочи и соответственно осуществить диагностику. 7 табл., 2 пр.

Способ оценки проницаемости эпителиального барьера кишечника у больных, получающих лечение гемодиализом, отличающийся тем, что у пациентов, получающих лечение гемодиализом, в междиализный день утром натощак до приема лекарственных препаратов отбирают образцы венозной крови в пробирки с активатором коагуляции, которые оставляют на 2 часа при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, затем определяют концентрацию D-лактата, мкмоль/л, в полученной сыворотке методом иммуноферментного анализа; затем производят исследование образцов кала после предварительной пробоподготовки, при этом к клиническому материалу добавляют 5 мл буфера, тщательно суспендируют и центрифугируют 5 мин/2000 g, образовавшийся супернатант проб фекалий используют для последующего анализа сразу после его приготовления, затем определяют концентрацию зонулина, нг/мл, в кале методом иммуноферментного анализа, а также концентрацию кальпротектина, мкг/г; затем оценивают значение концентрации каждого из биомаркеров в баллах от 0 до 3 в зависимости от увеличения концентраций в соответствии с таблицей 2, суммируют баллы и определяют индекс проницаемости, и при значении индекса проницаемости, равном 0, определяют отсутствие нарушений проницаемости кишечника, 1-3 – незначительно повышенную проницаемость кишечника, 4-6 – умеренно повышенную проницаемость кишечника, 7-9 – значительно повышенную проницаемость кишечника.