Новая композиция, содержащая аминокислоты с разветвленными боковыми цепями Российский патент 2024 года по МПК A61K31/198 A61P21/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к комбинации аминокислот с разветвленными боковыми цепями (branched-chain amino acid-BCAA) и дипептида L-аланил-L-аланина, содержащим их фармацевтическим композициям и пищевым добавкам, а также к их применению для улучшения работоспособности и восстановления во время физической активности и для применения в качестве медицинского препарата для предупреждения и/или лечения мышечной атрофии, связанной с патологическими или возрастными состояниями.

Предпосылки создания изобретения

Скелетная мышца представляет собой пластичный орган, который поддерживается несколькими путями, регулирующими клеточный и белковый обмен. Белки скелетных мышц постоянно и одновременно синтезируются и разрушаются. Количество белка в мышцах и поддержание массы скелетных мышц у зрелого индивидуума зависит от баланса чистого мышечного белка (net muscle protein balance-NBAL), разницы между синтезом белка скелетных мышц (muscle protein synthesis-MPS) и его разрушением (muscle protein breakdown-MPB). Факторы роста, гормоны, цитокины, питательные вещества и механическая нагрузка могут активировать клеточные сигнальные пути, которые способствуют синтезу или разрушению белка, что приводит к увеличению или потере, соответственно, массы скелетных мышц.

Мышцы важны не только для передвижения и поддержания осанки, но также являются крупнейшим резервуаром белка в организме и служат источником аминокислот, которые могут использоваться для выработки энергии и глюконеогенеза различными органами (включая сердце, печень и мозг) при катаболическом метаболизме.

С отрицательным балансом чистого мышечного белка связан ряд состояний. В процессе некоторых патологических состояний может иметь место повышенная активация протеолитических систем, в результате чего сократительные белки и органеллы удаляются из мышцы, что приводит к атрофии мышц. Системно мышечное истощение происходит у пожилых людей (состояние, известное как возрастное состояние саркопения), как физиологическая реакция на голодание, недоедание или неподвижность (например, послеоперационное) и при патологических состояниях, таких как нервно-мышечные дегенеративные расстройства (например, мышечная дистрофия или атрофия), хроническое обструктивное заболевание легких, кахексия, связанная с раком, диабет, почечная недостаточность, сердечная недостаточность, синдром Кушинга, сепсис, ожоговые травмы, уремия, цирроз печени и СПИД.

Чрезмерная потеря мышечной массы связана с плохим прогнозом при некоторых заболеваниях.

Потеря мышечной массы также может наблюдаться как следствие продолжительных упражнений высокой интенсивности, таких как, например, марафонский бег, который стимулирует катаболизм мышц, чтобы обеспечить аминокислоты в качестве субстрата для выработки энергии.

Спортсмены широко используют спортивные добавки, чтобы обеспечить достаточное количество углеводов и белков и, таким образом, избежать катаболизма мышц.

Незаменимые аминокислоты представляют собой биомолекулы, которые не могут быть синтезированы человеческим организмом и поэтому должны поступать с пищей. Аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (BCAA) лейцин, валин и изолейцин составляют 35% незаменимых аминокислот в мышцах и являются наиболее интенсивно потребляемыми незаменимыми аминокислотами во время занятий спортом.

Также было продемонстрировано, что концентрация незаменимых аминокислот в сыворотке может влиять на развитие и степень утомляемости, достигаемой во время соревнований на выносливость.

Кроме того, предполагается, что аминокислоты улучшают работоспособность различными способами, такими как изменение использования калорий во время упражнений и предотвращение умственной усталости (Newsholme EA et al., J Nutr. 2006, 136; 274S-6S; C.P.M. Sharp et al., Journal of Strength and Conditioning Research 2010, 24(4)/1125-1130).

В ряде исследований было продемонстрировано, что BCAA служат субстратом для синтеза белка и выработки энергии и выполняют несколько метаболических и сигнальных функций, в частности, посредством активации сигнального пути mTOR.

Эти эффекты реализуются самими BCAA, особенно лейцином, и их метаболитами. Фактически, лейцин стимулирует синтез белка через сигнальный путь mTOR и фосфорилирование факторов инициации трансляции и рибосомных белков, в то время как ингибирующее действие на протеолиз в основном опосредуется HMG (β-гидрокси-β-метилбутират) и кетокислотами с разветвленной цепью.

Интересно отметить, что в отличие от большинства аминокислот, начальный этап катаболизма BCAA происходит в скелетных мышцах, а не в печени, из-за более высокой активности в этой ткани аминотрансферазы с разветвленной цепью (BCAT), первого фермента, ответственного за катаболический путь BCAA. Это дает уникальное преимущество питательному составу на основе BCAA по сравнению с другими в отношении воздействия на улучшение функции мышц и мозга, поскольку количество циркулирующих BCAA быстро увеличивается после приема белка и становится легко доступным для внепеченочных тканей.

Ввиду вышеизложенного, добавки BCAA в настоящее время широко используются спортсменами как для ограничения развития центральной усталости, так и для поддержания здоровья мышц и анаболизма.

L-аланин представляет собой глюконеогенную аминокислоту, входящую в состав BCAA.

Friliver® Sport Performance (Dompé Farmaceutici S.p.A.) представляет собой продаваемую на рынке пищевую добавку, содержащую как BCCA, так и L-аланин, и используется для улучшения спортивных результатов и снижения утомляемости.

По-прежнему существует потребность в разработке улучшенных, более эффективных композиций, которые можно было бы использовать в качестве добавок для спортсменов. Кроме того, настоятельно ощущается необходимость разработки композиций, эффективных для предупреждения и/или лечения мышечного истощения, например, связанного с возрастным состоянием, голоданием, недоеданием, неподвижностью или патологическими состояниями.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили на моделях животных, что пероральное введение комбинации, содержащей BCAA и дипептид L-аланил-L-аланин (Ala-Ala), является особенно эффективным для улучшения функции, структуры и метаболизма мышц как в случае интенсивных тренировок, так и при тех состояниях, когда происходит истощение мышц.

Соответственно, объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (BCCA) и пептид L-аланил-L-аланин.

Еще одним объектом настоящего изобретения является указанная выше композиция для применения в качестве медицинского препарата для предупреждения и/или лечения мышечной атрофии, связанной с патологическими состояниями, возрастными состояниями, недоеданием, неподвижностью или голоданием.

Другой целью настоящего изобретения является применение указанной выше композиции в качестве пищевой добавки при физических упражнениях для улучшения мышечной деятельности, и/или восстановления, и/или для снижения мышечной усталости.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция или пищевая добавка, содержащая указанную выше комбинацию аминокислот с разветвленными боковыми цепями (BCCA) и L-аланил-L-аланин в качестве активного начала по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым или приемлемым как нутрицевтик носителем, вспомогательным веществом и/или адъювантом.

Определения

Как используется в настоящем документе, термин «аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (BCAA)» относится к аминокислотам L-изолейцину, L-лейцину и L-валину.

Как используется в настоящем документе, термин «L-аланил-L-аланин» или «Ala-Ala» обычно используется для обозначения дипептида, состоящего из двух звеньев L-аланина, соединенных амидной связью. Между тем термин «Ala» относится только к аминокислоте L-аланин.

Фигуры

На фигуре 1 показана сила передних конечностей, нормализованная по массе тела мышей, проходящих тренировочный протокол и получавших носитель, BCAA (BCAA), BCAA плюс L-аланин (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 1. (ANOVA при T3: *** BCAA+Ala-Ala в сравнении с BCAA+2Ala (p<0,005), в сравнении с BCAA (p<0,005) и в сравнении с носителем (p<0,005); ^§§ BCAA+2ALA в сравнении с носителем (p<0,01). ANOVA при T4: ** BCAA+Ala-Ala в сравнении с BCAA+2Ala (p<0,01), в сравнении с BCAA (p<0,01) и в сравнении с носителем (p<0,005); ^§§ BCAA+2ALA в сравнении с BCAA (p<0,05) и в сравнении с носителем (p<0,01).

На фигуре 2 показано содержание белка, определенное с помощью анализа Брэдфорда в гомогенатах икроножной мышцы мышей, получавших носитель, BCAA (BCAA), BCAA плюс L-аланин (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 1 (BCAA+Ala-Ala * в сравнении с носителем p<0,005; ^§ в сравнении с BCAA p<0,01; ° в сравнении с BCAA+2Ala p<0,05).

На фигуре 3 показаны уровни IgA в слюне, нормализованные к общему белку (нг/мкг) у мышей, получавших носитель, BCAA (BCAA), BCAA плюс L-аланин (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 1 (* BCAA+Ala-Ala в сравнении с носителем p<0,005; ^§ в сравнении с BCAA p<0,01; ° в сравнении с BCAA+2Ala p<0,01).

На фигуре 4 показаны уровни лактатдегидрогеназы в плазме (Ед/л) у мышей, получавших носитель, BCAA (BCAA), BCAA плюс L-аланин в массовом соотношении 1:2 (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 1. (* BCAA+Ala-Ala в сравнении с носителем p<0,005; ^§ в сравнении с BCAA p<0,01; ° в сравнении с BCAA+2Ala p<0,01).

На фигуре 5 показана площадь под кривой от 0 до 24 часов (AUC0-24ч, мкг/мл*мин) для валина (панель A), лейцина (панель B) и изолейцина (панель C), измеренная после введения мышам только BCAA (BCAA), BCAA плюс L-аланин (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 2.

На фигуре 6 показано среднее значение±SD среднее время удержания препарата (MRT) для валина (панель A), лейцина (панель B) и изолейцина (панель C), измеренного после введения мышам только BCAA (BCAA), BCAA плюс L-аланин (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 2.

На фигуре 7 показана гликемическая кривая после болюсного введения глюкозы мышам, предварительно обработанных носителем, BCAA плюс L-аланин (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 3 (BCAA+Ala-Ala в сравнении с носителем *** p<0,005; BCAA+2Ala в сравнении с носителем ^§§§ p<0,005).

На фигуре 8 показана увеличивающаяся площадь под кривой (iAUC) гликемии, измеренная через 120 минут после введения болюса глюкозы у мышей, предварительно обработанных носителем, BCAA плюс L-аланин (BCAA+2Ala) или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 3.

На фигуре 9 показаны кривые «сила-частота» (Н*мм/кг), создаваемые крутящим моментом подошвенных мышц-сгибателей у контрольных мышей и мышей, подвергшихся разгрузке задних конечностей и получавших носитель, BCAA или BCAA плюс L-аланил-L-аланин (BCAA+Ala-Ala), как описано в примере 4.

Подробное описание изобретения

Как будет продемонстрировано в экспериментальной части, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что состав, содержащий BCAA в комбинации с дипептидом L-аланил-L-аланином, особенно эффективен для улучшения функции, структуры и метаболизма мышц. Удивительно, но этот эффект наблюдается как при интенсивных тренировках, так и при патологических состояниях истощения мышц. Полученные данные также демонстрируют, что дипептид L-аланил-L-аланин значительно увеличивает абсорбцию BCAA при их пероральном введении и вызывает их преимущественное распределение в мышцах.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (BCCA) L-лейцин, L-валин и L-изолейцин в комбинации с пептидом L-аланил-L-аланином.

Предпочтительно, в указанной выше композиции массовое соотношение L-лейцин: L-валин:L-изолейцин составляет от 2:1:1 до 8:1:1.

Согласно предпочтительному варианту осуществлению изобретения L-лейцин, L-валин и L-изолейцин представлены в композиции в массовом соотношении 2:1:1, соответственно.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения L-лейцин, L-валин и L-изолейцин представлены в композиции в массовом соотношении 4:1:1.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления изобретения L-лейцин, L-валин и L-изолейцин представлены в композиции в массовом соотношении 8:1:1.

Предпочтительно, в композиции по изобретению массовое соотношение BCAA и пептида L-аланил-L-аланина составляет между 5:1 и 1:1, предпочтительно, оно составляет между 3:1 и 1,5:1, более предпочтительно, оно равно 2:1 или 1,6:1.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления в композиции по изобретению массовое соотношение L-лейцин:L-валин:L-изолейцин:L-аланил-L-аланин составляет между 2:1:1:1 и 2:1:1:3,6, более предпочтительно, оно равно 2:1:1:2,5 или 2:1:1:2.

Предпочтительно, композиция по изобретению не содержит дополнительных аминокислот или пептидов помимо BCAA и L-аланил-L-аланина.

Предпочтительно, композиция по изобретению подходит для перорального введения.

В соответствии с одним вариантом осуществления композиция согласно первому объекту изобретения представляет собой фармацевтическую композицию.

Указанная фармацевтическая композиция, предпочтительно, содержит указанные BCAA и дипептид L-аланил-L-аланин в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или адъювантом. Композиция может содержать любой из фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или адъювантов, известных в данной области. Например, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать обычные ингредиенты, такие как наполнители, связующие, смазывающие вещества, ароматизаторы, стабилизаторы, регуляторы pH, разрыхлители, консерванты.

Предпочтительно, фармацевтическая композиция по изобретению подходит для перорального введения.

Фармацевтическая композиция для перорального введения по изобретению может представлять собой твердую или жидкую композицию. Предпочтительные составы по изобретению включают фармацевтические формы, выбранные из группы, включающей гранулят, таблетку, капсулу, шипучую таблетку, пероральную суспензию, эмульсию, порошок, раствор или сироп. Наиболее предпочтительной фармацевтической формой согласно изобретению является гранулят для пероральной суспензии или растворения в жидкости, предпочтительно, в воде.

Согласно альтернативному варианту осуществления изобретения указанная композиция представляет собой пищевую добавку.

Предпочтительно, указанная пищевая добавка содержит указанные BCAA и дипептид L-аланил-L-аланин в смеси по меньшей мере с одним приемлемым носителем или вспомогательным веществом для использования человеком.

Предпочтительно, указанная пищевая добавка представлена в виде таблетки, капсулы или жидкости, более предпочтительно, она является жидкостью.

Согласно одному варианту осуществления указанная пищевая добавка может быть в виде напитка или пищевой композиции.

Предпочтительно, композиция по изобретению, предпочтительно, в виде фармацевтической композиции или диетической добавки, составлена таким образом, чтобы она содержала следующее количество BCAA и дипептида на единицу дозы: от 0,6 до 1 г, предпочтительно, 0,8 г L-лейцина, от 0,3 до 0,5 г, предпочтительно, 0,4 г L-изолейцина, от 0,3 до 0,5 г, предпочтительно, 0,4 г L-валина и от 0,5 г до 1,5 г, предпочтительно, от 0,8 г до 1,5 г, более предпочтительно, 0,8 г L-аланил-L-аланина.

Вторым объектом изобретения является описанная выше композиция для использования в качестве медицинского препарата.

Как показано в экспериментальном разделе, композиция по настоящему изобретению при введении значительно улучшает нервно-мышечную функцию подошвенной мышцы-сгибателя на животной модели мышечного истощения.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления вышеуказанная композиция предназначена для использования для предупреждения, облегчения и/или лечения мышечного истощения, связанного со следующим:

i. патологические состояния, предпочтительно, выбранные из группы, включающей нервно-мышечные дегенеративные нарушения, такие как мышечная дистрофия или мышечная атрофия; хроническое обструктивное заболевание легких; кахексия, связанная с раком; диабет; почечная недостаточность; сердечная недостаточность; синдром Кушинга; сепсис; ожоговые травмы; уремия; цирроз печени и СПИД;

ii. возрастное состояние, предпочтительно, саркопения; или

iii. недоедание, неподвижность или голодание.

Во всех вышеперечисленных применениях композицию по изобретению, предпочтительно, вводят два раза в день.

Как показано в экспериментальном разделе, композиция по изобретению особенно полезна для введения до, во время или после физических упражнений для улучшения мышечной деятельности и/или восстановления, и/или для снижения мышечной усталости.

Соответственно, третьим объектом изобретения является применение вышеупомянутой композиции, предпочтительно, в качестве пищевой добавки, до, во время и после физических упражнений.

Следующим объектом изобретения является применение вышеуказанной композиции для улучшения мышечной деятельности и/или восстановления, и/или для уменьшения мышечной усталости до, во время или после физических упражнений.

При указанном выше применении композицию вводят в виде однократной дозы от 0,6 до 1 г, предпочтительно, 0,8 г L-изолейцина, от 0,3 до 0,5 г, предпочтительно, 0,4 г L-изолейцина, от 0,3 до 0,5 г, предпочтительно, 0,4 г L-валина и от 0,5 г до 1,5 г, предпочтительно, от 0,8 г до 1,5 г, более предпочтительно, 0,8 г L-аланил-L-аланина по мере необходимости.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Все эксперименты проводились в соответствии с принятыми в Италии рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных (D.L, 116/92) и Европейской директивой (2010/63/UE). Исследование относится к исследованиям, одобренными национальным этическим комитетом по вопросам благополучия животных Министерства здравоохранения Италии в том, что касается этических вопросов и соблюдения закона. Большинство экспериментальных процедур, используемых в настоящем исследовании, одобрены международными научными сетями, работающими на животных моделях нервно-мышечных заболеваний (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/SOPs/).

Статистика

Все экспериментальные данные были выражены как среднее значение±стандартная ошибка среднего (SEM). Ряд статистических сравнений между группами был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорной коррекцией t-критерия Бонферрони, когда нулевая гипотеза была отвергнута (p<0,05), чтобы дать возможность лучше оценить внутри- и межгрупповую изменчивость и избежать ложноположительных результатов. При необходимости проводили однократные сравнения двух средних значений (модифицированные составы в сравнении с носителем или в сравнении со стандартным составом).

Пример 1. Эффективность состава во время тренировки

a) Экспериментальные группы и протокол

В исследовании использовали самцов мышей C57BL/6J дикого типа (WT) в возрасте 10 недель, приобретенных у компании Charles River (Calco, Италия). Все мыши были акклиматизированы в течение одной недели в помещении для животных до начала экспериментального протокола; затем они были включены в каждую группу лечения на основании их массы тела и абсолютных и нормированных значений силы захвата передними конечностями, чтобы создать однородные когорты в начале исследования.

Эксперименты, сбор и анализ данных проводились экспериментаторами вслепую.

Мышей разделяли на следующие группы:

1. Контрольная группа (n=5):

Мышей не подвергали протоколу физических упражнений и поили носителем;

2. Группа носителя (n=5):

Мышей подвергали протоколу физических упражнений, описанному ниже, и поили носителем (фильтрованной водопроводной водой).

3. Группа BCAA (n=8):

Мышей подвергали протоколу физических упражнений, описанному ниже, и поили водным раствором, содержащим смесь L-лейцина, L-валина и L-изолейцина в массовом соотношении 2:1:1. Каждая мышь получала общее количество 328 мг/кг L-лейцина, 164 мг/кг L-валина и 164 мг/кг L-изолейцина.

4. Группа BCAA и L-Ala (n=8):

Мышей подвергали протоколу физических упражнений, описанному ниже, и поили водным раствором смеси L-лейцина, L-валина, L-изолейцина и L-аланина в массовом введении 2:1:1:2. Каждая мышь получала в общей сложности 328 мг/кг L-лейцина, 164 мг/кг L-валина, 164 мг/кг L-изолейцина и 328 мг/кг L-аланина.

5. BCAA и L-Ala-L-Ala (n=8):

Мышей подвергали протоколу физических упражнений, описанному ниже, и поили водным раствором, содержащим смесь L-лейцина, L-валина, L-изолейцина и дипептида L-аланил-L-аланина в массовом соотношении 2:1:1:2. Каждая мышь получала в общей сложности 328 мг/кг L-лейцина, 164 мг/кг L-валина, 164 мг/кг L-изолейцина и 328 мг/кг L-аланил-L-аланина.

Водные растворы, используемые для групп с 3 по 5, получали растворением аминокислот и дипептида в фильтрованной водопроводной воде для получения желаемой конечной концентрации. Это осуществляли путем прямого приготовления с учетом еженедельного количества воды, потребляемой каждой мышью, и ее массы тела.

Группы мышей от 2 до 5 подвергали следующему протоколу физических упражнений.

Подробно, всех мышей заставляли бегать на горизонтальной моторной беговой дорожке (Columbus Instruments, США) в соответствии со следующим двухфазным графиком:

Фаза 1: она состояла из 3 недель тренировок перед лечением (45 минут, 5 дней в неделю), чтобы заставить мышей адаптироваться к процедуре, постепенно достигая целевой нагрузки. Всех мышей заставляли бегать, начиная с 5-минутной разминки со скоростью 5 м/мин, а затем увеличивая скорость на 1 м/мин каждую минуту до достижения максимальной скорости, которая сохранялась до конца упражнения. Максимальная скорость увеличивалась еженедельно до достижения целевой скорости 25 м/мин.

Фаза 2: эта фаза состояла из 4 недель тренировок (45 мин, 5 дней в неделю) с максимальной нагрузкой, начиная с 15-минутной разминки со скоростью 10 м/мин, а затем увеличивая скорость на 1 м/мин каждую минуту, достигая максимальной скорости 25 м/мин, которая сохранялась до конца упражнения.

Обработка водой (группа 2) или разными растворами (группы 3-5) проводилась параллельно с фазой 2.

На протяжении всего исследования всех мышей поддерживали на контролируемой диете с ежедневным количеством корма 4-5 г/мышь.

b) Анализ показателей у мышей

i. Способы

У животных собирали показатели in vivo и ex vivo.

Сбор показателей in vivo

Во время выполнения протокола упражнения отслеживались следующие данные:

1. Изменения массы тела и потребление воды

2. Сила захвата передними конечностями

В день 0 (T0), 7 (T1), 14 (T2), 21 (T3) и 28 (T4) фазы 2 протокола упражнений сила передних конечностей измерялась для каждой мыши с помощью измерителя силы захвата (Columbus Instruments, США). Для статистического анализа использовалась максимальная сила (абсолютная и нормализованная к массе тела), развиваемая против осторожного высвобождения от захвата в 5 определениях/животное.

3. Определение уровня IgA в слюне in vivo с помощью иммуноферментного анализа (ELISA)

Образцы слюны собирали из ротовой полости каждой мыши с помощью микропипетки через ~5 минут после внутрибрюшинной инъекции пилокарпина для стимуляции секреции слюны (1 мг/кг, Sigma-Aldrich, США). Затем слюну сразу помещали в микроцентрифужные пробирки, содержащие PMSF (Sigma-Aldrich, США) для ингибирования протеаз, и хранили на льду. Пробы осветляли центрифугированием при 16000×g в течение 10 мин при температуре 4°C; супернатант хранили при температуре -80°C до проведения анализов. Уровни IgA в слюне определяли количественно с использованием набора для ELISA Mouse IgA Ready-SET-Go! (eBioscience, Вена, Австрия), согласно протоколу производителя.

4. Определение уровня лактатдегидрогеназы (LDH) в плазме с помощью спектрофотометрии

Пункцией левого желудочка сердца с помощью гепаринизированного инсулинового шприца брали кровь и собирали в гепаринизированные пробирки. Образцы обрабатывали в течение 30 минут после сбора. Бедную тромбоцитами плазму получали после двух последовательных этапов центрифугирования (20 минут, 4000 об/мин, 4°C; 10 минут, 12000 об/мин, 4°C). Активность лактатдегидрогеназы (LDH) определяли с помощью имеющихся в продаже наборов (CK NAC LR и LDH LR, SGM, Италия). Инструмент был настроен на длину волны 340 нм при 37°C.

Сбор показателей ex vivo

В конце 4 недели фазы 2 животных анестезировали внутрибрюшинно комбинацией кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг) и умерщвляли. У каждой мыши отрезали икроножные и большеберцовые мышцы и замораживали до анализа.

Эти образцы хранили при температуре -80°C, чтобы использовать их для запланированных оценок конечных точек. Проводили следующий анализ:

1. Определение содержания белка в икроножной мышце с помощью анализа Брэдфорда

Буфер, используемый в анализе, состоял из следующих ингредиентов, растворенных в 100 мл воды: 1 мл Triton X-100, 2 мл Tris HCl pH8, 2,74 мл NaCl (5M), 10 мл глицерина, 1 мл EDTA 0,5 M pH 8. Перед использованием добавляли PMSF (ингибитор протеазы) 100 мМ в EtOH. Икроножные мышцы гомогенизировали в буфере с разведением 1/5 мас./об. (г/мл) с использованием пробирки CK14 (набор Precellys Lysing) с гомогенизатором Bertin. Затем после гомогенизации образцы центрифугировали и лизаты анализировали для количественного определения общего белка. Определение содержания белка проводили с помощью теста Брэдфорда согласно следующему протоколу: 1) в планшет добавляли 250 мкл бриллиантового синего; 2) образцы исследовали при разведении 1:10, и они были вне диапазона калибровки, поэтому были разведены 1:20 в физиологическом растворе и исследованы повторно; 3) в планшет добавляли пять мкл физиологического раствора (раствор сравнения), 5 мкл образцов. Калибровку проводили в трех экземплярах, а также на образцах; 4) образцы встряхивали 30 сек; 5) планшет инкубировали 10 мин при комнатной температуре; 6) планшет считывали при 595 нм.

ii. Полученные результаты

1. Самочувствие и масса тела

Все мыши прошли протокол упражнений/лечения без каких-либо признаков стресса (отсутствие аппетита, аномальная потеря массы тела, выпадение волос, стереотипное или агрессивное поведение и т. д.) или макроскопических изменений жизненно важных функций. Никаких значительных изменений в массе тела животных, подвергшихся лечению или нет, не наблюдалось в течение всего экспериментального окна.

2. Сила захвата передними конечностями

Значения максимальной силы передних конечностей, нормированные на массу тела, измеренную в каждую неделю, показаны на фигуре 1.

При T0 значения разных экспериментальных групп существенно перекрывались.

От T1-T4 все мыши, получавшие BCAA, BCAA и L-аланин, BCAA и L-аланил-L-аланин, показали более высокие значения силы по сравнению с мышами, получавшими носитель.

Добавление L-аланина или L-аланил-L-аланина к BCAA приводило к укреплению передних конечностей.

При T3 и T4 мыши, получавшие BCAA и L-аланил-L-аланин, были значительно сильнее по сравнению с мышами, получавшими BCAA и L-аланин (фигура 1).

Эти данные показывают, что добавка L-аланил-L-аланина улучшает функцию и силу мышц после лечения: это демонстрирует, что состав эффективен для защиты от мышечной слабости как при физиологических, так и при патологических состояниях,

3. Определение содержания белка в мышцах

Гомогенаты икроножных мышц, проанализированные с помощью анализа Брэдфорда, показали значительное увеличение общего содержания белка во всех обработанных группах по сравнению с носителем (125±13 мг/г ткани). В частности, группа, получавшая BCAA и L-аланил-L-аланин (192±8 мг/г ткани), показала более высокое содержание белка по сравнению с группой, получавшей BCAA и L-аланин (162±18 мг/г ткани), и группой, получавшей BCAA (142±10 мг/г ткани).

Данные представлены на фигуре 2 в виде среднего значения±SEM

Эти данные показывают, что добавка L-аланил-L-аланина увеличивает содержание мышечного протеина: это может привести к сохранению мышечной массы, что может благоприятно сказаться на функциональном восстановлении пораженных скелетных мышц.

4. Уровни IgA в слюне

IgA представляют собой маркеры, указывающие на уровень воспаления верхних дыхательных путей. Уровни IgA в образцах слюны, собранных непосредственно перед умерщвлением каждой мыши, показаны нормализованными к значениям общего белка (нг/мкг) на фигуре 3. Уровни IgA в слюне мышей, получавших BCAA, BCAA и L-аланин, BCAA и L-аланил-L-аланин, были значительно снижены по сравнению с мышами, получавшими носитель. Уровни IgA у мышей, получавших BCAA и L-аланил-L-аланин были значительно ниже по сравнению с мышами любой другой группы.

Эти данные показывают, что добавки с BCAA и L-аланил-L-аланином имеют улучшенную эффективность по сравнению с BCAA и L-аланином в защите мышц от истощения при патологических состояниях и для предотвращения начала перетренированности.

5. Уровень лактатдегидрогеназы (LDH) в плазме

Концентрация ферментов LDH в плазме, оцененная в образцах плазмы мышей, показана на фигуре 4. Все три обработки показали четкую и значительную тенденцию к снижению уровней LDH в плазме по отношению к носителю. Уровни LDH у мышей, получавших BCAA и L-аланил-L-аланин были значительно ниже по сравнению с ними у мышей любой другой группы.

Эти данные показывают, что добавки с BCAA и L-аланил-L-аланином имеют улучшенную эффективность по сравнению с BCAA и L-аланином в защите структурной целостности и метаболизма скелетных мышц во время длительных упражнений.

Пример 2. Фармакокинетическое исследование

Целью исследования было сравнить воздействие L-лейцина-¹³C6, ¹⁵N, L-изолейцина-¹³C6, ¹⁵N, L-валина-¹³C5, ¹⁵N в плазме после их введения отдельно или в сочетании с L-аланином или L-аланил-L-аланином у мышей. Образцы плазмы анализировали путем очистки и дериватизации с использованием набора для анализа аминокислот EZfaast^TM (Phenomenex) и анализировали с помощью UPLC-MSMS.

i. Способы

Животные и обслуживание

В этом исследовании использовались мыши CD1 с массой тела 25-30 г на момент лечения, приблизительный возраст составлял около 4 недель в соответствии с кривой роста. Изначально животные поставлялись компанией Harlan, Италия. После получения от поставщика животных подвергали медицинскому освидетельствованию и приемке. Животных содержали группами по пять в подходящих для данного вида клетках. Акклиматизация животных к местным условиям содержания продолжалась около 5 дней. Животных обычно содержали в следующих условиях, за исключением коротких периодов времени, когда экспериментальные процедуры требовали иного. Животных размещали в отдельной эксклюзивной комнате с кондиционером, обеспечивающим как минимум 15 воздухообменов в час. Контроль окружающей среды был установлен для поддержания температуры в области 22ºC и относительной влажности в диапазоне от 50 до 60% с приблизительно 12-часовым циклом освещения и 12-часовым циклом темноты, которые контролируются автоматически. Пища (рацион Mucedola Standard GLP) и вода были доступны в неограниченном количестве на протяжении всего исследования. Всех животных взвешивали в день каждой обработки и случайным образом распределяли в группы, однозначно идентифицируемые с помощью цветного спрея на спине перед экспериментом. Клинические признаки контролировались через регулярные промежутки времени на протяжении всего исследования, чтобы оценить кукую-либо реакцию на лечение. Эксперимент проводился в соответствии с итальянским законодательством (D. L.vo 26/2014). Образцы крови (50-60 мкл) собирали в гепаринизированные пробирки типа Эппендорф (Heparin Vister 5000 IU/ml), осторожно перемешивали и сразу помещали на лед; затем пробирки типа Эппендорф центрифугировали (3500×g, при 4°C в течение 15 мин), полученную плазму собирали и переносили в однозначно помеченные пробирки типа Эппендорф и замораживали при -80°C до анализа. В конце исследования животных умерщвляли путем обескровливания под глубокой анестезией изофлураном.

Группы и дозы

Голодных животных разделяли на 4 группы по 6 мышей в каждой, и разные группы подвергались следующим обработкам. Вводимый объем составлял 15 мл/кг, в то время как носитель, используемый для исследования, представлял собой 1,5%-ный водный раствор лимонной кислоты.

1) Группа BCAA:

L-лейцин-¹³C6, ¹⁵N 328 мг/кг; L-изолейцин-¹³C6, ¹⁵N 164 мг/кг; L-валин-¹³C5, ¹⁵N 164 мг/кг.

2) Группа BCAA+Ala:

L-лейцин-¹³C6, ¹⁵N 328 мг/кг; L-изолейцин-¹³C6, ¹⁵N 164 мг/кг; L-валин-¹³C5, ¹⁵N 164 мг/кг и L-аланин 328 мг/кг.

3) Группа BCAA+Ala-Ala

L-лейцин-¹³C6, ¹⁵N 328 мг/кг; L-изолейцин-¹³C6, ¹⁵N 164 мг/кг; L-валин-¹³C5, ¹⁵N 164 мг/кг плюс L-аланин 328 мг/кг.

График отбора крови и режим кормления

Животных не кормили с ночи перед введением, и пищу снова помещали в клетки через 3 часа после введения. Последовательный отбор образцов через 15 минут, 30 минут, 1 час, 3 часа, 8 часов, 24 часа производили с отбором примерно 50-60 мкл крови в каждый момент времени.

ii. Полученные результаты

AUC±SD для каждой отдельной меченой аминокислоты вычисляли для интервалов времени 0-24 часа и они представлены на фигурах 5A, B и C. Среднее значение±SD среднего времени удержания препарата (MRT) для каждой меченой аминокислоты указано на фигурах 6A, B и C.

Концентрации в плазме меченых аминокислот значительно увеличивались при введении аланина и L-аланил-L-аланина, причем последний показал самые высокие концентрации (фигура 5A, B, C). Средние значения времени пребывания были значительно увеличены по сравнению с группой BCAA, при этом у мышей, получавших BCAA плюс L-аланил-L-аланин, были показаны самые высокие значения. Среди трех групп не было различий по другим рассчитанным фармакокинетическим параметрам (Cmax, Tmax и T1/2).

Пример 3. Пероральный тест на толерантность к глюкозе на мышах

Тест пероральной толерантности к глюкозе (OGTT) оценивали на мышах, предварительно обработанных пероральным введением 15 мл/кг носителя (1,5% мас./мас. водный раствор лимонной кислоты) или композиции BCAA плюс L-аланин или BCAA плюс L-аланил-L-аланин в дозах, описанных в примере 1 и растворенных в 1,5% мас./мас. водном растворе лимонной кислоты. Объем введения каждого раствора составлял 15 мл/кг. Мышей подвергали голоданию в течение ночи, взвешивали, и каждый из указанных выше препаратов вводили перорально, как описано выше.

Через сорок пять минут после перорального введения предварительной обработки мышам перорально вводили болюс 20% глюкозы (2 мг/г массы тела) и измеряли гликемию крови в моменты времени -45', 0', 15', 30', 60', 90' и 120' отбором крови из хвостовой вены с помощью портативного глюкометра (Johnson & Johnson).

На фигуре 7 показаны гликемические кривые, полученные у мышей при каждой из предварительных обработок. После болюсного введения глюкозы мыши, получавшие BCAA плюс L-аланил-L-аланин, показали значительно более низкие уровни гликемии через 15, 30 и 60 минут, тогда как в случае BCAA плюс L-аланин было показано значительное снижение гликемических уровней только через 15 минут.

Полученные данные продемонстрировали более сильную способность (то есть его эффективность в большем количестве временных точек) L-аланил-L-аланина по сравнению с L-аланином по улучшению толерантности к глюкозе у мышей.

Затем рассчитывали дополнительную площадь под кривой для отклонения уровня глюкозы в крови от t=0 до t=120 минут (iAUC0-120) и она показана на фигуре 8.

Как видно на фигуре, введение BCAA плюс L-аланил-L-аланина значительно влияло на толерантность к глюкозе по сравнению с мышами, которым вводили носитель и BCAA плюс L-аланин.

Эти данные показывают, что пероральное введение BCAA плюс L-аланил-L-аланин вызывало улучшение толерантности к глюкозе у здоровых мышей C57BL/6. Это соответствует данным, полученным в фармакокинетическом исследовании, показывающим, что L-аланил-L-аланин увеличивает воздействие BCAA по сравнению с L-аланином. Следовательно, это повышение уровня BCAA в плазме приводило к увеличению секреции инсулина после болюсного введения глюкозы, что приводило к снижению содержания глюкозы в плазме. В заключение было продемонстрировано более сильное снижение уровня глюкозы в плазме у дипептида L-аланил-L-аланина по сравнению с L-аланином.

Пример 4. Доклиническая оценка эффективности улучшения мышечной функции на мышиной модели мышечной атрофии (HU-мышь)

i Способы

Эксперименты проводились в соответствии с принятыми в Италии рекомендациями по использованию лабораторных животных (Italian legislative decree 2014 n.26), который соответствует Директиве Европейского Союза по защите экспериментальных животных (2011/63/EU), и одобренными Министерством здравоохранения Италии (DM № 133/2000-B).

Взрослых мышей-самцов C57BL/6J (в возрасте 12-14 недель) приобретали у компании Charles River (Calco, Италия). Мышей разделяли на 4 группы по 8 животных, одна контрольная группа и 3 группы с разгруженными задними конечностями (HU). Подробно:

Контрольная группа:

мышей содержали отдельно в контрольных условиях в течение 4 недель.

Группы с разгруженными задними конечностями (HU):

Был использован протокол разгрузки мышц, аналогичный тому, который использовался ранее для крыс HU (Pierno S, et al. J Physiol 2007;584:983-95). В частности, в специальных клетках животных индивидуально подвешивали на 2 недели. Тонкую веревку одним концом прикрепляли с помощью пластыря к хвосту, а другим концом к верху клетки. Длину веревки регулировали так, чтобы животные могли свободно перемещаться на передних конечностях, при этом тело располагалось под углом 30-40º относительно горизонтальной плоскости. Все мыши получали воду без ограничений и получали стандартный корм для грызунов в течение 8 г в день. Пищу, оставшуюся на следующий день, взвешивали для расчета ежедневного потребления пищи.

Различные группы HU обрабатывались следующим образом:

Носитель: мышей размещали отдельно на 4 недели, и в течение последних 2 недель разгружали задние конечности. В этот период они получили носитель (воду).

BCAA: мышей размещали отдельно в течение 4 недель, они получали BCAA (L-лейцин 328 мг/кг; L-изолейцин 164 мг/кг; L-валин 164 мг/кг) один раз в день в течение 4 недель, и разгружали задние конечности в течение последних 2 недель.

BCAA+Ala-Ala: мышей размещали отдельно на 4 недели, они получали смесь BCAA плюс L-аланил-L-аланин (L-лейцин 328 мг/кг; L-изолейцин 164 мг/кг; L-валин 164 мг/кг плюс L-аланил-L-аланин 328 мг/кг) один раз в день в течение 4 недель, и разгружали задние конечности в течение последних 2 недель.

Каждый состав был приготовлен путем растворения порошка в фильтрованной водопроводной воде для получения конечной концентрации. Это было получено путем прямого приготовления, учитывая еженедельное количество воды, потребляемой каждой мышью, и массу ее тела. Продолжительность лечения составила 4 недели.

Животных с HU обследовали ежедневно в течение всего периода HU на предмет поведения, чистоты, состояния волос и глаз, потребления пищи и воды. Ежедневное потребление пищи измеряли как среднее значение количества коммерческой пищи (в граммах), съедаемой каждый день в течение 14 дней мышами, принадлежащими к группам CTRL и HU. Мышам давали стандартное количество пищи (10 г) каждое утро, а оставшуюся пищу взвешивали утром следующего дня. Суточное потребление получали путем вычитания, и для каждого животного было рассчитано среднее суточное потребление за 14 дней. Окончательный результат представлял собой среднее значение±SEM для n животных в каждой экспериментальной группе. В конце периода лечения мышей взвешивали и подвергали глубокой анестезии внутрибрюшинной инъекцией уретана (1,2 г/кг массы тела), чтобы можно было удалить скелетные мышцы задних конечностей, которые представляют собой камбаловидную мышцу (Sol), длинный разгибатель пальцев (Extensor Digitorum Longus (EDL)) и икроножную мышцу (Gas). Эти мышцы сразу использовали для электрофизиологических и функциональных исследований или замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80ºC для дальнейшего биохимического анализа экспрессии генов. После операции животных усыпляли передозировкой уретана. Были приложены все усилия, чтобы минимизировать страдания животных.

Протокол крутящего момента in vivo

Максимальный изометрический крутящий момент группы подошвенных мышц (GC и камбаловидная мышцы) in vivo оценивали в различные моменты времени при хронической физической нагрузке или активности в клетке. Мышей анестезировали путем ингаляции (~4% изофлурана и 1,5% O₂ л/мин) и помещали на термостатируемый стол; анестезию поддерживали через носовой конус (~2% изофлурана и 1,5% O₂ л/мин). Правую заднюю конечность брили и обрабатывали в асептических условиях, и ступню помещали на педаль, соединенную с серводвигателем (модель 300C-LR; Aurora Scientific, Aurora, ON, Канада). Сокращения вызывали чрескожной электрической стимуляцией большеберцового нерва с помощью игольчатых электродов (Chalgren Enterprises), подключенных к стимулятору (модель 701B; Aurora Scientific), чтобы вызвать сокращение группы подошвенных мышц-сгибателей. Ток регулировали от 30 до 50 мА до достижения максимального изометрического крутящего момента. Затем выполнялась серия стимуляций с возрастающими частотами: 1, 10, 30, 50, 80 и 100 Гц с последовательностью импульсов 200 мс. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Dynamic Muscle Analysis (DMAv5,201; Aurora Scientific) для получения крутящего момента, который был нормализован по массе тела мыши. Нормализованные значения использовали для построения кривых крутящего момента от частоты.

ii. Полученные результаты

Самочувствие и масса тела

Все мыши прошли протокол упражнений/лечения без каких-либо признаков стресса (отсутствие аппетита, аномальная потеря массы тела, выпадение волос, стереотипное или агрессивное поведение и т. д.) или макроскопических изменений жизненно важных функций. Никаких значительных изменений в массе тела животных, подвергшихся лечению или нет, не наблюдалось в течение всего экспериментального окна.

Крутящий момент in vivo

Нервно-мышечную функцию in vivo оценивали путем измерения крутящего момента, создаваемого подошвенными мышцами-сгибателями задней конечности у анестезированных мышей, независимо от желания животного. Как показано на фигуре 9, мыши, получавшие BCAA плюс L-аланил-L-аланин, имели значительно более высокую кривую частоты крутящего момента среди обработанных групп. В частности, было обнаружено, что максимальное значение крутящего момента, создаваемого на частоте 100 Гц, практически перекрывало значение для группы малоподвижных мышей (398±7 в сравнении с 379±8 Н*мм/кг; n=8).

Измерения крутящего момента у анестезированных животных подтвердили состояние неиспользования мышц (то есть слабость) у мышей с разгруженными задними конечностями по сравнению с контрольной группой.

Кроме того, данные ясно показывают, что лечение BCAA плюс L-аланил-L-аланином улучшает нервно-мышечную функцию подошвенного сгибателя (в основном GC и камбаловидной мышцы) по отношению к носителю и BCAA, и со значениями силы крутящего момента, близкими к наблюдаемые для контрольной группы.

Группа изобретений относится к композиции для улучшения функции, структуры и метаболизма мышц, содержащей аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (BCCA) L-лейцин, L-валин и L-изолейцин в комбинации с пептидом L-аланил-L-аланином, где массовое соотношение L-лейцин:L-валин:L-изолейцин:L-аланил-L-аланин составляет между 2:1:1:1 и 2:1:1:3,6, также относится к применению композиции для предупреждения, облегчения и/или лечения мышечного истощения, связанного со следующим: i) патологические состояния, включающие нервно-мышечные дегенеративные нарушения, такие как мышечная дистрофия или мышечная атрофия; хроническое обструктивное заболевание легких; кахексия, связанная с раком; диабет; почечная недостаточность; сердечная недостаточность; синдром Кушинга; сепсис; ожоговые травмы; уремия; цирроз печени и СПИД; ii) возрастное состояние, включающее саркопению; или iii) недоедание, неподвижность или голодание, и также относится к применению композиции для улучшения мышечной работоспособности, и/или восстановления, и/или для уменьшения мышечной усталости до, после или во время физических упражнений. Группа изобретений обеспечивает особенно эффективное улучшение функции, структуры и метаболизма мышц за счет использования состава, содержащего аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (BCAA) в комбинации с дипептидом L-аланил-L-аланином. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 пр.

1. Композиция для улучшения функции, структуры и метаболизма мышц, содержащая аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (BCCA) L-лейцин, L-валин и L-изолейцин в комбинации с пептидом L-аланил-L-аланином, где массовое соотношение L-лейцин:L-валин:L-изолейцин:L-аланил-L-аланин составляет между 2:1:1:1 и 2:1:1:3,6.

2. Композиция по п.1, где массовое соотношение L-лейцин: L-валин:L-изолейцин:L-аланил-L-аланин составляет 2:1:1:2,5 или 2:1:1:2.

3. Композиция по п.1 или 2, которая является фармацевтической композицией.

4. Композиция по любому из пп.1-3 для перорального введения.

5. Композиция по любому из пп.1-4, содержащая следующие количества BCAA и дипептида на стандартную дозу: между 0,6 и 1 г L-лейцина, между 0,3 и 0,5 г L-изолейцина, между 0,3 и 0,5 г L-валина и от 0,5 г до 1,5 г L-аланил-L-аланина.

6. Композиция по п.5, содержащая следующие количества BCAA и дипептида на стандартную дозу: 0,8 г L-лейцина, 0,4 г L-изолейцина, 0,4 г L-валина и 0,8 г L-аланил-L-аланина.

7. Применение композиции по пп.1-6 для предупреждения, облегчения и/или лечения мышечного истощения, связанного со следующим:

i) патологические состояния, включающие нервно-мышечные дегенеративные нарушения, такие как мышечная дистрофия или мышечная атрофия; хроническое обструктивное заболевание легких; кахексия, связанная с раком; диабет; почечная недостаточность; сердечная недостаточность; синдром Кушинга; сепсис; ожоговые травмы; уремия; цирроз печени и СПИД;

ii) возрастное состояние, включающее саркопению; или

iii) недоедание, неподвижность или голодание.

8. Применение композиции по пп.1-6 для улучшения мышечной работоспособности, и/или восстановления, и/или для уменьшения мышечной усталости до, после или во время физических упражнений.