Способ оценки эффективности радиозащитных лекарственных средств с использованием гуманизированных мышей Российский патент 2024 года по МПК G01N33/577 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно, к исследованию биологических материалов, в частности, крови и может использоваться в радиационной медицине, фармакологии.

Проблема заключается в следующем.

Экспериментальные модели для доклинических исследований являются очень важным инструментом в разработке новых лекарственных средств. Однако доклинические модели на животных из-за видоспецифических отличий часто недостаточно отражают физиологическую ситуацию у людей, что впоследствии приводит к неудачам лечения в клинических испытаниях. Особенно важным это является при проведении доклинических исследований радиозащитных средств, когда очень сложно организовать клинические исследования на II-IV стадиях клинических исследований вследствие редкой встречаемости острого радиационного синдрома. Поэтому доклинические исследования, где в качестве модели рассматриваются системы человека in vivo, в модели ксенотрансплантации, дают существенные преимущества, поскольку позволяют оценивать действие исследуемых препаратов на клетки человека in vivo.

В литературе описаны подходы к применению иммунодефицитных мышей с трансплантированными опухолями или опухолевыми клетками человека (ксенографтами) в доклинических исследованиях противоопухолевых средств (Wege, А.K., 2018; Cogels MM. et al. 2021; Gauthier L.M., 2022; Gbyli R. et al., 2020; Park N. et al., 2020). Однако опухолевые ксенографты не могут быть применены для доклинических исследований радиозащитных средств.

Известен «Подкожный ксенографт клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека mel Rac с мутацией NRAS для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств», представленный в п. РФ №2651939 С2.

Известный способ характеризуется следующей формулой: «Применение подкожного ксенографта клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека mel Rac с мутацией гена NRAS и с адаптацией к росту со стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c nude для доклинического изучения таргетных противоопухолевых средств».

Недостатком известного способа является то, что опухолевый ксенографт клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека не является адекватной моделью для доклинических исследований радиозащитных средств. В организме человека при облучении в дозах до 10 Гр критическим является повреждение гемопоэтических стволовых клеток и других клеток системы кроветворения и иммунной системы.

Недостатком известных способов является невозможность создать модель радиационного поражения кроветворной системы человека, наиболее чувствительной к действию ионизирующего излучения. Именно на защиту кроветворной системы и ее восстановление после облучения должно быть направлено действие радиозащитных средств.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ использования мышей линии NOD SCID в качестве модели для радиобиологических исследований клеток человека in vivo, представленный в ст. Атаманюк Н.И. и др. «Радиационная индукция фокусов γ-Н2АХ в лимфоцитах человека в моделях in vitro и in vivo при ксенотрансплантации NOD SCID мышам» в журн. «Вопросы радиационной безопасности», 2019 г., №4, стр. 44-54 и выбранный в качестве прототипа (см. Приложение к заявке).

Известный способ заключается в следующем. Берут человека - донора, производят забор у него периферической крови, из которой выделяют лейкоциты, затем клетки от каждого донора вводят внутрибрюшинно двум мышам NOD SCID (линия СВ17-Prkdcscid/NcrCrl). Животные после инъекции человеческих клеток содержат в условиях SPF-вивария в течение 21 дня. Животных облучают в дозе 10 Гр через 21 день после введения клеток человека. Первой из двух мышей, получивших инъекцию клеток от одного и того же донора, вводят радиозащитный препарат (меркамин) внутрибрюшинно в дозе 205 мг/кг за 15 мин до облучения, вторую мышь с клетками того же донора облучают без радиопротектора. Через 30 мин и через 120 мин после облучения у мышей отбирают периферическую кровь из хвостовой вены, окрашивают клетки крови для подсчета числа человеческих CD45+клеток и измерения интенсивности флюоресценции антител γ-Н2АХ в клетках человека. Через 2 часа после облучения животных забивают, извлекают селезенки, гомогенизируют и окрашивают человеческие CD45+клетки и фокусы γ-Н2АХ в клетках человека в полученной суспензии спленоцитов. Измерения проводят методом проточной цитометрии. Сравнивают измеряемые показатели после облучения у мышей, получивших и не получивших инъекцию радиозащитного препарата.

Принцип использования иммунодефицитных мышей здесь состоит в следующем: после приживления человеческих клеток животное подвергается действию изучаемого фактора (определенный тип излучения, химический агент, лекарственный препарат), через некоторое время после воздействия оценивают ожидаемый эффект (например, такие показатели как количество клеток человека, радиационно-индуцированные повреждения ДНК, эффективность систем репарации, апоптоз, иммунологические реакции). Такие модели могут быть использованы также в целях отбора и тестирования лекарственных средств защиты человека от ионизирующих излучений.

Недостатком известного решения является использование зрелых лейкоцитов, а не стволовых кроветворных клеток, отсутствие моделирования человеческого кроветворения, измерение показателей однократно через 2 часа после облучения без оценки последующего восстановления. Перечисленные недостатки снижают надежность оценки эффективности и безопасности радиозащитных лекарственных средств.

Задачей является повышение надежности оценки эффективности и безопасности радиозащитных лекарственных средств путем повышения качества проводимых доклинических исследований радиозащитных средств.

Поставленная задача решается тем, что в способе оценки эффективности радиозащитных лекарственных средств, заключающемся в том, что у человека - донора получают клетки крови, которые вводят мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, затем мышам вводят радиозащитное средство, подвергают мышей ионизирующему облучению, затем после воздействия облучения анализируют человеческие клетки СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ, от человека-донора в качестве клеток крови получают гемопоэтические стволовые клетки - ГСК, до введения ГСК иммунодефицитных мышей подвергают гамма-облучению в дозе 2,5 Гр с мощностью дозы 0, 91 Гр/мин, затем ГСК вводят им внутривенно в боковую хвостовую вену в количестве 30-200 тыс. клеток на каждое животное, выдерживают мышей не менее 8 недель, после чего одной из групп - группе защищенных мышей вводят испытуемое радиозащитное средство, затем проводят гамма-облучение всех мышей в дозе 0,5 Гр или 1 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, идентифицируют человеческие клетки в костном мозге и измеряют долю ГСК от общего количества всех CD451low/ CD45+клеток человека для каждого животного после облучения у группы мышей без применения радиозащитного средства и у группы защищенных мышей, при этом радиозащитное средство оценивают как эффективное, если коэффициент K _14/3 у защищенных мышей выше, чем коэффициент K _14/3 у незащищенных мышей, где коэффициент K _14/3 - это отношение доли ГСК на 14 сутки после облучения к доле ГгСК человека на третьи сутки после облучения.

При этом гемопоэтические стволовые клетки крови выделяют из пуповинной крови человека-донора методом иммуномагнитной сепарации клеток CD45 или гемопоэтические стволовые клетки человека получают из материала биопсии костного мозга, либо гемопоэтические стволовые клетки выделяют методом клеточного сортинга активируемого флуоресценцией или гемопоэтические стволовые клетки получают методами антител-опосредованной сортировки клеток.

Использование в заявляемом способе мышей, гуманизированных путем введения ГСК человека, в совокупности с тем, что для исследования часть мышей до введения ГСК иммунодефицитных мышей подвергают гамма-облучению в дозе 2,5 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, затем ГСК вводят им внутривенно в боковую хвостовую вену в количестве 30-200 тыс. клеток на каждое животное, выдерживают мышей не менее 8 недель, после чего одной из групп - группе защищенных мышей вводят испытуемое радиозащитное средство, затем проводят гамма-облучение всех мышей в дозе 0,5 Гр или 1 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, идентифицируют человеческие клетки в костном мозге и измеряют долю ГСК от общего количества всех CD451low/ CD45+клеток человека для каждого животного после облучения у группы мышей без применения радиозащитного средства и при применении испытуемого радиозащитного средства на 14-е сутки после облучения, позволяет оценить влияние применяемых радиозащитных средств на количество клеток человека после облучения, их гибель, восстановление.

Измерение количества клеток человека, проводимое через 3 и 14 суток после облучения, дает возможность оценивать как повреждение, так и восстановление клеток человека с помощью коэффициента K_14/3, равного отношению доли ГСК человека на 14 сутки после облучения к доле ГСК человека на 3 сутки после облучения.

Анализ гемопоэза путем сравнения реакции ГСК на облучение после применения испытуемого средства с реакцией ГСК на облучение без его применения дает возможность более достоверно оценить эффективность радиозащитных средств. На основе этого анализа считают, что вещество обладает радиозащитным действием, если увеличивается коэффициент K_14/3.

Технический результат - повышение достоверности оценки эффективности и безопасности радиозащитных лекарственных средств.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него такими существенными признаками как получение от человека-донора в качестве клеток крови гемопоэтических стволовых клеток - ГСК, гамма-облучение до введения ГСК иммунодефицитных мышей в дозе 2,5 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, последующее введение ГСК мышам внутривенно в боковую хвостовую вену в количестве 30-200 тыс. клеток на каждое животное, выдерживание мышей не менее 8 недель, введение после этого одной из групп - группе защищенных мышей испытуемого радиозащитного средства, последующее гамма-облучение всех мышей в дозе 0,5 Гр или 1 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, идентификация человеческих клеток в костном мозге и измерение доли ГСК от общего количества всех CD451low/ Сβ45+клеток человека для каждого животного после облучения у группы мышей без применения радиозащитного средства и у группы защищенных мышей, и оценка при этом радиозащитного средства как эффективное, если коэффициент K _14/3 у защищенных мышей выше, чем коэффициент K _14/3 у незащищенных мышей, где коэффициент K _14/3 - это отношение доли ГСК на 14 сутки после облучения к доле гСК человека на третьи сутки после облучения, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, которые давали бы в совокупности достижение заявленного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти широкое применение в радиационной медицине, радиобиологии и потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Изобретение иллюстрируется материалами, где приведены:

- на фиг. 1 - график, где показано сравнение коэффициента К14/3 у гуманизированных мышей, получивших клетки ГСК от трех разных доноров пуповинной крови, с применением и без применения вещества с известным радиозащитным действием - цистеамина;

- на фиг. 2 - таблица, где приведены значения коэффициента К14/3 у гуманизированных мышей, получивших клетки ГСК от трех разных доноров пуповинной крови, с применением и без применения вещества с известным радиозащитным действием - цистеамина.

Заявляемый способ заключается в следующем.

От человека-донора в качестве клеток крови получают гемопоэтические стволовые клетки -ГСК. До введения ГСК иммунодефицитных мышей подвергают гамма-облучению в дозе 2,5 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин. Затем ГСК вводят им внутривенно в боковую хвостовую вену в количестве 30-200 тыс. клеток на каждое животное и выдерживают мышей не менее 8 недель. После этого одной из групп - группе защищенных мышей вводят испытуемое радиозащитное средство и затем проводят гамма-облучение всех мышей в дозе 0,5 Гр или 1 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин. Далее идентифицируют человеческие клетки в костном мозге и измеряют долю ГСК от общего количества всех CD451low/ CD45+клеток человека для каждого животного после облучения у группы мышей без применения радиозащитного средства и у группы защищенных мышей. При этом радиозащитное средство оценивают как эффективное, если коэффициент K _14/3 у защищенных мышей выше, чем коэффициент K _14/3 у незащищенных мышей, где коэффициент K _14/3 - это отношение доли ГСК на 14 сутки после облучения к доле ГгСК человека на третьи сутки после облучения. При этом на практике способ выполняют в следующей последовательности:

Производят подготовку суспензии ГСК клеток человека для трансплантации мышам следующим образом.

После сепарации клеток необходимо определить количество ГСК в полученной клеточной суспензии. ГСК идентифицируют как клетки с низкой экспрессией CD45 (CD45^low) и высокой экспрессией CD34 (CD34⁺) методом проточной цитометрии. Следует подсчитать количество CD45^lowCD34⁺ и CD45⁺CD34^~ клеток. Доля CD45^lowCD34⁺клеток должна составлять не менее 80% от количества всех CD45⁺ клеток.

Рекомендуется вводить не менее 30 тысяч ГСК на одно животное, общее количество ГСК, полученное от одного обследуемого лица, должно составлять не менее 150 тысяч клеток.

Суспензию клеток, полученную после сепарации, необходимо однократно отмыть в питательной среде 199 - центрифугировать при 1500 об/мин в течение 10 минут, слить надосадочную жидкость, осадок ресуспендировать в среде 199 до объема 200 мкл.

Иммунодефицитных мышей подвергают внешнему гамма-облучению в дозе 2,5 Гр с соблюдением правил асептики и антисептики.

Далее выполняют трансплантацию ГСК человека мышам.

ГСК человека вводят мышам после облучения внутривенно в латеральную хвостовую вену.

Для каждого животного используется индивидуальный шприц. Манипуляции производят с соблюдением правил асептики и антисептики.

Объем вводимой суспензии должен составлять не более 200 мкл при внутривенном введении.

После трансплантации животных оставляют не менее чем на 8 недель для приживления ГСК человека и формирования человеческого кроветворения в костном мозге гуманизированных мышей.

Через 8 недель после трансплантации производят экспериментальное облучение животных.

Проводят внешнее равномерное гамма-облучение животных.

Перемещение животных из клеток постоянного содержания в установку для облучения следует выполнять, соблюдая правила асептики и антисептики: животных рекомендовано пересадить в стерильные контейнеры в чистом помещении или в ламинарном шкафу.

Для проведения анализа показателей выполняют следующие операции.

Для анализа необходимо получить костный мозг гуманизированных животных из бедренной кости. Костный мозг извлекают путем промывания кости 1 мл раствора хлорида натрия 0,9%. Анализ проводят в разные сроки после облучения, например через 3 и 14 суток, для каждого срока используя одно облученное животное без введения тестируемого лекарственного радиозащитного средства, одно животное облученное с тестируемым лекарственным радиозащитным средством, одно необлученное животное.

Необходимо измерение в костном мозге гуманизированных мышей количества CD34+ клеток человека (ГСК), CD45+ клеток человека, доли ГСК от общего числа CD45+ клеток человека, коэффициента K14/3 как отношения доли ГСК человека на 14 сутки после облучения к доле ГСК человека на 3 сутки после облучения.

В суспензии клеток костного мозга методом проточной цитометрии необходимо измерить CD45^lowCD34⁺ и CD45⁺ клеток человека.

Доля ГСК человека рассчитывается как отношение числа CD45^lowCD34⁺ клеток к сумме CD45^lowCD34⁺ клеток и CD45 CD34^- клеток человека, выраженное в процентах.

Коэффициент К14/3 рассчитывается как отношение доли ГСК человека на 14 сутки после облучения к доле ГСК человека на 3 сутки после облучения у животных, гуманизированных ГСК от одного и того же донора.

Перечисленные показатели сравнивают у мышей, гуманизированных ГСК одного и того же донора, получивших тестируемое лекарственное радиозащитное средство и не получавших его.

Для получения итоговых выводов производится следующая интерпретация результатов.

Считают, что вещество обладает радиозащитным действием или является радиомитигатором, если увеличивается коэффициент К14/3.

Пример 1

Для получения гуманизированных мышей использовали иммунодефицитных мышей линии NOD SCID из питомника SPF-вивария ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск.

Животным вводили ГСК из проб пуповинной крови, отобранных в ГБУЗ Областной Перинатальный Центр (всего три донора пуповинной крови). ГСК выделяли из крови методом иммуномагнитной сепарации с помощью набора EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II (Stem Cell Technologies, Канада), идентифицировали как CD45^lowCD34⁺ клетки.

Мыши получали инъекцию ГСК пуповинной крови внутривенно в боковую хвостовую вену после предварительного острого внешнего гамма-облучения в дозе 2,5 Гр, в течение 9 недель происходило приживление ГСК в костном мозге мыши и формирование человеческого лимфогранулопоэза. ГСК, полученные от каждого донора пуповинной крови, вводили в равном количестве пяти мышам (количество вводимых ГСК составляло 30-200 тыс. клеток на каждое животное). Одна мышь оставалась контрольной, а четырех других вновь облучали через 9 недель после трансплантации ГСК. При этом двум из пяти гуманизированных мышей, полученных от каждого донора ГСК, за 30 минут до облучения водили внутрибрюшинно препарат с известным радиозащитным действием - 2-меркаптоэтиламин (цистеамин) в дозе 200 мг/кг массы тела (Serva, США). Животных от двух доноров облучали в дозе 0,5 Гр, а от третьего донора - в дозе 1 Гр. Сравнивали коэффициент К14/3 у гуманизированных мышей без цистеамина и у мышей с повышенной за счет цистеамина радиорезистентностью.

Измеряли количество клеток человека и мыши в костном мозге бедренной кости контрольной мыши и у мышей через 3 суток и 14 суток после облучения.

Облучение проводили на исследовательской радиобиологической гамма-установке ИГУР-1М (137Cs-источники, мощность дозы 0,91 Гр/мин, неравномерность гамма-поля не более 10%).

Методом проточной цитометрии в костном мозге мышей измеряли количество мышиных CD45+ клеток (окраска моноклональными крысиными антителами антиСD45-РЕ, клон 30-F11, BD Pharmingen, США), человеческих лейкоцитарных CD45+ клеток (окраска моноклональными мышиными антителами aнтиCD45-FITC, клон HI30, Stem Cell Technologies, Канада) и человеческих стволовых CD45lowCD34+ клеток (окраска моноклональными мышиными антителами aнтиCD34-АРС, клон 581, Stem Cell Technologies, Канада). Измерения проводили на цитометре Accuri С6 (BD Biosciences, США), рассчитывали количество клеток в мл суспензии, содержащей клетки из одной кости.

Рассчитывали выживаемость облученных клеток как отношение числа облученных клеток через 3 и 14 сутки к числу клеток того же донора у контрольной необлученной мыши для ГСК пуповинной крови, как отношение числа облученных клеток к числу необлученных клеток того же донора в тот же срок после облучения для ГСК периферической крови. Рассчитывали процентное содержание ГСК от общего количества всех CD45low/CD45+ клеток человека для каждого гуманизированного животного. Также определяли коэффициент, равный отношению доли ГСК на 14 сутки после облучения к доле ГСК на 3 сутки после облучения (К14/3).

Было показано, что у защищенных с помощью радиопротектора гуманизированных мышей коэффициент К14/3 был выше, чем у незащищенных, облученных в той же дозе (см. ниже фиг. 1). Коэффициент 14/3 представляет собой отношение доли ГСК человека на 14 сутки после облучения к доле ГСК человека на 3 сутки после облучения у животных, гуманизированных ГСК от одного и того же донора. Этот показатель отражает эффективность репопуляции ГСК после облучения, их пролиферативный потенциал и эффективность восстановления пула стволовых клеток. Данный коэффициент предложен для использования в качестве критерия оценки радиочувствительности. Изменение коэффициента К_14/3 при использовании радиопротекторного средства цистеамина в модели гуманизированных мышей с введением ГСК пуповинной крови показано ниже в таблице (фиг. 2).

В сравнении с прототипом заявляемый способ дает возможность повысить достоверность оценки действия тестируемого лекарственного средства на радиационно-индуцированную гибель и последующее восстановление ГСК человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию биологических материалов, в частности крови, и может использоваться в радиационной медицине, фармакологии. Способ оценки эффективности радиозащитных лекарственных средств с использованием гуманизированных мышей заключается в том, что от человека-донора в качестве клеток крови получают гемопоэтические стволовые клетки – ГСК. До введения ГСК иммунодефицитных мышей подвергают гамма-облучению в дозе 2,5 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин. Затем ГСК вводят им внутривенно в боковую хвостовую вену в количестве 30-200 тыс. клеток на каждое животное, выдерживают мышей не менее 8 недель. После чего одной из групп - группе защищенных мышей вводят испытуемое радиозащитное средство. Затем проводят гамма-облучение всех мышей в дозе 0,5 Гр или 1 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, идентифицируют человеческие клетки в костном мозге и измеряют долю ГСК от общего количества всех CD451^low/ CD45+клеток человека для каждого животного после облучения у группы мышей без применения радиозащитного средства и у группы защищенных мышей. При этом радиозащитное средство оценивают как эффективное, если коэффициент К_14/3 у защищенных мышей выше, чем коэффициент К_14/3 у незащищенных мышей, где коэффициент К_14/3 - это отношение доли ГСК на 14 сутки после облучения к доле ГСК человека на третьи сутки после облучения. Изобретение повышает достоверность оценки эффективности и безопасности радиозащитных лекарственных средств. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Способ оценки эффективности радиозащитных лекарственных средств с использованием гуманизированных мышей, заключающийся в том, что у человека-донора получают клетки крови, которые вводят мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, затем мышам вводят радиозащитное средство, подвергают мышей ионизирующему облучению, затем после воздействия облучения анализируют человеческие клетки, отличающийся тем, что от человека-донора в качестве клеток крови получают гемопоэтические стволовые клетки - ГСК, до введения ГСК иммунодефицитных мышей подвергают гамма-облучению в дозе 2,5 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, затем ГСК вводят им внутривенно в боковую хвостовую вену в количестве 30-200 тыс. клеток на каждое животное, выдерживают мышей не менее 8 недель, после чего одной из групп - группе защищенных мышей вводят испытуемое радиозащитное средство, затем проводят гамма-облучение всех мышей в дозе 0,5 Гр или 1 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, идентифицируют человеческие клетки в костном мозге и измеряют долю ГСК от общего количества всех CD451^low/ CD45+клеток человека для каждого животного после облучения у группы мышей без применения радиозащитного средства и у группы защищенных мышей, при этом радиозащитное средство оценивают как эффективное, если коэффициент К_14/3 у защищенных мышей выше, чем коэффициент К_14/3 у незащищенных мышей, где коэффициент К_14/3 - это отношение доли ГСК на 14 сутки после облучения к доле гСК человека на третьи сутки после облучения.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гемопоэтические стволовые клетки крови выделяют из пуповинной крови человека-донора методом иммуномагнитной сепарации клеток CD45.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гемопоэтические стволовые клетки человека получают из материала биопсии костного мозга.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гемопоэтические стволовые клетки выделяют методом клеточного сортинга, активируемого флуоресценцией.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гемопоэтические стволовые клетки получают методами антител-опосредованной сортировки клеток.